囊泡在制备肠道菌群的生长调节剂中的应用

1.本发明属于生物医药领域，涉及囊泡在制备肠道菌群的生长调节剂中的应用。


背景技术：

2.原核生物和真核生物已经共存数百万年。在人的体表和体内栖生着许多种类和数量的正常微生物，人类微生物群包括真菌、酵母、古细菌和病毒，但主要由细菌组成。人体正常菌群种类约500-1000余种，细菌数量达10
14
个，比人体细胞数量还要多10倍，它们加起来大约有1.5千克重，被称为“人体第二基因组”。人体微生物分布在口腔，肠道，阴道，皮肤等，其中，70％分布在肠道。
3.为了维持人体与微生物的生态平衡，原核细胞和真核细胞可以通过各种激素和类似激素的化合物相互交流，如酰基高丝氨酸内酯(ahls)和芳香族(自诱导剂(ai-3)信号等。但其具体机制仍有待探索。liu等研究发现，粪便中microrna(mirna)介导的种间基因调控有助于宿主控制肠道微生物群(liu et al.,2016)。anderson等研究发现，肠上皮细胞凋亡产生的可溶性小分子可以促进伤寒沙门氏菌等的生长(anderson et al.,2021)。宿主细胞是通过何种途径调控细菌并最终维持人体与微生物生态平衡的，仍有待进一步探索。
4.细胞外囊泡(extracellular vesicles,evs)是细胞分泌的含有蛋白质、核酸及各种细胞因子的纳米级载体。细胞外囊泡可以通过内分泌或旁分泌的方式作用于靶细胞，在细胞间物质传递和信息交流过程中发挥了重要作用。研究发现，细胞外囊泡所介导的信息交流在机体生理或病理过程中发挥了重要的调控作用，涉及到免疫调节、肿瘤生长、血管生成、损伤修复等。迄今为止，间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)被认为是产生外泌体能力最强的细胞。


技术实现要素：

5.一些实施方案中，本发明提供了诱导性囊泡在制备肠道益生菌群的生长调节剂中的用途。
6.一些实施方案中，所述的生长调节剂包括增殖促进剂或增殖抑制剂。
7.一些实施方案中，所述的诱导性囊泡通过进入所述肠道菌群的菌体内部调节所述肠道菌群的生长。
8.一些实施方案中，所述肠道菌群包括益生菌和有害菌。
9.一些实施方案中，所述的生长调节剂包括促进益生菌的增殖或抑制有害菌的增殖。
10.益生菌有益于人体肠道健康，益生菌可以通过阻碍某些肠道病原菌在肠道上的黏附与定植、代谢产生有益物质(挥发性短链脂肪酸、乙酸、丙酸等)、调节肠道菌群以及调节免疫等维持肠道健康。然而强健的菌株活性，是乳酸菌发挥益生功能的重要基础。
11.益生菌在生长及应用的过程中面临着多种环境胁迫，严重限制着益生菌的功能。如，乳酸菌在受到例如物理、化学、营养以及生物因素的影响时，其生长与代谢性能受到一
定程度的限制，这种环境就是所谓的“胁迫”(duwat et al.,2000)。乳酸菌在人体肠道中发挥益生作用时也会受胃酸、胆盐，氧胁迫、盐胁迫、温度胁迫、营养胁迫等，而这些环境胁迫作用对乳酸菌的生理特性以及代谢途径产生一定程度的影响，从而影响了其细胞的活力。在益生菌使用过程中，机体是如何协助益生菌抵抗胁迫，帮助益生菌保持活性的，文献中鲜有报道。
12.本发明研究发现，所述的诱导性囊泡能够进入菌体内部促进益生菌生长及提高其抗胁迫性能。
13.一些实施方案中，所述的益生菌群包括乳酸乳球菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜黏蛋白阿克曼菌中的一种或多种。
14.一些实施方案中，所述的生长调节剂包括促进益生菌适应不利环境的调节剂。
15.一些实施方案中，所述的不利环境包括环境胁迫。
16.一些实施方案中，所述环境胁迫包括物理、化学、营养以及生物因素的胁迫。
17.一些实施方案中，所述环境胁迫包括酸胁迫、胆盐胁迫、氧胁迫、渗透胁迫、温度胁迫、营养胁迫。
18.一些实施方案中，所述渗透胁迫包括高盐浓度导致的高渗透压胁迫。
19.一些实施方案中，所述盐包括氯化钠。
20.一些实施方案中，所述生长调节剂抑制有害菌的生长。
21.一些实施方案中，所述有害菌包括白色念珠菌。
22.一些实施方案中，本发明提供了一种组合物，包含诱导性囊泡和肠道菌群调节剂，所述菌群调节剂为促进包括乳酸乳球菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌或嗜黏蛋白阿克曼菌在内(但又不限于此)的益生菌生长的调节剂或抑制包括白色念珠菌在内(但又不限于此)的有害菌生长的调节剂。
23.一些实施方案中，本发明提供了一种治疗肠道菌群相关的疾病的方法，包括：向受试者施用有效量的所述诱导性囊泡。
24.一些实施方案中，本发明提供了一种治疗肠道菌群相关的疾病的方法，包括：向受试者施用有效量的所述组合物。
25.一些实施方案中，本发明提供了一种调节肠道菌群生长的方法，所述方法包括添加诱导性囊泡与所述菌群共培养。
26.一些实施方案中，所述肠道菌群包括益生菌和有害菌。
27.一些实施方案中，所述调节肠道菌群生长包括促进益生菌的增殖或抑制有害菌的增殖。
28.一些实施方案中，所述的诱导性囊泡通过进入所述肠道菌群的菌体内部调节所述肠道菌群的生长。
29.一些实施方案中，所述有害菌包括白色念珠菌。
30.一些实施方案中，所述的益生菌群包括乳酸乳球菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜黏蛋白阿克曼菌中的一种或多种。
31.一些实施方案中，所述的调节肠道菌群生长包括促进益生菌适应不利环境。
32.一些实施方案中，所述的不利环境包括环境胁迫。
33.一些实施方案中，所述环境胁迫包括物理、化学、营养以及生物因素的影响。
34.一些实施方案中，所述环境胁迫包括酸胁迫、胆盐胁迫，氧胁迫、渗透胁迫、温度胁迫、营养胁迫。
35.一些实施方案中，所述渗透胁迫包括高盐浓度导致的高渗透压胁迫。
36.一些实施方案中，所述盐包括氯化钠。
37.一些实施方案中，所述酸胁迫为ph为1～7的酸环境。
38.一些实施方案中，所述酸胁迫为ph为3～6的酸环境。
39.一些实施方案中，所述酸胁迫为ph为4～6的酸环境。
40.一些实施方案中，所述胆盐胁迫为胆盐浓度为0.01～0.5g/ml的环境。
41.一些实施方案中，所述胆盐胁迫为胆盐浓度为0.02～0.1g/ml的环境。
42.一些实施方案中，所述胆盐胁迫为胆盐浓度为0.02～0.08g/ml的环境。
43.一些实施方案中，所述氧胁迫为h2o2浓度为0.01～10μm的环境。
44.一些实施方案中，所述氧胁迫为h2o2浓度为0.1～10μm的环境。
45.一些实施方案中，所述氧胁迫为h2o2浓度为0.1～5μm的环境。
46.一些实施方案中，所述的渗透胁迫为nacl浓度为10mg/ml～1000mg/ml的环境。
47.一些实施方案中，所述的渗透胁迫为nacl浓度为10mg/ml～800mg/ml的环境。
48.一些实施方案中，所述的渗透胁迫为nacl浓度为20mg/ml～200mg/ml的环境。
49.一些实施方案中，所述的渗透胁迫为nacl浓度为10mg/ml～100mg/ml的环境。
50.一些实施方案中，所述的诱导性囊泡是在所述干细胞或体细胞处于正常存活期间通过外力诱导凋亡而产生的囊泡。
51.一些实施方案中，所述外力诱导包括添加星形孢菌、紫外线照射、饥饿法、或热应力法或其中一种或多种的组合诱导干细胞凋亡产生。
52.一些实施方案中，所述干细胞来源于哺乳动物，但又不限于此。
53.一些实施方案中，所述哺乳动物选自人或鼠，但又不限于此。
54.一些实施方案中，所述干细胞为间充质干细胞。
55.一些实施方案中，所述间充质干细胞来源选自诱导性多能干细胞、血液干细胞、骨髓间充质干细胞、尿液间充质干细胞、口腔间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脐带间充质干细胞、骨膜间充质干细胞、皮肤间充质干细胞组成群组中的至少一种。
56.在一些实施方案中，所述间充质干细胞的代数可以为第2～5代，但又不限于此。
57.在一些实施方案中，在一些实施方案中，分离所述诱导性囊泡的方法包括选用超速离心的方法分离所述囊泡。所述超速离心包括四次离心。
58.在一些实施例中，所述诱导性囊泡的制备方法包括步骤：(1)培养间充质干细胞；(2)间充质干细胞诱导；(3)收集间充质干细胞的培养基上清；(4)从步骤(3)中的培养基上清中分离出囊泡。
59.在一些实施例中，所述步骤(1)中的培养间充质干细胞的步骤包括：(4)从组织中分离间充质干细胞；(5)添加培养基培养间充质干细胞；所述间充质干细胞的培养基中接触凋亡诱导剂。
60.在一些实施例中，所述步骤(3)中，分离囊泡的方法包括选用超速离心的方法分离所述囊泡。
61.在一些实施例中，所述超速离心的方法分离所述囊泡的步骤包括：(a)将收集到的培养上清进行第一次离心，取上清；(b)将步骤(a)中收集到的上清进行第二次离心，取上清；(c)将步骤(b)中收到的上清进行第三次离心，取沉淀；(d)将步骤(c)中收到的沉淀进行第四次离心，取沉淀。
62.在一些实施方案中，所述第一次离心为500-1500g离心5-30分钟；或者所述第一次离心为500-1000g离心5-20分钟；或者所述第一次离心为500-900g离心5-15分钟。在一些实施例中，所述第二次离心为1000-3000g离心5-30分钟；或者所述第二次离心为1500-2500g离心5-20分钟；或者所述第二次离心为1500-2200g离心5-15分钟。在一些实施例中，所述第三次离心为10000-30000g离心15-60分钟；或者所述第三次离心为12000-25000g离心20-60分钟；或者所述第三次离心为12000-20000g离心20-40分钟。在一些实施例中，所述第四次离心为10000-30000g离心15-60分钟，或者所述第四次离心为12000-25000g离心20-60分钟；或者所述第四次离心为12000-20000g离心20-40分钟。
63.在一些实施例中，所述诱导性囊泡具有标志物syntaxin 4。在一些实施例中，所述诱导性囊泡高表达标志物syntaxin 4。在一些实施例中，所述诱导性囊泡对标志物syntaxin 4的表达高于mscs或外泌体。在一些实施例中，所述标志物syntaxin 4的表达量为来源于间充质干细胞的外泌体中syntaxin 4的表达量的3-6倍。在一些实施例中，所述标志物syntaxin 4的表达量为来源于间充质干细胞的外泌体中syntaxin 4的表达量的3.5-5倍。在一些实施例中，所述标志物syntaxin 4的表达量为来源于间充质干细胞的外泌体中syntaxin 4的表达量的4.45倍。在一些实施例中，所述标志物还包括annexin v、flotillin-1、cadherin 11和integrin alpha 5中的一种或多种。在一些实施例中，所述标志物为syntaxin 4、annexin v、flotillin-1、cadherin 11和integrin alpha 5的组合。在一些实施例中，所述诱导性囊泡高表达标志物annexin v、flotillin-1、cadherin 11、integrin alpha 5。在一些实施例中，所述诱导性囊泡对标志物annexin v、flotillin-1、cadherin 11、integrin alpha 5的表达量高于mscs或外泌体。在一些实施例中，所述诱导性囊泡中的标志物annexin v、flotillin-1、cadherin 11、integrin alpha 5的表达量相对于来源于间充质干细胞的外泌体中标记物的表达量分别为1-2倍、2-3倍、1-3倍和3-4倍。一些实施例中，所述诱导性囊泡中的标志物annexin v、flotillin-1、cadherin 11、integrin alpha 5的表达量分别为1.5-2倍、2.5-3倍、1.5-2.5倍和3.5-4倍。在一些实施例中，所述囊泡中的标志物annexin v、flotillin-1、cadherin 11、integrin alpha 5的表达量分别为1.76倍、2.81倍、2.41倍、3.68倍。本发明中所述诱导性囊泡与外泌体有本质的不同，例如与外泌体相比，本发明所述的诱导性囊泡ievs高表达syntaxin 4，以及其annexin v、flotillin-1、cadherin 11、integrin alpha 5的表达量明显高于外泌体。
64.除了具有的标志物有差别之外，所述诱导性囊泡ievs在功能上或治疗效果上也呈现出有别于干细胞和其他的细胞外囊泡的特性。例如ievs能显著缩短大部分血浆的体外凝固时间，促凝效果好于外泌体。例如，间充质干细胞可以治疗损伤性肝纤维化，然而，诱导性囊泡对这些疾病并不能实现治疗效果。例如mscs能够治疗干燥综合征，而本发明所述的诱导性囊泡对干燥综合征无治疗效果。例如ievs治疗血友病小鼠的机制与ps和tf无关，而以往文献报道中，细胞外囊泡发挥促凝作用都高度依赖于其表面的ps和tf。
附图说明
65.图1为mscs来源的ievs能够进入细菌内部。(1a)显示细菌围绕ievs(红色)聚集生长。(1b-1c)采用高分辨激光共聚焦显微镜下观察到进行分层扫描，imaris软件进行三维重建，发现部分ievs能够进入细菌内部(大肠杆菌，图1b；乳酸乳球菌，图1c)。(1d)对小鼠结肠中的粪菌进行放大，采用高分辨激光共聚焦显微镜进行分层扫描，imaris软件进行三维重建，发现部分ievs能够进入肠道菌群的核区。(1e)western检测显示，ievs进行共培养的大肠杆菌和乳酸乳球菌蛋白中均表达哺乳动物细胞骨架蛋白β-actin，而对照菌不表达。(1f)pcr检测发现，与ievs进行共培养的大肠杆菌和乳酸乳球菌均表达哺乳动物细胞骨架蛋白基因β-actin，而对照菌不表达。(1g-1j)pkh26标记的ievs与乳酸乳球菌、大肠杆菌、鼠李糖乳杆菌、白色念珠菌共培养，流式细胞术检测菌体中pkh26荧光的表达，实验结果提示，对ievs的内吞具有菌种特异性。其中，1010 ievs、109 ievs、108 ievs分别指的是10
10
个ievs、109个ievs、108个ievs。(1k)将pkh26标记的ievs灌入小鼠胃部，分别在不同时间点收集小鼠粪便，采用流式细胞术测菌体中pkh26荧光的表达，灌胃后8h，菌体中的荧光量达到最大值，约3％。
66.图2为mscs来源的ievs能够促进乳酸乳球菌等益生菌的生长。(2a)ievs能够促进乳酸乳球菌的生长。(2b)ievs能够促进鼠李糖乳杆菌的生长。(2c)ievs能够促进嗜酸乳杆菌的生长。(2d)ievs能够促进嗜黏蛋白阿克曼菌的生长。(2e)ievs对罗伊氏乳杆菌的生长几乎没有作用。(2f)ievs能够抑制白色念珠菌生长。(2g)ievs对大肠杆菌的生长几乎没有作用。(2h)ievs对具核梭杆菌几乎没有作用。其中，1010、109、108分别指的是10
10
个ievs、109个ievs、108个ievs。
67.图3为mscs来源的ievs能够提高乳酸乳球菌的抗酸性能。(3a-3c)不同ph值条件下的细菌生长曲线。(3d)不同ph值条件下菌落计数。其中，1010 ievs、109 ievs分别指的是10
10
个ievs、109个ievs。
68.图4为mscs来源的ievs能够提高乳酸乳球菌的耐胆盐性能。(4a-4d)在不同浓度胆盐处理下的细菌生长曲线。其中，1010、109、108分别指的是10
10
个ievs、109个ievs、108个ievs。
69.图5为mscs来源的ievs能够提高乳酸乳球菌的耐氧胁迫性能。(5a-5e)不同浓度h2o2处理下的细菌生长曲线。(5f)不同浓度的h2o2处理下的菌落计数。其中，1010、109、108分别指的是10
10
个ievs、109个ievs、108个ievs。
70.图6为mscs来源的ievs能够提高乳酸乳球菌的耐高渗性能。(6a-6e)不同浓度nacl处理下的细菌生长曲线。其中，1010、109、108分别指的是10
10
个ievs、109个ievs、108个ievs。
具体实施方式
71.以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
72.本文实施例中，ievs的获得方法同中国专利申请202110077486.9。
73.本文实施例中，共培养时使用的培养基为gm17培养基，葡萄糖浓度为0.0112g/ml。
74.本文实施例中，使用的胆盐购自广州环凯微生物科技有限公司(050100牛胆盐0x bile salts)。
75.实施例1 mscs来源的ievs能够进入细菌内部
76.1、实验方法
77.(1)提取间充质干细胞来源的ievs进行定量，pkh26进行标记(将1ul pkh26染料(sigma(st.louis,mo,usa)公司的pkh26(mini67)与1*10
10
囊泡混匀，染色5min，fbs中和，pbs洗两次)。
78.(2)复苏乳酸乳球菌，大肠杆菌，进行培养、鉴定、扩增，计数。采用双交换法构建带gfp原位标记的乳酸乳球菌和大肠杆菌菌株。
79.(3)将1
×
107乳酸乳球菌，大肠杆菌与不同浓度的带膜标记pkh26的ievs进行共培养，6h后进行镜下观察，观察ievs与细菌之间的交互作用。
80.2、实验结果
81.本实施例以上实验结果中所述的ievs均为带膜标记pkh26的ievs。
82.(1)细菌围绕ievs(红色)聚集生长(图1a)。
83.(2)收集共培养后的细菌，pbs洗三遍后，采用0.5％的triton处理8min，去除细菌表面黏附的ievs，制备菌悬液涂片，dapi染核区，采用高分辨激光共聚焦显微镜进行分层扫描，imaris软件进行三维重建，发现部分ievs能够进入细菌内部(大肠杆菌，图1b；乳酸乳球菌，图1c)。
84.(3)将pkh26染色的ievs给小鼠进行尾静脉注射。24小时后收集小鼠结肠，切片观察发现，红色的pkh26在小鼠结肠有分布，更多的是出现在结肠中的粪便中。对小鼠结肠中的粪菌进行放大，采用高分辨激光共聚焦显微镜进行分层扫描，imaris软件进行三维重建，发现部分ievs能够进入肠道菌群的核区(图1d)。
85.(4)收集共培养后的细菌，pbs洗三遍后，采用0.5％的triton处理，去除细菌表面黏附的ievs，采用细菌蛋白提取试剂盒提取菌体蛋白，western检测发现，与ievs进行共培养的大肠杆菌和乳酸乳球菌蛋白中均表达哺乳动物细胞骨架蛋白β-actin，而对照菌不表达。提示经过共培养，部分表达β-actin蛋白的ievs进入了菌体内部。两株细菌均表达gfp荧光蛋白(图1e)。
86.(5)收集共培养后的细菌，pbs洗三遍后，采用0.5％的triton处理，去除细菌表面黏附的ievs，采用细菌dna提取试剂盒提取细菌dna，pcr检测发现，与ievs进行共培养的大肠杆菌和乳酸乳球菌均表达哺乳动物细胞骨架蛋白基因β-actin，而对照菌不表达(图1f)。提示经过共培养，部分表达β-actin基因的ievs进入了菌体内部。
87.(6)将1*10
10
pkh26标记的ievs与分别与1*107乳酸乳球菌、大肠杆菌、鼠李糖乳杆菌、白色念珠菌共培养，分别在不同时间点收集细菌，pbs洗三遍后，采用0.5％的triton处理8min，去除细菌表面黏附的ievs，流式细胞术检测菌体中pkh26荧光的表达。
88.结果如图1g-1j，实验结果显示：随着时间的推移，pkh26阳性的细菌量逐渐增加。乳酸乳球菌最高阳性率出现在共培养后16h，最高可达54％。而大肠杆菌与ievs共培养1h后即可达到最大吞菌比例，比例仅为7％。鼠李糖乳杆菌最高阳性率为11％，出现在共培养后15h。白色念珠菌在共培养24h时，有65％的菌都内吞了ievs，实验结果提示，对ievs的内吞具有菌种特异性。
89.(7)将pkh26标记的ievs灌入小鼠胃部，分别在不同时间点收集小鼠粪便，去除残渣，制备菌悬液，pbs洗三遍后，采用0.5％的triton处理8min，去除细菌表面黏附的ievs，采用流式细胞术测菌体中pkh26荧光的表达。如图1k，实验结果发现，灌胃后8h，菌体中的荧光量达到最大值，约3％。
90.以上体内体外实验结果表明，mscs来源的ievs能够进入细菌内部。
91.实施例2 mscs来源的ievs能够促进乳酸乳球菌等益生菌的生长
92.1、实验方法
93.将不同数量的ievs与1*107乳酸乳球菌共培养，酶标仪实时监测od值，检测细菌生长曲线。
94.2、实验结果
95.mscs来源的ievs能够促进乳酸乳球菌(图2a)，鼠李糖乳杆菌(图2b)，嗜酸乳杆菌(图2c)，嗜黏蛋白阿克曼菌(图2d)等益生菌的生长，能够抑制白色念珠菌生长(图2f)，但对罗伊氏乳杆菌(图2e)、大肠杆菌(图2g)，具核梭杆菌(图2h)几乎没有作用。
96.实施例3 mscs来源的ievs能够提高乳酸乳球菌的抗胁迫性能
97.1.mscs来源的ievs能够提高乳酸乳球菌的抗酸性能
98.益生菌在进入肠道之前必须要经受胃酸环境的胁迫。己有研究证明(zhu et al.,2019)，有机酸通过细胞膜扩散到细胞内，降低胞内ph，损伤部分蛋白质和核酸，导致细胞失活。
99.(1)实验方法
100.将不同数量的ievs与107乳酸乳球菌在不同ph值条件下共培养，酶标仪实时监测od值，检测细菌生长曲线(图3a-3c)。
101.将不同数量的ievs与107乳酸乳球菌共培养，在不同ph值条件下酸胁迫4h，将共培养体系梯度稀释，涂板培养。24小时后进行菌落计数(图3d)。
102.(2)实验结果
103.图3a-3c显示mscs来源的ievs能够在不同ph值条件下促进乳酸乳球菌生长，ph值越低，这一作用越明显。
104.图3d显示，mscs来源的ievs能够在不同ph值条件下促进乳酸乳球菌存活。
105.2.mscs来源的ievs能够提高乳酸乳球菌的耐胆盐性能
106.胆汁的主要成分胆汁酸是由胆固醇合成,并与肝脏中的甘氨酸或牛磺酸结合，形成牛磺胆酸盐和甘氨胆酸盐，通过胆总管分泌到十二指肠前储存在胆囊中。高浓度的胆汁可溶解磷脂并破坏细胞膜的脂质双层结构，引起细胞溶解。zhang等(zhang et al.,2010)利用电镜观察到胆盐能使乳酸菌的细胞完全受损，导致葡萄糖无法摄入。此外，胆汁酸会诱导蛋白质发生错误折叠，导致dna和rna的氧化损伤以及细胞内酸化(van de guchte et al.,2002)。
107.益生菌发挥其特定益生功能的前提是必须通过胃中酸性和十二指肠高胆盐的环境，以活菌的形式到达小肠和大肠。所以耐受肠道胆盐胁迫对益生菌在体内发挥作用至关重要。
108.(1)实验方法
109.将不同数量的ievs与107乳酸乳球菌在不同胆盐浓度下共培养，酶标仪实时监测
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