包含颗粒和mrna的药物组合物及其制备和储存的方法
技术领域：
：1.本公开内容总体上涉及这样的领域：包含颗粒(特别是脂质纳米粒(lipidnanoparticle，lnp))和mrna的药物组合物、用于制备和储存这样的药物组合物的方法以及药物组合物在治疗中的用途。
背景技术：
：：2.使用重组核酸(例如dna或rna)以将外来遗传信息递送到靶细胞中是公知的。使用rna的优点包括瞬时表达和非转化特征。rna不需要进入细胞核以进行表达，并且此外rna不会整合至宿主基因组中，从而消除多种风险例如肿瘤发生。3.重组核酸可以以裸形式施用于有此需要的对象；然而，通常使用药物组合物施用重组核酸。例如，rna可通过所谓的纳米粒制剂进行递送，所述纳米粒制剂包含rna和纳米粒形成载剂，例如，阳离子脂质(例如永久性带电荷的阳离子脂质)、阳离子脂质与一种或更多种另外的脂质的混合物、或阳离子聚合物。这样的纳米粒制剂的命运受多样的关键因素(例如，纳米粒的尺寸和尺寸分布；等)控制。例如，在2018年的fda“liposomedrugproductsguidance”中，这些因素被称为应进行分析和说明的特定属性。当前纳米粒制剂的临床应用的局限性可能在于缺乏均质、纯且良好表征的纳米粒制剂。4.与其他rna纳米粒产品相比，包含可电离脂质的lnp在靶向和效力方面可显示出优势。然而，获得如常规药物使用所需的足够保质期是具有挑战性的。例如，在适用于包含永久性带电荷阳离子脂质的类似基于脂质的纳米粒制剂的条件下，包含可电离脂质的lnp不能通过在-20℃下冷冻来稳定。此外，用于提高保质期稳定性的另一些技术，例如脱水，在标准方案的情况下是不可能的。相比之下，据说为了稳定，包含可电离脂质的lnp需要在低得多的温度例如-80℃下冷冻，这给冷链带来了巨大的挑战，或者它们只可在高于冷冻温度(例如5℃)的条件下储存，在该温度下只能获得有限的稳定性。5.因此，本领域仍然需要(i)这样的药物组合物，其包含含有可电离脂质和mrna的lnp，并且是稳定的并且可储存于符合药物实践中常规技术的温度下，特别是在约-25℃或甚至更高的温度下，以及(ii)用于制备和储存这样的组合物的方法。本公开内容解决了这些和另一些需求。6.本发明人出人意料地发现本文中所述的方法和药物组合物满足上述需求。特别地，表明了通过遵守某些参数(例如，将用于制备药物组合物的制剂的ph降低到低于所用的阳离子可电离脂质的pka；排除nacl和/或kcl的添加；排除制剂中的柠檬酸阴离子；和/或排除制剂中的磷酸阴离子)，可制备冷冻或冷冻干燥形式的药物组合物，其是稳定的并且可储存在约-25℃或甚至更高温度下。7.发明概述8.在第一方面中，本公开内容提供了用于制备药物组合物的方法，其包括以下步骤：9.(i)制备包含脂质纳米粒(lnp)的制剂，其中所述lnp包含阳离子可电离脂质和mrna，并且其中以下中一者或更多者适用：10.(i)步骤(i)不包括添加nacl和/或kcl；11.(ii)所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka；12.(iii)所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子；13.(iv)所述制剂基本上不含无机磷酸阴离子；以及14.(ii)将所述制剂冷冻至约-10℃或低于-10℃，从而获得冷冻形式的所述药物组合物。15.在一个实施方案中，特别地，如果期望制备冷冻干燥形式的药物组合物，第一方面的方法还包括步骤(iii)将所述冷冻制剂冷冻干燥，从而获得冷冻干燥形式的药物组合物。16.在第一方面的第一子组中，标准(i)至(iv)中的至少一者适用。例如，在该第一子组的一个实施方案中，至少步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl。在该第一子组的另一个实施方案中，至少所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka。在该第一子组的另一个实施方案中，至少所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子。在该第一子组的另一个实施方案中，至少所述制剂基本上不含无机磷酸阴离子。17.在第一方面的第二子组中，标准(i)至(iv)中的至少两者适用。例如，在该第二子组的一个实施方案中，至少所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl。在该第二子组的另一个实施方案中，至少所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl。在该第二子组的另一个实施方案中，至少所述制剂基本上不含无机磷酸阴离子，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl。在该第二子组的另一个实施方案中，至少所述制剂的ph低于阳离子可电离脂质的pka，并且所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子。在该第二子组的另一个实施方案中，至少所述制剂的ph低于阳离子可电离脂质的pka，并且所述制剂基本上不含无机磷酸阴离子。在该第二子组的另一个实施方案中，至少所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子。18.在第一方面的第三子组中，标准(i)至(iv)中的至少三者适用。例如，在该第三子组的一个实施方案中，至少所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka、所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl。在该第三子组的另一个实施方案中，至少所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka、所述制剂基本上不含无机磷酸阴离子并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl。在第三子组的另一个实施方案中，至少所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl。在第三子组的另一个实施方案中，至少所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka并且所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子。19.在第一方面的第四子组中，标准(i)至(iv)中的至少全部皆适用。即，在该第四子组中，至少所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka、所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl。20.在第一方面的一个实施方案中(特别是第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中)，所述制剂包含缓冲剂体系和/或冷冻保护剂。例如，在一个实施方案中(特别是第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中)，所述制剂包含缓冲剂体系。在另一个实施方案中(特别是第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的另一个实施方案中)，所述制剂包含冷冻保护剂。在另一个实施方案中(特别是第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的另一个实施方案中)，所述制剂包含缓冲剂体系和冷冻保护剂。因此，这些实施方案的一些具体实例为以下：21.(1)所述制剂包含缓冲剂体系，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；22.(2)所述制剂包含冷冻保护剂，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；23.(3)所述制剂包含缓冲剂体系和冷冻保护剂，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；24.(4)所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述制剂包含缓冲剂体系；25.(5)所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述制剂包含冷冻保护剂；26.(6)所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述制剂包含缓冲剂体系和冷冻保护剂；27.(7)所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子并且包含缓冲剂体系；28.(8)所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子并且包含冷冻保护剂；29.(9)所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子并且包含缓冲剂体系和冷冻保护剂；30.(10)所述制剂基本上不含无机磷酸阴离子并且包含缓冲剂体系；31.(11)所述制剂基本上不含无机磷酸阴离子并且包含冷冻保护剂；32.(12)所述制剂基本上不含无机磷酸阴离子，并且包含缓冲剂体系和冷冻保护剂；33.(13)所述制剂包含缓冲剂体系，所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；34.(14)所述制剂包含冷冻保护剂体系，所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；35.(15)所述制剂包含缓冲剂体系和冷冻保护剂，所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；36.(16)所述制剂包含缓冲剂体系并且基本上不含柠檬酸阴离子，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；37.(17)所述制剂包含冷冻保护剂并且基本上不含柠檬酸阴离子，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；38.(18)所述制剂包含缓冲剂体系和冷冻保护剂并且基本上不含柠檬酸阴离子，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；39.(19)所述制剂包含缓冲剂体系并且基本上不含无机磷酸阴离子，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；40.(20)所述制剂包含冷冻保护剂并且基本上不含无机磷酸阴离子，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；41.(21)所述制剂包含缓冲剂体系和冷冻保护剂并且基本上不含无机磷酸阴离子，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；42.(22)所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子并且包含缓冲剂体系；43.(23)所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子并且包含冷冻保护剂；44.(24)所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子并且包含缓冲剂体系和冷冻保护剂；45.(25)所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述制剂基本上不含无机磷酸阴离子并且包含缓冲剂体系；46.(26)所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述制剂基本上不含无机磷酸阴离子并且包含冷冻保护剂；47.(27)所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述制剂基本上不含无机磷酸阴离子，并且包含缓冲剂体系和冷冻保护剂；48.(28)所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子并且包含缓冲剂体系；49.(29)所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子并且包含冷冻保护剂；50.(30)所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子并且包含缓冲剂体系和冷冻保护剂；51.(31)所述制剂包含缓冲剂体系，所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；52.(32)所述制剂包含冷冻保护剂，所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；53.(33)所述制剂包含缓冲剂体系和冷冻保护剂，所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；54.(34)所述制剂包含缓冲剂体系，所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，所述制剂基本上不含无机磷酸阴离子，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；55.(35)所述制剂包含冷冻保护剂，所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，所述制剂基本上不含无机磷酸阴离子，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；56.(36)所述制剂包含缓冲剂体系和冷冻保护剂，所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，所述制剂基本上不含无机磷酸阴离子，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；57.(37)所述制剂包含缓冲剂体系，所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；58.(38)所述制剂包含冷冻保护剂，所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；59.(39)所述制剂包含缓冲剂体系和冷冻保护剂，所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；60.(40)所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子，并且所述制剂包含缓冲剂体系；61.(41)所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子，并且所述制剂包含冷冻保护剂；62.(42)所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子，并且所述制剂包含缓冲剂体系和冷冻保护剂；63.(43)所述制剂包含缓冲剂体系，所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；64.(44)所述制剂包含冷冻保护剂，所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；65.(45)所述制剂包含缓冲剂体系和冷冻保护剂，所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl。66.在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述制剂的ph为至多6.5，优选至多6.4、至多6.3、至多6.2、至多6.1或至多6.0。在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述制剂的ph的范围为5.5至6.5，例如5.6至6.4、5.7至6.6、5.8至6.2或5.9至6.1。在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上列出实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述制剂的ph为约6.0。67.在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述制剂包含缓冲剂体系，所述缓冲剂体系包含水(特别是去离子水，例如注射用水)和缓冲物质。在一个实施方案中，缓冲剂体系包含hepes、组氨酸、tris和乙酸中任一者作为缓冲物质，例如hepes、组氨酸和tris中任一者作为缓冲物质。在一个优选实施方案中，缓冲剂体系包含hepes作为缓冲物质。在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述制剂包含缓冲剂体系，所述缓冲剂体系包含水(特别是去离子水，例如注射用水)和hepes作为缓冲物质。68.在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述制剂包含缓冲剂体系，所述缓冲剂在所述制剂中的浓度为至多50mm，优选至多45mm，更优选至多40mm，更优选至多35mm，更优选至多30mm，更优选至多25mm，更优选至多20mm。在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述缓冲剂在所述制剂中的浓度为5mm至50mm，例如，5mm至40mm，10mm至30mm，或15mm至25mm。69.在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述制剂包含冷冻保护剂，所述冷冻保护剂包含一种或更多种碳水化合物。例如，冷冻保护剂可包含以下中的任一种：蔗糖、海藻糖、葡萄糖、或其组合。在第一方面的一个优选实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述制剂包含蔗糖和/或海藻糖作为冷冻保护剂。70.在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述制剂包含冷冻保护剂，所述冷冻保护剂在所述制剂中的浓度为至少1％w/v，例如至少2％w/v、至少3％w/v、至少4％w/v、至少5％w/v、至少6％w/v、至少7％w/v或至少8％w/v。在一个实施方案中，所述冷冻保护剂在所述制剂中的浓度为最高25％w/v，例如最高20％w/c、最高19％w/v、最高18％w/v、最高17％w/v、最高16％w/v、最高15％w/v、最高14％w/v、最高13％w/v、最高12％w/v或最高11％w/v。在一个实施方案中，所述冷冻保护剂在所述制剂中的浓度为1％w/v至20％w/v，例如2％w/v至19％w/v、3％w/v至18％w/v、4％w/v至17％w/v、5％w/v至16％w/v、5％w/v至15％w/v、6％w/v至14％w/v、7％w/v至13％w/v、8％w/v至12％w/v、9％w/v至11％w/v或约10％w/v。在第一方面一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述制剂包含冷冻保护剂(特别是蔗糖和/或海藻糖)，其浓度为5％w/v至15％w/v，例如6％w/v至14％w/v，7％w/v至13％w/v，8％w/v至12％w/v，或9％w/v至11％w/v，或浓度为约10％w/v。71.在第一方面的一个优选实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个优选实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述制剂包含缓冲剂体系和冷冻保护剂，所述缓冲剂体系包含hepes作为缓冲物质，并且所述冷冻保护剂包含蔗糖和/或海藻糖，优选地以上述限定的浓度。72.在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述制剂还包含泊洛沙姆(poloxamer)。73.在第一方面的替代实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，特别地其中所述制剂包含hepes作为缓冲物质，所述制剂不包含泊洛沙姆。74.在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述阳离子可电离脂质包含含有至少一个能够在生理条件下被质子化的氮原子的头基。例如，阳离子可电离脂质可具有式(i)结构：[0075][0076]或其可药用盐、互变异构体、前药或立体异构体，[0077]其中l1、l2、g1、g2、g3、r1、r2和r3如本文中所限定。优选地，所述阳离子可电离脂质选自以下：结构i-1至i-36(本文中所示)；和/或结构a至f(本文中所示)；和/或n,n-二甲基-2,3-二油烯基氧基丙胺(dodma)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(dodap)、三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(dlin-mc3-dma)和4-((二((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)氨基)氧基)-n,n-二甲基-4-氧代丁烷-1-胺(dpl-14)。[0078]在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，lnp还包含一种或更多种另外的脂质。优选地，所述一种或更多种另外的脂质选自聚合物缀合的脂质、中性脂质、类固醇、及其组合。在第一方面的一个优选实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，lnp包含如本文中所述的阳离子可电离脂质、聚合物缀合的脂质(例如聚乙二醇化脂质或聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂物质的缀合物)、中性脂质(例如，dspc)和类固醇(例如，胆固醇)。[0079]在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述lnp还包含聚合物缀合的脂质作为一种或更多种另外的脂质之一，所述聚合物缀合的脂质是聚乙二醇化脂质。例如，所述聚乙二醇化脂质可具有以下结构：[0080][0081]或其可药用盐、互变异构体或立体异构体，[0082]其中r12、r13和w如本文中所限定。[0083]在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述lnp还包含聚合物缀合的脂质作为一种或更多种另外的脂质之一，所述聚合物缀合的脂质是聚肌氨酸-脂质缀合物或者聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物。例如，聚肌氨酸-脂质缀合物或者聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物可以是选自以下的成员：聚肌氨酸-二酰基甘油缀合物、聚肌氨酸-二烷氧基丙基缀合物、聚肌氨酸-磷脂缀合物、聚肌氨酸-神经酰胺缀合物、及其混合物。[0084]在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述lnp还包含中性脂质作为一种或更多种另外的脂质之一，所述中性脂质是磷脂。这样的磷脂优选地选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂。磷脂的一些特定实例包括二硬脂酰基磷脂酰胆碱(distearoylphosphatidylcholine，dspc)、二油酰基磷脂酰胆碱(dioleoylphosphatidylcholine，dopc)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(dimyristoylphosphatidylcholine，dmpc)、双十五烷酰基磷脂酰胆碱、二月桂酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(dipalmitoylphosphatidylcholine，dppc)、二花生酰基磷脂酰胆碱(diarachidoylphosphatidylcholine，dapc)、二山萮炔酰基磷脂酰胆碱(dibehenoylphosphatidylcholine，dbpc)、双二十三烷酰基磷脂酰胆碱(ditricosanoylphosphatidylcholine，dtpc)、双二十四酰基磷脂酰胆碱(dilignoceroylphatidylcholine，dlpc)、棕榈酰基油酰基-磷脂酰胆碱(palmitoyloleoyl-phosphatidylcholine，popc)、1,2-二-o-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0二醚pc)、1-油酰基-2-胆甾醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(ochemspc)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(c16lysopc)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(dioleoylphosphatidylethanolamine，dope)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(distearoyl-phosphatidylethanolamine，dspe)、二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺(dipalmitoyl-phosphatidylethanolamine，dppe)、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(dimyristoyl-phosphatidylethanolamine，dmpe)、二月桂酰基-磷脂酰乙醇胺(dilauroyl-phosphatidylethanolamine，dlpe)和二植烷酰基-磷脂酰乙醇胺(diphytanoyl-phosphatidylethanolamine，dpype)。[0085]在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述lnp还包含类固醇作为一种或更多种另外的脂质之一，所述类固醇是固醇例如胆固醇。[0086]在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述制剂还包含螯合剂，例如edta。在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述制剂包含螯合剂，所述螯合剂在所述制剂中的浓度为至多20mm，优选至多15mm，更优选至多10mm，更优选至多5mm。[0087]在第一方面的一个替代实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个替代实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述制剂不包含螯合剂。[0088]在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，阳离子可电离脂质与mrna之比为2:1至12:1，例如2:1至10:1，或4:1至8:1。[0089]在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述mrna包封在所述lnp之内或者与所述lnp缔合。[0090]在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，mrna包含替代尿苷的经修饰核苷。例如，经修饰核苷可选自假尿苷(ψ)、n1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5u)。[0091]在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述mrna包含以下中的一者或更多者：(a)5’帽；(b)5’utr；(c)3’utr；和(d)poly-a序列，例如包含至少100个核苷酸的poly-a序列。[0092]在第一方面的一个优选实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个优选实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述mrna编码一种或更多种多肽。例如，所述一种或更多种多肽可包含用于在对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位。在一个优选实施方案中，所述mrna编码包含sars-cov-2s蛋白、其免疫原性变体或者所述sars-cov-2s蛋白或所述其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列。[0093]在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，将所述制剂冷冻至温度范围为约-30℃至约-10℃，例如约-25℃至约-15℃，或约-25℃至约-20℃，或者冷冻至温度为约-20℃。[0094]在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述方法包括步骤(iii)将所述冷冻制剂冷冻干燥，所述冷冻制剂被冷冻干燥直至所述药物组合物基本上不含包含在所述冷冻制剂中的水。例如，所述冷冻制剂可被冷冻干燥直至所述药物组合物包含小于1.0重量％的水，例如小于0.8重量％、小于0.7重量％、小于0.6重量％、小于0.5重量％、小于0.4重量％、小于0.3重量％、小于0.2重量％或小于0.1重量％的水。[0095]在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，步骤(i)包括(a)制备包含水(特别是去离子水，例如注射用水)和缓冲剂体系的mrna溶液；(b)制备包含阳离子可电离脂质和(如果存在的话)一种或更多种另外的脂质的乙醇溶液；以及(c)将(a)中制备的mrna溶液与(b)中制备的乙醇溶液混合，从而制备包含lnp的制剂。为了去除不期望的组分(例如，乙醇)，在一个优选实施方案中，步骤(i)在步骤(c)之后还包括一个或更多个选自稀释和过滤(例如切向流过滤和/或渗滤)的步骤。在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，在步骤(i)(a)中制备的mrna溶液包含小于0.2％w/v，例如小于0.15％w/v、小于0.10％w/v、小于0.05％w/v或小于0.01％w/v的组合浓度的nacl和kcl。[0096]在第一方面的一个替代实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个替代实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，步骤(i)包括(a’)制备阳离子可电离脂质和如果存在的话一种或更多种另外的脂质在水相中的脂质体或胶体制备物；和(b’)制备包含水和缓冲剂体系的mrna溶液；以及(c’)将(a’)中制备的脂质体或胶体制备物与(b’)中制备的mrna溶液混合。在一个优选实施方案中，步骤(i)在步骤(c’)之后还包括一个或更多个稀释步骤。在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，在步骤(i)(b’)中制备的mrna溶液包含小于0.2％w/v，例如小于0.15％w/v、小于0.10％w/v、小于0.05％w/v或小于0.01％w/v的组合浓度的nacl和kcl。[0097]在第二方面中，本公开内容提供了储存药物组合物的方法，其包括根据第一方面的方法制备药物组合物，并将所述药物组合物储存在约-30℃或更高，例如约-25℃或更高的温度下。例如，可将冷冻的药物组合物储存在约-30℃至约-10℃，例如约-25℃至约-15℃或约-25℃至约-20℃的温度范围下，或约-20℃的温度下。可将冷冻干燥的药物组合物储存在约-25℃至约室温，例如约-15℃至约8℃、约-10℃至约2℃或约-5℃至约0℃的温度范围下。在第二方面的一个实施方案中，将药物组合物储存至少3个月，优选至少6个月，更优选至少12个月，更优选至少18个月，更优选至少24个月，更优选至少30个月，更优选至少36个月。[0098]应当理解，在第一方面的情况中本文中所述的任何实施方案(特别地，第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的任何实施方案，例如以上所列实施方案(1)至(45)中的任何实施方案)也可适用于第二方面的任何实施方案。[0099]在第三方面中，本公开内容提供了冷冻的药物组合物，其可通过第一方面的所述方法制备。在第三方面的一个实施方案中，所述药物组合物可储存在约-30℃或更高，例如约-25℃或更高的温度下。例如，第三方面的冷冻的药物组合物可储存在约-30℃至约-10℃，例如约-25℃至约-15℃或约-25℃至约-20℃的温度范围下，或约-20℃的温度下。在第三方面的一个实施方案中，药物组合物可储存至少3个月，优选至少6个月，更优选至少12个月，更优选至少18个月，更优选至少24个月，更优选至少30个月，更优选至少36个月。在第三方面的一个实施方案中，在将所述冷冻的药物组合物解冻之后所述lnp的尺寸(z平均值)为约50nm至约500nm。在第三方面的一个实施方案中，在将所述冷冻的药物组合物解冻之后所述lnp的尺寸(z平均值)(和/或尺寸分布和/或多分散性指数(polydispersityindex，pdi))等于在冷冻之前所述lnp的尺寸(z平均值)(和/或尺寸分布和/或pdi)。在第三方面的一个实施方案中，在将所述冷冻的药物组合物解冻之后所述lnp的pdi小于0.3，优选小于0.2，更优选小于0.1，例如小于0.05。在第三方面的一个实施方案中，在将所述冷冻的药物组合物解冻之后所述lnp的尺寸(z平均值)为约50nm至约500nm，并且在将所述冷冻的药物组合物解冻之后所述lnp的尺寸(z平均值)(和/或尺寸分布和/或pdi)等于在冷冻之前所述lnp的尺寸(z平均值)(和/或尺寸分布和/或pdi)。在第三方面的一个实施方案中，在将所述冷冻的药物组合物解冻之后所述lnp的尺寸(z平均值)为约50nm至约500nm，并且在将所述冷冻的药物组合物解冻之后所述lnp的pdi小于0.3(优选小于0.2，更优选小于0.1，例如小于0.05)。[0100]应当理解，在第一或第二方面的情况中本文中所述的任何实施方案(特别地，第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的任何实施方案，例如以上所列实施方案(1)至(45)中的任何实施方案)也可适用于第三方面的任何实施方案。[0101]在第四方面中，本公开内容提供了冷冻干燥的药物组合物，其可通过第二方面的方法制备。在第四方面的一个实施方案中，所述药物组合物可储存在约-30℃或更高，例如约-25℃或更高的温度下。例如，第四方面的冷冻干燥的药物组合物可储存在约-25℃至约室温，例如约-15℃至约8℃、约-10℃至约2℃或约-5℃至约0℃的温度下。在第四方面的一个实施方案中，所述药物组合物可储存至少3个月，优选至少6个月，更优选至少12个月，更优选至少18个月，更优选至少24个月，更优选至少30个月，更优选至少36个月。在第四方面的一个实施方案中，在将所述冷冻干燥的药物组合物重构之后所述lnp的尺寸(z平均值)为约50nm至约500nm。在第四方面的一个实施方案中，在将所述冷冻干燥的药物组合物重构之后所述lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi等于冷冻干燥之前所述lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi。在第四方面的一个实施方案中，在将所述冷冻干燥的药物组合物重构之后所述lnp的pdi小于0.3，优选小于0.2，更优选小于0.1，例如小于0.05。在第四方面的一个实施方案中，在将所述冷冻干燥的药物组合物重构之后所述lnp的尺寸(z平均值)为约50nm至约500nm，并且在将所述冷冻干燥的药物组合物重构之后所述lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi等于冷冻干燥之前所述lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi。在第四方面的一个实施方案中，在将所述冷冻干燥的药物组合物重构之后所述lnp的尺寸(z平均值)为约50nm至约500nm，并且在将所述冷冻干燥的药物组合物重构之后所述lnp的pdi小于0.3(优选小于0.2，更优选小于0.1，例如小于0.05)。[0102]应当理解，在第一、第二或第三方面的情况中本文中所述的任何实施方案(特别地，第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的任何实施方案，例如以上所列实施方案(1)至(45)中的任何实施方案)也可适用于第四方面的任何实施方案。[0103]在第五方面中，本公开内容提供了用于制备即用型药物组合物的方法，所述方法包括以下步骤：提供通过第一方面所述的方法制备的冷冻的药物组合物并将所述冷冻的药物组合物解冻，从而获得所述即用型药物组合物。[0104]应当理解，在第一、第二、第三或第四方面的情况中本文中所述的任何实施方案(特别地，第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的任何实施方案，例如以上所列实施方案(1)至(45)中的任何实施方案)也可适用于第五方面的任何实施方案。[0105]在第六方面中，本公开内容提供了用于制备即用型药物组合物的方法，所述方法包括以下步骤：提供通过第二方面的所述方法制备的冷冻干燥的药物组合物并将所述冷冻的药物组合物重构，从而获得所述即用型药物组合物。[0106]应当理解，在第一、第二、第三、第四或第五方面的情况中本文所述的任何实施方案(特别地，第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的任何实施方案，例如以上所列实施方案(1)至(45)中的任何实施方案)也可适用于第六方面的任何实施方案。[0107]在第七方面中，本公开内容提供了即用型药物组合物，其可通过第五或第六方面所述的方法制备。[0108]应当理解，在第一、第二、第三、第四、第五或第六方面的情况中本文所述的任何实施方案(特别地，第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的任何实施方案，例如以上所列实施方案(1)至(45)中的任何实施方案)也可适用于第七方面的任何实施方案。[0109]在第八方面中，本公开内容提供了包含lnp的药物组合物，其中所述lnp包含阳离子可电离脂质和mrna，并且其中以下中一者或更多者适用：[0110](i)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量，所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于0.20重量％；[0111](ii)所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka；[0112](iii)所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子；[0113](iv)所述药物组合物基本上不含无机磷酸阴离子，[0114]其中所述药物组合物是冷冻形式或冷冻干燥形式。[0115]在第八方面的一个实施方案中，基于所述药物组合物中脂质和mrna的总重量，所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，优选小于9重量、优选小于8重量、优选小于7重量、优选小于6重量、优选小于5重量、优选小于4重量、优选小于3重量、优选小于2重量、优选小于1重量、优选小于0.9重量、优选小于0.8重量、优选小于0.7重量、优选小于0.6重量、优选小于0.5重量、优选小于0.4重量、优选小于0.3重量、优选小于0.2重量、优选小于0.1重量。[0116]在第八方面的第一子组中，标准(i)至(iv)中的至少一者适用。例如，在该第一子组的一个实施方案中，基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量，至少所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％。在该第一子组的另一个实施方案中，在以水性液体形式时，至少所述药物组合物的ph低于阳离子可电离脂质的pka。在该第一子组的另一个实施方案中，至少所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子。在该第一子组的另一个实施方案中，至少所述药物组合物基本上不含无机磷酸阴离子。[0117]在第八方面的第二子组中，标准(i)至(iv)中的至少两者适用。例如，在该第二子组的一个实施方案中，基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量，至少所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka。在该第二子组的另一个实施方案中，基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量，至少所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且基本上不含柠檬酸阴离子。在该第二子组的另一个实施方案中，基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量，所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且基本上不含无机磷酸阴离子。在该第二子组的另一个实施方案中，在以水性液体形式时至少所述药物组合物的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka并且所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子。在该第二子组的另一个实施方案中，在以水性液体形式时，至少所述药物组合物的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka并且所述药物组合物基本上不含无机磷酸阴离子。在该第二子组的另一个实施方案中，至少所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子。[0118]在第八方面的第三子组中，标准(i)至(iv)中的至少三者适用。例如，在该第三子组的一个实施方案中，基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量，至少所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子。在第三子组的另一个实施方案中，基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量，至少所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含无机磷酸阴离子。在第三子组的另一个实施方案中，基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量，至少所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子。在该第三子组的另一个实施方案中，在以水性液体形式时，至少所述药物组合物的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka并且所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子。[0119]在第八方面的第四子组中，标准(i)至(iv)中的至少所有均适用。即，在该第四子组中，基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量，至少所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％、所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka并且所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子。[0120]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中)，所述药物组合物包含缓冲剂体系和/或冷冻保护剂。例如，在一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中)，所述药物组合物包含缓冲剂体系。在另一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的另一个实施方案中)，所述药物组合物包含冷冻保护剂。在另一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的另一个实施方案中)，所述药物组合物包含缓冲剂体系和冷冻保护剂。因此，这些实施方案中的一些具体实例为下：[0121](1)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且包含缓冲剂体系；[0122](2)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且包含冷冻保护剂；[0123](3)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且包含缓冲剂体系和冷冻保护剂；[0124](4)所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka并且所述药物组合物包含缓冲剂体系；[0125](5)所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka并且所述药物组合物包含冷冻保护剂；[0126](6)所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka并且所述药物组合物包含缓冲剂体系和冷冻保护剂；[0127](7)所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子并且包含缓冲剂体系；[0128](8)所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子并且包含冷冻保护剂；[0129](9)所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子并且包含缓冲剂体系和冷冻保护剂；[0130](10)所述药物组合物基本上不含无机磷酸阴离子并且包含缓冲剂体系；[0131](11)所述药物组合物基本上不含无机磷酸阴离子并且包含冷冻保护剂；[0132](12)所述药物组合物基本上不含无机磷酸阴离子，并且包含缓冲剂体系和冷冻保护剂；[0133](13)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且包含缓冲剂体系，并且所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka；[0134](14)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且包含冷冻保护剂体系，并且所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka；[0135](15)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且包含缓冲剂体系和冷冻保护剂，并且所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka；[0136](16)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，所述药物组合物包含缓冲剂体系并且基本上不含柠檬酸阴离子；[0137](17)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，所述药物组合物包含冷冻保护剂并且基本上不含柠檬酸阴离子；[0138](18)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，所述药物组合物包含缓冲剂体系和冷冻保护剂并且基本上不含柠檬酸阴离子；[0139](19)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且所述药物组合物包含缓冲剂体系且基本上不含无机磷酸阴离子；[0140](20)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且所述药物组合物包含冷冻保护剂并且基本上不含无机磷酸阴离子；[0141](21)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且所述药物组合物包含缓冲剂体系和冷冻保护剂并且基本上不含无机磷酸阴离子；[0142](22)所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子并且包含缓冲剂体系；[0143](23)所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子并且包含冷冻保护剂；[0144](24)所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子并且包含缓冲剂体系和冷冻保护剂；[0145](25)所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含无机磷酸阴离子并且包含缓冲剂体系；[0146](26)所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含无机磷酸阴离子并且包含冷冻保护剂；[0147](27)所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含无机磷酸阴离子并且包含缓冲剂体系和冷冻保护剂；[0148](28)所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子并且包含缓冲剂体系；[0149](29)所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子并且包含冷冻保护剂；[0150](30)所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子并且包含缓冲剂体系和冷冻保护剂；[0151](31)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且所述药物组合物包含缓冲剂体系，所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子；[0152](32)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且所述药物组合物包含冷冻保护剂，所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子；[0153](33)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且所述药物组合物包含缓冲剂体系和冷冻保护剂，所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子；[0154](34)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且所述药物组合物包含缓冲剂体系，所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含无机磷酸阴离子；[0155](35)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且所述药物组合物包含冷冻保护剂，所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含无机磷酸阴离子；[0156](36)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且所述药物组合物包含缓冲剂体系和冷冻保护剂，所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含无机磷酸阴离子；[0157](37)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，所述药物组合物包含缓冲剂体系，并且基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子；[0158](38)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，所述药物组合物包含冷冻保护剂，并且基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子；[0159](39)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，所述药物组合物包含缓冲剂体系和冷冻保护剂，并且基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子；[0160](40)所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子，并且所述药物组合物包含缓冲剂体系；[0161](41)所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子，并且所述药物组合物包含冷冻保护剂；[0162](42)所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子，并且所述药物组合物包含缓冲剂体系和冷冻保护剂；[0163](43)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且所述药物组合物包含缓冲剂体系，所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子；[0164](44)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且所述药物组合物包含冷冻保护剂，所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子；[0165](45)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且所述药物组合物包含缓冲剂体系和冷冻保护剂，所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子。[0166]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述药物组合物在以水性液体形式时其ph为至多6.5，优选至多6.4、至多6.3、至多6.2、至多6.1或至多6.0。在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述制剂的ph的范围为5.5至6.5，例如5.6至6.4、5.7至6.6、5.8至6.2或5.9至6.1。在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述制剂的ph为约6.0。[0167]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述药物组合物包含缓冲剂体系，所述缓冲剂体系包含水(特别是去离子水，例如注射用水)和缓冲物质。在一个实施方案中，缓冲剂体系包含hepes、组氨酸、tris和乙酸中的任一者作为缓冲物质，例如hepes、组氨酸和tris中的任一者作为缓冲物质。在一个优选实施方案中，缓冲剂体系包含hepes作为缓冲物质。在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述制剂包含缓冲剂体系，所述缓冲剂体系包含水(特别是去离子水，例如注射用水)和hepes作为缓冲物质。[0168]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述药物组合物包含缓冲剂体系，所述药物组合物中缓冲物质的量为每克的所述药物组合物中脂质和mrna的总重量至多4mmol，优选至多3.6mmol，更优选至多3.2mmol、更优选至多2.8mmol、更优选至多2.4mmol、更优选至多2.0mmol、至多1.8mmol。在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述药物组合物中缓冲物质的量为每克的所述药物组合物中脂质和mrna的总重量0.4mmol至4mmol，例如0.4mmol至3.2mmol、0.8mmol至2.8mmol、0.8mmol至2.4mmol、1.2mmol至2.0mmol或1.4mmol至1.6mmol。[0169]在第八方面的一个实施方案中(特别地，在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述药物组合物包含冷冻保护剂，所述冷冻保护剂包含一种或更多种碳水化合物。例如，所述冷冻保护剂可包含以下中的任一种：蔗糖、海藻糖、葡萄糖中或其组合。在第八方面的一个优选实施方案中(特别地，在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述药物组合物包含蔗糖和/或海藻糖作为冷冻保护剂。[0170]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述药物组合物包含冷冻保护剂，所述冷冻保护剂在所述药物组合物中的浓度为至少80重量％，例如至少81重量％，至少82重量％，至少83重量％、至少84重量％、至少85重量％或至少86重量％(优选地：(i)在所述药物组合物为冷冻形式的情况下，基于不包含所述药物组合物中任何溶剂的所述药物组合物的总量，或(ii)在所述药物组合物为冷冻干燥形式的情况下，基于所述药物组合物的总量)。在一个实施方案中，所述冷冻保护剂在所述药物组合物中的浓度为最高95重量％，例如最高94重量％、最高93重量％、最高92重量％、最高91重量％或最高90重量％或最高89重量％(优选地：(i)在所述药物组合物为冷冻形式的情况下，基于不包含所述药物组合物中任何溶剂的所述药物组合物的总量，或(ii)在所述药物组合物为冷冻干燥形式的情况下，基于所述药物组合物的总量)。在一个实施方案中，所述冷冻保护剂在所述药物组合物中的浓度为80重量％至95重量％、例如81重量％至94重量％、82重量％至93重量％、83重量％至92重量％、84重量％至91重量％、84重量％至91重量％、85重量％至91重量％、86重量％至91重量％、87重量％至91重量％、88重量％至89重量％、或约89重量％(优选地，(i)在所述药物组合物为冷冻形式的情况下，基于不包含所述药物组合物中任何溶剂的所述药物组合物的总量，或(ii)在所述药物组合物为冷冻干燥形式的情况下，基于所述药物组合物的总量)。在第八方面的一个优选实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述药物组合物包含冷冻保护剂(特别是蔗糖和/或海藻糖)，其浓度为85重量％至95重量％、例如，85重量％至94重量％、86重量％至93重量％、87重量％至92重量％、或88重量％至91重量％(优选地，(i)在所述药物组合物为冷冻形式的情况下，基于不包含所述药物组合物中任何溶剂的所述药物组合物的总量，或(ii)在所述药物组合物为冷冻干燥形式的情况下，基于所述药物组合物的总量)。[0171]在第八方面的一个优选实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个优选实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述药物组合物包含缓冲剂体系和冷冻保护剂，所述缓冲剂体系包含hepes作为缓冲物质，并且所述冷冻保护剂包含蔗糖和/或海藻糖，优选地以上述限定的量/浓度。[0172]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述药物组合物还包含泊洛沙姆。[0173]在第八方面的一个替代实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，特别地其中所述药物组合物包含hepes作为缓冲物质，所述药物组合物不包含泊洛沙姆。[0174]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述阳离子可电离脂质包含含有至少一个能够在生理条件下被质子化的氮原子的头基。例如，所述阳离子可电离脂质可以具有式(i)结构：[0175][0176]或其可药用盐、互变异构体、前药或立体异构体，[0177]其中l1、l2、g1、g2、g3、r1、r2和r3如本文中所限定。优选地，所述阳离子可电离脂质选自以下：结构i-1至i-36(本文中所示)；和/或结构a至f(本文中所示)；和/或n,n-二甲基-2,3-二油烯基氧基丙胺(dodma)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(dodap)、三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(dlin-mc3-dma)和4-((二((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)氨基)氧基)-n,n-二甲基-4-氧代丁烷-1-胺(dpl-14)。[0178]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述lnp还包含一种或更多种另外的脂质。优选地，所述一种或更多种另外的脂质选自聚合物缀合的脂质、中性脂质、类固醇、及其组合。在第八方面的一个优选实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述lnp包含如本文中所述的阳离子可电离脂质、聚合物缀合的脂质(例如，聚乙二醇化脂质或聚肌氨酸-脂质缀合物或者聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物)、中性脂质(例如dspc)和类固醇(例如胆固醇)。[0179]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述lnp还包含聚合物缀合的脂质作为一种或更多种另外的脂质之一，所述聚合物缀合的脂质是聚乙二醇化脂质。例如，聚乙二醇化脂质可具有以下结构：[0180][0181]或其可药用盐、互变异构体或立体异构体，[0182]其中r12、r13和w如本文中所限定。[0183]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述lnp还包含聚合物缀合的脂质作为一种或更多种另外的脂质之一，所述聚合物缀合的脂质是聚肌氨酸-脂质缀合物或者聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物。例如，聚肌氨酸-脂质缀合物或者聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物可以是选自以下的成员：聚肌氨酸-二酰基甘油缀合物、聚肌氨酸-二烷氧基丙基缀合物、聚肌氨酸-磷脂缀合物、聚肌氨酸-神经酰胺缀合物、及其混合物。[0184]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述lnp还包含中性脂质作为一种或更多种另外的脂质之一，所述中性脂质是磷脂。这样的磷脂优选地选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂。磷脂的一些特定实例包括二硬脂酰基磷脂酰胆碱(dspc)、二油酰基磷脂酰胆碱(dopc)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(dmpc)、双十五烷酰基磷脂酰胆碱、二月桂酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(dppc)、二花生酰基磷脂酰胆碱(dapc)、二山萮炔酰基磷脂酰胆碱(dbpc)、双二十三烷酰基磷脂酰胆碱(dtpc)、双二十四酰基磷脂酰胆碱(dlpc)、棕榈酰基油酰基-磷脂酰胆碱(popc)、1,2-二-o-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0二醚pc)、1-油酰基-2-胆甾醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(ochemspc)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(c16lysopc)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(dspe)、二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺(dppe)、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(dmpe)、二月桂酰基-磷脂酰乙醇胺(dlpe)和二植烷酰基-磷脂酰乙醇胺(dpype)。[0185]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述lnp还包含类固醇作为一种或更多种另外的脂质之一，所述类固醇是固醇，例如胆固醇。[0186]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述药物组合物还包含螯合剂，例如edta。在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述药物组合物包含螯合剂，所述药物组合物中所述螯合剂的量为每克的所述药物组合物中脂质和mrna的总重量至多0.8mmol，优选至多0.6mmol，更优选0.4mmol，更优选至多0.2mmol。[0187]在第八方面的一个替代实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个替代实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述药物组合物不包含螯合剂。[0188]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，阳离子可电离脂质与mrna之比为2:1至12:1，例如2:1至10:1，或4:1至8:1。[0189]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述mrna包封在所述lnp之内或者与所述lnp缔合。[0190]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述mrna包含替代尿苷的经修饰核苷。例如，经修饰核苷可选自假尿苷(ψ)、n1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5u)。[0191]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述mrna包含以下中的一种或更多种：(a)5’帽；(b)5’utr；(c)3’utr；和(d)poly-a序列，例如包含至少100个核苷酸的poly-a序列。[0192]在第八方面的一个优选实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个优选实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述mrna编码一种或更多种多肽。例如，所述一种或更多种多肽可以包含用于在对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位。在一个优选实施方案中，mrna编码包含sars-cov-2s蛋白、其免疫原性变体或者所述sars-cov-2s蛋白或所述其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列。[0193]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，将所述制剂冷冻至温度为约-30℃至约-10℃，例如约-25℃至约-15℃或约-25℃至约-20℃，或冷冻至温度为约-20℃。[0194]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述药物组合物可储存在约-30℃或更高，例如约-25℃或更高的温度下。例如，第八方面所述冷冻的药物组合物可储存在约-30℃至约-10℃，例如约-25℃至约-15℃或约-25℃至约-20℃的温度下，或储存在约-20℃的温度下。第八方面所述冷冻干燥的药物组合物可储存在约-25℃至约室温，例如约-15℃至约8℃、约-10℃至约2℃或约-5℃至约0℃的温度下。[0195]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述药物组合物可储存至少3个月、优选至少6个月、更优选至少12个月、更优选至少18个月、更优选至少24个月、更优选至少30个月、更优选至少36个月。[0196]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，在将所述冷冻的药物组合物解冻之后或在将所述冷冻干燥的药物组合物重构之后所述lnp的尺寸(z平均值)为约50nm至约500nm。[0197]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，在将所述冷冻的药物组合物解冻之后所述lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi等于冷冻之前lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi，或者在将所述冷冻干燥的药物组合物重构之后所述lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi等于冷冻干燥之前lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi。在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，在将所述冷冻的药物组合物解冻之后或在将所述冷冻干燥的药物组合物重构之后所述lnp的pdi小于0.3，优选小于0.2，更优选小于0.1，例如小于0.05。[0198]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，在将所述冷冻的药物组合物解冻之后或在将所述冷冻干燥的药物组合物重构之后所述lnp的尺寸(z平均值)为约50nm至约500nm，并且(i)在将所述冷冻的药物组合物解冻之后所述lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi等于冷冻之前lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi，或者(ii)在将所述冷冻干燥的药物组合物重构之后所述lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi等于冷冻干燥之前lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi。在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，在将所述冷冻的药物组合物解冻之后或在将所述冷冻干燥的药物组合物重构之后lnp的尺寸(z平均值)为约50nm至约500nm，并且在将所述冷冻的药物组合物解冻之后或在将所述冷冻干燥的药物组合物重构之后所述lnp的pdi小于0.3(优选小于0.2，更优选小于0.1，例如小于0.05)。[0199]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述药物组合物为冷冻干燥形式，所述药物组合物基本上不含水。例如，基于所述药物组合物的总重量，所述药物组合物可包含小于1.0重量％的水，例如小于0.8重量％、小于0.7重量％、小于0.6重量％、小于0.5重量％、小于0.4重量％、小于0.3重量％、小于0.2重量％或小于0.1重量％的水。[0200]应当理解，在第一、第二、第三、第四、第五、第六或第七方面的情况中本文所述的任何实施方案也可适用于第八方面的任何实施方案。[0201]在第九方面中，本公开内容提供了第三、第四、第七和第八方面中任一方面的药物组合物，其用于治疗。[0202]应当理解，在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七或第八方面的情况中本文所述的任何实施方案也可适用于第九方面的任何实施方案。[0203]在第十方面中，本公开内容提供了第三、第四、第七和第八方面中任一方面所述的药物组合物，其用于诱导免疫应答。[0204]应当理解，在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八或第九方面的情况中本文所述的任何实施方案也可适用于第十方面的任何实施方案。[0205]本发明中要求保护的方法允许在保持产物活性和品质的情况下稳定包含mrna和阳离子可电离脂质的lnp组合物。特别地，产品特征例如颗粒尺寸、组分完整性、产品的活性和安全性，应保持至少12个月，更好是24个月，甚至更好是36个月的储存时间。[0206]另一些分项的实施方案如下：[0207]1.用于制备药物组合物的方法，其包括以下步骤：[0208](i)制备包含脂质纳米粒(lnp)的制剂，其中所述lnp包含阳离子可电离脂质和mrna，并且其中以下中一者或更多者适用：[0209](i)步骤(i)不包括添加nacl和/或kcl[0210](ii)所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka；[0211](iii)所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子；[0212](iv)所述制剂基本上不含无机磷酸阴离子；以及[0213](ii)将所述制剂冷冻至约-10℃或低于-10℃，从而获得冷冻形式的所述药物组合物。[0214]2.项1所述的方法，其还包括步骤(iii)将所述冷冻制剂冷冻干燥，从而获得冷冻干燥形式的所述药物组合物。[0215]3.项1或2所述的方法，其中所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka。[0216]4.项1或2所述的方法，其中所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子。[0217]5.项1或2所述的方法，其中所述制剂基本上不含无机磷酸阴离子。[0218]6.项1或2所述的方法，其中所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子。[0219]7.项1或2所述的方法，其中所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述制剂基本上不含无机磷酸阴离子。[0220]8.项1或2所述的方法，其中所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子。[0221]9.项1或2所述的方法，其中所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子。[0222]10.项1至9中任一项所述的方法，其中步骤(i)不包括添加nacl。[0223]11.项1至9中任一项所述的方法，其中步骤(i)不包括添加kcl。[0224]12.项1至9中任一项所述的方法，其中步骤(i)不包括添加nacl和kcl。[0225]13.项1至12中任一项所述的方法，其中所述制剂包含缓冲剂体系和/或冷冻保护剂。[0226]14.项1至12中任一项所述的方法，其中所述制剂包含缓冲剂体系，并且所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka。[0227]15.项1至12中任一项所述的方法，其中所述制剂包含冷冻保护剂，并且所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka。[0228]16.项1至12中任一项所述的方法，其中所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述制剂包含缓冲剂体系和冷冻保护剂。[0229]17.项1至12中任一项所述的方法，其中所述制剂包含缓冲剂体系并且基本上不含柠檬酸阴离子。[0230]18.项1至12中任一项所述的方法，其中所述制剂包含冷冻保护剂并且基本上不含柠檬酸阴离子。[0231]19.项1至12中任一项所述的方法，其中所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子，并且包含缓冲剂体系和冷冻保护剂。[0232]20.项1至12中任一项所述的方法，其中所述制剂包含缓冲剂体系并且基本上不含无机磷酸阴离子。[0233]21.项1至12中任一项所述的方法，其中所述制剂包含冷冻保护剂并且基本上不含无机磷酸阴离子。[0234]22.项1至12中任一项所述的方法，其中所述制剂基本上不含无机磷酸阴离子，并且包含缓冲剂体系和冷冻保护剂。[0235]23.项1至12中任一项所述的方法，其中所述制剂包含缓冲剂体系，并且基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子。[0236]24.项1至12中任一项所述的方法，其中所述制剂包含冷冻保护剂并且基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子。[0237]25.项1至12中任一项所述的方法，其中所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子，并且包含缓冲剂体系和冷冻保护剂。[0238]26.项1至12中任一项所述的方法，其中所述制剂包含缓冲剂体系，所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子和/或基本上不含无机磷酸阴离子。[0239]27.项1至12中任一项所述的方法，其中所述制剂包含冷冻保护剂，所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子和/或基本上不含无机磷酸阴离子。[0240]28.项1至12中任一项所述的方法，其中所述制剂包含缓冲剂体系和冷冻保护剂，所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子和/或基本上不含无机磷酸阴离子。[0241]29.项1至28中任一项所述的方法，其中所述制剂的ph为至多6.5，优选至多6.0。[0242]30.项13至29中任一项所述的方法，其中所述缓冲剂体系包含水和缓冲物质。[0243]31.项13至30中任一项所述的方法，其中所述缓冲剂体系包含hepes、组氨酸、tris和乙酸中的任一者作为缓冲物质。[0244]32.项13至31中任一项所述的方法，其中所述缓冲剂体系包含hepes、组氨酸和tris中的任一者作为缓冲物质。[0245]33.项13至32中任一项所述的方法，其中所述缓冲剂体系包含hepes作为缓冲物质。[0246]34.项13至33中任一项所述的方法，其中所述缓冲剂在所述制剂中的浓度为至多50mm，优选至多40mm，更优选至多20mm。[0247]35.项13至34中任一项所述的方法，其中所述冷冻保护剂包含一种或更多种碳水化合物。[0248]36.项13至35中任一项所述的方法，其中所述冷冻保护剂包含蔗糖、海藻糖、葡萄糖、或其组合。[0249]37.项13至36中任一项所述的方法，其中所述冷冻保护剂包含蔗糖和/或海藻糖。[0250]38.项13至37中任一项所述的方法，其中所述冷冻保护剂在所述制剂中的浓度为至少1％w/v。[0251]39.项13至38中任一项所述的方法，其中所述缓冲剂体系包含hepes作为缓冲物质，并且所述冷冻保护剂包含蔗糖和/或海藻糖。[0252]40.项1至39中任一项所述的方法，其中所述制剂还包含泊洛沙姆。[0253]41.项33或39所述的方法，其中所述制剂不包含泊洛沙姆。[0254]42.项1至41中任一项所述的方法，其中所述阳离子可电离脂质包含含有至少一个能够在生理条件下被质子化的氮原子的头基。[0255]43.项1至42中任一项所述的方法，其中所述阳离子可电离脂质具有式(i)结构：[0256][0257]或其可药用盐、互变异构体、前药或立体异构体，[0258]其中：[0259]l1或l2中一者是-o(c＝o)-、-(c＝o)o-、-c(＝o)-、-o-、-s(o)x-、-s-s-、-c(＝o)s-、sc(＝o)-、-nrac(＝o)-、-c(＝o)nra-、nrac(＝o)nra-、-oc(＝o)nra-或-nrac(＝o)o-，并且l1或l2中另一者是–o(c＝o)-、-(c＝o)o-、-c(＝o)-、-o-、-s(o)x-、-s-s-、-c(＝o)s-、sc(＝o)-、-nrac(＝o)-、-c(＝o)nra-、nrac(＝o)nra-、-oc(＝o)nra-或-nrac(＝o)o-或者直接键；[0260]g1和g2各自独立地是未经取代的c1-c12亚烷基或c2-c12亚烯基；[0261]g3是c1-c24亚烷基、c2-c24亚烯基、c3-c8亚环烷基、c3-c8亚环烯基；[0262]ra是h或c1-c12烷基；[0263]r1和r2各自独立地是c6-c24烷基或c6-c24烯基；[0264]r3是h、or5、cn、-c(＝o)or4、-oc(＝o)r4或–nr5c(＝o)r4；[0265]r4是c1-c12烷基；[0266]r5是h或c1-c6烷基；并且[0267]x是0、1或2。[0268]44.项1至43中任一项所述的方法，其中所述阳离子可电离脂质选自本文示出的结构i-1至i-36。[0269]45.项1至42中任一项所述的方法，其中所述阳离子可电离脂质选自本文示出的结构a至f。[0270]46.项1至42中任一项所述的方法，其中所述阳离子可电离脂质选自n,n-二甲基-2,3-二油烯基氧基丙胺(dodma)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(dodap)、三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(dlin-mc3-dma)和4-((二((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)氨基)氧基)-n,n-二甲基-4-氧代丁烷-1-胺(dpl-14)。[0271]47.项1至46中任一项所述的方法，其中所述lnp还包含一种或更多种另外的脂质，优选地选自聚合物缀合的脂质、中性脂质、类固醇、及其组合。[0272]48.项1至47中任一项所述的方法，其中所述lnp包含所述阳离子可电离脂质、聚合物缀合的脂质、中性脂质和类固醇。[0273]49.项47或48所述的方法，其中所述聚合物缀合的脂质包含聚乙二醇化脂质。[0274]50.项49所述的方法，其中所述聚乙二醇化脂质具有以下结构：[0275][0276]或其可药用盐、互变异构体或立体异构体，[0277]其中：[0278]r12和r13各自独立地是直链或支链、饱和或不饱和的包含10至30个碳原子的烷基链，其中所述烷基链任选地间插有一个或更多个酯键；并且w具有范围为30至60的平均值。[0279]51.项47或48所述的方法，其中所述聚合物缀合的脂质包含聚肌氨酸-脂质缀合物或者聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物。[0280]52.项51所述的方法，其中所述聚肌氨酸-脂质缀合物或者聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物是选自以下的成员：聚肌氨酸-二酰基甘油缀合物、聚肌氨酸-二烷氧基丙基缀合物、聚肌氨酸-磷脂缀合物、聚肌氨酸-神经酰胺缀合物、及其混合物。[0281]53.项47至52中任一项所述的方法，其中所述中性脂质是磷脂，优选地选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸或鞘磷脂。[0282]54.项53所述的方法，其中所述磷脂选自二硬脂酰基磷脂酰胆碱(dspc)、二油酰基磷脂酰胆碱(dopc)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(dmpc)、双十五烷酰基磷脂酰胆碱、二月桂酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(dppc)、二花生酰基磷脂酰胆碱(dapc)、二山萮炔酰基磷脂酰胆碱(dbpc)、双二十三烷酰基磷脂酰胆碱(dtpc)、双二十四酰基磷脂酰胆碱(dlpc)、棕榈酰基油酰基-磷脂酰胆碱(popc)、1,2-二-o-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0二醚pc)、1-油酰基-2-胆甾醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(ochemspc)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(c16lysopc)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(dspe)、二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺(dppe)、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(dmpe)、二月桂酰基-磷脂酰乙醇胺(dlpe)和二植烷酰基-磷脂酰乙醇胺(dpype)。[0283]55.项47至54中任一项所述的方法，其中所述类固醇包含固醇，例如胆固醇。[0284]56.项1至55中任一项所述的方法，其中所述制剂还包含螯合剂。[0285]57.项56所述的方法，其中所述螯合剂在所述制剂中的浓度为至多20mm，优选至多10mm，更优选至多5mm。[0286]58.项56或57所述的方法，其中所述螯合剂是edta。[0287]59.项1至55中任一项所述的方法，其中所述制剂不包含螯合剂。[0288]60.项1至59中任一项所述的方法，其中所述阳离子可电离脂质与mrna之比为2:1至12:1。[0289]61.项1至60中任一项所述的方法，其中所述mrna包封在所述lnp之内或者与所述lnp缔合。[0290]62.项1至61中任一项所述的方法，其中所述mrna包含替代尿苷的经修饰核苷。[0291]63.项62所述的方法，其中所述经修饰核苷选自假尿苷(ψ)、n1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5u)。[0292]64.项1至63中任一项所述的方法，其中所述mrna包含5’帽。[0293]65.项1至64中任一项所述的方法，其中所述mrna包含5’utr。[0294]66.项1至65中任一项所述的方法，其中所述mrna包含3’utr。[0295]67.项1至66中任一项所述的方法，其中所述mrna包含poly-a序列。[0296]68.项67所述的方法，其中所述poly-a序列包含至少100个核苷酸。[0297]69.项1至68中任一项所述的方法，其中所述mrna编码一种或更多种多肽。[0298]70.项69所述的方法，其中所述一种或更多种多肽包含用于在对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位。[0299]71.项69或70所述的方法，其中所述mrna编码包含sars-cov-2s蛋白、其免疫原性变体或者所述sars-cov-2s蛋白或所述其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列。[0300]72.项1至71中任一项所述的方法，其中将所述制剂冷冻至温度为约-30℃至约-10℃，例如约-25℃至约-15℃或约-25℃至约-20℃，或者冷冻至温度为约-20℃。[0301]73.项2至72中任一项所述的方法，其中将所述冷冻制剂冷冻干燥，直至所述药物组合物基本上不含包含在所述冷冻制剂中的水。[0302]74.项73所述的方法，其中将所述冷冻制剂冷冻干燥，直至所述药物组合物包含少于1.0重量％的水。[0303]75.项1至74中任一项所述的方法，其中步骤(i)包括(a)制备包含水和缓冲剂体系的mrna溶液；(b)制备包含阳离子可电离脂质和如果存在的话一种或更多种另外的脂质的乙醇溶液；以及(c)将(a)中制备的mrna溶液与(b)中制备的乙醇溶液混合，从而制备所述包含lnp的制剂。[0304]76.项1至74中任一项所述的方法，其中步骤(i)包括(a’)制备所述阳离子可电离脂质和如果存在的话一种或更多种另外的脂质在水相中的脂质体或胶体制备物；和(b’)制备包含水和缓冲剂体系的mrna溶液；以及(c’)将(a’)中制备的脂质体或胶体制备物与(b’)中制备的mrna溶液混合。[0305]77.项75或76所述的方法，其中步骤(i)在步骤(c)或(c’)之后还包括一个或更多个选自稀释和过滤例如切向流过滤的步骤。[0306]78.储存药物组合物的方法，其包括根据项1至77中任一项所述的方法制备药物组合物，并将所述药物组合物储存在约-30℃至约-10℃，例如约-25℃至约-15℃或约-25℃至约-20℃的温度下，或者储存在约-20℃的温度下。[0307]79.项78所述的方法，其中将所述药物组合物储存至少3个月，优选至少12个月，更优选至少24个月，更优选至少36个月。[0308]80.冷冻的药物组合物，其可通过项1至79中任一项所述的方法制备。[0309]81.项80所述的药物组合物，其中在将所述冷冻的药物组合物解冻之后lnp的尺寸(z平均值)为约50nm至约500nm。[0310]82.项80或81所述的药物组合物，其中在将所述冷冻的药物组合物解冻之后lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或多分散性指数(pdi)等于冷冻之前lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi。[0311]83.冷冻干燥的药物组合物，其可通过项2至79中任一项所述的方法制备。[0312]84.项83所述的药物组合物，其中在将所述冷冻干燥的药物组合物重构之后lnp的尺寸(z平均值)为约50nm至约500nm。[0313]85.项83或84所述的药物组合物，其中在将所述冷冻干燥的药物组合物重构之后lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi等于冷冻干燥之前lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi。[0314]86.用于制备即用型药物组合物的方法，所述方法包括以下步骤：提供通过项1至79中任一项所述的方法制备的冷冻的药物组合物，并将所述冷冻的药物组合物解冻，从而获得所述即用型药物组合物。[0315]87.用于制备即用型药物组合物的方法，所述方法包括以下步骤：提供通过项2至79中任一项所述的方法制备的冷冻干燥的药物组合物，并将所述冷冻的药物组合物重构，从而获得所述即用型药物组合物。[0316]88.即用型药物组合物，其可通过项86或87所述的方法制备。[0317]89.药物组合物，其包含lnp，其中所述lnp包含阳离子可电离脂质和mrna，并且其中以下中一者或更多者适用：[0318](i)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量，所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％；[0319](ii)所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka；[0320](iii)所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子；[0321](iv)所述药物组合物基本上不含无机磷酸阴离子，[0322]其中所述药物组合物是冷冻形式或冷冻干燥形式。[0323]90.项89所述的药物组合物，其中基于所述药物组合物中脂质和mrna的总重量，所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于5重量％，优选小于1重量％。[0324]91.项89或90所述的药物组合物，其中所述制剂在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka。[0325]92.项89或90所述的药物组合物，其中所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子。[0326]93.项89或90所述的药物组合物，其中所述药物组合物基本上不含无机磷酸阴离子。[0327]94.项89或90所述的药物组合物，其中：[0328](1)所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子；[0329](2)所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含无机磷酸阴离子；[0330](3)所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子；或者[0331](4)所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子。[0332]95.项89至94中任一项所述的药物组合物，其中：[0333](1)所述药物组合物包含缓冲剂体系和/或冷冻保护剂；[0334](2)所述药物组合物包含缓冲剂体系，并且所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka；[0335](3)所述药物组合物包含冷冻保护剂，并且所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka；[0336](4)所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物包含缓冲剂体系和冷冻保护剂；[0337](5)所述药物组合物包含缓冲剂体系，并且基本上不含柠檬酸阴离子；[0338](6)所述药物组合物包含冷冻保护剂，并且基本上不含柠檬酸阴离子；[0339](7)所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子，并且包含缓冲剂体系和冷冻保护剂；[0340](8)所述药物组合物包含缓冲剂体系，并且基本上不含无机磷酸阴离子；[0341](9)所述药物组合物包含冷冻保护剂，并且基本上不含无机磷酸阴离子；[0342](10)所述药物组合物基本上不含无机磷酸阴离子，并且包含缓冲剂体系和冷冻保护剂；[0343](11)所述药物组合物包含缓冲剂体系，并且基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子；[0344](12)所述药物组合物包含冷冻保护剂，并且基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子；[0345](13)所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子，并且包含缓冲剂体系和冷冻保护剂；[0346](14)所述药物组合物包含缓冲剂体系，所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子和/或基本上不含无机磷酸阴离子；[0347](15)所述药物组合物包含冷冻保护剂，所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子和/或基本上不含无机磷酸阴离子；或者[0348](16)所述药物组合物包含缓冲剂体系和冷冻保护剂，所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子和/或基本上不含无机磷酸阴离子。[0349]96.项89至95中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物在以水性液体形式时其ph为至多6.5，优选至多6.0。[0350]97.项95或96所述的药物组合物，其中所述缓冲剂体系包含水和缓冲物质。[0351]98.项95至97中任一项所述的药物组合物，其中所述缓冲剂体系包含hepes、组氨酸、tris和乙酸中的任一者作为缓冲物质。[0352]99.项95至98中任一项所述的药物组合物，其中所述缓冲剂体系包含hepes、组氨酸和tris中的任一者作为缓冲物质。[0353]100.项95至99中任一项所述的药物组合物，其中所述缓冲剂体系包含hepes作为缓冲物质。[0354]101.项95至100中任一项所述的药物组合物，其中所述缓冲剂在所述药物组合物中的量为，药物组合物中每1克脂质和mrna总重量中至多4mmol，优选至多3.6mmol，更优选至多1.8mmol。[0355]102.项95至101中任一项所述的药物组合物，其中所述冷冻保护剂包含一种或更多种碳水化合物。[0356]103.项95至102中任一项所述的药物组合物，其中所述冷冻保护剂包含蔗糖、海藻糖、葡萄糖、或其组合。[0357]104.项95至103中任一项所述的药物组合物，其中所述冷冻保护剂包含蔗糖和/或海藻糖。[0358]105.项95至104中任一项所述的药物组合物，其中(i)在所述药物组合物为冷冻形式的情况下，基于不包含所述药物组合物中任何溶剂的所述药物组合物的总量，所述冷冻保护剂在所述药物组合物中的量为至少80重量％，或者(ii)在所述药物组合物为冷冻干燥形式的情况下，基于所述药物组合物的总量，所述冷冻保护剂在所述药物组合物中的量为至少80重量％。[0359]106.项95至105中任一项所述的药物组合物，其中所述缓冲剂体系包含hepes作为缓冲物质，并且所述冷冻保护剂包含蔗糖和/或海藻糖。[0360]107.项89至106中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含泊洛沙姆。[0361]108.项100或106所述的药物组合物，其中所述制剂不包含泊洛沙姆。[0362]109.项89至108中任一项所述的药物组合物，其中所述阳离子可电离脂质包含含有至少一个能够在生理条件下被质子化的氮原子的头基。[0363]110.项89至109中任一项所述的药物组合物，其中所述阳离子可电离脂质具有式(i)结构：[0364][0365]或其可药用盐、互变异构体、前药或立体异构体，[0366]其中：[0367]l1或l2中一者是-o(c＝o)-、-(c＝o)o-、-c(＝o)-、-o-、-s(o)x-、-s-s-、-c(＝o)s-、sc(＝o)-、-nrac(＝o)-、-c(＝o)nra-、nrac(＝o)nra-、-oc(＝o)nra-或-nrac(＝o)o-，并且l1或l2中另一者是–o(c＝o)-、-(c＝o)o-、-c(＝o)-、-o-、-s(o)x-、-s-s-、-c(＝o)s-、sc(＝o)-、-nrac(＝o)-、-c(＝o)nra-、nrac(＝o)nra-、-oc(＝o)nra-或-nrac(＝o)o-或者直接键；[0368]g1和g2各自独立地是未经取代的c1-c12亚烷基或c2-c12亚烯基；[0369]g3是c1-c24亚烷基、c2-c24亚烯基、c3-c8亚环烷基、c3-c8亚环烯基；[0370]ra是h或c1-c12烷基；[0371]r1和r2各自独立地是c6-c24烷基或c6-c24烯基；[0372]r3是h、or5、cn、-c(＝o)or4、-oc(＝o)r4或–nr5c(＝o)r4；[0373]r4是c1-c12烷基；[0374]r5是h或c1-c6烷基；并且[0375]x是0、1或2。[0376]111.项89至110中任一项所述的药物组合物，其中所述阳离子可电离脂质选自本文示出的结构i-1至i-36。[0377]112.项89至109中任一项所述的药物组合物，其中所述阳离子可电离脂质选自本文示出的结构a至f。[0378]113.项89至109中任一项所述的药物组合物，其中所述阳离子可电离脂质选自n,n-二甲基-2,3-二油烯基氧基丙胺(dodma)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(dodap)、三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(dlin-mc3-dma)和4-((二((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)氨基)氧基)-n,n-二甲基-4-氧代丁烷-1-胺(dpl-14)。[0379]114.项89至113中任一项所述的药物组合物，其中所述lnp还包含一种或更多种另外的脂质，优选地选自聚合物缀合的脂质、中性脂质、类固醇、及其组合。[0380]115.项89至114中任一项所述的药物组合物，其中所述lnp包含所述阳离子可电离脂质、聚合物缀合的脂质、中性脂质和类固醇。[0381]116.项114或115所述的药物组合物，其中所述聚合物缀合的脂质包含聚乙二醇化脂质。[0382]117.项116所述的药物组合物，其中所述聚乙二醇化脂质具有以下结构：[0383][0384]或其可药用盐、互变异构体或立体异构体，[0385]其中：[0386]r12和r13各自独立地是直链或支链、饱和或不饱和的包含10至30个碳原子的烷基链，其中所述烷基链任选地间插有一个或更多个酯键；并且w具有范围为30至60的平均值。[0387]118.项114或115所述的药物组合物，其中所述聚合物缀合的脂质包含聚肌氨酸-脂质缀合物或者聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物。[0388]119.项118所述的药物组合物，其中所述聚肌氨酸-脂质缀合物或者聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物是选自以下的成员：聚肌氨酸-二酰基甘油缀合物、聚肌氨酸-二烷氧基丙基缀合物、聚肌氨酸-磷脂缀合物、聚肌氨酸-神经酰胺缀合物、及其混合物。[0389]120.项114至119中任一项所述的药物组合物，其中所述中性脂质是磷脂，优选地选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸或鞘磷脂。[0390]121.项120所述的药物组合物，其中所述磷脂选自二硬脂酰基磷脂酰胆碱(dspc)、二油酰基磷脂酰胆碱(dopc)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(dmpc)、双十五烷酰基磷脂酰胆碱、二月桂酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(dppc)、二花生酰基磷脂酰胆碱(dapc)、二山萮炔酰基磷脂酰胆碱(dbpc)、双二十三烷酰基磷脂酰胆碱(dtpc)、双二十四酰基磷脂酰胆碱(dlpc)、棕榈酰基油酰基-磷脂酰胆碱(popc)、1,2-二-o-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0二醚pc)、1-油酰基-2-胆甾醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(ochemspc)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(c16lysopc)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(dspe)、二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺(dppe)、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(dmpe)、二月桂酰基-磷脂酰乙醇胺(dlpe)和二植烷酰基-磷脂酰乙醇胺(dpype)。[0391]122.项114至121中任一项所述的药物组合物，其中所述类固醇包含固醇，例如胆固醇。[0392]123.项89至122中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含螯合剂。[0393]124.项123所述的药物组合物，其中所述药物组合物中所述螯合剂的量为，药物组合物中每1克脂质和mrna总重量中至多0.8mmol，优选至多0.4mmol，更优选至多0.2mmol。[0394]125.项123或124所述的药物组合物，其中所述螯合剂是edta。[0395]126.项89至122中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物不包含螯合剂。[0396]127.项89至126中任一项所述的药物组合物，其中所述阳离子可电离脂质与mrna之比为2:1至12:1。[0397]128.项89至127中任一项所述的药物组合物，其中所述mrna包封在所述lnp之内或者与所述lnp缔合。[0398]129.项89至128中任一项所述的药物组合物，其中所述mrna包含替代尿苷的经修饰核苷。[0399]130.项129所述的药物组合物，其中所述经修饰核苷选自假尿苷(ψ)、n1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5u)。[0400]131.项89至130中任一项所述的药物组合物，其中所述mrna包含5’帽。[0401]132.项89至131中任一项所述的药物组合物，其中所述mrna包含5’utr。[0402]133.项89至132中任一项所述的药物组合物，其中所述mrna包含3’utr。[0403]134.项89至133中任一项所述的药物组合物，其中所述mrna包含poly-a序列。[0404]135.项134所述的药物组合物，其中所述poly-a序列包含至少100个核苷酸。[0405]136.项89至135中任一项所述的药物组合物，其中所述mrna编码一种或更多种多肽。[0406]137.项136所述的药物组合物，其中所述一种或更多种多肽包含用于在对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位。[0407]138.项136或137所述的药物组合物，其中所述mrna编码包含sars-cov-2s蛋白、其免疫原性变体或者所述sars-cov-2s蛋白或所述其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列。[0408]139.项89至138中任一项所述的药物组合物，其中所述冷冻的药物组合物冷冻并可储存于约-30℃至约-10℃，例如约-25℃至约-15℃的温度下，或者冷冻并可储存于约-20℃的温度下，或者所述冷冻干燥的药物组合物可储存于约-25℃至约室温，例如约-15℃至约8℃、约-10℃至约2℃或约-5℃至约0℃的温度下。[0409]140.项89至139中任一项所述的药物组合物，其中在将所述冷冻的药物组合物解冻之后或在将所述冷冻干燥的药物组合物重构之后所述lnp的尺寸(z平均值)为约50nm至约500nm。[0410]141.项89至140中任一项所述的药物组合物，其中(i)在将所述冷冻的药物组合物解冻之后所述lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi等于冷冻之前所述lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi，或者(ii)在将所述冷冻干燥的药物组合物重构之后所述lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi等于冷冻干燥之前所述lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi。[0411]142.项80至85和88至141中任一项所述的药物组合物，其用于治疗。[0412]143.项80至85和88至141中任一项所述的药物组合物，其用于诱导免疫应答。[0413]本文中公开了本公开内容的另一些方面。[0414]附图简述[0415]图1示出了来自以下的结果：(a)将包含lnp的六种lnp组合物冷冻在-20℃下，以及(b)将其储存不同的冻/融循环，其中组合物的不同之处在于制备lnp时所用的缓冲剂体系。[0416]图2示出了来自以下的结果：(a)将三种脂质复合物(lipoplex)组合物冷冻在-20℃下，以及(b)储存不同的冻/融循环，其中所述组合物的不同之处在于制备该组合物时所用的缓冲剂体系。[0417]图3示出了来自以下的结果：(a)将三种脂质复合物组合物冷冻在-20℃下，以及(b)储存不同的冻/融循环，其中组合物包含泊洛沙姆，但不同之处在于制备该组合物时所用的缓冲剂体系。[0418]图4示出了来自以下的结果：(a)将包含lnp的四种lnp组合物冷冻在-20℃下，以及(b)储存不同的冻/融循环，其中四种组合物的不同之处在于制备组合物时所用的阳离子可电离脂质(dodma、mc3-dma或dpl-14)。[0419]图5示出了来自以下的结果：(a)将包含lnp的三种lnp组合物冷冻在-20℃下，以及(b)储存不同的冻/融循环，其中所述组合物的不同之处在于其n/p比。[0420]图6示出了来自以下的结果：(a)将包含lnp的两种lnp组合物冷冻在-20℃下，以及(b)储存不同的冻/融循环，其中所述组合物的不同之处在于制备该组合物时所用的酸。[0421]图7示出了来自以下的结果：将包含lnp的三种lnp组合物储存在-20℃下，其中所述组合物的不同之处在于制备该组合物时所用的ph。[0422]图8示出了来自以下的结果：将包含lnp的四种lnp组合物储存在-20℃下，其中所述组合物的不同之处在于组合物中存在的edta的量。[0423]图9示出了适用于以脱水状态稳定lnp的冷冻干燥循环。[0424]图10示出了在(a)4℃、(b)25℃或(c)40℃的温度下，冷冻干燥的lnp的长期稳定性作为颗粒尺寸的函数。[0425]图11示出了冷冻干燥对以下的影响：lnp的特性作为所用缓冲剂体系的函数。[0426]图12示出了在-20℃下冷冻对分散在包含不同量蔗糖的水性介质中的脂质复合物的特性的影响。[0427]图13示出了批次1中在4、25和40℃下c12脂质纳米粒的颗粒尺寸随储存持续时间的变化。0个月时的时间点是指冷冻干燥过程之前的尺寸。[0428]图14示出了批次1中在4、25和40℃下c12脂质纳米粒的rna完整性随储存持续时间laboratorypress,coldspringharbor1989)。[0440]在整个本说明书和随附的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含/包括”以及变化形式将被理解为暗含包括所述的成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，但不排除任何其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组。术语“基本上由......组成”意指排除任何实质意义的其他成员、整数或步骤。术语“包含/包括”涵盖术语“基本上由......组成”，“基本上由......组成”反过来又涵盖术语“由......组成”。因此，在本技术中每次出现时，术语“包含/包括”可用术语“基本上由......组成”或“由......组成”代替。同样，在本技术中每次出现时，术语“基本上由......组成”可用术语“由......组成”代替。[0441]除非在本文中另外指明或与上下文明显矛盾，否则在描述本公开内容的上下文中(尤其是在权利要求的上下文中)使用的没有数量词修饰的名词及类似的引用解释为覆盖复数和单数二者。本文中对数值范围的记载仅旨在用作单独的提及落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非本文另外说明，否则每个单独值被并入说明书中，如同在本文中单独地记载一样。除非本文中另外指明或者与上下文明显矛盾，否则本文中描述的所有方法均可以以任何合适的顺序进行。本文中提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅旨在更好地说明本公开内容，并且不对另外要求保护的本公开内容的范围构成限制。本说明书中的语言均不应被解释为指明对实践本公开内容必需的任何未要求保护的要素。[0442]本文中使用的“和/或”被认为是两个指定特征或组分具有或不具有二者中另一者中的每一种的特定公开内容。例如“x和/或y”被认为是(i)x、(ii)y以及(iii)x和y中每一种的特定公开内容，就如同各自单独地在本文中列出一样。[0443]在本公开内容的上下文中，术语“约”表示本领域普通技术人员将理解的精度区间以仍然确保所讨论特征的技术效果。该术语通常表示与指定数值偏差±5％、±4％、±3％、±2％、±1％、±0.9％、±0.8％、±0.7％、±0.6％、±0.5％、±0.4％、±0.3％、±0.2％、±0.1％、±0.05％，例如±0.01％。如普通技术人员将理解的，对于给定技术效果的数值的特定的这样的偏差将取决于技术效果的性质。例如，天然的或生物的技术效果的这样的偏差通常可比人造的或改造的技术效果的偏差更大。[0444]本文中对数值范围的记载仅旨在用作单独的提及落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非本文另外说明，否则每个单独值被并入说明书中，如同在本文中单独地记载一样。[0445]在本说明书的全文中引用了若干文献。无论是上文还是下文，本文引用的每篇文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指南等)都在此通过引用整体并入。本文中的任何内容均不应被解释为承认本发明无权由于在先发明而先于这样的公开内容。[0446]定义[0447]下面将提供适用于本公开内容所有方面的定义。除非另外指出，否则以下术语具有以下含义。任何未经定义的术语均具有其本领域公认的含义。[0448]本文中使用的术语例如“降低”或“抑制”意指引起水平总体降低例如约5％或更多、约10％或更多、约15％或更多、约20％或更多、约25％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多或者约75％或更多的能力。术语“抑制”或类似短语包括完全或基本上完全抑制，即降低至零或基本上至零。[0449]在一个实施方案中，术语例如“提高”或“增强”涉及提高或增强至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约80％、或至少约100％。[0450]本文中使用的“生理ph”是指约7.5的ph。[0451]本公开内容中使用的“％w/v”是指按体积计的重量百分比，其是测量溶质的量(以克(g)计)的浓度单位，表示为溶液总体积(以毫升(ml)计)的百分比。[0452]本公开内容中使用的“重量％”是指重量百分比，其是测量物质量(以克(g)计)的浓度单位，表示为总组合物总重量(以克(g)计)的百分比。[0453]关于二价离子，特别是二价阳离子的存在，在一个实施方案中，其浓度或有效浓度(游离离子的存在)由于螯合剂的存在而足够低以防止rna的降解。在一个实施方案中，二价离子的浓度或有效浓度低于用于水解rna核苷酸之间磷酸二酯键的催化水平。在一个实施方案中，游离二价离子的浓度为20μm或更小。在一个实施方案中，不存在或基本上不存在游离二价离子。[0454]“渗量浓度(osmolality)”是指特定溶质的浓度，表示为每千克溶剂的溶质的渗透压摩尔数。[0455]术语“冷冻”涉及液体的固化，通常伴随着热量的去除。[0456]术语“冻干”及其变化形式是指通过将物质冷冻并随后降低周围压力(例如，低于15pa，例如低于10pa、低于5pa或1pa或更低)以使物质中的冷冻介质直接从固相升华至气相而进行的物质的冷冻干燥。因此，术语“冻干(lyophilizing)”和“冷冻干燥(freeze-drying)”在本文中可互换使用。[0457]术语“重构”涉及向干燥产品添加溶剂(例如水)以使其返回液体状态，例如其原始液体状态。[0458]在本公开内容的上下文中的术语“重组”意指“通过遗传改造制备的”。在一个实施方案中，在本公开内容的上下文中的“重组物质”不是天然存在的。[0459]本文中使用的术语“天然存在的”是指物体可在自然界中发现的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中并且可从天然来源分离且没有在实验室中被人有意修饰的肽或核酸是天然存在的。术语“在自然界中存在”意指“存在于自然界中”并且包括已知的物体以及尚未从自然界发现和/或分离但可在将来从天然来源发现和/或分离的物体。[0460]本文中使用的术语“室温”和“环境温度”在本文中可互换使用，并且是指至少约15℃，优选约15℃至约35℃、约15℃至约30℃、约15℃至约25℃、或约17℃至约22℃的温度。这样的温度将包括15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃和22℃。[0461]术语edta是指乙二胺四乙酸二钠盐。所有浓度都是针对edta二钠盐给出的。[0462]术语“烷基”是指饱和直链或支链烃的单价基团(monoradical)。优选地，烷基包含1至12个(例如1至10个)碳原子，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个碳原子，缩写为c1-12烷基，(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子，缩写为c1-10烷基)，更优选1至8个碳原子，例如1至6或1至4个碳原子。示例性烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基(也称为2-丙基或1-甲基乙基)、丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、1,2-二甲基-丙基、异戊基、正己基、异己基、仲己基、正庚基、异庚基、正辛基、2-乙基-己基、正壬基、正癸基、正十一烷基、正十二烷基等。“经取代烷基”意指亚烷基的一个或更多个(例如1至与烷基结合的氢原子的最大数目，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或多达10个，例如1至5、1至4、或1至3、或者1或2个)氢原子被除氢之外的取代基替代(当替代多于一个氢原子时，取代基可以是相同或不同的)。优选地，除氢以外的取代基是第一级取代基，如本文中所述。经取代烷基的一些实例包括氯甲基、二氯甲基、氟甲基和二氟甲基。[0463]术语“亚烷基”是指饱和直链或支链烃的双基团(diradical)。优选地，亚烷基包含1至12个(例如1至10个)碳原子，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个碳原子(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子)，更优选1至8个碳原子，例如1至6或1至4个碳原子。一些示例性亚烷基包括亚甲基、亚乙基(即，1,1-亚乙基、1,2-亚乙基)、亚丙基(即，1,1-亚丙基、1,2-亚丙基(-ch(ch3)ch2-)、2,2-亚丙基(-c(ch3)2-)和1,3-亚丙基)、亚丁基异构体(例如，1,1-亚丁基、1,2-亚丁基、2,2-亚丁基、1,3-亚丁基、2,3-亚丁基(顺式或反式或其混合物)、1,4-亚丁基、1,1-异亚丁基、1,2-异亚丁基和1,3-异亚丁基)、亚戊基异构体(例如，1,1-亚戊基、1,2-亚戊基、1,3-亚戊基、1,4-亚戊基、1,5-亚戊基、1,1-异亚戊基、1,1-仲戊基、1,1-新戊基)、亚己基异构体(例如，1,1-亚己基、1,2-亚己基、1,3-亚己基、1,4-亚己基、1,5-亚己基、1,6-亚己基和1,1-异亚己基)、亚庚基异构体(例如，1,1-亚庚基、1,2-亚庚基、1,3-亚庚基、1,4-亚庚基、1,5-亚庚基、1,6-亚庚基、1,7-亚庚基和1,1-异亚庚基)、亚辛基异构体(例如，1,1-亚辛基、1,2-亚辛基、1,3-亚辛基、1,4-亚辛基、1,5-亚辛基、1,6-亚辛基、1,7-亚辛基、1,8-亚辛基和1,1-异亚辛基)等。每端具有至少3个碳原子和自由价的直链亚烷基部分也可称为亚甲基的倍数(例如，1,4-亚丁基也可称为四亚甲基)。通常，作为使用上述亚烷基部分的结尾“ylene(亚基)”的替代，还可使用结尾“diyl(二基)”(例如，1,2-亚丁基也可以称为丁烷-1,2-二基)。“经取代亚烷基”意指亚烷基的一个或更多个(例如1至与亚烷基结合的氢原子的最大数目，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或多达10个，例如1至5、1至4、1至3、或1或2个)氢原子被除氢之外的取代基替代(当多于一个氢原子被替代时，则取代基可相同或不同)。优选地，除氢以外的取代基是第一级取代基，如本文中所述。[0464]术语“烯基”是指具有至少一个碳-碳双键的不饱和直链或支链烃的单价基团。一般而言，烯基中碳-碳双键的最大数目可等于通过将烯基中碳原子的数目除以2而计算得到的整数，并且如果烯基中碳原子的数目是奇数，则将除法结果舍入到下一整数。例如，对于具有9个碳原子的烯基，碳-碳双键的最大数目为4。优选地，烯基具有1至6个(例如1至4个)，即1、2、3、4、5或6个碳-碳双键。优选地，烯基包含2至12个(例如2至10个)碳原子，即2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个碳原子(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子)，更优选2至8个碳原子，例如2至6个碳原子或2至4个碳原子。因此，在一个优选实施方案中，烯基包含2至12个碳原子(缩写为c2-12烯基)，(例如2至10个)碳原子，和1、2、3、4、5或6个(例如，1、2、3、4或5个)碳-碳双键，更优选地，其包含2至8个碳原子和1、2、3或4个碳-碳双键，例如2至6个碳原子和1、2或3个碳-碳双键或者2至4个碳原子和1或2个碳-碳双键。碳-碳双键可呈顺式(z)或反式(e)构型。一些示例性烯基包括乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基(即，烯丙基)、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基、1-庚烯基、2-庚烯基、3-庚烯基、4-庚烯基、5-庚烯基、6-庚烯基、1-辛烯基、2-辛烯基、3-辛烯基、4-辛烯基、5-辛烯基、6-辛烯基、7-辛烯基、1-壬烯基、2-壬烯基、3-壬烯基、4-壬烯基、5-壬烯基、6-壬烯基、7-壬烯基、8-壬烯基、1-癸烯基、2-癸烯基、3-癸烯基、4-癸烯基、5-癸烯基、6-癸烯基、7-癸烯基、8-癸烯基、9-癸烯基、1-十一碳烯基、2-十一碳烯基、3-十一碳烯基、4-十一碳烯基、5-十一碳烯基、6-十一碳烯基、7-十一碳烯基、8-十一碳烯基、9-十一碳烯基、10-十一碳烯基、1-十二碳烯基、2-十二碳烯基、3-十二碳烯基、4-十二碳烯基、5-十二碳烯基、6-十二碳烯基、7-十二碳烯基、8-十二碳烯基、9-十二碳烯基、10-十二碳烯基、11-十二碳烯基等。如果烯基与氮原子连接，则双键不可在氮原子的α位。“经取代烯基”意指烯基的一个或更多个(例如1至与烯基结合的氢原子的最大数目，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或多达10个，例如1至5、1至4、或1至3、或1或2个)氢原子被除氢之外的取代基替代(当多于一个氢原子被替代时，则取代基可以是相同或不同的)。优选地，除氢以外的取代基是第一级取代基，如本文中所述。[0465]术语“亚烯基”是指具有至少一个碳-碳双键的不饱和直链或支链烃的双基团。一般而言，亚烯基中碳-碳双键的最大数目可等于通过将亚烯基中碳原子的数目除以2而计算得到的整数，并且如果亚烯基中碳原子的数目是奇数，则将除法结果舍入到下一整数。例如，对于具有9个碳原子的亚烯基，碳-碳双键的最大数目为4。优选地，亚烯基具有1至6个(例如1至4个)，即1、2、3、4、5或6个碳-碳双键。优选地，亚烯基包含2至12个(例如2至10个)碳原子，即2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个碳原子(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子)，更优选2至8个碳原子，例如2至6个碳原子或2至4个碳原子。因此，在一个优选实施方案中，亚烯基包含2至12个(例如2至10个)碳原子和1、2、3、4、5或6个(例如，1、2、3、4或5个)碳-碳双键，更优选地，其包含2至8个碳原子和1、2、3或4个碳-碳双键，例如2至6个碳原子和1、2或3个碳-碳双键或者2至4个碳原子和1或2个碳-碳双键。碳-碳双键可呈顺式(z)或反式(e)构型。一些示例性亚烯基包括乙烯-1,2-二基、乙烯叉(vinylidene)(也称为亚乙烯基(ethenylidene))、1-丙烯-1,2-二基，1-丙烯-1,3-二基，1-丙烯-2,3-二基、烯丙基、1-丁烯-1,2-二基、1-丁烯-1,3-二基、1-丁烯-1,4-二基、1-丁烯-2,3-二基、1-丁烯-2,4-二基、1-丁烯-3,4-二基、2-丁烯-1,2-二基、2-丁烯-1,3-二基、2-丁烯-1,4-二基、2-丁烯-2,3-二基、2-丁烯-2,4-二基、2-丁烯-3,4-二基等。如果亚烯基与氮原子连接，则双键不可在氮原子的α位。“经取代亚烯基”意指亚烯基的一个或更多个(例如1至与亚烯基结合的氢原子的最大数目，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或多达10个，例如1至5、1至4、或1至3、或1或2个)氢原子被除氢之外的取代基替代(当多于一个氢原子被替代时，取代基可以是相同或不同的)。优选地，除氢以外的取代基是第一级取代基，如本文中所述。[0466]术语“亚环烷基”表示“亚烷基”的环状非芳族形式，并且是成对的、邻位的或分离的双基团。在某些实施方案中，亚环烷基(i)是单环或多环(例如双环或三环)和/或(ii)是3至14元(即，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14元，例如3至12元或3至10元)。在一个实施方案中，亚环烷基是单、双或三环3至14元(即，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14元，例如3至12元或3至10元)亚环烷基。通常，作为使用上述亚环烷基部分的结尾“亚基”的替代，还可使用结尾“二基”(例如，1,2-环亚丙基也可称为环丙烷-1,2-二基)。一些示例性的亚环烷基包括亚环己基、亚环庚基、亚环丙基、亚环丁基、亚环戊基、亚环辛基、双亚环[3.2.1]辛基、双亚环[3.2.2]壬基和亚金刚烷基(例如，三环[3.3.1.13,7]癸烷-2,2-二基)。“经取代亚环烷基”意指亚烷基的一个或更多个(例如1至与亚环烷基结合的氢原子的最大数目，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或多达10个，例如1至5、1至4、或1至3、或1或2个)氢原子被除氢之外的取代基替代(当多于一个氢原子被替代时，取代基可以是相同或不同的)。优选地，除氢以外的取代基是第一级取代基，如本文中所述。[0467]术语“亚环烯基”表示“亚烯基”的环状非芳族形式，并且是成对的、邻位的或分离的双基团。一般而言，亚环烯基中碳-碳双键的最大数目可等于通过将亚环烯基中碳原子的数目除以2而计算得到的整数，并且如果亚环烯基中碳原子的数目是奇数，则将除法结果舍入到下一整数。例如，对于具有9个碳原子的亚环烯基，碳-碳双键的最大数目为4。优选地，亚环烯基具有1至6个(例如1至4个)，即1、2、3、4、5或6个碳-碳双键。在某些实施方案中，亚环烯基(i)是单环或多环(例如双环或三环)和/或(ii)是3至14元(即，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14元，例如3至12元或3至10元)。在一个实施方案中，亚环烯基是单、双或三环3至14元(即，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14元，例如3至12元或3至10元)亚环烯基。一些示例性的亚环烯基包括亚环己烯、亚环庚烯、亚环丙烯、亚环丁烯、亚环戊烯和亚环辛烯。“经取代亚环烯基”意指亚环烯基的一个或更多个(例如1至与亚环烯基结合的氢原子的最大数目，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或多达10个，例如1至5、1至4、或1至3、或1或2个)氢原子被除氢之外的取代基替代(当多于一个氢原子被替代时，取代基可以是相同或不同的)。优选地，除氢以外的取代基是第一级取代基，如本文中所述。[0468]在烃的上下文中使用的术语“芳族”意指整个分子必须是芳族的。例如，如果单环芳基被氢化(部分或完全)，则出于本公开内容的目的，将所得氢化环状结构分类为环烷基。同样地，如果双环或多环芳基(例如萘基)被氢化，则出于本公开内容的目的，将所得氢化双环或多环结构(例如1,2-二氢萘基)分类为环烷基(即使一个环(例如在1,2-二氢萘基中)仍为芳香族的)。[0469]典型的第一级取代基优选选自c1-3烷基、苯基、卤素、-cf3、-oh、-och3、-sch3、-nh2-z(ch3)z、-c(＝o)oh和-c(＝o)och3，其中z是0、1或2，并且c1-3烷基是甲基、乙基、丙基或异丙基。特别优选的第一级取代基选自甲基、乙基、丙基、异丙基、卤素(例如f、cl或br)和-cf3，例如卤素(例如f、cl或br)和-cf3。[0470]在冷冻的药物组合物的情况中本文中使用的表述“在将冷冻的药物组合物解冻之后”意指在可进行测量特征(例如药物组合物中包含的lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi)之前，必须解冻冷冻的药物组合物。[0471]在冷冻干燥的药物组合物的情况中本文中使用的表述“在将冷冻干燥的药物组合物重构之后”意指在可进行测量特征(例如药物组合物中包含的lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi)之前，必须重构冷冻干燥的药物组合物(例如，通过添加去离子水例如注射用水)。[0472]在冷冻或冷冻干燥的药物组合物的情况中本文中使用的表述“在药物组合物以水性液体形式时其ph”意指在可测量药物组合物的ph之前，必须解冻冷冻的药物组合物并任选地用水(或水性介质)稀释，或者必须重构冷冻干燥的药物组合物(例如，通过添加去离子水例如注射用水)。[0473]术语“冷冻保护剂”涉及添加至制剂以在冷冻阶段期间保护活性成分的物质。[0474]根据本公开内容，术语“肽”包括寡肽和多肽，并且是指包含通过肽键彼此连接的约两个或更多个、约3个或更多个、约4个或更多个、约6个或更多个、约8个或更多个、约10个或更多个、约13个或更多个、约16个或更多个、约20个或更多个，并且最高约50个、约100个、或约150个连续氨基酸的物质。术语“蛋白质”是指大肽，特别是具有至少约151个氨基酸的肽，但是术语“肽”和“蛋白质”在本文中通常作为同义词使用。[0475]“治疗性蛋白质”当以治疗有效量向对象提供时，对该对象的病症或疾病状态具有积极或有利作用。在一个实施方案中，治疗性蛋白质具有治愈性或姑息治疗性特性并且可被施用以改善、缓解、减轻、逆转疾病或病症、延迟疾病或病症发作，或者减轻疾病或病症的一种或更多种症状的严重程度。治疗性蛋白质可具有预防特性，并且可用于延迟疾病发作或减轻这样的疾病或病理状况的严重程度。术语“治疗性蛋白质”包括完整的蛋白质或肽，并且也可指其治疗活性片段。其还可包括蛋白质的治疗活性变体。治疗活性蛋白质的一些实例包括但不限于用于疫苗接种的抗原以及免疫刺激剂(例如细胞因子)。[0476]根据本公开内容，优选的是编码肽或蛋白质的核酸(例如mrna)一旦被细胞摄取或者引入(即转染或转导)到细胞中，则导致所述肽或蛋白质的表达，所述细胞可存在于体外或对象中。细胞可在胞内(例如在胞质中和/或在细胞核中)表达编码的肽或蛋白质，可分泌编码的肽或蛋白质，或者可在表面上表达编码的肽或蛋白质。[0477]根据本公开内容，术语例如“表达……的核酸”和“编码……的核酸”或类似术语在本文中可互换使用，并且对于特定的肽或多肽，意指所述核酸，如果存在于合适的环境中，优选在细胞内，可被表达以产生所述肽或多肽。[0478]术语“部分(portion)”是指小部分(fraction)。对于例如氨基酸序列或蛋白质的特定结构，术语其“部分”可指所述结构的连续或不连续小部分。[0479]术语“一部分(part)”和“片段”在本文中可互换使用，并且是指连续元件。例如，结构(例如氨基酸序列或蛋白质)的一部分是指所述结构的连续元件。当在组合物的上下文中使用时，术语“部分”意指组合物的一部分。例如，组合物的一部分可以是所述组合物的0.1％至99.9％(例如0.1％、0.5％、1％、5％、10％、50％、90％或99％)的任何部分。[0480]关于氨基酸序列(肽或蛋白质)，“片段”是指氨基酸序列的一部分，即代表在n端和/或c端缩短的氨基酸序列的序列。在c端缩短的片段(n端片段)可例如通过翻译缺少开放阅读框的3’端的截短的开放阅读框来获得。在n端缩短的片段(c端片段)可例如通过翻译缺少开放阅读框的5’端的截短的开放阅读框来获得，只要截短的开放阅读框包含用于开始翻译的起始密码子即可。氨基酸序列的片段包含来自氨基酸序列的例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的氨基酸残基。氨基酸序列的片段优选地包含来自氨基酸序列的至少6个、特别地至少8个、至少12个、至少15个、至少20个、至少30个、至少50个或至少100个连续氨基酸。[0481]根据本公开内容，肽或蛋白质的一部分或片段优选地具有其所来源的肽或蛋白质的至少一种功能特性。这样的功能特性包括药理活性、与其他肽或蛋白质的相互作用、酶活性、与抗体的相互作用以及核酸的选择性结合。例如，肽或蛋白质的药理活性片段具有片段所来源的肽或蛋白质的至少一种药理活性。肽或蛋白质的一部分或片段优选地包含肽或蛋白质的至少6个，特别是至少8个、至少10个、至少12个、至少15个、至少20个、至少30个或至少50个连续氨基酸的序列。肽或蛋白质的一部分或片段优选地包含肽或蛋白质的最高8个，特别是最高10个、最高12个、最高15个、最高20个、最高30个或最高55个连续氨基酸的序列。[0482]本文中的“变体”意指由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本氨基酸序列的氨基酸序列。亲本氨基酸序列可以是天然存在的或野生型(wildtype，wt)氨基酸序列，或者可以是野生型氨基酸序列的经修饰形式。优选地，变体氨基酸序列与亲本氨基酸序列相比具有至少一个氨基酸修饰，例如与亲本相比具有1至约20个氨基酸修饰，并且优选1至约10或1至约5个氨基酸修饰。[0483]本文中的“野生型”或“wt”或“天然的”意指在自然界中存在的氨基酸序列，包括等位基因变化。野生型氨基酸序列、肽或蛋白质具有未经有意修饰的氨基酸序列。[0484]出于本公开内容的目的，氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)的“变体”包括氨基酸插入变体、氨基酸添加变体、氨基酸缺失变体和/或氨基酸替换变体。术语“变体”包括所有突变体、剪接变体、翻译后修饰的变体、构象体(conformation)、同种型、等位基因变体、物种变体和物种同源物，特别是天然存在的那些。术语“变体”特别地包括氨基酸序列的片段。[0485]氨基酸插入变体包括在特定氨基酸序列中单个或两个或更多个氨基酸的插入。在具有插入的氨基酸序列变体的情况下，一个或更多个氨基酸残基插入到氨基酸序列中的特定位点中，但是随机插入并对所得产物进行合适的筛选也是可以的。氨基酸添加变体包括一个或更多个氨基酸(例如1、2、3、5、10、20、30、50或更多个氨基酸)的氨基端和/或羧基端融合。氨基酸缺失变体的特征在于从序列中去除一个或更多个氨基酸，例如，去除1、2、3、5、10、20、30、50或更多个氨基酸。缺失可在蛋白质的任何位置中。包含蛋白质n端和/或c端末端缺失的氨基酸缺失变体也称为n端和/或c端截短变体。氨基酸替换变体的特征在于去除序列中的至少一个残基，并且在其位置插入另一个残基。优选在同源蛋白质或肽之间氨基酸序列中的非保守的位置处进行修饰和/或将氨基酸用具有类似特性的其他氨基酸替代。优选地，肽和蛋白质变体中的氨基酸变化是保守的氨基酸变化，即，类似带电荷或不带电荷氨基酸的替换。保守的氨基酸变化涉及在其侧链中相关的氨基酸家族之一的替换。天然存在的氨基酸一般分为四个家族：酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和不带电荷的极性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时一起被归类为芳族氨基酸。在一个实施方案中，保守氨基酸替换包括以下组内的替换：[0486]-甘氨酸，丙氨酸；[0487]-缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；[0488]-天冬氨酸，谷氨酸；[0489]-天冬酰胺，谷氨酰胺；[0490]-丝氨酸，苏氨酸；[0491]-赖氨酸，精氨酸；以及[0492]-苯丙氨酸，酪氨酸。[0493]优选地，给定氨基酸序列与作为所述给定氨基酸序列的变体的氨基酸序列之间的相似性，优选同一性的程度将为至少约60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％。相似性或同一性的程度优选地针对为参考氨基酸序列的全长的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的氨基酸区域给出。例如，如果参考氨基酸序列由200个氨基酸组成，则相似性或同一性的程度优选地针对至少约20个、至少约40个、至少约60个、至少约80个、至少约100个、至少约120个、至少约140个、至少约160个、至少约180个或约200个氨基酸，在一些实施方案中为连续氨基酸给出。在一些实施方案中，相似性或同一性的程度针对参考氨基酸序列的全长给出。用于确定序列相似性，优选序列同一性的比对可使用本领域已知的工具，优选地使用最佳序列比对，例如，使用align，使用标准设置，优选emboss::needle，matrix:blosum62，gapopen10.0，gapextend0.5来进行。[0494]“序列相似性”表示相同的或代表保守氨基酸替换的氨基酸的百分比。两个氨基酸序列之间的“序列同一性”表示所述序列之间相同的氨基酸的百分比。两个核酸序列之间的“序列同一性”表示所述序列之间相同的核苷酸的百分比。[0495]术语“％相同”和“％同一性”或类似术语特别地旨在是指待比较的序列之间在最佳比对中相同的核苷酸或氨基酸的百分比。所述百分比是纯统计学的，并且两个序列之间的差异可以(但不一定)是随机分布在待比较序列的整个长度上。两个序列的比较通常在关于区段或“比较窗口”进行最佳比对以鉴定相应序列的局部区域之后通过比较所述序列来进行。用于比较的最佳比对可人工进行，或者借助于smithandwaterman,1981,adsapp.math.2,482的局部同源性算法，借助于needlemanandwunsch,1970,j.mol.biol.48,443的局部同源性算法，借助于pearsonandlipman,1988,proc.natlacad.sci.usa88,2444的相似性检索算法，或借助于使用所述算法的计算机程序(gap、bestfit、fasta、blastp、blastn和tfasta，wisconsingeneticssoftwarepackage,geneticscomputergroup,575sciencedrive,madison,wis.)来进行。在一些实施方案中，使用可在美国国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation，ncbi)网站获得的blastn或blastp算法(例如，blast，ncbi·nlm·nih·gov/blast·cgi？page_type＝blastsearch&blast_spec＝blast2seq&ijnk_loc＝ahgn2seq)来确定两个序列的同一性百分比。在一些实施方案中，在ncbi网站上blastn算法使用的算法参数包括：(i)预期阈值设置为10；(ii)字长设置为28；(iii)查询范围内的最大匹配设置为0；(iv)匹配/不匹配评分设置为1、-2；(v)空位成本(gapcost)设置为线性；以及(vi)针对正在使用的低复杂性区域的筛选程序(filter)。在一些实施方案中，在ncbi网站上blastp算法使用的算法参数包括：(i)预期阈值设置为10；(ii)字长设置为3；(iii)查询范围内的最大匹配设置为0；(iv)矩阵设置为blosum62；(v)空位成本设置为存在11:延伸:1；以及(vi)条件组成评分矩阵调整。[0496]同一性百分比通过确定待比较序列所对应的相同位置的数目，将该数目除以所比较位置的数目(例如，参考序列中的位置数目)，并将该结果乘以100来获得。[0497]在一些实施方案中，相似性或同一性程度针对为参考序列全长的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的区域给出。例如，如果参考核酸序列由200个核苷酸组成，则同一性程度针对至少约100、至少约120、至少约140、至少约160、至少约180或约200个核苷酸，在一些实施方案中为连续核苷酸给出。在一些实施方案中，相似性或同一性程度针对参考序列的全长给出。[0498]根据本公开内容，同源氨基酸序列显示出氨基酸残基的至少40％，特别地至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，并且优选至少95％、至少98％或至少99％同一性。[0499]本文中所述的氨基酸序列变体可由技术人员例如通过重组dna操作来容易地制备。用于制备具有替换、添加、插入或缺失的肽或蛋白质的dna序列的操作在例如sambrooketal.(1989)中详细描述。此外，本文中所述的肽和氨基酸变体可借助于已知的肽合成技术例如如通过固相合成和类似方法来容易地制备。[0500]在一个实施方案中，氨基酸序列(肽或蛋白质)的片段或变体优选是“功能片段”或“功能变体”。术语氨基酸序列的“功能片段”或“功能变体”涉及表现出与该片段或变体所来源的氨基酸序列的功能特性相同或相似的一个或更多个功能特性(即，其是功能等同的)的任何片段或变体。关于抗原或抗原性序列，一种特定的功能是由该片段或变体所来源的氨基酸序列表现的一种或更多种免疫原性活性。本文中使用的术语“功能片段”或“功能变体”特别地是指这样的变体分子或序列，其包含与亲本分子或序列的氨基酸序列相比改变了一个或更多个氨基酸并且仍然能够实现亲本分子或序列的一种或更多种功能(例如诱导免疫应答)的氨基酸序列。在一个实施方案中，亲本分子或序列的氨基酸序列中的修饰不显著影响或改变分子或序列的特征。在不同的实施方案中，功能片段或功能变体的功能可降低，但仍然显著存在，例如，功能变体的免疫原性可以是亲本分子或序列的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。然而，在另一些实施方案中，与亲本分子或序列相比，功能片段或功能变体的免疫原性可以是增强的。[0501]“来源于”指定氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)的氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)是指第一氨基酸序列的来源。优选地，来源于特定氨基酸序列的氨基酸序列具有与该特定序列或其片段相同、基本上相同或同源的氨基酸序列。来源于特定氨基酸序列的氨基酸序列可以是该特定序列或其片段的变体。例如，本领域普通技术人员将理解，适用于本文中的抗原可被改变，使得它们的序列与它们所来源的天然存在或天然的序列不同，同时保留天然序列的期望活性。[0502]“分离的”意指从天然状态中改变或脱离天然状态。例如，天然存在于活的动物中的核酸或肽不是“分离的”，但从其天然状态的共存物质中部分或完全分离的同样的核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或者可存在于非天然环境，例如如宿主细胞中。在一个优选实施方案中，本公开内容中使用的mrna是基本上纯化的形式。在一个实施方案中，以基本上纯化形式的mrna的溶液(优选水溶液)包含小于0.2％w/v，例如小于0.15％w/v、小于0.10％w/v、小于0.05％w/v或小于0.01w/v之组合浓度的nacl和kcl。[0503]术语“遗传修饰”或简称“修饰”包括用核酸转染细胞。术语“转染”涉及将核酸，特别是rna引入到细胞中。出于本公开内容的目的，术语“转染”还包括将核酸引入到细胞中或由这样的细胞对核酸的摄取，其中细胞可存在于对象例如患者中。因此，根据本公开内容，用于转染本文中所述核酸的细胞可存在于体外或体内，例如，细胞可形成患者的器官、组织和/或生物体的一部分。根据本公开内容，转染可以是瞬时的或稳定的。对于转染的一些应用，如果仅瞬时表达所转染的遗传物质就已足够。可将rna转染到细胞中以瞬时表达其编码的蛋白质。由于在转染过程中引入的核酸通常不会整合到核基因组中，因此外源核酸将通过有丝分裂而被稀释或者降解。允许核酸进行游离扩增的细胞大大降低了稀释率。如果期望所转染的核酸实际上保留在细胞及其子细胞的基因组中，则必须发生稳定的转染。这样的稳定转染可通过使用用于转染的基于病毒的系统或基于转座子的系统来实现。一般而言，将编码抗原的核酸瞬时转染到细胞中。可将rna转染到细胞中以瞬时表达其编码的蛋白质。[0504]根据本公开内容，肽或蛋白质的类似物是其所来源的所述肽或蛋白质的经修饰形式，并且具有所述肽或蛋白质的至少一种功能特性。例如，肽或蛋白质的药理活性类似物具有类似物所来源的肽或蛋白质的至少一种药理活性。这样的修饰包括任何化学修饰，并且包括与蛋白质或肽缔合的任何分子例如碳水化合物、脂质和/或蛋白质或肽的单个或多个替换、缺失和/或添加。在一个实施方案中，蛋白质或肽的“类似物”包括由糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、棕榈酰化、肉豆蔻酰化、异戊二烯化、脂化、烷基化、衍生化、引入保护/封闭基团、蛋白水解切割或者与抗体或其他细胞配体结合得到的那些经修饰形式。术语“类似物”还延伸到所述蛋白质和肽的所有功能化学等同物。[0505]本文中使用的“活化”或“刺激”是指已被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的免疫效应细胞(例如t细胞)的状态。活化也可与信号传导途径的启动、诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能有关。术语“活化的免疫效应细胞”尤其是指正在经历细胞分裂的免疫效应细胞。[0506]术语“致敏”是指其中免疫效应细胞例如t细胞首次与其特异性抗原接触并导致分化成效应细胞例如效应t细胞的过程。[0507]术语“克隆扩增”或“扩增”是指其中特定实体倍增的过程。在本公开内容的上下文中，该术语优选地在免疫应答的情况下使用，在所述免疫应答中免疫效应细胞被抗原刺激，增殖，并且识别所述抗原的特异性免疫效应细胞扩增。优选地，克隆扩增导致免疫效应细胞的分化。[0508]根据本公开内容的“抗原”涵盖将引起免疫应答的任何物质和/或免疫应答或免疫机制(例如细胞应答)所针对的任何物质。这也包括其中抗原被加工成抗原肽并且免疫应答或免疫机制针对一种或更多种抗原肽的情况，特别是如果在mhc分子的情况下呈递的话。特别地，“抗原”涉及与抗体或t淋巴细胞(t细胞)特异性反应的任何物质，优选肽或蛋白质。根据本公开内容，术语“抗原”包括包含至少一个表位(例如t细胞表位)的任何分子。优选地，在本公开内容的上下文中的抗原是任选地在加工之后诱导免疫反应的分子，该免疫反应优选地针对该抗原(包括表达该抗原的细胞)具有特异性。在一个实施方案中，抗原是疾病相关抗原，例如肿瘤抗原、病毒抗原或细菌抗原，并且表位来源于这样的抗原。[0509]根据本公开内容，可使用作为免疫应答的候选物的任何合适的抗原，其中免疫应答可以是体液免疫应答和细胞免疫应答二者。在本公开内容的一些实施方案的情况下，抗原优选由细胞呈递，优选由抗原呈递细胞呈递(在mhc分子的情况下)，其导致针对抗原的免疫应答。抗原优选是对应于或来源于天然存在的抗原的产物。这样的天然存在的抗原可包括或可以来源于变应原、病毒、细菌、真菌、寄生物和其他感染原和病原体，或者抗原也可以是肿瘤抗原。根据本公开内容，抗原可对应于天然存在的产物，例如病毒蛋白质，或其一部分。[0510]术语“疾病相关抗原”以其最广泛的含义使用，是指与疾病相关的任何抗原。疾病相关抗原是这样的分子：其包含将刺激宿主的免疫系统以产生针对该疾病的细胞抗原特异性免疫应答和/或体液抗体应答的表位。疾病相关抗原包括病原体相关抗原，即，与由微生物感染相关的抗原，通常为微生物抗原(例如细菌或病毒抗原)，或与癌症相关的抗原，通常为肿瘤，例如肿瘤抗原。[0511]在一个优选实施方案中，抗原是肿瘤抗原，即，肿瘤细胞的一部分，特别是主要存在于胞内或作为肿瘤细胞表面抗原的抗原。在另一个实施方案中，抗原是病原体相关抗原，即，来源于病原体的抗原，例如，来源于病毒、细菌、单细胞生物或寄生物的抗原，例如病毒抗原(例如病毒核糖核蛋白或外壳蛋白)。特别地，抗原应由mhc分子呈递，其导致免疫系统的细胞，特别是cd4 和cd8 淋巴细胞的调节，特别是活化，特别是通过对t细胞受体的活性的调节。[0512]术语“肿瘤抗原”是指癌细胞的成分，其可来源于细胞质、细胞表面或细胞核。特别地，它是指在胞内产生或在肿瘤细胞上作为表面抗原产生的那些抗原。例如，肿瘤抗原包括癌胚抗原、α1-胎蛋白、异铁蛋白和胎儿磺基糖蛋白、α2-h-铁蛋白和γ-胎蛋白，以及多种病毒肿瘤抗原。根据本公开内容，肿瘤抗原优选地包含肿瘤或癌症的特征性的以及就类型和/或表达水平而言肿瘤或癌细胞特征性的任何抗原。[0513]术语“病毒抗原”是指具有抗原特性，即，能够在个体中引起免疫应答的任何病毒组分。病毒抗原可以是病毒核糖核蛋白或包膜蛋白。[0514]术语“细菌抗原”是指具有抗原特性，即，能够在个体中引起免疫应答的任何细菌成分。细菌抗原可来源于细菌的细胞壁或细胞质膜。[0515]术语“表位”是指分子(例如抗原)中的抗原决定簇，即，分子中被免疫系统识别，例如被t细胞或b细胞识别的一部分或片段，特别是当在mhc分子的情况下呈递时。蛋白质的表位优选地包含所述蛋白质的连续或不连续部分，并且长度优选约5至约100个氨基酸，优选约5至约50、更优选约8至约0、最优选约10至约25个氨基酸，例如，表位的长度可优选9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。特别优选的是在本公开内容的上下文中的表位是t细胞表位。[0516]术语例如“表位”、“抗原片段”、“免疫原性肽”和“抗原肽”在本文中可互换使用，并且优选地涉及抗原的不完整表示，其优选地能够引发针对抗原或者表达或包含并且优选呈递抗原的细胞的免疫应答。优选地，该术语涉及抗原的免疫原性部分。优选地，其为抗原的被t细胞受体识别(即，特异性结合)的部分，特别是如果在mhc分子的情况下呈递的话。某些优选的免疫原性部分与mhci类或ii类分子结合。术语“表位”是指分子(例如抗原)中被免疫系统识别的部分或片段。例如，表位可被t细胞、b细胞或抗体识别。抗原的表位可包含抗原的连续或不连续部分，并且长度可为约5至约100，例如约5至约50，更优选约8至约30，最优选约8至约25个氨基酸，例如表位的长度可优选为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在一个实施方案中，表位的长度为约10至约25个氨基酸。术语“表位”包括t细胞表位。[0517]术语“t细胞表位”是指当在mhc分子的情况下呈递时被t细胞识别的蛋白质的部分或片段。术语“主要组织相容性复合体”和缩写“mhc”包括i类mhc和ii类mhc分子，并且涉及存在于所有脊椎动物中的基因复合体。mhc蛋白或分子对于免疫反应中淋巴细胞与抗原呈递细胞或病变细胞之间的信号传导是重要的，其中mhc蛋白或分子结合肽表位并呈递它们以被t细胞上的t细胞受体识别。由mhc编码的蛋白质在细胞表面上表达，并将自身抗原(来自细胞本身的肽片段)和非自身抗原(例如，入侵微生物的片段)二者展示给t细胞。在i类mhc/肽复合物的情况下，结合肽通常约8至约10个氨基酸长，但是更长或更短的肽可以是有效的。在ii类mhc/肽复合体的情况下，结合肽通常约10至约25个氨基酸长，并且特别地约13至约18个氨基酸长，然而更长和更短的肽也可以是有效的。[0518]肽和蛋白质抗原的长度可以为2至100个氨基酸，包括例如5个氨基酸、10个氨基酸、15个氨基酸、20个氨基酸、25个氨基酸、30个氨基酸、35个氨基酸、40个氨基酸、45个氨基酸或50个氨基酸。在一些实施方案中，肽可大于50个氨基酸。在一些实施方案中，肽可大于100个氨基酸。[0519]肽或蛋白质抗原可以是可诱导免疫系统产生针对该肽或蛋白质的抗体和t细胞应答的能力或将该能力提高的任何肽或蛋白质。[0520]在一个实施方案中，疫苗抗原，即接种到对象体内诱导免疫应答的抗原，被免疫效应细胞识别。优选地，疫苗抗原如果被免疫效应细胞识别，则能够在存在适当的共刺激信号的情况下，诱导携带识别疫苗抗原的抗原受体的免疫效应细胞的刺激、致敏和/或扩增。在本公开内容实施方案的上下文中，疫苗抗原优选呈递或存在于细胞(优选抗原呈递细胞)的表面上。在一个实施方案中，抗原由病变细胞(例如肿瘤细胞或受感染细胞)呈递。在一个实施方案中，抗原受体是与在mhc的情况下呈递的抗原的表位结合的tcr。在一个实施方案中，当由t细胞表达和/或存在于t细胞上的tcr与由细胞例如抗原呈递细胞呈递的抗原的结合导致所述t细胞的刺激、致敏和/或扩增。在一个实施方案中，当由t细胞表达和/或存在于t细胞上的tcr与在病变细胞上呈递的抗原的结合导致病变细胞的细胞溶解和/或凋亡，其中所述t细胞优选地释放细胞毒性因子，例如，穿孔蛋白和颗粒酶。[0521]在一个实施方案中，抗原受体是与抗原中的表位结合的抗体或b细胞受体。在一个实施方案中，抗体或b细胞受体与抗原的天然表位结合。[0522]术语“在细胞表面上表达”或“与细胞表面缔合”意指分子(例如抗原)与细胞质膜缔合并位于细胞质膜，其中该分子的至少一部分朝向所述细胞的胞外空间并且可例如通过位于细胞外部的抗体从所述细胞的外部接近。在该情况下，部分为优选至少4个、优选至少8个、优选至少12个、更优选至少20个氨基酸。该缔合可以是直接的或间接的。例如，该缔合可以是通过一个或更多个跨膜结构域、一个或更多个脂质锚，或者是通过与可在细胞质膜外小叶上存在的任何其他蛋白质、脂质、糖类或其他结构的相互作用。例如，与细胞表面缔合的分子可以是具有胞外部分的跨膜蛋白，或者可以是通过与另一种是跨膜蛋白的蛋白质相互作用而与细胞表面缔合的蛋白质。[0523]“细胞表面”或“细胞的表面”根据其在本领域中的通常含义使用，并因此包括可通过蛋白质和其他分子结合可及的细胞外部。如果抗原位于细胞的表面并且可通过例如添加至所述细胞的抗原特异性抗体的结合可及，则所述抗原在所述细胞的表面上表达。[0524]在本公开内容的上下文中，术语“胞外部分”或“胞外结构域”是指朝向细胞的胞外空间并且优选地从所述细胞的外部可及(例如通过位于细胞外部的结合分子，例如抗体)的分子(例如，蛋白质)的一部分。优选地，该术语是指一个或更多个胞外环或结构域或者其片段。[0525]术语“t细胞”和“t淋巴细胞”在本文中可互换使用并且包括t辅助细胞(cd4 t细胞)和包括溶细胞性t细胞的细胞毒性t细胞(ctl，cd8 t细胞)。术语“抗原特异性t细胞”或类似术语涉及识别t细胞所靶向的抗原的t细胞，特别是当在mhc分子的情况下呈递在抗原呈递细胞或病变细胞(例如癌细胞)的表面上时，并且优选地发挥t细胞的效应子功能。如果t细胞杀伤表达抗原的靶细胞，则认为该t细胞对抗原具有特异性。可使用例如在铬释放测定或增殖测定内的多种标准技术中的任一种来评价t细胞特异性。或者，可测量淋巴因子(例如干扰素γ)的合成。在本公开内容的某些实施方案中，rna(特别是mrna)编码至少一个表位。[0526]术语“靶标”应意指作为免疫应答(例如细胞免疫应答)的靶标的物质，例如细胞或组织。靶标包括呈递抗原或抗原表位(即来源于抗原的肽片段)的细胞。在一个实施方案中，靶细胞是表达抗原并优选用i类mhc呈递所述抗原的细胞。[0527]“抗原加工”是指抗原降解成作为所述抗原的片段的加工产物(例如，蛋白质降解成肽)，以及这些片段中的一个或更多个与mhc分子缔合(例如通过结合)，以用于由细胞(优选抗原呈递细胞)呈递至特定的t细胞。[0528]“抗原应答性ctl”意指对由抗原呈递细胞表面的i类mhc呈递的抗原或来源于所述抗原的肽具有应答性的cd8 t细胞。[0529]根据本公开内容，ctl应答性可包括持续的钙通量、细胞分裂、细胞因子(例如ifn-γ和tnf-α)产生、活化标志物(例如cd44和cd69)上调、以及肿瘤抗原表达靶细胞的特异性细胞裂解性杀伤。ctl应答性也可使用精确指示ctl应答性的人工报告物来确定。[0530]术语“免疫应答”和“免疫反应”在本文中按其常规含义可互换使用，并且是指对抗原的整体身体应答，并且优选地是指细胞免疫应答、体液免疫应答或二者。根据本公开内容，关于物质(例如抗原、细胞或组织)的术语“对......的免疫应答”或“针对......的免疫应答”涉及针对所述物质的免疫应答，例如细胞应答。免疫应答可包括选自以下的一种或更多种反应：产生针对一种或更多种抗原的抗体和抗原特异性t淋巴细胞(优选cd4 和cd8 t淋巴细胞，更优选cd8 t淋巴细胞)的扩增，其可在体外的多种增殖或细胞因子产生测试中检测。[0531]在本公开内容的上下文中，术语“诱导免疫应答”和“引起免疫应答”和类似术语是指免疫应答的诱导，优选细胞免疫应答、体液免疫应答或二者的诱导。免疫应答可以是保护性/预先性/预防性和/或治疗性的。免疫应答可针对任何免疫原或抗原或抗原肽，优选针对肿瘤相关抗原或病原体相关抗原(例如，病毒(例如流感病毒(a、b或c)、cmv或rsv)的抗原)。在这种情况下，“诱导”可意指在诱导之前没有针对特定抗原或病原体的免疫应答，但其也可意指在诱导之前存在一定水平的针对特定抗原或病原体的免疫应答，并且在诱导之后，所述免疫应答增强。因此，在这种情况下，“诱导免疫应答”也包括“增强免疫应答”。优选地，在个体中诱导免疫应答之后，所述个体被保护免于发展疾病，例如感染性疾病或癌性疾病，或者通过诱导免疫应答来改善疾病状况。[0532]术语“细胞免疫应答”、“细胞应答”、“细胞介导的免疫”或类似术语意在包括针对以表达抗原和/或用mhci类或ii类呈递抗原为特征之细胞的细胞应答。细胞应答与称为t细胞或t淋巴细胞的细胞有关，这些细胞充当“辅助者”或“杀手”。辅助t细胞(也称为cd4 t细胞)通过调节免疫应答来发挥中心作用，并且杀伤细胞(也称为细胞毒性t细胞、细胞裂解性t细胞、cd8 t细胞或ctl)杀伤细胞(例如病变细胞)。[0533]术语“体液免疫应答”是指活生物体中的过程，其中响应于物质和生物体而产生抗体，所述抗体最终中和和/或消除所述物质和生物体。抗体应答的特异性由t和/或b细胞通过结合单一特异性的抗原的膜缔合受体介导的。在结合适当的抗原以及接收多种其他活化信号之后，b淋巴细胞分裂，这产生了记忆b细胞以及分泌抗体的浆细胞克隆，每个克隆产生识别与其抗原受体所识别的相同的抗原表位的抗体。记忆b淋巴细胞保持休眠状态，直至其随后被其特异性抗原活化。当再次暴露于特异性抗原时，这些淋巴细胞提供了记忆的细胞基础，并导致抗体应答的迅速增加。[0534]本文中使用的术语“抗体”是指能够与抗原上的表位特异性结合的免疫球蛋白分子。特别地，术语“抗体”是指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(heavy，h)链和两条轻(light，l)链的糖蛋白。术语“抗体”包括单克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体以及前述任意的组合。每条重链包含重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)。每条轻链包含轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)。可变区和恒定区在本文中也分别称为可变结构域和恒定结构域。vh和vl区可以进一步细分成称为互补决定区(complementaritydeterminingregion，cdr)的高变区，散布有称为框架区(frameworkregion，fr)的更保守的区域。每个vh和vl由从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列的三个cdr和四个fr构成：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。vh的cdr称为hcdr1、hcdr2和hcdr3，vl的cdr称为lcdr1、lcdr2和lcdr3。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区包含重链恒定区(ch)和轻链恒定区(cl)，其中ch可以进一步细分成恒定结构域ch1、铰链区以及恒定结构域ch2和ch3(从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：ch1、ch2、ch3)。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(c1q)。抗体可以是来源于天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫活性部分。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。抗体可以以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、fv、fab和f(ab)2，以及单链抗体和人源化抗体。[0535]术语“免疫球蛋白”涉及免疫球蛋白超家族的蛋白质，优选涉及抗原受体，例如抗体或b细胞受体(bcellreceptor，bcr)。免疫球蛋白的特征在于具有特征性免疫球蛋白(immunoglobulin，ig)折叠的结构性结构域(即免疫球蛋白结构域)。该术语涵盖膜结合的免疫球蛋白以及可溶性免疫球蛋白。膜结合的免疫球蛋白也称为表面免疫球蛋白或膜免疫球蛋白，其通常是bcr的一部分。可溶性免疫球蛋白通常称为抗体。免疫球蛋白通常包含通过二硫键连接的数条链，通常是两条相同的重链和两条相同的轻链。这些链主要由免疫球蛋白结构域构成，所述免疫球蛋白结构域例如vl(可变轻链)结构域、cl(恒定轻链)结构域、vh(可变重链)结构域和ch(恒定重链)结构域ch1、ch2、ch3和ch4。存在五种类型的哺乳动物免疫球蛋白重链，即α、δ、ε、γ和μ，其是不同种类的抗体(即，iga、igd、ige、igg和igm)的原因。与可溶性免疫球蛋白的重链相反，膜或表面免疫球蛋白的重链在其羧基末端包含跨膜结构域和短的胞质结构域。在哺乳动物中，有两种类型的轻链，即λ和κ。免疫球蛋白链包含可变区和恒定区。恒定区在免疫球蛋白的不同同种型内是基本上保守的，其中可变部分是高度多样化的并且负责抗原识别。[0536]术语“疫苗接种”和“免疫接种”描述了出于治疗或预防原因而治疗个体的过程，并且涉及以下程序：向个体施用一种或更多种如本文所述的免疫原或抗原或其衍生物(特别是以编码它们的rna(尤其是mrna)的形式)，以及刺激针对所述一种或更多种的免疫原或抗原或者特征在于呈递所述一种或更多种的免疫原或抗原的细胞的免疫应答。[0537]“特征在于呈递抗原的细胞”或“呈递抗原的细胞”或“在抗原呈递细胞表面上呈递抗原的mhc分子”或类似表述意指直接地或在mhc分子(优选mhci类和/或mhcii类分子，最优选mhci类分子)的情况下加工之后呈递抗原或抗原肽的细胞，例如病变细胞(特别是肿瘤细胞或感染细胞)或抗原呈递细胞。[0538]在本公开内容的上下文中，术语“转录”涉及其中dna序列中的遗传密码转录成rna(特别是mrna)的过程。随后，rna(特别是mrna)可以翻译成肽或蛋白质。[0539]关于rna，术语“表达”或“翻译”涉及通过其mrna的链指导组装氨基酸序列以产生肽或蛋白质之细胞的核糖体中的过程。[0540]本文中使用的术语“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件、状况或情况可发生或可不发生，并且所述描述包括其中所述事件、状况或情况发生的实例以及其中所述事件、状况或情况不发生的实例。[0541]本文中所述的特定化合物的前药是在向个体施用后在生理条件下发生化学转化以提供特定化合物的那些化合物。另外，前药可以在离体环境中通过化学或生物化学方法转化成特定化合物。例如，当例如将前药与合适的酶或化学试剂一起置于经皮贴剂储库中时，前药可以缓慢转化成特定化合物。一些示例性的前药在体内是可水解的酯(使用在特定化合物中包含的醇或羧基)或酰胺(使用在特定化合物中包含的氨基或羧基)。特别地，包含在特定化合物中并携有至少一个氢原子的任意氨基均可以转化成前药形式。典型的n-前药形式包括氨基甲酸酯、曼尼希碱(mannichbase)、烯胺和烯胺酮。[0542]“异构体”是具有相同分子式但结构不同(“结构异构体”)或者官能团和/或原子的几何(空间)位置不同(“立体异构体”)的化合物。“对映体”是作为彼此不可重叠镜像的立体异构体对。“外消旋混合物”或“外消旋体”包含等量的对映体对，并用前缀(±)表示。“非对映体”是不可重叠且彼此不是镜像的立体异构体。“互变异构体”是同一化学物质的结构异构体，其由于单个原子或原子团的迁移而自发和可逆地彼此转化，即使当是纯的时；即互变异构体处于彼此的动态化学平衡。互变异构体的一个实例是酮-烯醇-互变异构的异构体。“构象异构体”是仅通过围绕形式上的单键旋转即可相互转化的立体异构体，并且特别是包括导致(杂)环的不同3维形式(例如环己烷的椅型、半椅型、船型和扭船型)的那些。[0543]术语“平均直径”意指如通过动态光散射(dynamiclightscattering，dls)以及使用所谓的累积量算法进行数据分析而测得的颗粒的平均流体动力学直径，其提供的结果是长度维度的所谓的z平均值和无量纲的多分散性指数(pdi)(koppel,d.,j.chem.phys.57,1972,第4814至4820页,iso13321)。在此，颗粒的“平均直径”、“直径”或“尺寸”与该z平均值的值同义使用。[0544]“多分散性指数”优选地基于动态光散射测量通过如在“平均直径”的定义中提及的所谓的累积量分析来计算。在某些先决条件下，可将其视为对纳米粒系综(ensemble)的尺寸分布的量度(measure)。[0545]颗粒绕旋转轴的“回转半径”(本文中缩写为rg)是指某一点距旋转轴的径向距离，此处如果假设颗粒的整个质量都是集中的，则绕给定轴的转动惯量与其实际质量分布相同。从数学上讲，rg是颗粒组分距其质心或给定轴的均方根距离。例如，对于由n个质量元素、质量mi(i＝1，2，3，...，n)构成的、位于距质心固定距离si处的大分子，rg是所有质量元素上si2的质量平均值的平方根，并可如下计算：[0546][0547]回转半径可通过实验(例如通过使用光散射)进行确定或计算。特别地，对于小的散射矢量结构函数s如下定义：[0548][0549]其中n是组分的数目(guinier定律)。[0550]“d10值”(特别是关于颗粒的定量尺寸分布)是10％颗粒的直径小于该值时的直径。d10值是描述颗粒群内(例如在从场流分级(field-flowfractionation)中获得的颗粒峰内)最小颗粒比例的手段。[0551]“d50值”(特别是关于颗粒的定量尺寸分布)是50％颗粒的直径小于该值时的直径。d50值是描述颗粒群内(例如在从场流分级中获得的颗粒峰内)的平均颗粒尺寸的手段。[0552]“d90值”(特别是关于颗粒的定量尺寸分布)是90％颗粒的直径小于该值时的直径。“d95”、“d99”和“d100”值具有相应的含义。d90、d95、d99和d100值是描述颗粒群内(例如在从场流分级中获得的颗粒峰内)较大颗粒比例的手段。[0553]颗粒的“流体动力学半径”(有时称为“斯托克斯半径(stokesradius)”或“斯托克斯-爱因斯坦半径(stokes-einsteinradius)”)是以与所述颗粒相同的速率扩散的假设硬球的半径。流体动力学半径与颗粒的流动性有关，不仅考虑了尺寸还考虑了溶剂效应。例如，水合作用更强的更小带电荷颗粒可比水合作用更弱的更大带电荷颗粒具有更大的流体动力学半径。这是因为当更小的颗粒在溶液中运动时，会带着更多数目的水分子。由于溶剂中颗粒的实际尺寸无法直接测量，因此流体动力学半径可由斯托克斯-爱因斯坦方程定义：[0554][0555]其中κb是玻尔兹曼常数(boltzmannconstant)；t是温度；η是溶剂的黏度；d是扩散系数。扩散系数可通过实验(例如通过使用动态光散射(dls))来确定。因此，用于确定颗粒或颗粒群的流体动力学半径(例如本文公开的样品或对照组合物中包含的颗粒的流体动力学半径，或从使这样的样品或对照组合物经受场流分级获得的颗粒峰的流体动力学半径)的一种程序是测量所述颗粒或颗粒群的dls信号(例如本文公开的样品或对照组合物中包含的颗粒的dls信号，或从使这样的样品或对照组合物经受场流分级获得的颗粒峰的dls信号)。[0556]本文中使用的术语“聚集体”涉及其中颗粒是相同的或非常相似的并且以非共价方式(例如，通过离子相互作用、h桥相互作用、偶极相互作用和/或范德华相互作用)彼此附着的颗粒簇。[0557]本文中使用的表述“光散射”是指由于光通过的介质中的局部不均匀性，光被迫偏离直线轨迹一个或更多个路径的物理过程。[0558]术语“uv”意指紫外线，并指电磁波谱带，其波长为10nm至400nm，即，比可见光短但比x射线长。[0559]本文中使用的表述“多角度光散射”或“mals”涉及用于测量被样品散射到多个角度的光的技术。在这方面中，“多角度”意指如例如通过在包括选定的特定角度的范围内移动的单个检测器或固定在特定角度位置的检测器阵列测量的，可以以不同的离散角度检测散射光。在一个优选实施方案中，在mals中使用的光源是激光源(malls：多角度激光散射)。基于包含颗粒的组合物的mals信号并通过使用合适的形式(例如，zimm图、berry图或debye图)，可以确定回转半径(rg)，并因此确定所述颗粒的尺寸。优选地，zimm图是使用下式的图形表示：[0560][0561]其中c是溶剂中颗粒的质量浓度(g/ml)；a2是第二维里系数(mol·ml/g2)；p(θ)是与散射光强度对角度的依赖性相关的形状因子(formfactor)；rθ为超瑞利比(excessrayleighratio)(cm-1)；k*是等于4π2ηo(dn/dc)2λ0-4na-1的光学常数，其中ηo是溶剂在入射辐射(真空)波长下的折射率，λ0是入射辐射(真空)波长(nm)，na是阿伏伽德罗数(mol-1)，以及dn/dc是微分折射率增量(ml/g)(参见，例如，buchholzetal.(electrophoresis22(2001),4118-4128)；b.h.zimm(j.chem.phys.13(1945),141；p.debye(j.appl.phys.15(1944):338；以及w.burchard(anal.chem.75(2003),4279-4291)。优选地，berry图由以下项计算：[0562][0563]其中c、rθ和k*如上所定义。优选地，debye图由以下项计算：[0564][0565]其中c、rθ和k*如上所定义。[0566]本文中使用的表述“动态光散射”或“dls”是指确定颗粒的尺寸和尺寸分布谱，特别是关于颗粒的流体动力学半径的技术。单色光源(通常是激光)通过起偏器射出并射入样品中。然后散射光通过第二个起偏器，在那里被检测到并且产生的图像被投射到屏幕上。溶液中的颗粒被光击中，并向各个方向衍射光。来自颗粒的衍射光可以相长干涉(亮区)或相消干涉(暗区)。将该过程以短时间间隔重复，并且由自相关仪分析所得的散斑图组，所述自相关仪比较了随时间变化的每个点处的光强度。[0567]本文中使用的表述“静态光散射”或“sls”是指确定颗粒的尺寸和尺寸分布谱，特别是关于颗粒的回转半径和/或颗粒的摩尔质量的技术。在含有颗粒的溶液中发射高强度单色光，通常是激光。将一个或更多个探测器用于测量一个或许多个角度处的散射强度。需要角度依赖性以获得对所有半径大分子的摩尔质量和尺寸二者的精确测量。因此，在相对于入射光方向的多个角度下的同时测量结果(称为多角度光散射(multi-anglelightscattering，mals)或多角度激光散射(multi-anglelaserlightscattering，malls))通常被视为静态光散射的标准实现。[0568]术语“核酸”包括脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid，dna)、核糖核酸(ribonucleicacid，rna)、其组合及其经修饰形式。该术语包括基因组dna、cdna、mrna、重组产生和化学合成的分子。核酸可以作为单链或双链和线性或共价环状闭合的分子存在。核酸可以是分离的。根据本公开内容，术语“分离的核酸”意指这样的核酸：其(i)对于dna在体外扩增，例如通过聚合酶链反应(polymerasechainreaction，pcr)，或对于rna在体外转录(使用例如rna聚合酶)，(ii)通过克隆重组产生，(iii)被纯化，例如通过切割和通过凝胶电泳的分离，或者(iv)被合成，例如通过化学合成。[0569]术语“核苷”(本文中缩写为“n”)涉及可以被认为是没有磷酸基团的核苷酸的化合物。核苷是与糖(例如核糖或脱氧核糖)连接的核碱基，而核苷酸是由核苷和一个或更多个磷酸基团构成。核苷的实例包括胞苷、尿苷、假尿苷、腺苷和鸟苷。[0570]通常构成天然存在的核酸的五种标准核苷是尿苷、腺苷、胸苷、胞苷和鸟苷。五种核苷通常缩写为其单字母代码，分别为u、a、t、c和g。然而，胸苷更通常被写为“dt”(“d”代表“脱氧”)，因为其含有2’‑脱氧呋喃核糖部分而不是尿苷中存在的呋喃核糖环。这是因为胸苷存在于脱氧核糖核酸(dna)而不是核糖核酸(rna)中。相反，尿苷存在于rna而非dna中。其余的三种核苷可存在于rna和dna二者中。在rna中，其将表示为a、c和g，而在dna中，其将表示为da、dc和dg。[0571]经修饰的嘌呤(a或g)或嘧啶(c、t或u)碱基部分优选被一个或更多个烷基基团，更优选一个或更多个c1-4烷基基团，甚至更优选一个或更多个甲基基团修饰。经修饰的嘌呤或嘧啶碱基部分的一些具体实例包括n7-烷基-鸟嘌呤、n6-烷基-腺嘌呤、5-烷基-胞嘧啶、5-烷基-尿嘧啶和n(1)-烷基-尿嘧啶，例如n7-c1-4烷基-鸟嘌呤、n6-c1-4烷基-腺嘌呤、5-c1-4烷基-胞嘧啶、5-c1-4烷基-尿嘧啶和n(1)-c1-4烷基-尿嘧啶，优选n7-甲基-鸟嘌呤、n6-甲基-腺嘌呤、5-甲基-胞嘧啶、5-甲基-尿嘧啶和n(1)-甲基-尿嘧啶。[0572]在此，术语“dna”涉及包含脱氧核糖核苷酸残基的核酸分子。在一些优选实施方案中，dna包含全部或大部分的脱氧核糖核苷酸残基。如本文中使用的“脱氧核糖核苷酸”是指在β-d-呋喃核糖基的2’‑位缺少羟基的核苷酸。dna涵盖但不限于双链dna、单链dna、分离的dna(例如部分纯化的dna)、基本上纯的dna、合成dna、重组产生的dna以及通过添加、缺失、替换和/或改变一个或更多个核苷酸而不同于天然存在的dna之经修饰dna。这样的改变可以是指将非核苷酸物质添加至内部dna核苷酸或添加至dna末端。本文中还考虑了dna中的核苷酸可以是非标准核苷酸，例如化学合成的核苷酸或核糖核苷酸。对于本公开内容，这些改变的dna被认为是天然存在的dna的类似物。如果分子中脱氧核糖核苷酸残基的含量大于基于分子中核苷酸残基的总数的50％(例如至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)，则该分子包含“大部分脱氧核糖核苷酸残基”。分子中核苷酸残基的总数目是所有核苷酸残基的总和(无论核苷酸残基是标准(即天然存在)的核苷酸残基还是其类似物)。[0573]dna可以是重组dna并且可以通过克隆核酸(特别是cdna)来获得。cdna可通过rna的逆转录来获得。[0574]术语“rna”涉及包含核糖核苷酸残基的核酸分子。在一些优选实施方案中，rna包含全部或大部分的核糖核苷酸残基。如本文中使用的，“核糖核苷酸”是指在β-d-呋喃核糖基的2’‑位具有羟基的核苷酸。rna包括但不限于双链rna、单链rna、分离的rna(例如部分纯化的rna)、基本上纯的rna、合成rna、重组产生的rna，以及通过添加、缺失、替换和/或改变一个或更多个核苷酸而不同于天然存在的rna之经修饰rna。这样的改变可以是指将非核苷酸物质添加至内部rna核苷酸或添加至rna末端。本文中还考虑了rna中的核苷酸可以是非标准核苷酸，例如化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。对于本公开内容，这些改变/经修饰的核苷酸可以被称为天然存在的核苷酸的类似物，并且包含这样的改变/经修饰的核苷酸的相应rna(即，改变/经修饰rna)可以被称为天然存在的rna的类似物。如果分子中核糖核苷酸残基的含量大于基于分子中核苷酸残基总数的50％(例如至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)，则该分子包含“大部分核糖核苷酸残基”。分子中核苷酸残基的总数是所有核苷酸残基的总和(无论核苷酸残基是标准的(即，天然存在)的核苷酸残基还是其类似物)。[0575]“rna”包括mrna、trna、核糖体rna(ribosomalrna，rrna)、小核rna(smallnuclearrna，snrna)、自扩增rna(self-amplifyingrna，sarna)、单链rna(single-strandedrna，ssrna)、dsrna、抑制性rna(例如反义ssrna、小干扰rna(smallinterferingrna，sirna)或微rna(microrna，mirna))、激活rna(例如小激活rna)和免疫刺激性rna(immunostimulatoryrna，isrna)。[0576]本文中使用的术语“体外转录”或“ivt”意指以无细胞方式进行转录(即，rna的产生)。即，ivt不使用活的/培养的细胞，而是使用从细胞中提取的转录机器(例如，细胞裂解物或其分离的组分，包括rna聚合酶(优选t7、t3或sp6聚合酶))。[0577]mrna[0578]根据本公开内容，术语“mrna”意指“信使rna”，并且涉及可通过使用dna模板产生并且可以编码肽或蛋白质的“转录物”。通常，mrna包含5’‑utr、肽/蛋白质编码区和3’‑utr。在本公开内容的上下文中，mrna优选通过体外转录(invitrotranscription，ivt)从dna模板产生。如上所述，体外转录方法是技术人员已知的，并且多种体外转录试剂盒是可商购的。[0579]mrna是单链的，但可包含自身互补序列，所述序列允许mrna的一部分折叠并与其自身配对以形成双螺旋。[0580]根据本公开内容，“dsrna”意指双链rna，并且是具有两条部分或完全互补链的rna。[0581]在本公开内容的一些优选实施方案中，mrna涉及编码肽或蛋白质的rna转录物。[0582]在一个实施方案中，优选编码肽或蛋白质的mrna的长度为至少45个核苷酸(例如至少60个、至少90个、至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个、至少700个、至少800个、至少900个、至少1,000个、至少1,500个、至少2,000个、至少2,500个、至少3,000个、至少3,500个、至少4,000个、至少4,500个、至少5,000个、至少6,000个、至少7,000个、至少8,000个、至少9,000个核苷酸)，优选至多15,000个核苷酸，例如至多14,000、至多13,000个、至多12,000个核苷酸、至多11,000个核苷酸或至多10,000个核苷酸。[0583]如本领域中认可的，mrna通常包含5’非翻译区(5’‑untranslatedregion，5’‑utr)、肽编码区和3’非翻译区(3’‑untranslatedregion，3’‑utr)。在一些实施方案中，mrna通过体外转录或化学合成产生。在一个实施方案中，mrna使用dna模板通过体外转录产生。体外转录方法是技术人员已知的；参见，例如，molecularcloning:alaboratorymanual,2ndedition,j.sambrooketal.eds.,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor1989。此外，多种体外转录试剂盒是可商购的，例如来自thermofisherscientific(例如transcriptaidtmt7试剂盒、t7试剂盒、)、newenglandbiolabsinc.(例如hiscribetmt7试剂盒、hiscribetmt7arcamrna试剂盒)、promega(例如ribomaxtm、系统)、jenabioscience(例如sp6或t7转录试剂盒)和epicentre(例如ampliscribetm)。为了提供经修饰的mrna，可以在合成(优选体外转录)期间并入相应经修饰的核苷酸，例如经修饰的天然存在的核苷酸、非天然存在的核苷酸和/或经修饰的非天然存在的核苷酸，或者可以在转录之后在mrna中实现和/或添加修饰。[0584]在一个实施方案中，mrna是体外转录的mrna(ivt-rna)，并且可通过合适的dna模板的体外转录获得。用于控制转录的启动子可以是任何rna聚合酶的任何启动子。rna聚合酶的一些具体实例是t7、t3和sp6rna聚合酶。优选地，体外转录由t7或sp6启动子控制。用于体外转录的dna模板可通过克隆核酸，特别是cdna，并将其引入到用于体外转录的合适载体中而获得。cdna可通过rna的逆转录获得。[0585]在本公开内容的某些实施方案中，mrna是“复制子mrna”或简称为“复制子”，特别是“自复制mrna”或“自扩增mrna”。在一个特别优选的实施方案中，复制子或自复制mrna来源于或包含这样的元件：所述元件来源于ssrna病毒，特别是正链ssrna病毒例如甲病毒。甲病毒是正链rna病毒的典型代表。甲病毒在感染细胞的细胞质中复制(关于甲病毒生命周期的综述，参见joséetal.,futuremicrobiol.,2009,第4卷,第837至856页)。许多甲病毒的总基因组长度通常为11,000至12,000个核苷酸，并且基因组rna通常具有5’帽和3’poly(a)尾。甲病毒的基因组编码非结构蛋白(参与病毒rna的转录、修饰和复制以及蛋白质修饰)和结构蛋白(形成病毒颗粒)。基因组中通常有两个开放阅读框(openreadingframe，orf)。四种非结构蛋白(nsp1至nsp4)通常由自基因组5’端附近开始的第一orf一起编码，而甲病毒结构蛋白由存在于第一orf的下游并延伸靠近基因组3’端的第二orf一起编码。通常而言，第一orf大于第二orf，比例为大致2:1。在被甲病毒感染的细胞中，仅编码非结构蛋白的核酸序列从基因组rna翻译，而编码结构蛋白的遗传信息可从亚基因组转录物翻译，所述亚基因组转录物是类似于真核信使rna(messengerrna，mrna)的rna分子(gouldetal.,2010,antiviralres.,第87卷,第111至124页)。在感染之后，即在病毒生命周期的早期阶段，( )链基因组rna像信使rna一样直接用于翻译编码非结构多聚蛋白(nsp1234)的开放阅读框。已经提出将甲病毒来源载体用于将外来遗传信息递送至靶细胞或靶生物体中。在简单的方法中，将编码甲病毒结构蛋白的开放阅读框替换成编码目的蛋白的开放阅读框。基于甲病毒的反式复制系统依赖于两个分开的核酸分子上的甲病毒核苷酸序列元件：一个核酸分子编码病毒复制酶，而另一个核酸分子能够被所述复制酶反式复制(因此称为反式复制系统)。反式复制需要在给定的宿主细胞中存在这两种核酸分子。能够被复制酶反式复制的核酸分子必须包含某些甲病毒序列元件，以允许通过甲病毒复制酶进行识别和rna合成。[0586]在本公开内容的一个实施方案中，mrna包含一个或更多个修饰，例如，以便提高其稳定性和/或提高翻译效率和/或降低免疫原性和/或减少细胞毒性。例如，为了提高mrna的表达，可以在编码区(即编码所表达的肽或蛋白质的序列)内进行修饰，优选不改变所表达肽或蛋白质的序列。这样的修饰例如在wo2007/036366和pct/ep2019/056502中描述，并且包括以下：5’‑帽结构；天然存在的poly(a)尾的延伸或截短；5’‑和/或3’‑非翻译区(utr)的改变(例如引入与所述rna编码区无关的utr)；用合成核苷酸替换一个或更多个天然存在的核苷酸；以及密码子优化(例如，改变(优选提高)rna的gc含量)。根据本公开内容，在经修饰mrna的上下文中术语“修饰”优选地涉及mrna中非天然存在于所述mrna中的任何修饰。[0587]在一些实施方案中，mrna包含5’‑帽结构。在一个实施方案中，mrna不具有未加帽的5’‑三磷酸。在一个实施方案中，mrna可包含常规的5’‑帽和/或5’‑帽类似物。术语“常规5’‑帽”是指存在于mrna分子5’端的帽结构，并且通常由鸟苷5’‑三磷酸(gppp)组成，所述鸟苷5’‑三磷酸通过其三磷酸部分与mrna中下一个核苷酸的5’端连接(即鸟苷通过5’‑5’三磷酸键联与mrna的其余部分连接)。鸟苷可以在n7位甲基化(产生帽结构m7gppp)。术语“5’‑帽类似物”是指这样的5’‑帽，其基于常规5’‑帽但在m7鸟苷结构的2’‑或3’‑位被修饰以避免5’‑帽类似物在相反方向的整合(这样的5’‑帽类似物也被称为抗反向帽类似物(anti-reversecapanalog，arca))。特别优选的5’‑帽类似物是在磷酸桥中在桥接和非桥接氧处具有一个或更多个取代的那些，例如在β-磷酸处硫代磷酸酯修饰的5’‑帽类似物(例如m27，2′og(5′)ppsp(5′)g(称为beta-s-arca或β-s-arca))，如pct/ep2019/056502中所述。提供了具有如本文中所述5’‑帽结构的mrna可以在存在相应的5’‑帽化合物的情况下通过dna模板的体外转录来实现，其中所述5’‑帽结构被共转录并入到所产生的mrna链中，或者mrna可以例如通过体外转录来产生，并且5’‑帽结构可以使用加帽酶(例如痘苗病毒的加帽酶)在转录后与mrna连接。[0588]在一些实施方案中，mrna包含选自m27，2′og(5’)ppsp(5′)g(特别是其d1非对映体)、m27，3′og(5′)ppp(5′)g和m27，3′ogppp(m12′‑o)apg的5’‑帽结构。[0589]在一些实施方案中，mrna包含cap0、cap1或cap2，优选cap1或cap2。根据本公开内容，术语“cap0”意指结构“m7gpppn”，其中n是在2’位携有oh部分的任何核苷。根据本公开内容，术语“cap1”意指结构“m7gpppnm”，其中nm是在2’位携有och3部分的任何核苷。根据本公开内容，术语“cap2”意指结构“m7gpppnmnm”，其中每个nm独立地是在2’位携有och3部分的任何核苷。[0590]beta-s-arca(β-s-arca)的d1非对映体具有以下结构：[0591][0592]“β-s-arca的d1非对映体”或“β-s-arca(d1)”是β-s-arca的非对映体，其与β-s-arca的d2非对映体(β-s-arca(d2))相比首先在hplc柱上洗脱，并因此表现出较短的保留时间。hplc优选地是分析型hplc。在一个实施方案中，supelcosillc-18-trp柱，优选形式为：5μm，4.6×250mm用于分离，由此可以施加1.3ml/分钟的流量。在一个实施方案中，在15分钟内使用乙酸铵中甲醇的梯度，例如在0.05m乙酸铵中甲醇的0％至25％线性梯度，ph＝5.9。uv检测(vwd)可在260nm处进行，荧光检测(fluorescencedetection，fld)可在280nm下激发和337nm下检测进行。[0593]作为cap1构件的5’‑cap类似物m27，3′‑ogppp(m12′‑o)apg(也称为m27，3′og(5′)ppp(5′)m2′‑oapg)具有以下结构：al.,2006,blood,第108卷,第4009至4017页)。[0603]poly-a尾可具有任何长度。在一些实施方案中，poly-a尾包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：至少20个、至少30个、至少40个、至少80个或至少100个、并且至多500个、至多400个、至多300个、至多200个或至多150个a核苷酸，并且特别是约120个a核苷酸。在本上下文中，“基本上由……组成”意指poly-a尾中的大多数核苷酸，通常按poly-a尾中核苷酸的数目计至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％是a核苷酸，但允许其余核苷酸是除a核苷酸之外的核苷酸，例如u核苷酸(尿苷酸)、g核苷酸(鸟苷酸)或c核苷酸(胞苷酸)。在本上下文中，“由……组成”意指poly-a尾中的所有核苷酸，即按poly-a尾中核苷酸的数目计100％均是a核苷酸。术语“a核苷酸”或“a”是指腺苷酸。[0604]在一些实施方案中，基于在与编码链互补的链中包含重复的dt核苷酸(脱氧胸苷酸)的dna模板，在rna转录期间，例如在制备体外转录的rna期间，连接poly-a尾。编码poly-a尾的dna序列(编码链)称为poly(a)盒。[0605]在一些实施方案中，存在于dna编码链中的poly(a)盒基本上由da核苷酸组成，但被四种核苷酸(da、dc、dg和dt)的随机序列中断。这样的随机序列的长度可以是5至50、10至30或10至20个核苷酸。这样的盒公开于wo2016/005324a1中，其在此通过引用并入。wo2016/005324a1中公开的任何poly(a)盒均可用于本公开内容。涵盖以下：基本上由da核苷酸组成但被具有均等分布的四种核苷酸(da、dc、dg、dt)并且长度为例如5至50个核苷酸的随机序列中断的poly(a)盒显示，在dna水平上质粒dna在大肠杆菌(e.coli)中的恒定增殖，而在rna水平上仍与对于支持rna稳定性和翻译效率的有益特性相关。因此，在一些实施方案中，本文中所述mrna分子中包含的poly-a尾基本上由a核苷酸组成，但是被四种核苷酸(a、c、g、u)的随机序列中断。这样的随机序列的长度可以是5至50、10至30或10至20个核苷酸。[0606]在一些实施方案中，除a核苷酸之外，无核苷酸侧接poly-a尾其3’端，即，poly-a尾在其3’端未被除a之外的核苷酸掩蔽或跟随。[0607]在一些实施方案中，本公开内容中使用的mrna包含5’‑utr和/或3’‑utr。术语“非翻译区”或“utr”涉及dna分子中被转录但未被翻译成氨基酸序列的区域，或者涉及rna分子(例如mrna分子)中的相应区域。非翻译区(utr)可存在于开放阅读框的5’(上游)(5’‑utr)和/或开放阅读框的3’(下游)(3’‑utr)。5’‑utr(如果有的话)位于5’端，蛋白质编码区起始密码子的上游。5’‑utr位于5’‑帽(如果有的话)的下游，例如，与5’‑帽直接相邻。3’‑utr(如果有的话)位于3’端，蛋白质编码区终止密码子的下游，但是术语“3’‑utr”优选不包含poly-a序列。因此，3’‑utr位于poly-a序列(如果有的话)的上游，例如，与poly-a序列直接相邻。将3’‑utr并入到rna(优选mrna)分子的3’‑非翻译区中可导致翻译效率的提高。可以通过并入两个或更多个这样的3’‑utr(其优选以头至尾方向排列；参见例如，holtkampetal.,blood108,4009-4017(2006))来实现协同作用。3’‑utr对于它们待引入其中的rna(优选mrna)而言可以是自体的或异源的。在一个具体的实施方案中，3’‑utr来源于珠蛋白基因或mrna，例如α2-珠蛋白、α1-珠蛋白或β-珠蛋白，优选β-珠蛋白，更优选人β-珠蛋白的基因或mrna。例如，可以通过将现有3’‑utr替换成一个或更多个，优选两个拷贝的来源于珠蛋白基因例如α2-珠蛋白、α1-珠蛋白、β-珠蛋白，优选β-珠蛋白，更优选人β-珠蛋白的3’‑utr，或者插入一个或更多个，优选两个拷贝的来源于珠蛋白基因例如α2-珠蛋白、α1-珠蛋白、β-珠蛋白，优选β-珠蛋白，更优选人β-珠蛋白的3’‑utr，来对rna(优选mrna)进行修饰。[0608]mrna可具有经修饰的核糖核苷酸以便提高其稳定性和/或降低免疫原性和/或降低细胞毒性。例如，在一个实施方案中，本文中所述mrna中的尿苷被经修饰核苷替换(部分地或完全地，优选完全地)。在一些实施方案中，经修饰核苷是经修饰尿苷。[0609]在一些实施方案中，替代尿苷的经修饰尿苷选自假尿苷(ψ)、n1-甲基-假尿苷(m1ψ)、5-甲基-尿苷(m5u)及其组合。[0610]在一些实施方案中，替代(部分地或完全地，优选完全地)mrna中的尿苷的经修饰核苷可以是以下中的任一种或更多种：3-甲基-尿苷(m3u)、5-甲氧基-尿苷(mo5u)、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷(s2u)、4-硫代-尿苷(s4u)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho5u)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤代-尿苷(例如，5-碘代-尿苷或5-溴代-尿苷)、尿苷5-羟乙酸(cmo5u)、尿苷5-羟乙酸甲酯(mcmo5u)、5-羧甲基-尿苷(cm5u)、1-羧甲基-假尿苷、5-羧基羟甲基-尿苷(chm5u)、5-羧基羟甲基-尿苷甲酯(mchm5u)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm5u)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm5s2u)、5-氨甲基-2-硫代-尿苷(nm5s2u)、5-甲基氨甲基-尿苷(mnm5u)、1-乙基-假尿苷、5-甲基氨甲基-2-硫代-尿苷(mnm5s2u)、5-甲基氨甲基-2-硒代-尿苷(mnm5se2u)、5-氨甲酰基甲基-尿苷(ncm5u)、5-羧甲基氨甲基-尿苷(cmnm5u)、5-羧甲基氨甲基-2-硫代-尿苷(cmnm5s2u)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(τm5u)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷(τm5s2u)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷)、5-甲基-2-硫代-尿苷(m5s2u)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮杂-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮杂-假尿苷、二氢尿苷(d)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m5d)、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、n1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp3u)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨甲基)尿苷(inm5u)、5-(异戊烯基氨甲基)-2-硫代-尿苷(inm5s2u)、α-硫代-尿苷、2’‑o-甲基-尿苷(um)、5,2’‑o-二甲基-尿苷(m5um)、2’‑o-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫代-2’‑o-甲基-尿苷(s2um)、5-甲氧基羰基甲基-2’‑o-甲基-尿苷(mcm5um)、5-氨甲酰基甲基-2’‑o-甲基-尿苷(ncm5um)、5-羧甲基氨甲基-2’‑o-甲基-尿苷(cmnm5um)、3,2’‑o-二甲基-尿苷(m3um)、5-(异戊烯基氨甲基)-2’‑o-甲基-尿苷(inm5um)、1-硫代-尿苷、脱氧胸苷、2’‑f-阿糖-尿苷、2’‑f-尿苷、2’‑oh-阿糖-尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷、5-[3-(1-e-丙烯基氨基)尿苷或本领域中已知的任何其他经修饰尿苷。[0611]通过假尿苷(部分地或完全地，优选完全地替换尿苷)修饰的rna(优选mrna)在本文中称为“ψ修饰的”，而术语“m1ψ-修饰的”意指rna(优选mrna)包含n(1)-甲基假尿苷(部分地或完全地，优选完全地替换尿苷)。此外，术语“m5u修饰的”意指rna(优选mrna)包含5-甲基尿苷(部分地或完全地，优选完全地替换尿苷)。与其未经修饰形式相比，这样的ψ-或m1ψ-或m5u-修饰的rna通常表现出降低的免疫原性，并因此，优选其中需要避免或最小化免疫应答诱导的应用。[0612]可以进一步优化本公开内容中使用的mrna的密码子，例如，以提高rna的gc含量和/或将在待表达目的肽或蛋白质的细胞(或对象)中罕见的密码子替换成作为所述细胞(或对象)中同义的频繁密码子的密码子。在一些实施方案中，由本公开内容中使用的mrna编码的氨基酸序列由密码子优化和/或与野生型编码序列相比提高的g/c含量的编码序列编码。这也包括一些实施方案，其中编码序列的一个或更多个序列区域与野生型编码序列的相应序列区域相比是密码子优化的和/或g/c含量提高的。在一个实施方案中，密码子优化和/或g/c含量提高优选不改变所编码氨基酸序列的序列。[0613]术语“密码子优化”是指改变核酸分子的编码区中的密码子以反映宿主生物体的典型密码子使用而不优选改变由核酸分子编码的氨基酸序列。在本公开内容的上下文中，编码区优选是密码子优化的，以便在使用本文中所述mrna治疗的对象中进行最佳表达。密码子优化是基于这样的发现：翻译效率还由细胞中trna出现的不同频率决定。因此，可以修饰mrna的序列，使得插入频繁出现的trna可用的密码子来替代“罕见密码子”。[0614]在一些实施方案中，与野生型rna的相应编码序列的鸟苷/胞嘧啶(g/c)含量相比，本文中所述mrna的编码区的g/c含量提高，其中与野生型rna编码的氨基酸序列相比，所述mrna编码的氨基酸序列优选是未经修饰的。mrna序列的该修饰是基于这样的事实：任何待翻译的rna区域的序列对于该mrna的有效翻译均是重要的。与具有a(腺苷)/u(尿嘧啶)含量提高的序列相比，具有g(鸟苷)/c(胞嘧啶)含量提高的序列更稳定。关于数种密码子编码一种且相同氨基酸(所谓的遗传密码子简并性)的事实，可以确定对稳定性最有利的密码子(所谓的替代密码子使用)。取决于待由所述mrna编码的氨基酸，与其野生型序列相比，存在多种修饰mrna序列的可能性。特别地，可以通过用编码同一氨基酸但不含a和/或u或者含有较低含量的a和/或u核苷酸的另一些密码子替换这些密码子来修饰包含a和/或u核苷酸的密码子。[0615]在多个实施方案中，与野生型rna编码区的g/c含量相比，本文中所述mrna的编码区的g/c含量提高了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少55％或甚至更多。[0616]上述修饰(即5’‑帽结构的并入、poly-a序列的并入、poly-a序列的未掩蔽、5’‑和/或3’‑utr的改变(例如一个或更多个3’‑utr的并入)、用合成核苷酸替换一个或更多个天然存在的核苷酸(例如，用5-甲基胞苷替换胞苷和/或用假尿苷(ψ)或n(1)-甲基假尿苷(m1ψ)或5-甲基尿苷(m5u)替换尿苷)以及密码子优化)的组合对rna(优选mrna)的稳定性和翻译效率的提高具有协同影响。因此，在一个优选实施方案中，本公开内容中使用的mrna包含至少两种、至少三种、至少四种或所有五种上述修饰即以下的组合：(i)5’‑帽结构的并入，(ii)poly-a序列的并入，poly-a序列的未掩蔽；(iii)5’‑和/或3’‑utr的改变(例如一个或更多个3’‑utr的并入)；(iv)用合成核苷酸替换一个或更多个天然存在的核苷酸(例如，用5-甲基胞苷替换胞苷和/或用假尿苷(ψ)或n(1)-甲基假尿苷(m1ψ)或5-甲基尿苷(m5u)替换尿苷)以及(v)密码子优化。[0617]本公开内容的一些方面涉及将本文中公开的mrna靶向递送至某些细胞或组织。在一个实施方案中，本公开内容涉及靶向淋巴系统，特别是次级淋巴器官，更特别地是脾。如果施用的mrna是编码用于诱导免疫应答的抗原或表位的mrna，则特别优选的是靶向淋巴系统，特别是次级淋巴器官，更特别地是脾。在一个实施方案中，靶细胞是脾细胞。在一个实施方案中，靶细胞是抗原呈递细胞，例如脾中的专职抗原呈递细胞。在一个实施方案中，靶细胞是脾中的树突细胞。“淋巴系统”是循环系统的一部分并且是免疫系统的一个重要部分，其包含携有淋巴的淋巴管网络。淋巴系统由淋巴器官、淋巴管的传导网络和循环淋巴组成。初级或中枢淋巴器官从未成熟的祖细胞产生淋巴细胞。胸腺和骨髓构成初级淋巴器官。次级或外周淋巴器官(包括淋巴结和脾)维持成熟的初始淋巴细胞并启动适应性免疫应答。[0618]基于脂质的mrna递送系统对肝具有固有的偏好。肝积聚是由肝脉管系统或脂质代谢(脂质体和脂质或胆固醇缀合物)的不连续性质引起的。在一个实施方案中，靶器官是肝并且靶组织是肝组织。优选递送至这样的靶组织，特别是在期望在该器官或组织中存在mrna或编码的肽或蛋白质时，和/或者在期望表达大量编码的肽或蛋白质时，和/或者在期望或需要全身性存在编码的肽或蛋白质，特别是以显著的量时。[0619]在一个实施方案中，在施用本文中所述mrna颗粒之后，至少一部分mrna被递送至靶细胞或靶器官。在一个实施方案中，至少一部分mrna被递送至靶细胞的胞质溶胶。在一个实施方案中，mrna是编码肽或蛋白质的mrna，并且mrna被靶细胞翻译以产生肽或蛋白质。在一个实施方案中，靶细胞是肝中的细胞。在一个实施方案中，靶细胞是肌细胞。在一个实施方案中，靶细胞是内皮细胞。在一个实施方案中，靶细胞是肿瘤细胞或肿瘤微环境中的细胞。在一个实施方案中，靶细胞是血细胞。在一个实施方案中，靶细胞是淋巴结中的细胞。在一个实施方案中，靶细胞是肺中的细胞。在一个实施方案中，靶细胞是血细胞。在一个实施方案中，靶细胞是皮肤中的细胞。在一个实施方案中，靶细胞是脾细胞。在一个实施方案中，靶细胞是抗原呈递细胞，例如脾中的专职抗原呈递细胞。在一个实施方案中，靶细胞是脾中的树突细胞。在一个实施方案中，靶细胞是t细胞。在一个实施方案中，靶细胞是b细胞。在一个实施方案中，靶细胞是nk细胞。在一个实施方案中，靶细胞是单核细胞。因此，本文中所述的rna颗粒可用于将mrna递送至这样的靶细胞。因此，本公开内容还涉及用于在对象中将mrna递送至靶细胞的方法，所述方法包括向对象施用本文中所述的mrna颗粒。在一个实施方案中，mrna被递送至靶细胞的胞质溶胶。在一个实施方案中，mrna是编码肽或蛋白质的mrna，并且rna被靶细胞翻译以产生肽或蛋白质。[0620]“编码”是指多核苷酸(例如基因、cdna或mrna)中的特定核苷酸序列用作在生物过程中合成其他聚合物和大分子的模板的固有特性，所述其他聚合物和大分子具有限定的核苷酸序列(即，rrna、trna和mrna)或限定的氨基酸序列和由其产生的生物学特性。因此，如果与基因对应的mrna的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mrna序列相同且通常在序列表中提供)和非编码链(用作基因或cdna的转录模板)二者均可称为编码该蛋白质或者该基因或cdna的其他产物。[0621]在一个实施方案中，本公开内容中使用的mrna包含编码一种或更多种多肽(例如，肽或蛋白质、优选药物活性肽或蛋白质)的核酸序列。[0622]在一个优选实施方案中，本公开内容中使用的mrna包含编码肽或蛋白质、优选药物活性肽或蛋白质的核酸序列，并且能够表达所述肽或蛋白质，特别是如果转移到细胞或对象中的话。因此，本公开内容中使用的mrna优选地包含编码肽或蛋白质、优选地编码药物活性肽或蛋白质的编码区(开放阅读框(orf))。在这方面中，“开放阅读框”或“orf”是从起始密码子开始以终止密码子结束的连续的密码子区段。这样的编码药物活性肽或蛋白质的mrna在本文中也称为“药物活性mrna”。[0623]根据本公开内容，术语“药物活性肽或蛋白质”意指这样的肽或蛋白质，其可用于治疗个体(在该个体中肽或蛋白质的表达将是有益的)，例如，在改善疾病或病症的症状中。优选地，药物活性肽或蛋白质具有治愈或姑息特性，并且可被施用以改善、减轻、缓解、逆转疾病或病症的一种或更多种症状、延迟疾病或病症的一种或更多种症状的发作或者减轻疾病或病症的一种或更多种症状的严重程度。优选地，当以治疗有效量施用于个体时，药物活性肽或蛋白质对个体的病症或疾病状态具有积极或有利的作用。药物活性肽或蛋白质可具有预防特性，并且可用于延迟疾病或病症的发作或者减轻这样的疾病或病症的严重程度。术语“药物活性肽或蛋白质”包括完整的蛋白质或多肽，并且还可指其药物活性片段。它还可包括肽或蛋白质的药物活性类似物。[0624]药物活性肽和蛋白质的一些具体实例包括但不限于细胞因子、激素、黏附分子、免疫球蛋白、免疫活性化合物、生长因子、蛋白酶抑制剂、酶、受体、凋亡调节剂、转录因子、肿瘤抑制蛋白、结构蛋白、重编程因子、基因组工程蛋白和血液蛋白。[0625]术语“细胞因子”涉及分子量为约5至20kda并参与细胞信号传导(例如，旁分泌、内分泌和/或自分泌信号传导)的蛋白质。特别地，当释放时，细胞因子对其释放位置周围的细胞行为产生影响。细胞因子的一些实例包括淋巴因子、白介素、趋化因子、干扰素和肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor，tnf)。根据本公开内容，细胞因子不包括激素或生长因子。细胞因子与激素的不同之处在于：(i)它们通常以比激素更加可变的浓度发挥作用，以及(ii)通常由广泛范围的细胞产生(几乎所有有核细胞均可以产生细胞因子)。干扰素通常特征在于抗病毒、抗增殖和免疫调节活性。干扰素是通过与所调节细胞表面上的干扰素受体结合来改变和调节细胞内基因的转录从而防止细胞内病毒复制的蛋白质。干扰素可分为两种类型。ifn-γ是唯一的ii型干扰素；所有其他均为i型干扰素。细胞因子的一些具体实例包括促红细胞生成素(erythropoietin，epo)、集落刺激因子(colonystimulatingfactor，csf)、粒细胞集落刺激因子(granulocytecolonystimulatingfactor，g-csf)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor，gm-csf)、肿瘤坏死因子(tnf)、骨形态发生蛋白(bonemorphogeneticprotein，bmp)、α干扰素(interferonalfa，ifnα)、β干扰素(interferonbeta，ifnβ)、γ干扰素(interferongamma，infγ)、白介素2(il-2)、白介素4(il-4)、白介素10(il-10)、白介素11(il-11)、白介素12(il-12)和白介素21(il-21)。[0626]在一个实施方案中，药物活性肽或蛋白质包含替代蛋白。在该实施方案中，本公开内容提供了用于治疗患有需要蛋白质替代(proteinreplacement)的病症(例如，蛋白质缺乏症)的对象的方法，所述方法包括向对象施用编码替代蛋白质的如本文所述的rna。术语“蛋白质替代”是指将蛋白质(包括其功能变体)引入到缺乏这样的蛋白质的对象中。该术语还指以其他方式将蛋白质引入需要或受益于提供蛋白质的对象(例如患有蛋白质不足的对象)中。术语“特征在于蛋白质缺乏的病症”是指表现出由蛋白质缺乏或蛋白质的量不足而引起的病理状况的任何病症。该术语涵盖导致生物上无活性的蛋白质产物的蛋白质折叠病症，即构象病症。蛋白质不足可涉及感染性疾病、免疫抑制、器官衰竭、腺体问题、放射病、营养缺乏、中毒或其他环境或外部损伤。[0627]术语“激素”涉及由腺体产生的一类信号传导分子，其中信号传导通常包括以下步骤：(i)在特定组织中合成激素；(ii)储存和分泌；(iii)将激素转运至其靶标；(iv)受体与激素结合；(v)信号的传递和放大；以及(vi)激素的分解。激素与细胞因子的不同之处在于：(1)激素通常以较小的可变浓度发挥作用，以及(2)通常由特定种类的细胞产生。在一个实施方案中，“激素”是肽或蛋白质激素，例如胰岛素、升压素、催乳素、促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropichormone，acth)、甲状腺激素、生长激素(例如人生长激素或牛生长激素)、催产素、心房钠尿肽(atrial-natriureticpeptide，anp)、胰高血糖素、生长抑素、胆囊收缩素、胃泌素和瘦素。[0628]术语“黏附分子”涉及位于细胞表面上并且参与细胞与另一些细胞或与细胞外基质(extracellularmatrix，ecm)结合的蛋白质。黏附分子通常是跨膜受体，并且可分类为钙非依赖性(例如整合素、免疫球蛋白超家族、淋巴细胞归巢受体)和钙依赖性(钙黏着蛋白和选择素)。黏附分子的一些具体实例是整合素、淋巴细胞归巢受体、选择素(例如，p-选择素)和地址素。[0629]整合素也参与信号转导。特别地，在配体结合后，整合素调节细胞信号传导途径，例如跨膜蛋白激酶(例如受体酪氨酸激酶(receptortyrosinekinase，rtk))的途径。这样的调节可导致细胞生长、分裂、存活或分化或者凋亡。整合素的一些具体实例包括：α1β1、α2β1、α3β1、α4β1、α5β1、α6β1、α7β1、αlβ2、αmβ2、αiibβ3、αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8和α6β4。[0630]术语“免疫球蛋白”或“免疫球蛋白超家族”意指参与细胞的识别、结合和/或黏附过程的分子。属于该超家族的分子的共同特征是其包含被称为免疫球蛋白结构域或折叠的区域。免疫球蛋白超家族的一些成员包括抗体(例如，igg)、t细胞受体(tcellreceptor，tcr)、主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex，mhc)分子、共受体(例如，cd4、cd8、cd19)、抗原受体辅助分子(例如，cd-3γ、cd3-δ、cd-3ε、cd79a、cd79b)、共刺激性或抑制性分子(例如，cd28、cd80、cd86)等。[0631]术语“免疫活性化合物”涉及改变免疫应答的任何化合物，优选通过诱导和/或抑制免疫细胞成熟，诱导和/或抑制细胞因子生物合成，和/或通过刺激b细胞产生抗体改变体液免疫进行。免疫活性化合物具有有效的免疫刺激活性，包括但不限于抗病毒和抗肿瘤活性，并且还可下调免疫应答的另一些方面，例如将免疫应答从th2免疫应答移开，这对于治疗广泛的th2介导的疾病是有用的。免疫活性化合物可用作疫苗佐剂。免疫活性化合物的一些具体实例包括白介素、集落刺激因子(csf)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、促红细胞生成素、肿瘤坏死因子(tnf)、干扰素、整合素、地址素、选择素、归巢受体和抗原，特别是肿瘤相关抗原、病原体相关抗原(例如细菌、寄生物或病毒抗原)、变应原和自身抗原。优选的免疫活性化合物是疫苗抗原，即接种到对象中诱导免疫应答的抗原。[0632]术语“自身抗原”或“自体抗原”是指源自对象体内(即，自身抗原也可以称为“自体抗原”)并且其产生针对身体的该正常部分的异常剧烈免疫应答的抗原。这样的针对自身抗原的剧烈免疫反应可能是“自身免疫病”的原因。[0633]术语“变应原”是指源自对象身体外部(即，变应原也可称为“异源抗原”)并且其产生异常剧烈的免疫应答的一类抗原，其中对象的免疫系统对抗原本对对象无害的感知到的威胁。“变态反应”是由针对变应原的这样的剧烈免疫反应引起的疾病。变应原通常是能够在特应性个体中通过免疫球蛋白e(immunoglobuline，ige)应答刺激i型超敏反应的抗原。变应原的一些具体实例包括来源于花生蛋白(例如，arah2.02)、卵清蛋白、草花粉蛋白(例如，phlp5)和尘螨蛋白(例如，derp2)的变应原。[0634]术语“生长因子”是指能够刺激细胞生长、增殖、愈合和/或细胞分化的分子。通常而言，生长因子充当细胞之间的信号传导分子。术语“生长因子”包括与其靶细胞表面上的特定受体结合的特定细胞因子和激素。生长因子的一些实例包括骨形态发生蛋白(bmp)、成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor，fgf)、血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，vegf)(例如vegfa)、表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，egf)、胰岛素样生长因子、肝配蛋白(ephrin)、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、神经调节蛋白、神经营养因子(例如，脑源性神经营养因子(brain-derivedneurotrophicfactor，bdnf)、神经生长因子(nervegrowthfactor，ngf))、胎盘生长因子(placentalgrowthfactor，pgf)、血小板来源生长因子(platelet-derivedgrowthfactor，pdgf)、肾酶(renalase，rnls)(抗凋亡生存因子)、t细胞生长因子(t-cellgrowthfactor，tcgf)、血小板生成素(thrombopoietin，tpo)、转化生长因子(转化生长因子α(transforminggrowthfactoralpha，tgf-α)、转化生长因子β(transforminggrowthfactorbeta，tgf-β))和肿瘤坏死因子-α(tnf-α)。在一个实施方案中，“生长因子”是肽或蛋白质生长因子。[0635]术语“蛋白酶抑制剂”是指抑制蛋白酶功能的分子，特别是肽或蛋白质。蛋白酶抑制剂可通过被抑制的蛋白酶(例如，天冬氨酸蛋白酶抑制剂)或通过其作用机制(例如，自杀抑制剂，例如丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin))进行分类。蛋白酶抑制剂的一些具体实例包括丝氨酸蛋白酶抑制剂，例如α1-抗胰蛋白酶、抑肽酶和苯丁抑制素(bestatin)。[0636]术语“酶”是指加速化学反应的大分子生物催化剂。像任何催化剂一样，酶在其催化的反应中不被消耗，并且不改变所述反应的平衡。与许多另一些催化剂不同，酶的特异性要高得多。在一个实施方案中，酶对于对象的稳态是必不可少的，例如，酶的任何功能障碍(特别是活性降低，其可由突变、缺失或产生降低中的任一者引起)均导致疾病。酶的一些实例包括单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(herpessimplexvirustype1thymidinekinase，hsv1-tk)、己糖胺酶、苯丙氨酸羟化酶、假胆碱酯酶和乳糖酶。[0637]术语“受体”是指从细胞外接收信号(特别是称为配体的化学信号)的蛋白质分子。信号(例如配体)与受体的结合引起细胞的一些类型的响应，例如激酶的细胞内激活。受体包括跨膜受体(例如离子通道连接(离子移变)受体、g蛋白连接(代谢)受体和酶连接受体)以及胞内受体(例如胞质受体和核受体)。受体的一些具体实例包括类固醇激素受体、生长因子受体和肽受体(即，其配体为肽的受体)，例如p-选择素糖蛋白配体-1(p-selectinglycoproteinligand-1，psgl-1)。术语“生长因子受体”是指与生长因子结合的受体。[0638]术语“凋亡调节剂”是指调节凋亡的分子，特别是肽或蛋白质，即激活或抑制凋亡的分子。凋亡调节剂可分为两大类：调节线粒体功能的那些和调节胱天蛋白酶的那些。第一类包括用于通过阻止线粒体膜电位的损失和/或促凋亡蛋白质(例如细胞色素c)释放到胞质溶胶中来维持线粒体完整性的蛋白质(例如，bcl-2、bcl-xl)。促进细胞色素c释放的促凋亡蛋白(例如，bax、bak、bim)也属于第一类。第二类包括这样的蛋白质，例如凋亡蛋白抑制剂(例如，xiap)或flip，其阻断胱天蛋白酶的激活。[0639]术语“转录因子”涉及调节遗传信息从dna转录到信使rna的速率的蛋白质，特别是通过与特定dna序列结合来进行。转录因子可在整个生命中调节细胞分裂、细胞生长和细胞死亡；在胚胎发育期间调节细胞迁移和组织；和/或响应于来自细胞外的信号(例如激素)。转录因子包含至少一个与特定dna序列结合的dna结合结构域，通常与受转录因子调节的基因相邻。转录因子的一些具体实例包括mecp2、foxp2、foxp3、stat蛋白家族和hox蛋白家族。[0640]术语“肿瘤抑制蛋白”涉及保护细胞免于致癌途径上的一个步骤的分子，特别是肽或蛋白质。肿瘤抑制蛋白(通常由相应的肿瘤抑制基因编码)在调节细胞周期方面表现出弱化或抑制作用和/或促进凋亡。其功能可能是以下中的一种或更多种：抑制持续细胞周期所必需的基因；使细胞周期与dna损伤关联(只要细胞中存在受损的dna，就不应发生细胞分裂)；如果受损的dna无法修复，则启动凋亡；转移抑制(例如，阻止肿瘤细胞扩散，阻断接触抑制的损失以及抑制转移)；以及dna修复。肿瘤抑制蛋白的一些具体实例包括p53、磷酸酶和张力蛋白同源物(pten)、swi/snf(switch/不可发酵蔗糖)(switch/sucrosenon-fermentable)、vonhippel–lindau肿瘤抑制物(pvhl)、腺瘤性结肠息肉病(adenomatouspolyposiscoli，apc)、cd95、肿瘤发生抑制蛋白5(suppressionoftumorigenicity5，st5)、肿瘤发生抑制蛋白5(st5)、肿瘤发生抑制蛋白14(st14)和yippee样3(yippee-like，ypel3)。[0641]术语“结构蛋白”是指赋予原本为流体的生物组分以硬度和刚性的蛋白质。结构蛋白主要是纤维状的(例如胶原蛋白和弹性蛋白)，但也可以是球形的(例如肌动蛋白和微管蛋白)。通常而言，球形蛋白作为单体溶解，但是聚合以形成例如可以构成细胞骨架的长纤维。另一些结构蛋白是能够产生机械力的运动蛋白(例如肌球蛋白、驱动蛋白和动力蛋白)以及表面活性蛋白。结构蛋白的一些具体实例包括胶原蛋白、表面活性蛋白a、表面活性蛋白b、表面活性蛋白c、表面活性蛋白d、弹性蛋白、微管蛋白、肌动蛋白和肌球蛋白。[0642]术语“重编程因子”或“重编程转录因子”涉及这样的分子，特别是肽或蛋白质，当其在体细胞中表达(任选地与另一些试剂例如另一些重编程因子一起)时，导致所述体细胞重编程或去分化成具有干细胞特征，特别是多能性的细胞。重编程因子的一些具体实例包括oct4、sox2、c-myc、klf4、lin28和nanog。[0643]术语“基因组工程蛋白”涉及能够插入、缺失或替换对象基因组中dna的蛋白质。基因组工程蛋白的一些具体实例包括兆核酸酶、锌指核酸酶(zincfingernuclease，zfn)、转录激活因子样效应子核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornuclease，talen)和成簇规则间隔的短回文重复序列-crispr相关蛋白9(crispr-cas9)。[0644]术语“血液蛋白质”涉及存在于对象的血浆中，特别是健康对象的血浆中的肽或蛋白质。血液蛋白具有多种功能，例如运输(例如，白蛋白、转铁蛋白)、酶活性(例如，凝血酶或铜蓝蛋白)、血液凝固(例如，纤维蛋白原)、针对病原体的防御(例如，补体组分和免疫球蛋白)、蛋白酶抑制剂(例如，α1-抗胰蛋白酶)等。血液蛋白的一些具体实例包括凝血酶、血清白蛋白、因子vii、因子viii、胰岛素、因子ix、因子x、组织纤溶酶原激活剂、蛋白c、冯·维勒布兰德因子(vonwillebrandfactor)、抗凝血酶iii、葡糖脑苷脂酶、促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、经修饰因子viii和抗凝剂。[0645]因此，在一个实施方案中，药物活性肽或蛋白质是(i)细胞因子，优选选自促红细胞生成素(epo)、白介素4(il-2)和白介素10(il-11)，更优选epo；(ii)黏附分子，特别是整联蛋白；(iii)免疫球蛋白，特别是抗体；(iv)免疫活性化合物，特别是抗原；(v)激素，特别是升压素、胰岛素或生长激素；(vi)生长因子，特别是vegfa；(vii)蛋白酶抑制剂，特别是α1-抗胰蛋白酶；(viii)酶，优选选自单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(hsv1-tk)、己糖胺酶、苯丙氨酸羟化酶、假胆碱酯酶、胰酶和乳糖酶；(ix)受体，特别是生长因子受体；(x)凋亡调节剂，特别是bax；(xi)转录因子，特别是foxp3；(xii)肿瘤抑制蛋白，特别是p53；(xiii)结构蛋白，特别是表面活性蛋白b；(xiv)重编程因子，例如，选自oct4、sox2、c-myc、klf4、lin28和nanog；(xv)基因组工程蛋白，特别是成簇规则间隔的短回文重复序列-crispr相关蛋白9(crispr-cas9)；以及(xvi)血液蛋白，特别是纤维蛋白原。[0646]在一个实施方案中，药物活性肽或蛋白质包含一种或更多种抗原或者一种或更多种表位，即向对象施用所述肽或蛋白质在对象中引发针对所述一种或更多种抗原或者一种或更多种表位的免疫应答，其可以是治疗性的或者部分或完全保护性的。[0647]在某些实施方案中，mrna编码至少一个表位。[0648]在某些实施方案中，表位来源于肿瘤抗原。肿瘤抗原可以是“标准”抗原，通常已知其在多种癌症中表达。肿瘤抗原也可以是“新抗原”，其是个体的肿瘤所特有的，并且之前未被免疫系统识别。新抗原或新表位可以由癌细胞基因组中导致氨基酸变化的一个或更多个癌症特异性突变引起。肿瘤抗原的一些实例包括但不限于p53，art-4，bage，β-联蛋白/m，bcr-ablcamel，cap-1，casp-8，cdc27/m，cdk4/m，cea，密封蛋白家族的细胞表面蛋白例如密封蛋白-6、密封蛋白-18.2和密封蛋白-12，c-myc，ct，cyp-b，dam，elf2m，etv6-aml1，g250，gage，gnt-v，gap100，hage，her-2/neu，hpv-e7，hpv-e6，hast-2，htert(或htrt)，lage，ldlr/fut，mage-a优选mage-a1、mage-a2、mage-a3、mage-a4、mage-a5、mage-a6、mage-a7、mage-a8、mage-a9、mage-a10、mage-a11、或mage-a12、mage-b、mage-c，mart-1/melan-a，mc1r，肌球蛋白/m，muc1，mum-1，mum-2，mum-3，na88-a，nf1，ny-eso-1，ny-br-1，pl90minorbcr-abl，pml/rara，prame，蛋白酶3，psa，psm，rage，ru1或ru2，sage，sart-1或sart-3，scgb3a2，scp1，scp2，scp3，ssx，存活蛋白，tel/aml1，tpi/m，trp-1，trp-2，trp-2/int2，tpte，wt和wt-1。[0649]癌症突变随每个个体而异。因此，编码新的表位(新表位)的癌症突变在疫苗组合物和免疫治疗的开发中代表有吸引力的靶标。肿瘤免疫治疗的效力取决于能够在宿主内诱导强效免疫应答的癌症特异性抗原和表位的选择。rna可用于将患者特异性肿瘤表位递送至患者。驻留在脾中的树突细胞(dc)代表对免疫原性表位或抗原(例如肿瘤表位)的rna表达特别感兴趣的抗原呈递细胞。已表明，多表位的使用促进肿瘤疫苗组合物的治疗效力。肿瘤突变组的快速测序可为个体化疫苗提供多个表位，其可以由本文中所述的rna编码，例如作为单一多肽，其中表位任选地被接头分开。在本公开内容的某些实施方案中，mrna编码至少一个表位、至少两个表位、至少三个表位、至少四个表位、至少五个表位、至少六个表位、至少七个表位、至少八个表位、至少九个表位或至少十个表位。一些示例性的实施方案包括编码至少五个表位(称为“五表位(pentatope)”)的mrna和编码至少十个表位(称为“十表位(decatope)”)的mrna。[0650]在某些实施方案中，表位来源于病原体相关抗原，特别是来源于病毒抗原。在一个实施方案中，表位来源于sars-cov-2s蛋白、其免疫原性变体、或者sars-cov-2s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段。因此，在一个实施方案中，本公开内容中使用的mrna编码包含sars-cov-2s蛋白、其免疫原性变体或者sars-cov-2s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列。[0651]在本公开内容的一个实施方案中，抗原(例如肿瘤抗原或疫苗抗原)优选以在进入施用rna的对象的细胞时翻译成相应的蛋白质之单链5’加帽的mrna进行施用。优选地，rna包含针对rna在稳定性和翻译效率方面的最大效力而优化的结构元件(5’帽、5’utr、3’utr、poly(a)序列)。[0652]在一个实施方案中，β-s-arca(d1)用作mrna5’端的特定加帽结构。在一个实施方案中，m27，3’‑ogppp(m12’‑o)apg用作mrna5’端处的特定加帽结构。在一个实施方案中，5’‑utr序列来源于人α-珠蛋白mrna并且任选地具有优化的“kozak序列”以提高翻译效率。在一个实施方案中，将来源于“氨基末端分裂增强子”(aminoterminalenhancerofsplit，aes)mrna(称为f)和线粒体编码的12s核糖体rna(称为i)的两个序列元件(fi元件)的组合置于编码序列与poly(a)序列之间以确保更高的最大蛋白质水平和mrna的延长的持久性。在一个实施方案中，将来源于人β-珠蛋白mrna的两个重复的3’‑utr置于编码序列与poly(a)序列之间，以确保更高的最大蛋白质水平和mrna的延长的持久性。在一个实施方案中，使用测量长度为110个核苷酸的poly(a)序列，其由以下组成：30个腺苷残基区段，随后是10个核苷酸接头序列和另外70个腺苷残基。这种poly(a)序列被设计成用于增强rna稳定性和翻译效率。[0653]在一个实施方案中，编码抗原(例如肿瘤抗原或疫苗抗原)的mrna在所治疗对象的细胞中表达以提供抗原。在一个实施方案中，mrna在对象的细胞中瞬时表达。在一个实施方案中，mrna在体外转录。在一个实施方案中，抗原的表达在细胞表面。在一个实施方案中，抗原在mhc的背景下表达和呈递。在一个实施方案中，抗原的表达进入胞外空间，即抗原是分泌的。[0654]抗原分子或其加工产物(例如，其片段)可以与抗原受体(例如由免疫效应细胞携带的bcr或tcr)结合或者与抗体结合。[0655]通过施用编码肽和蛋白质抗原的mrna而向根据本公开内容的对象提供的肽和蛋白质抗原(其中所述抗原是疫苗抗原)优选导致在被提供肽或蛋白质抗原的对象中诱导免疫应答，例如体液和/或细胞免疫应答。所述免疫应答优选针对靶抗原。因此，疫苗抗原可包含靶抗原、其变体，或者其片段。在一个实施方案中，这样的片段或变体在免疫学上与靶抗原等同。在本公开内容的上下文中，术语“抗原的片段”或“抗原的变体”意指导致诱导免疫应答的试剂，所述免疫应答靶向该抗原(即靶抗原)。因此，疫苗抗原可对应于或可包含靶抗原，可对应于或可包含靶抗原的片段，或者可对应于或可包含与靶抗原或其片段同源的抗原。因此，根据本公开内容，疫苗抗原可包含靶抗原的免疫原性片段或与靶抗原的免疫原性片段同源的氨基酸序列。根据本公开内容的“抗原的免疫原性片段”优选地涉及能够诱导针对靶抗原的免疫应答的抗原片段。疫苗抗原可以是重组抗原。[0656]术语“免疫学上等同的”意指免疫学上等同的分子，例如免疫学上等同的氨基酸序列表现出相同或基本上相同的免疫特性和/或发挥相同或基本上相同的免疫学作用，例如对于免疫学作用类型而言。在本公开内容的上下文中，术语“免疫学上等同的”优选地关于用于免疫接种的抗原或抗原变体的免疫学作用或特性使用。例如，如果氨基酸序列在暴露于对象的免疫系统时诱导具有与参考氨基酸序列反应的特异性的免疫反应，则所述氨基酸序列与该参考氨基酸序列在免疫学上等同。[0657]在一个实施方案中，本公开内容中使用的mrna是非免疫原性的。编码免疫刺激剂的rna可根据本公开内容施用以提供佐剂作用。编码免疫刺激剂的rna可以是标准rna或非免疫原性rna。[0658]本文中使用的术语“非免疫原性rna”(例如“非免疫原性mrna”)是指在向例如哺乳动物施用时不诱导通过免疫系统的应答的rna，或相比于由相同rna(不同之处仅在于其没有经受使非免疫原性rna无免疫原性的修饰和处理)诱导，即相比于由标准rna(standardrna，stdrna)所诱导的应答，诱导更弱的应答的rna。在一个优选实施方案中，通过将抑制rna介导的固有免疫受体激活的经修饰核苷并入到rna中并除去双链rna(double-strandedrna，dsrna)使非免疫原性rna(本文中也称为经修饰rna(modifiedrna，modrna))无免疫原性。[0659]为了通过并入经修饰核苷而使得非免疫原性的rna(尤其是mrna)成为非免疫原性的，可使用任何经修饰核苷，只要其降低或抑制rna的免疫原性即可。特别优选的是抑制rna介导的固有免疫受体激活的经修饰核苷。在一个实施方案中，经修饰核苷包含用包含经修饰核碱基的核苷对一个或更多个尿苷的替换。在一个实施方案中，经修饰核碱基是经修饰尿嘧啶。在一个实施方案中，包含经修饰核碱基的核苷选自3-甲基尿苷(m3u)、5-甲氧基-尿苷(mo5u)、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷(s2u)、4-硫代-尿苷(s4u)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho5u)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤代-尿苷(例如，5-碘代-尿苷或5-溴代-尿苷)、尿苷5-羟乙酸(cmo5u)、尿苷5-羟乙酸甲酯(mcmo5u)、5-羧甲基-尿苷(cm5u)、1-羧甲基-假尿苷、5-羧基羟甲基-尿苷(chm5u)、5-羧基羟甲基-尿苷甲酯(mchm5u)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm5u)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm5s2u)、5-氨甲基-2-硫代-尿苷(nm5s2u)、5-甲基氨甲基-尿苷(mnm5u)、1-乙基-假尿苷、5-甲基氨甲基-2-硫代-尿苷(mnm5s2u)、5-甲基氨甲基-2-硒代-尿苷(mnm5se2u)、5-氨甲酰基甲基-尿苷(ncm5u)、5-羧甲基氨甲基-尿苷(cmnm5u)、5-羧甲基氨甲基-2-硫代-尿苷(cmnm5s2u)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(τm5u)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷(τm5s2u)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷)、5-甲基-2-硫代-尿苷(m5s2u)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮杂-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮杂-假尿苷、二氢尿苷(d)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m5d)、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、n1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp3u)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨甲基)尿苷(inm5u)、5-(异戊烯基氨甲基)-2-硫代-尿苷(inm5s2u)、α-硫代-尿苷、2’‑o-甲基-尿苷(um)、5,2’‑o-二甲基-尿苷(m5um)、2’‑o-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫代-2’‑o-甲基-尿苷(s2um)、5-甲氧基羰基甲基-2’‑o-甲基-尿苷(mcm5um)、5-氨甲酰基甲基-2’‑o-甲基-尿苷(ncm5um)、5-羧甲基氨甲基-2’‑o-甲基-尿苷(cmnm5um)、3,2’‑o-二甲基-尿苷(m3um)、5-(异戊烯基氨甲基)-2’‑o-甲基-尿苷(inm5um)、1-硫代-尿苷、脱氧胸苷、2’‑f-阿糖-尿苷、2’‑f-尿苷、2’‑oh-阿糖-尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷以及5-[3-(1-e-丙烯基氨基)尿苷。在一个特别优选的实施方案中，包含经修饰核碱基的核苷是假尿苷(ψ)、n1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5u)，特别是n1-甲基-假尿苷。[0660]在一个实施方案中，用包含经修饰核碱基的核苷替换一个或更多个尿苷包括替换至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少75％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的尿苷。[0661]在使用t7rna聚合酶通过体外转录(ivt)合成mrna期间，由于该酶的非常规活性产生了大量异常产物，包括双链rna(dsrna)。dsrna诱导炎性细胞因子并激活效应酶，导致蛋白质合成抑制。可以例如使用非多孔或多孔c-18聚苯乙烯-二乙烯基苯(polystyrene-divinylbenzene，ps-dvb)基质通过离子对反相hplc，将dsrna从rna(例如ivtrna)中去除。或者，可使用基于酶的方法，其使用特异性水解dsrna而非水解ssrna的大肠杆菌rnaseiii，从而从ivtrna制备物中消除dsrna污染物。此外，可通过使用纤维素材料将dsrna与ssrna分离。在一个实施方案中，使rna制备物与纤维素材料接触，并且在允许dsrna与纤维素材料结合并且不允许ssrna与纤维素材料结合的条件下使ssrna从纤维素材料中分离。用于提供ssrna的合适方法在例如wo2017/182524中公开。[0662]本文中使用的术语“去除”是指将第一物质群体(例如非免疫原性rna)的特征与第二物质群体(例如dsrna)的邻近区域分离，其中第一物质群体不一定缺少第二物质，并且第二物质群体不一定缺少第一物质。然而，与第一物质和第二物质的未分离混合物相比，以去除第二物质群体为特征的第一物质群体具有可测量的较低的第二物质含量。[0663]在一个实施方案中，从非免疫原性rna中去除dsrna(特别是mrna)包括去除dsrna，使得非免疫原性rna组合物中少于10％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％、少于1％、少于0.5％、少于0.3％或少于0.1％的rna是dsrna。在一个实施方案中，非免疫原性rna(特别是mrna)不含或基本上不含dsrna。在一些实施方案中，非免疫原性rna(特别是mrna)组合物包含单链核苷经修饰rna的纯化制备物。例如，在一些实施方案中，单链核苷经修饰rna(特别是mrna)的纯化制备物基本上不含双链rna(dsrna)。在一些实施方案中，相对于所有其他核酸分子(dna、dsrna等)，经纯化的制备物是至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少99.9％的单链核苷经修饰rna。[0664]在一个实施方案中，非免疫原性rna(特别是mrna)在细胞中的翻译比具有相同序列的标准rna更有效。在一个实施方案中，翻译相对于其未经修饰的对应物增强了2倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了3倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了4倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了5倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了6倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了7倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了8倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了9倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了10倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了15倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了20倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了50倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了100倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了200倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了500倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了1000倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了2000倍因数。在一个实施方案中，因数是10至1000倍。在一个实施方案中，因数是10至100倍。在一个实施方案中，因数是10至200倍。在一个实施方案中，因数是10至300倍。在一个实施方案中，因数是10至500倍。在一个实施方案中，因数是20至1000倍。在一个实施方案中，因数是30至1000倍。在一个实施方案中，因数是50至1000倍。在一个实施方案中，因数是100至1000倍。在一个实施方案中，因数是200至1000倍。在一个实施方案中，翻译增强了任何其他显著的量或量的范围。[0665]在一个实施方案中，非免疫原性rna(特别是mrna)表现出比具有相同序列的标准rna显著更少的固有免疫原性。在一个实施方案中，非免疫原性rna(特别是mrna)表现出是其未经修饰的对应物2倍少的固有免疫应答。在一个实施方案中，固有免疫原性降低了3倍因数。在一个实施方案中，固有免疫原性降低了4倍因数。在一个实施方案中，固有免疫原性降低了5倍因数。在一个实施方案中，固有免疫原性降低了6倍因数。在一个实施方案中，固有免疫原性降低了7倍因数。在一个实施方案中，固有免疫原性降低了8倍因数。在一个实施方案中，固有免疫原性降低了9倍因数。在一个实施方案中，固有免疫原性降低了10倍因数。在一个实施方案中，固有免疫原性降低了15倍因数。在一个实施方案中，固有免疫原性降低了20倍因数。在一个实施方案中，固有免疫原性降低了50倍因数。在一个实施方案中，固有免疫原性降低了100倍因数。在一个实施方案中，固有免疫原性降低了200倍因数。在一个实施方案中，固有免疫原性降低了500倍因数。在一个实施方案中，固有免疫原性降低了1000倍因数。在一个实施方案中，固有免疫原性降低了2000倍因数。[0666]术语“表现出显著更少的固有免疫原性”是指固有免疫原性的可检测的降低。在一个实施方案中，该术语是指降低使得可施用有效量的非免疫原性rna(特别是mrna)，而不触发可检测的固有免疫应答。在一个实施方案中，该术语是指降低使得可重复施用非免疫原性rna(特别是mrna)，而不引起足以可检测地降低由非免疫原性rna编码的蛋白质的产生的固有免疫应答。在一个实施方案中，该降低使得可重复施用非免疫原性rna(特别是mrna)，而不引起足以消除由非免疫原性rna编码的蛋白质的可检测地产生的固有免疫应答。[0667]“免疫原性”是外来物质(例如rna)在人或另一些动物身体中引发免疫应答的能力。固有免疫系统是免疫系统中相对非特异性和即时性的组成部分。其与适应性免疫系统一起，是脊椎动物免疫系统的两个主要组分之一。[0668]本文中使用的“内源性”是指来自或产生于生物体、细胞、组织或系统内部的任何物质。[0669]本文中使用的术语“外源性”是指从生物体、细胞、组织或系统外部引入或产生的任何物质。[0670]本文中使用的术语“表达”定义为特定核苷酸序列的转录和/或翻译。[0671]本文中使用的术语“连接的”、“融合的”或“融合/融合体”可互换使用。这些术语是指将两个或更多个要素或组分或结构域连接在一起。[0672]颗粒[0673]先前已描述了不同类型的包含rna的颗粒适合于以颗粒形式递送rna(参见，例如，kaczmarek,j.c.etal.,2017,genomemedicine9,60)。对于非病毒rna递送载剂，rna的纳米粒包封物理地保护rna免于降解，并且根据特定的化学性质，可协助细胞摄取和内体逃逸。[0674]带正电荷的分子(例如聚合物和脂质)与带负电荷的核酸之间的静电相互作用参与颗粒形成。这导致核酸颗粒的复合和自发形成。[0675]在本公开内容的上下文中，术语“颗粒”涉及由分子或分子复合物(特别是颗粒形成化合物)形成的结构化实体。优选地，颗粒包含由一种或更多种类型的两亲性物质(例如，两亲性脂质、两亲性聚合物和/或两亲性蛋白质/多肽)制成的包膜(例如，一层或更多层或薄层)。在本文中，表述“两亲性物质”意指物质具有亲水性和亲脂性特性二者。包膜还可包含不具有两亲性的另外的物质(例如，另外的脂质和/或另外的聚合物)。因此，颗粒可以是单层或多层结构，其中构成一层或更多层或薄层的物质包含一种或更多种类型的两亲性物质(特别是选自两亲性脂质、两亲性聚合物和/或两亲性蛋白质/多肽)，任选地与不具有两亲性的另外的物质(例如另外的脂质和/或另外的聚合物)组合。在一个实施方案中，术语“颗粒”涉及微米或纳米尺寸的结构，例如微米或纳米尺寸的密实结构。在该方面中，术语“微米尺寸”意指颗粒的所有三种外部尺寸均是微米级的，即为1至5μm。根据本公开内容，术语“颗粒”包括脂质复合物颗粒(lipoplexparticle，lpx)、脂质纳米粒(lnp)、聚合复合物颗粒(polyplexparticle)、脂质聚合复合物颗粒(lipopolyplexparticle)、病毒样颗粒(virus-likeparticle，vlp)及其混合物(例如，两种或更多种颗粒类型的混合物，例如lpx与vlp的混合物或lnp与vlp的混合物)。[0676]“核酸颗粒”可用于将核酸递送至目的靶位点(例如，细胞、组织、器官等)。核酸颗粒可以由至少一种阳离子或阳离子可电离脂质或类脂质物质、至少一种阳离子聚合物例如鱼精蛋白或其混合物以及核酸形成。核酸颗粒包括基于脂质纳米粒(lnp)的制剂和基于脂质复合物(lpx)的制剂。[0677]不旨在受任何理论的束缚，认为阳离子的或阳离子可电离的脂质或类脂质物质和/或阳离子聚合物与核酸结合在一起形成聚集体，并且该聚集体产生胶体稳定的颗粒。[0678]在一个实施方案中，除阳离子可电离脂质之外，本文中所述的颗粒还包含至少一种脂质或类脂质物质。[0679]在一些实施方案中，核酸颗粒(特别是mrna颗粒例如mrnalnp)包含多于一种类型的核酸分子，其中核酸分子的分子参数可彼此类似或不同，如关于摩尔质量或基本结构元素，例如分子结构、加帽、编码区或其他特征。[0680]如在本公开内容中使用的，“纳米粒”是指包含如本文中所述的核酸(特别是mrna)和至少一种阳离子脂质的颗粒，其中颗粒的所有三种外部尺寸均是纳米级的，即至少约1nm且低于约1000nm(优选地，10至990nm，例如15至900nm、20至800nm、30至700nm、40至600nm、或50至500nm)。优选地，最长轴和最短轴没有明显不同。优选地，颗粒的尺寸是其直径。[0681]本文中所述的核酸颗粒(特别是mrna颗粒，例如mrnalnp)可表现出多分散性指数(polydispersityindex，pdi)小于约0.5、小于约0.4、小于约0.3、小于约0.2、小于约0.1或小于约0.05。举例来说，核酸颗粒可表现出多分散性指数为约0.01至约0.4或约0.1至约0.3。[0682]在本公开内容的上下文中，术语“脂质复合物颗粒”涉及包含两亲性脂质(特别是阳离子两亲性脂质)和本文中所述核酸(特别是mrna)的颗粒。带正电荷的脂质体(由一种或更多种两亲性脂质，特别是阳离子两亲性脂质制成)与带负电荷的核酸(特别是mrna)之间的静电相互作用导致核酸脂质复合物颗粒的复合和自发形成。带正电荷的脂质体通常可以使用阳离子两亲性脂质(例如dotma)和另外的脂质(例如dope)来合成。在一个实施方案中，核酸(特别是mrna)脂质复合物颗粒是纳米粒。[0683]术语“脂质纳米粒”涉及纳米尺寸的含有脂质的颗粒。[0684]在本公开内容的上下文中，术语“聚合复合物颗粒”涉及包含两亲性聚合物(特别是阳离子两亲性聚合物)和如本文中所述核酸(特别是mrna)的颗粒。带正电荷的阳离子两亲性聚合物与带负电荷的核酸(特别是mrna)之间的静电相互作用导致核酸聚合复合物颗粒的复合和自发形成。适合于制备聚合复合物颗粒的带正电荷的两亲性聚合物包括鱼精蛋白、聚乙烯亚胺、聚-l-赖氨酸、聚-l-精氨酸和组蛋白。在一个实施方案中，核酸(特别是mrna)聚合复合物颗粒是纳米粒。[0685]术语“脂质聚合复合物颗粒”涉及包含如本文中所述的两亲性脂质(特别是阳离子两亲性脂质)、如本文中所述的两亲性聚合物(特别是阳离子两亲性聚合物)以及如本文中所述的核酸(特别是mrna)的颗粒。在一个实施方案中，核酸(特别是mrna)脂质聚合复合物颗粒是纳米粒。[0686]术语“病毒样颗粒”(本文中缩写为vlp)是指非常类似于病毒但其不包含所述病毒的任何遗传物质并因此是非感染性的分子。优选地，vlp包含如本文中所述的核酸(优选rna)，所述核酸(优选rna)对于vlp所源自的病毒是异源的。vlp可通过病毒结构蛋白的单独表达来合成，其然后可以自组装成病毒样结构。在一个实施方案中，来自不同病毒的结构衣壳蛋白的组合可用于产生重组vlp。vlp可由多种病毒家族的组分产生，所述病毒家族包括乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus，hbv)(小hbv来源表面抗原(hbsag))、细小病毒科(例如，腺相关病毒)、乳头瘤病毒科(例如，hpv)、逆转录病毒科(例如，hiv)、黄病毒科(例如，丙型肝炎病毒)以及噬菌体(例如，qβ、ap205)。[0687]术语“含有核酸的颗粒”涉及与核酸(特别是mrna)结合的如本文中所述的颗粒。在该方面中，核酸(特别是mrna)可黏附至颗粒的外表面(表面核酸(特别是表面mrna))和/或可包含在颗粒中(包封的核酸(特别是包封的mrna))。[0688]在一个实施方案中，在本公开内容的方法和用途中使用的颗粒的尺寸(优选直径，即半径加倍例如回转半径(rg)值加倍或流体动力学半径加倍)为约10至约2000nm，例如至少约15nm(优选至少约20nm、至少约25nm、至少约30nm、至少约35nm、至少约40nm、至少约45nm、至少约50nm、至少约55nm、至少约60nm、至少约65nm、至少约70nm、至少约75nm、至少约80nm、至少约85nm、至少约90nm、至少约95nm或至少约100nm)和/或至多1900nm(优选至多约1900nm、至多约1800nm、至多约1700nm、至多约1600nm、至多约1500nm、至多约1400nm、至多约1300nm、至多约1200nm、至多约1100nm、至多约1000nm、至多约950nm、至多约900nm、至多约850nm、至多约800nm、至多约750nm、至多约700nm、至多约650nm、至多约600nm、至多约550nm或至多约500nm)，优选为约20至约1500nm，例如约30至约1200nm、约40至约1100nm、约50至约1000nm、约60至约900nm、约70至800nm、约80至700nm、约90至600nm或约50至500nm或约100至500nm，例如为10至1000nm、15至500nm、20至450nm、25至400nm、30至350nm、40至300nm、50至250nm、60至200nm或70至150nm。[0689]关于rna脂质颗粒(特别是mrna颗粒例如mrnalnp)，n/p比率给出了脂质中氮基团与rna中磷酸基团数目的比率。其与电荷比相关，因为氮原子(取决于ph)通常带正电荷，而磷酸基团带负电荷。存在电荷平衡的n/p比率取决于ph。脂质制剂通常以大于4，高达12的n/p比率形成，因为认为带正电荷的纳米粒有利于转染。在这种情况下，认为rna与纳米粒完全结合。[0690]本文中所述的核酸颗粒(特别是mrna颗粒，例如mrnalnp)可使用广泛范围的方法制备，所述方法可涉及从至少一种阳离子或阳离子可电离的脂质和/或至少一种阳离子聚合物获得胶体，并将所述胶体与核酸混合以获得核酸颗粒。[0691]本文中使用的术语“胶体”涉及其中分散的颗粒不沉降的均匀混合物类型。混合物中的不溶性颗粒是微观的，颗粒尺寸为1至1000纳米。该混合物可称为胶体或胶体混悬液。有时，术语“胶体”仅指混合物中的颗粒，而不是整个混悬液。[0692]对于包含至少一种阳离子的或阳离子可电离的脂质和/或至少一种阳离子聚合物的胶体的制备，在本文中可应用常规用于制备脂质体囊泡并适当地进行调整的方法。最常用的用于制备脂质体囊泡的方法共有以下基本阶段：(i)脂质在有机溶剂中的溶解，(ii)将所得溶液干燥，以及(iii)将干燥脂质水合(使用多种水性介质)。[0693]在膜水合法中，首先将脂质溶解在合适的有机溶剂中，并完全干燥(drydown)以在烧瓶底部产生薄膜。使用适当的水性介质将获得的脂质膜水合以产生脂质体分散体。此外，可包括另外的缩减(downsizing)步骤。[0694]反相蒸发是用于制备脂质体囊泡的膜水合的替代方法，其涉及在水相与含有脂质的有机相之间形成油包水乳液。体系均质化需要对该混合物进行简短的声处理。在减压下除去有机相产生乳状凝胶，其随后变成脂质体混悬液。[0695]术语“乙醇注射技术”是指其中通过针将包含脂质的乙醇溶液快速注射到水溶液中的过程。该作用将脂质分散在整个溶液中并促进脂质结构形成，例如脂质囊泡形成例如脂质体形成。通常而言，本文中所述的核酸(特别是mrna)脂质复合物颗粒可通过将核酸(特别是mrna)添加至胶体脂质体分散体来获得。在一个实施方案中，使用乙醇注射技术，如下形成这样的胶体脂质体分散体：在搅拌下将包含脂质(例如阳离子脂质(如dotma)和另外的脂质)的乙醇溶液注射到水溶液中。在一个实施方案中，本文中所述的核酸(特别是mrna)脂质复合物颗粒无需挤出步骤即可获得。[0696]术语“挤出”及其变化形式是指产生具有固定的截面轮廓的颗粒。特别地，其是指颗粒的缩减，由此迫使颗粒通过具有限定孔的过滤器。[0697]根据本公开内容，也可使用具有无有机溶剂特征的另一些方法来制备胶体。[0698]lnp通常包含四种组分：可电离的阳离子脂质、中性脂质例如磷脂、类固醇例如胆固醇以及聚合物缀合的脂质。每种组分均负责有效载荷保护，并实现有效的胞内递送。可通过将溶解在乙醇中的脂质与核酸在水性缓冲液中迅速混合来制备lnp。[0699]先前已描述了不同类型的包含核酸的颗粒适合于以颗粒形式递送核酸(参见，例如，kaczmarek,j.c.etal.,2017,genomemedicine9,60)。对于非病毒核酸递送载剂，核酸的纳米粒包封物理地保护核酸免于降解，并且根据特定的化学性质，可有助于细胞摄取和内体逃逸。[0700]在一个优选实施方案中，本文中所述的包含mrna和至少一种阳离子可电离脂质的lnp还包含一种或更多种另外的脂质。[0701]在一个实施方案中，本文中所述的包含mrna和至少一种阳离子可电离脂质的lnp通过以下进行制备：(a)制备包含水和缓冲系统的mrna溶液；(b)制备包含阳离子可电离脂质和(如果有的话)一种或更多种另外的脂质的乙醇溶液；以及(c)将在(a)中制备的mrna溶液与在(b)中制备的乙醇溶液混合，从而制备包含lnp的制剂。在步骤(c)之后，可以接着进行一个或更多个选自稀释和过滤(例如切向流过滤)的步骤。[0702]在一个替代实施方案中，本文中所述的包含mrna和至少一种阳离子可电离脂质的lnp通过以下进行制备：(a’)制备阳离子可电离脂质和(如果有的话)一种或更多种另外的脂质在水相中的脂质体或胶体制备物；和(b’)制备包含水和缓冲系统的mrna溶液；以及(c’)将在(a’)中制备的脂质体或胶体制备物与在(b’)中制备的mrna溶液混合。在步骤(c’)之后，可以接着进行一个或更多个选自稀释和过滤(例如切向流过滤)的步骤。[0703]本公开内容描述了包含mrna(尤其是包含mrna的lnp)和至少一种与mrna缔合以形成核酸颗粒的阳离子可电离脂质的颗粒以及包含这样的颗粒的组合物。mrna颗粒可包含通过非共价相互作用以不同形式与颗粒复合的mrna。本文中所述的颗粒不是病毒颗粒，特别不是感染性的病毒颗粒，即它们不能病毒性地感染细胞。[0704]合适的阳离子可电离脂质是形成核酸颗粒的那些，并且包含在术语“颗粒形成组分”或“颗粒形成剂”中。术语“颗粒形成组分”或“颗粒形成剂”涉及与核酸缔合以形成核酸颗粒的任何组分。这样的组分包括可以是核酸颗粒一部分的任何组分。[0705]阳离子可电离脂质[0706]本文中所述的核酸颗粒包含至少一种阳离子可电离脂质作为颗粒形成剂。考虑用于本文的阳离子可电离脂质包括能够静电结合核酸的任何阳离子可电离脂质或类脂质物质。在一个实施方案中，考虑用于本文的阳离子可电离脂质可与核酸缔合，例如通过与核酸形成复合物或者形成其中围住或包封核酸的囊泡。[0707]如本文中使用的，“阳离子脂质”或“阳离子类脂质物质”是指具有净正电荷的脂质或类脂质物质。阳离子脂质或类脂质物质通过静电相互作用与带负电荷的核酸结合。通常而言，阳离子脂质具有亲脂性部分，例如固醇、酰基链、二酰基链或更多个酰基的链，并且脂质的头基通常带有正电荷。[0708]在某些实施方案中，阳离子脂质或类脂质物质仅在特定ph，特别是酸性ph下具有净正电荷，而在不同的优选更高的ph例如生理ph下，其优选不具有净正电荷，优选不具有电荷，即其是中性的。与在生理ph下保持阳离子的颗粒相比，这种可电离的行为被认为通过帮助内体逃逸和降低毒性来增强效力。[0709]如本文中使用的，“阳离子可电离脂质”是指具有净正电荷或中性的脂质或类脂质物质，即不是永久性阳离子的脂质。因此，取决于其中溶解阳离子可电离脂质的组合物的ph，阳离子可电离脂质是带正电荷的或中性的。[0710]在一个实施方案中，阳离子可电离脂质包含含有至少一个氮原子(n)的头基，所述氮原子带正电荷或者能够被质子化，优选在生理条件下。[0711]阳离子可电离脂质的一些实例公开于例如，wo2016/176330和wo2018/078053。在一些实施方案中，阳离子可电离脂质具有式(i)结构：[0712][0713]或其可药用盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：[0714]l1和l2中一者是-o(c＝o)-，-(c＝o)o-，-c(＝o)-，-o-，-s(o)x-，-s-s-，-c(＝o)s-，-sc(＝o)-，-nrac(＝o)-，-c(＝o)nra-，nrac(＝o)nra-，-oc(＝o)nra-或-nrac(＝o)o-，并且l1和l2中另一者是-o(c＝o)-，-(c＝o)o-，-c(＝o)-，-o-，-s(o)x-，-s-s-，-c(＝o)s-，sc(＝o)-，-nrac(＝o)-，-c(＝o)nra-，nrac(＝o)nra-，-oc(＝o)nra-或-nrac(＝o)o-或直接键；[0715]g1和g2各自独立地是未经取代的c1-c12亚烷基或c2-c12亚烯基；[0716]g3是c1-c24亚烷基、c2-c24亚烯基、c3-c8亚环烷基、c3-c8亚环烯基；[0717]ra是h或c1-c12烷基；[0718]r1和r2各自独立地是c6-c24烷基或c6-c24烯基；[0719]r3是h、or5、cn、-c(＝o)or4、-oc(＝o)r4或-nrsc(＝o)r4；[0720]r4是c1-c12烷基；[0721]r5是h或c1-c6烷基；并且[0722]x是0、1或2。[0723]在式(iii)之前述实施方案中的一些中，脂质具有以下结构(iiia)或(iiib)之一：[0724][0725]其中：[0726]a是3至8元的环烷基或亚环烷基；[0727]r6在每次出现时独立地是h、oh或c1-c24烷基；[0728]n是1至15的整数。[0729]在式(iii)之前述实施方案中的一些中，脂质具有结构(iiia)，并且在另一些实施方案中，脂质具有结构(iiib)。[0730]在式(i)的另一些实施方案中，脂质具有以下结构(ic)或(id)之一：[0731][0732]其中y和z各自独立地是1至12的整数。[0733]在式(i)之前述实施方案中的任一个中，l1和l2中一者是-o(c＝o)-。例如，在一些实施方案中，l1和l2各自均是-o(c＝o)-。在任意前述中的一些不同实施方案中，l1和l2各自独立地是-(c＝o)o-或-o(c＝o)-。例如，在一些实施方案中，l1和l2各自是-(c＝o)o-。[0734]在式(i)的一些不同实施方案中，脂质具有以下结构(ie)或(if)之一：[0735][0736]在式(i)之前述实施方案中的一些中，脂质具有以下结构(ig)、(ih)、(ij)或(ik)之一：[0737][0738]在式(i)之前述实施方案中的一些中，n是2至12的整数，例如2至8或2至4。例如，在一些实施方案中，n是3、4、5或6。在一些实施方案中，n是3。在一些实施方案中，n是4。在一些实施方案中，n是5。在一些实施方案中，n是6。[0739]在式(i)之前述实施方案中的另一些实施方案中，y和z各自独立地是2至10的整数。例如，在一些实施方案中，y和z各自独立地是4至9或4至6的整数。[0740]在式(i)前述实施方案中的一些中，r6是h。在前述实施方案中的另一些中，r6是c1-c24烷基。在另一些实施方案中，r6是oh。[0741]在式(i)的一些实施方案中，g3是未经取代的。在另一些实施方案中，g3是经取代的。在多个不同的实施方案中，g3是线性c1-c24亚烷基或线性c2-c24亚烯基。[0742]在式(i)的另一些前述实施方案中，r1或r2或二者均是c6至c24烯基。例如，在一些实施方案中，r1和r2各自独立地具有以下结构：[0743][0744]其中：[0745]r7a和r7b在每次出现时独立地是h或c1-c12烷基；并且[0746]a是2至12的整数，[0747]其中r7a、r7b和a各自选择成使得r1和r2各自独立地包含6至20个碳原子。例如，在一些实施方案中，a为5至9或8至12的整数。[0748]在式(i)前述实施方案中的一些中，r7a的至少一次出现是h。例如，在一些实施方案，r7a在每次出现时均是h。在前述中的另一些不同实施方案中，r7b的至少一次出现是c1-c8烷基。例如，在一些实施方案中，c1-c8烷基是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基或正辛基。[0749]在式(i)一些不同实施方案中，r1或r2或二者具有以下结构之一：[0750][0751]在式(i)之前述实施方案中的一些中，r3是oh、cn、-c(＝o)or4、-oc(＝o)r4或-nhc(＝o)r4。在一些实施方案中，r4是甲基或乙基。[0752]在多个不同的实施方案中，式(i)阳离子脂质具有下述结构之一。[0753]式(i)代表性化合物。[0754][0755][0756][0757][0758][0759]在多个不同的实施方案中，阳离子可电离脂质具有下表中所述的结构之一。[0760][0761]在多个不同的实施方案中，阳离子可电离脂质选自n,n-二甲基-2,3-二油烯基氧基丙胺(dodma)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(dodap)、三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(dlin-mc3-dma)和4-((二((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)氨基)氧基)-n’,n’‑二甲基-4-氧代丁烷-1-胺(dpl-14)。[0762]阳离子可电离脂质的另一些实例包括但不限于3-(n-(n’,n’‑二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(dc-chol)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(dodap)；1,2-二酰氧基-3-二甲基铵丙烷；1,2-二烷氧基-3-二甲基铵丙烷、1,2-二硬脂基氧基-n,n-二甲基-3-氨基丙烷(dsdma)、1,2-二乙烯基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlindma)、1,2-二亚麻基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlendma)、双十八烷基酰胺基甘氨酰精胺(dogs)、3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁烷-4-氧基)-1-(顺式,顺式-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(clindma)、2-[5’‑(胆甾-5-烯-3-β-氧基)-3’‑氧杂戊氧基)-3-二甲基-1-(顺式,顺式-9’,12’‑十八碳二烯氧基)丙烷(cplindma)、n,n-二甲基-3,4-二油烯基氧基苄胺(dmoba)、1,2-n,n′‑二油烯基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(docarbdap)、2,3-二亚油酰基氧基-n,n-二甲基丙胺(dlindap)、1,2-n,n’‑二亚油基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(dlincarbdap)、1,2-二亚油酰基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(dlincdap)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(dlin-k-dma)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(dlin-k-xtc2-dma)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(dlin-kc2-dma)、三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(dlin-mc3-dma)、2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-n,n-二甲基-3-[(9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(辛基-clindma)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-二甲基铵-丙烷(dmdap)、1,2-二棕榈酰基-3-二甲基铵-丙烷(dpdap)、n1-[2-((1s)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基甲酰氨基)乙基]-3,4-二[油烯基氧基]-苯甲酰胺(mvl5)、二((z)-壬-2-烯-1-基)8,8’‑((((2(二甲基氨基)乙基)硫基)羰基)氮烷二基)二辛酸酯(atx)、n,n-二甲基-2,3-双(十二烷基氧基)丙烷-1-胺(dldma)、n,n-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)丙烷-1-胺(dmdma)、二((z)-壬-2-烯-1-基)-9-((4-(二甲基氨基丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(l319)、n-十二烷基-3-((2-十二烷基氨基甲酰基-乙基)-{2-[(2-十二烷基氨基甲酰基-乙基)-2-{(2-十二烷基氨基甲酰基-乙基)-[2-(2-十二烷基氨基甲酰基-乙基氨基)-乙基]-氨基}-乙基氨基)丙酰胺(lipidoid98n12-5)、1-[2-[双(2-羟基十二烷基)氨基]乙基-[2-[4-[2-[双(2羟基十二烷基)氨基]乙基]哌嗪-1-基]乙基]氨基]十二烷-2-醇(lipidoidc12-200)。[0763]在一些实施方案中，阳离子可电离脂质可占颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约100mol％、约20mol％至约100mol％、约30mol％至约100mol％、约40mol％至约100mol％、或约50mol％至约100mol％。[0764]在一个实施方案中，其中本文中所述的颗粒(特别是lnp，优选包含mrna的lnp)包含阳离子可电离脂质和一种或更多种另外的脂质，阳离子可电离脂质占颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约80mol％、约20mol％至约60mol％、约25mol％至约55mol％、约30mol％至约50mol％、约35mol％至约45mol％、或约40mol％。[0765]在一个实施方案中，本文中所述的颗粒(特别是lnp，优选包含mrna的lnp)包含40至55mol％、40至50mol％、41至49mol％、41至48mol％、42至48mol％、43至48mol％、44至48mol％、45至48mol％、46至48mol％、47至48mol％或47.2至47.8mol％的阳离子可电离脂质。一个实施方案中，颗粒(特别是lnp，优选包含mrna的lnp)包含约47.0、47.1、47.2、47.3、47.4、47.5、47.6、47.7、47.8、47.9或48.0mol％的阳离子可电离脂质。[0766]另外的脂质[0767]本文中所述的颗粒还可包含除阳离子可电离脂质之外的脂质或类脂质物质，即非阳离子脂质或类脂质物质(包括非阳离子可电离脂质或类脂质物质)。阴离子脂质或类脂质物质和中性脂质或类脂质物质在本文中统称为非阳离子脂质或类脂质物质。除阳离子可电离脂质之外，还通过添加其他疏水性部分(例如胆固醇和脂质)对核酸颗粒的制剂进行优化可以增强颗粒稳定性和核酸递送的效力。[0768]术语“脂质”和“类脂质物质”在本文中被广泛定义为包含一个或更多个疏水性部分或基团以及任选地一个或更多个亲水性部分或基团的分子。包含疏水性部分和亲水性部分的分子也经常被称为两亲体。脂质通常难溶于水。在水性环境中，两亲性性质允许分子自组装成有组织的结构和不同的相。那些相之一由脂质双层组成，当它们存在于囊泡、多层/单层脂质体或水环境中的膜时。可通过包含非极性基团来赋予疏水性，所述非极性基团包括但不限于长链饱和和不饱和脂族烃基以及被以下取代的这样的基团：一个或更多个芳族、脂环族或杂环基团。亲水性基团可包含极性和/或带电荷基团，并且包括碳水化合物、磷酸根、羧基、硫酸根、氨基、巯基、硝基、羟基和其他类似基团。[0769]如本文中使用的，术语“两亲”是指具有极性部分和非极性部分二者的分子。两亲化合物通常具有与长疏水尾连接的极性头部。在一些实施方案中，极性部分可溶于水，而非极性部分不溶于水。另外，极性部分可具有形式正电荷(formalpositivecharge)或形式负电荷(formalnegativecharge)。或者，极性部分可具有形式正电荷和负电荷二者，并且可以是两性离子或内盐。处于本公开内容的目的，两亲化合物可以是但不限于一种或更多种的天然或非天然脂质和类脂质化合物。[0770]术语“类脂质物质”、“类脂质化合物”或“类脂质分子”涉及与脂质在结构和/或功能上相关但在严格意义上不能视为脂质的物质。例如，该术语包括当其存在于囊泡、多层/单层脂质体或水环境中的膜时能够形成两亲层的化合物，并且包括表面活性剂或具有亲水性和疏水性部分二者的合成化合物。一般而言，该术语是指这样的分子，其包含亲水性和疏水性部分，其具有可以与或可以不与脂质类似的不同结构组织。除非本文中另外指出或明显与上下文相矛盾，否则如本文中使用的术语“脂质”应被解释为包括脂质和类脂质物质二者。[0771]可包含在两亲层中的两亲化合物的一些具体实例包括但不限于磷脂、氨基脂质和鞘脂。[0772]在某些实施方案中，两亲化合物是脂质。术语“脂质”是指特征在于不溶于水，但可溶于许多有机溶剂的一组有机化合物。通常而言，脂质可分成八个类别：脂肪酸、甘油脂质、甘油磷脂、鞘脂、糖脂、聚酮(来源于酮酯酰亚基的缩合)、固醇脂质和孕烯醇酮脂类(来源于异戊二烯亚基的缩合)。尽管有时将术语“脂质”用作脂肪的同义词，但脂肪是称为甘油三酯的脂质亚组。脂质还涵盖分子例如脂肪酸及其衍生物(包括甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和磷脂)，以及类固醇即包含固醇的代谢物例如胆固醇或其衍生物。胆固醇衍生物的一些实例包括但不限于胆甾烷醇(cholestanol)、胆甾烷酮(cholestanone)、胆甾烯酮(cholestenone)、粪甾烷醇(coprostanol)、胆甾醇基-2’‑羟乙基醚、胆甾醇基-4’‑羟丁基醚、生育酚及其衍生物，及其混合物。[0773]脂肪酸或脂肪酸残基是由终止于羧酸基团的烃链构成的不同分子基团；这种排列赋予该分子以极性的亲水端和不溶于水的非极性疏水端。通常长为4至24个碳的碳链可以是饱和或不饱和的，并且可与包含氧、卤素、氮和硫的官能团连接。如果脂肪酸包含双键，则可能存在顺式或反式几何异构，这显著影响分子构型。顺式双键导致脂肪酸链弯曲，即一种与链中更多的双键复合的效应。脂肪酸类别中的另一些主要脂质种类是脂肪酯和脂肪酰胺。[0774]甘油脂质由单取代甘油、双取代甘油和三取代甘油构成，最著名的是甘油脂肪酸三酯，称为甘油三酯。词语“三酰甘油”有时与“甘油三酯”同义使用。在这些化合物中，甘油的三个羟基通常各自被不同的脂肪酸酯化。另外的甘油脂质亚类以糖基甘油为代表，其特征在于存在通过糖苷键与甘油连接的一个或更多个糖残基。[0775]甘油磷脂是两亲性分子(包含疏水区和亲水区二者)，其包含通过酯键联与两个脂肪酸来源的“尾”连接和通过磷酸根键联与一个“头”基连接的甘油核心。甘油磷脂(通常称为磷脂(尽管鞘磷脂也被归类为磷脂))的一些实例是磷脂酰胆碱(也称为pc、gpcho或卵磷脂)、磷脂酰乙醇胺(pe或gpetn)和磷脂酰丝氨酸(ps或gpser)。[0776]鞘脂是享有共同的结构特征——鞘氨醇碱(sphingoidbase)骨架的复杂的化合物家族。哺乳动物中主要的鞘氨醇碱通常被称为鞘氨醇。神经酰胺(n-酰基-鞘氨醇碱)是具有酰胺连接的脂肪酸的鞘氨醇碱衍生物的主要亚类。脂肪酸通常是饱和的或单不饱和的，链长度为16至26个碳原子。哺乳动物的主要磷酸鞘脂(phosphosphingolipid)是鞘磷脂(神经酰胺磷酸胆碱)，而昆虫主要包含神经酰胺磷酸乙醇胺并且真菌具有植物神经酰胺磷酸肌醇和含甘露糖的头基。鞘糖脂是由通过糖苷键与鞘氨醇碱连接的一个或更多个糖残基构成的不同分子家族。这些中的一些实例是简单和复杂的鞘糖脂，例如脑苷脂和神经节苷脂。[0777]固醇脂质(例如胆固醇及其衍生物或者生育酚及其衍生物)与甘油磷脂和鞘磷脂一起是膜脂质的重要组分。[0778]糖脂描述的是其中脂肪酸与糖骨架直接连接从而形成与膜双层相容的结构的化合物。在糖脂中，单糖替代了存在于甘油脂质和甘油磷脂中的甘油骨架。最熟悉的糖脂是革兰氏阴性菌中脂多糖的脂质a组分的酰化葡糖胺前体。典型的脂质a分子是葡糖胺的二糖，其被多达七个脂肪酰基链衍生化。在大肠杆菌中生长所需的最小脂多糖是kdo2-脂质a，即被两个3-脱氧-d-甘露糖-辛酮糖酸(kdo)残基糖基化的葡糖胺六酰化二糖。[0779]聚酮是通过经典酶以及与脂肪酸合酶共享机械特征的迭代和多模块酶通过乙酰基和丙酰基亚基的聚合而合成的。它们包含来自动物、植物、细菌、真菌和海洋来源的大量次级代谢物和天然产物，并且具有大的结构多样性。许多聚酮是其骨架通常通过糖基化、甲基化、羟基化、氧化或另一些过程进一步修饰的环状分子。[0780]根据本公开内容，脂质和类脂质物质可以是阳离子的、阴离子的或中性的。中性脂质或类脂质物质在选定的ph下以不带电荷或中性两性离子的形式存在。[0781]阳离子脂质和类脂质物质或阳离子可电离脂质和类脂质物质可用于与rna静电结合。阳离子可电离的脂质和类脂质物质是优选地仅在酸性ph下带正电荷的物质。与在生理ph下保持阳离子的颗粒相比，这种可电离的行为被认为通过帮助内体逃逸和降低毒性来增强效力。颗粒还可包含非阳离子脂质或类脂质物质。阴离子的脂质或类脂质物质以及中性的脂质或类脂质物质在本文中统称为非阳离子的脂质或类脂质物质。除可电离/阳离子的脂质或类脂质物质之外还通过添加其他疏水性部分(例如胆固醇和脂质)对rna颗粒的制剂进行优化增强了颗粒稳定性并且可显著增强rna递送的效力。[0782]可以并入可影响或可不影响核酸颗粒的总电荷的一种或更多种另外的脂质。在某些实施方案中另外的脂质或更多种另外的脂质是非阳离子脂质或类脂质物质。非阳离子脂质可包含例如一种或更多种阴离子脂质和/或中性脂质。本文中使用的“阴离子脂质”是指在选定ph下带负电荷的任何脂质。本文中使用的“中性脂质”是指在选定ph下以不带电荷或中性两性离子形式存在的许多脂质物质中的任一种。[0783]在某些实施方案中，本文中所述的核酸颗粒(特别是包含mrna的lnp)包含阳离子可电离脂质和一种或更多种另外的脂质。[0784]不希望受到理论的束缚，与一种或更多种另外的脂质的量相比，阳离子可电离脂质的量可影响重要的核酸颗粒特征，例如核酸的生物活性、电荷、颗粒尺寸、稳定性和组织选择性。因此，在一些实施方案中，阳离子可电离脂质与一种或更多种另外的脂质的摩尔比为约10:0至约1:9，约4:1至约1:2，或约3:1至约1:1。[0785]在一个实施方案中，包含在本文中所述的核酸颗粒(特别是包含mrna的lnp)中的一种或更多种另外的脂质包含以下中一种或更多种：中性脂质、类固醇、聚合物缀合的脂质、及其组合。[0786]在一个实施方案中，一种或更多种另外的脂质包含是磷脂的中性脂质。优选地，磷脂选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂。可使用的特定磷脂包括但不限于磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸或鞘磷脂。这样的磷脂特别是包括二酰基磷脂酰胆碱(diacylphosphatidylcholine)，例如二硬脂酰基磷脂酰胆碱(dspc)、二油酰基磷脂酰胆碱(dopc)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(dmpc)、双十五烷酰基磷脂酰胆碱、二月桂酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(dppc)、二花生酰基磷脂酰胆碱(dapc)、二萮炔酰基磷脂酰胆碱(dbpc)、双二十三烷酰基磷脂酰胆碱(dtpc)、双二十四酰基磷脂酰胆碱(dlpc)、棕榈酰基油酰基-磷脂酰胆碱(popc)、1,2-二-o-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0二醚pc)、1-油酰基-2-胆甾醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(ochemspc)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(c16lysopc)和磷脂酰乙醇胺，特别是二酰基磷脂酰乙醇胺，例如二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(dspe)、二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺(dppe)、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(dmpe)、二月桂酰基-磷脂酰乙醇胺(dlpe)、二植烷酰基-磷脂酰乙醇胺(dpype)、1,2-二-(9z-十八碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dopg)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1’‑外消旋甘油)(dppg)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(pope)、n-棕榈酰基-d-赤-鞘氨醇磷酸胆碱(sm)，以及具有不同疏水链的另一些磷脂酰乙醇胺脂质。在一个实施方案中，中性脂质选自dspc、dopc、dmpc、dppc、popc、dope、dopg、dppg、pope、dppe、dmpe、dspe和sm。在一个实施方案中，中性脂质选自dspc、dppc、dmpc、dopc、popc、dope和sm。在一个实施方案中，中性脂质是dspc。[0787]因此，在一个实施方案中，本文中所述的核酸颗粒(特别是包含mrna的lnp)包含阳离子可电离脂质和dspc。[0788]在一个实施方案中，中性脂质以5至15mol％、7至13mol％或9至11mol％的浓度存在于本文中所述的颗粒(特别是lnp，优选包含mrna的lnp)中。在一个实施方案中，中性脂质以本文中所述颗粒(特别是包含mrna的lnp)中存在的总脂质的约9.5、10或10.5mol％的浓度存在。[0789]在一个实施方案中，类固醇是胆固醇。因此，在一个实施方案中，核酸颗粒(特别是包含mrna的lnp)包含阳离子可电离脂质和胆固醇。[0790]在一个实施方案中，类固醇以30至50mol％、35至45mol％或38至43mol％的浓度存在于颗粒(特别是lnp，优选包含mrna的lnp)中。在一个实施方案中，类固醇以本文中所述颗粒(特别是包含mrna的lnp)中存在的总脂质的约40、41、42、43、44、45或46mol％的浓度存在。[0791]在某些优选实施方案中，本文中所述的核酸颗粒(特别是包含mrna的lnp)包含dspc和胆固醇，优选以上文给出的浓度。[0792]在一些实施方案中，中性脂质(特别是一种或更多种磷脂)和类固醇(特别是胆固醇)的组合浓度可占本文中所述的核酸颗粒(特别是包含mrna的lnp)中存在的总脂质的约0mol％至约90mol％、约0mol％至约80mol％、约0mol％至约70mol％、约0mol％至约60mol％、或约0mol％至约50mol％，例如约20mol％至约80mol％、约25mol％至约75mol％、约30mol％至约70mol％、约35mol％至约65mol％、或约40mol％至约60mol％。[0793]在一个实施方案中，聚合物缀合的脂质是聚乙二醇化脂质或聚肌氨酸-脂质缀合物或者聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物。[0794]术语“聚乙二醇化脂质”是指包含脂质部分和聚乙二醇部分二者的分子。聚乙二醇化脂质是本领域已知的。在一个实施方案中，聚合物缀合的脂质是聚乙二醇化脂质。在一个实施方案中，聚乙二醇化脂质具有以下结构：[0795][0796]或其可用盐、互变异构体或立体异构体，其中r12和r13各自独立地是含有10至30个碳原子的直链或支链烷基或烯基链，其中烷基或烯基链任选地间插有一个或更多个酯键；并且w的平均值为30至60。在一个实施方案中，r12和r13各自独立地是含有12至16个碳原子的直链饱和烷基链。在一个实施方案中，w的平均值为40至55。在一个实施方案中，平均w为约45。在一个实施方案中，r12和r13各自独立地是含有约14个碳原子的直链饱和烷基链，并且w的平均值为约45。[0797]在一个实施方案中，聚乙二醇化脂质是dmg-peg2000，例如，具有以下结构：[0798][0799]在一个实施方案中，本文中所述的核酸颗粒(特别是包含mrna的lnp)包含阳离子可电离的脂质和聚乙二醇化脂质，例如，如上定义的聚乙二醇化脂质。[0800]在一个实施方案中，聚乙二醇化脂质以本文中所述颗粒(特别是包含mrna的lnp)中存在的总脂质的1至10mol％、1至5mol％或1至2.5mol％的浓度存在于颗粒(特别是lnp，优选包含mrna的lnp)中。[0801]在一个实施方案中，聚合物缀合的脂质是聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物，即包含聚肌氨酸(聚(n-甲基甘氨酸))的脂质或类脂质物质。聚肌氨酸可包含乙酰化的(中性端基)或另一些官能化的端基。在rna-脂质颗粒的情况下，在一个实施方案中聚肌氨酸与颗粒中包含的非阳离子脂质或类脂质物质缀合，优选与其共价结合。[0802]在某些实施方案中，聚肌氨酸的端基可用以下来官能化：赋予某些特性(例如正电荷或负电荷)的一种或更多种分子部分，或者将颗粒定向到特定细胞类型、细胞群(collection)或组织的靶向剂。[0803]本领域已知多种合适的靶向剂。靶向剂的一些非限制性实例包括肽、蛋白质、酶、核酸、脂肪酸、激素、抗体、碳水化合物、单糖、寡糖或多糖、肽聚糖、糖肽等。例如，可使用与靶细胞表面上的抗原结合的多种不同物质中的任一种。靶细胞表面抗原的抗体通常会表现出对靶标的必要特异性。除抗体之外，还可使用合适的免疫反应性片段，例如fab、fab’、f(ab’)2或者scfv片段或单结构域抗体(例如骆驼科动物vhh片段)。本领域中已获得适合用于形成靶向机制的许多抗体片段。类似地，可适当使用靶细胞表面上任何受体的配体作为靶向剂。这些包括与存在于所期望的靶细胞表面处的细胞表面受体、蛋白质或糖蛋白特异性结合的任何天然或合成的小分子或生物分子。[0804]在某些实施方案中，聚肌氨酸包含2至200、2至190、2至180、2至170、2至160、2至150、2至140、2至130、2至120、2至110、2至100、2至90、2至80、2至70、5至200、5至190、5至180、5至170、5至160、5至150、5至140、5至130、5至120、5至110、5至100、5至90、5至80、5至70、10至200、10至190、10至180、10至170、10至160、10至150、10至140、10至130、10至120、10至110、10至100、10至90、10至80、或10至70个肌氨酸单元。[0805]在某些实施方案中，聚肌氨酸包含以下通式(ii)：[0806][0807]其中x是指肌氨酸单元的数目。通过该键中之一聚肌氨酸可与颗粒形成组分或疏水性组分连接。通过另一个键聚肌氨酸可与h、亲水性基团、可电离基团，或者与接头、与功能部分(例如靶向部分)连接。[0808]聚肌氨酸可与任何颗粒形成组分(例如脂质或类脂质物质)缀合，特别是与其共价结合或连接。聚肌氨酸-脂质缀合物是其中聚肌氨酸与本文中所述的脂质(例如阳离子脂质或阳离子可电离脂质或另外的脂质)缀合的分子。或者，聚肌氨酸与不同于阳离子可电离脂质或者一种或更多种另外的脂质的脂质或类脂质物质缀合。[0809]在某些实施方案中，聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物包含以下通式(iia)：[0810][0811]其中r1和r2中一者包含疏水性基团并且另一者是h、亲水性基团、可电离基团或任选地包含靶向部分的官能团。在一个实施方案中，疏水性基团包含线性或支链烷基或芳基，其优选地包含10至50、10至40或12至20个碳原子。在一个实施方案中，包含疏水性基团的r1或r2包含与一个或更多个线性或支链烷基连接的部分例如杂原子，特别是n。[0812]在某些实施方案中，聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物包含以下通式(iib)：[0813][0814]其中r是h、亲水性基团、可电离基团或任选地包含靶向部分的官能团。[0815]本文中通式，例如通式(iia)和(iib)中的符号“x”是指肌氨酸单元的数目，并且可以是本文中限定的数目。[0816]在某些实施方案中，聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物是选自以下的成员：聚肌氨酸-二酰基甘油缀合物、聚肌氨酸-二烷氧基丙基缀合物、聚肌氨酸-磷脂缀合物、聚肌氨酸-神经酰胺缀合物，及其混合物。[0817]通常而言，聚肌氨酸部分具有2至200、5至200、5至190、5至180、5至170、5至160、5至150、5至140、5至130、5至120、5至110、5至100、5至90、5至80、10至200、10至190、10至180、10至170、10至160、10至150、10至140、10至130、10至120、10至110、10至100、10至90、或10至80个肌氨酸单元。[0818]因此，在一个实施方案中，本文中所述的核酸颗粒(特别是包含mrna的lnp)包含阳离子可电离脂质和聚肌氨酸-脂质缀合物或者聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物，例如，如上所述的聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物。[0819]在某些情况下，聚肌氨酸-脂质缀合物可占本文中所述的核酸颗粒(特别是包含mrna的lnp)中存在的总脂质的约0.2mol％至约50mol％、约0.25mol％至约30mol％、约0.5mol％至约25mol％、约0.75mol％至约25mol％、约1mol％至约25mol％、约1mol％至约20mol％、约1mol％至约15mol％、约1mol％至约10mol％、约1mol％至约5mol％、约1.5mol％至约25mol％、约1.5mol％至约20mol％、约1.5mol％至约15mol％、约1.5mol％至约10mol％、约1.5mol％至约5mol％、约2mol％至约25mol％、约2mol％至约20mol％、约2mol％至约15mol％、约2mol％至约10mol％、或约2mol％至约5mol％。[0820]在一些实施方案中，一种或更多种另外的脂质包含以下组分之一：(1)中性脂质；(2)类固醇；(3)聚合物缀合的脂质；(4)中性脂质和类固醇的混合物；(5)中性脂质和聚合物缀合的脂质的混合物；(6)类固醇和聚合物缀合的脂质的混合物；或者(7)中性脂质、类固醇和聚合物缀合的脂质的混合物，优选各自以以上给定浓度。在一些实施方案中，一种或更多种另外的脂质包含以下组分之一：(1)磷脂；(2)胆固醇；(3)聚乙二醇化脂质；(4)磷脂和胆固醇的混合物；(5)磷脂和聚乙二醇化脂质的混合物；(6)胆固醇和聚乙二醇化脂质的混合物；或者(7)磷脂、胆固醇和聚乙二醇化脂质的混合物，优选各自以以上给定浓度。[0821]因此，在一些优选实施方案中，本文中所述的核酸颗粒(特别是包含mrna的lnp)包含阳离子可电离脂质和以下脂质或脂质混合物之一：(1)中性脂质；(2)类固醇；(3)聚合物缀合的脂质；(4)中性脂质和类固醇的混合物；(5)中性脂质和聚合物缀合的脂质的混合物；(6)类固醇和聚合物缀合的脂质的混合物；或(7)中性脂质、类固醇和聚合物缀合的脂质的混合物，优选各自以以上给定浓度。在一个具体实施方案中，阳离子可电离脂质以40至50mol％的浓度存在；中性脂质以5至15mol％的浓度存在；类固醇以35至45mol的浓度存在；以及聚合物缀合的脂质以1至10mol％的浓度存在，其中mrna包封在lnp内或与lnp缔合。[0822]在一些更优选实施方案中，本文中所述的核酸颗粒(特别是包含mrna的lnp)包含阳离子可电离脂质和以下脂质或脂质混合物之一：(1)磷脂；(2)胆固醇；(3)聚乙二醇化脂质；(4)磷脂和胆固醇的混合物；(5)磷脂和聚乙二醇化脂质的混合物；(6)胆固醇和聚乙二醇化脂质的混合物；或(7)磷脂、胆固醇和聚乙二醇化脂质的混合物，优选各自以以上给定浓度。在一个具体实施方案中，阳离子可电离脂质以40至50mol％的浓度存在；磷脂以5至15mol％的浓度存在；胆固醇以35至45mol的浓度存在；以及聚乙二醇化脂质以1至10mol％的浓度存在，其中mrna包封在lnp内或与lnp缔合。[0823]n/p值优选为至少约4。在一些实施方案中，n/p值为4至20、4至12、4至10、4至8或5至7。在一个实施方案中，n/p值为约6。[0824]在一个实施方案中，本文中所述的lnp的平均直径可为约30nm至约200nm，或约60nm至约120nm。[0825]一般来说，包含本文中所述mrna的lnp是可用于将rna递送至目的靶位点(例如，细胞、组织、器官等)的“rna-脂质颗粒”。rna-脂质颗粒通常由以下形成：阳离子可电离脂质(例如dodma)和一种或更多种另外的脂质，所述另外的脂质例如磷脂(例如，dspc)、类固醇(例如，胆固醇或其类似物)，以及聚合物缀合的脂质(例如，聚乙二醇化脂质或聚肌氨酸-脂质缀合物或者聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物)。[0826]不旨在受任何理论的束缚，认为阳离子可电离脂质和一种或更多种另外的脂质与rna组合在一起以形成胶体稳定的颗粒，其中核酸与脂质基质结合。[0827]在一些实施方案中，rna-脂质颗粒包含多于一种类型的rna分子，其中rna分子的分子参数可彼此类似或不同，如关于摩尔质量或基本结构要素，例如分子构造、加帽、编码区或其他特征。[0828]在一些实施方案中，mrna-脂质lnp除rna之外还包含(i)阳离子可电离脂质，其可占颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约80mol％、约20mol％至约60mol％、约25mol％至约55mol％、约30mol％至约50mol％、约35mol％至约45mol％、或约40mol％，(ii)中性脂质和/或类固醇(例如，一种或更多种磷脂和/或胆固醇)，其可占颗粒中存在的总脂质的约0mol％至约90mol％、约20mol％至约80mol％、约25mol％至约75mol％、约30mol％至约70mol％、约35mol％至约65mol％、或约40mol％至约60mol％，以及(iii)聚合物缀合的脂质(例如，聚乙二醇化脂质，其可占颗粒中存在的总脂质的1mol％至10mol％、1mol％至5mol％、或1mol％至2.5mol％；或者聚肌氨酸-脂质缀合物，其可占颗粒中存在的总脂质的约0.2mol％至约50mol％、约0.25mol％至约30mol％、约0.5mol％至约25mol％、约0.75mol％至约25mol％、约1mol％至约25mol％、约1mol％至约20mol％、约1mol％至约15mol％、约1mol％至约10mol％、约1mol％至约5mol％、约1.5mol％至约25mol％、约1.5mol％至约20mol％、约1.5mol％至约15mol％、约1.5mol％至约10mol％、约1.5mol％至约5mol％、约2mol％至约25mol％、约2mol％至约20mol％、约2mol％至约15mol％、约2mol％至约10mol％、或约2mol％至约5mol％)。[0829]在某些优选实施方案中，中性脂质包含磷脂，其为颗粒中存在的总脂质的约5mol％至约50mol％、约5mol％至约45mol％、约5mol％至约40mol％、约5mol％至约35mol％、约5mol％至约30mol％、约5mol％至约25mol％或约5mol％至约20mol％。[0830]在某些优选实施方案中，类固醇包含胆固醇或其衍生物，其为颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约80mol％、约10mol％至约70mol％、约15mol％至约65mol％、约20mol％至约60mol％、约25mol％至约55mol％或约30mol％至约50mol％。[0831]在某些优选实施方案中，中性脂质和类固醇包含以下的混合物：(i)磷脂例如dspc，其为颗粒中存在的总脂质的约5mol％至约50mol％、约5mol％至约45mol％、约5mol％至约40mol％、约5mol％至约35mol％、约5mol％至约30mol％、约5mol％至约25mol％、或约5mol％至约20mol％；以及(ii)胆固醇或其衍生物例如胆固醇，其为颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约80mol％、约10mol％至约70mol％、约15mol％至约65mol％、约20mol％至约60mol％、约25mol％至约55mol％或约30mol％至约50mol％。作为一个非限制性实例，包含磷脂和胆固醇之混合物的mrnalnp可包含dspc，其为颗粒中存在的总脂质的约5mol％至约50mol％、约5mol％至约45mol％、约5mol％至约40mol％、约5mol％至约35mol％、约5mol％至约30mol％、约5mol％至约25mol％、或约5mol％至约20mol％，以及胆固醇，其为颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约80mol％、约10mol％至约70mol％、约15mol％至约65mol％、约20mol％至约60mol％、约25mol％至约55mol％、或约30mol％至约50mol％。[0832]在一些实施方案中，rna-脂质颗粒除mrna之外还包含(i)阳离子可电离脂质(例如dodma)，其可占颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约80mol％、约20mol％至约60mol％、约25mol％至约55mol％、约30mol％至约50mol％、约35mol％至约45mol％、或约40mol％，(ii)dspc，其可占颗粒中存在的总脂质的约5mol％至约50mol％、约5mol％至约45mol％、约5mol％至约40mol％、约5mol％至约35mol％、约5mol％至约30mol％、约5mol％至约25mol％、或约5mol％至约20mol％，(iii)胆固醇，其可占颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约80mol％、约10mol％至约70mol％、约15mol％至约65mol％、约20mol％至约60mol％、约25mol％至约55mol％、或约30mol％至约50mol％，以及(iv)聚乙二醇化脂质，其可占颗粒中存在的总脂质的1mol％至10mol％、1mol％至5mol％、或1mol％至2.5mol％；或者(iv’)聚肌氨酸-脂质缀合物，其可占颗粒中存在的总脂质的约0.2mol％至约50mol％、约0.25mol％至约30mol％、约0.5mol％至约25mol％、约0.75mol％至约25mol％、约1mol％至约25mol％、约1mol％至约20mol％、约1mol％至约15mol％、约1mol％至约10mol％、约1mol％至约5mol％、约1.5mol％至约25mol％、约1.5mol％至约20mol％、约1.5mol％至约15mol％、约1.5mol％至约10mol％、约1.5mol％至约5mol％、约2mol％至约25mol％、约2mol％至约20mol％、约2mol％至约15mol％、约2mol％至约10mol％、或约2mol％至约5mol％。[0833]在一个实施方案中，本文中所述的mrnalnp的平均直径为约30nm至约1000nm、约30nm至约800nm、约30nm至约700nm、约30nm至约600nm、约30nm至约500nm、约30nm至约450nm、约30nm至约400nm、约30nm至约350nm、约30nm至约300nm、约30nm至约250nm、约30nm至约200nm、约30nm至约190nm、约30nm至约180nm、约30nm至约170nm、约30nm至约160nm、约30nm至约150nm、约50nm至约500nm、约50nm至约450nm、约50nm至约400nm、约50nm至约350nm、约50nm至约300nm、约50nm至约250nm、约50nm至约200nm、约50nm至约190nm、约50nm至约180nm、约50nm至约170nm、约50nm至约160nm、或约50nm至约150nm。[0834]在某些实施方案中，本文中所述的mrnalnp的平均直径为约40nm至约800nm、约50nm至约700nm、约60nm至约600nm、约70nm至约500nm、约80nm至约400nm、约150nm至约800nm、约150nm至约700nm、约150nm至约600nm、约200nm至约600nm、约200nm至约500nm、或约200nm至约400nm。[0835]本文中所述的mrnalnp(例如通过本文中所述方法制备的mrnalnp)表现出多分散性指数小于约0.5、小于约0.4、小于约0.3、小于约0.2、小于约0.1或约0.05或更小。举例来说，mrnalnp可表现出多分散性指数为约0.05至约0.2，例如约0.05至约0.1。[0836]在本公开内容的某些实施方案中，本文中所述的mrnalnp中的mrna的浓度为约0.002mg/ml至约5mg/ml、约0.002mg/ml至约2mg/ml、约0.005mg/ml至约2mg/ml、约0.01mg/ml至约1mg/ml、约0.05mg/ml至约0.5mg/ml、或约0.1mg/ml至约0.5mg/ml。在一些具体实施方案中，mrna的浓度为约0.005mg/ml至约0.1mg/ml、约0.005mg/ml至约0.09mg/ml、约0.005mg/ml至约0.08mg/ml、约0.005mg/ml至约0.07mg/ml、约0.005mg/ml至约0.06mg/ml或约0.005mg/ml至约0.005mg/ml[0837]包含rna颗粒的制剂[0838]本文中所述的制剂包含mrnalnp，优选多个mrnalnp。术语“多个mrnalnp”或“多个mrna-脂质颗粒”是指一定数目颗粒的群体。在某些实施方案中，该术语是指超过10、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019、1020、1021、1022或1023或更多个颗粒的群体。[0839]对本领域技术人员来说将明显的是，所述多个颗粒可包括前述范围的任何分数或其中的任意范围。[0840]在一些实施方案中，本文中所述的制剂是液体或固体，固体是指冷冻形式或冻干形式。[0841]本发明人出人意料地发现，在mrnalnp制剂中某些多价阴离子(例如柠檬酸或无机磷酸阴离子)的存在可导致在所述制剂被冷冻并随后解冻时(即在所述制剂经受至少一个冻融循环时)颗粒尺寸的增加，并且基本上不含柠檬酸和/或无机磷酸阴离子的mrna制剂可以在不增加颗粒尺寸的情况下冷冻和解冻。[0842]因此，根据本公开内容，本文中所述的制剂优选基本上不含柠檬酸和/或无机磷酸阴离子。在一个实施方案中，本文中所述的制剂优选基本上不含聚羧酸根阴离子和/或无机磷酸阴离子。[0843]本文中使用的表述“基本上不含x”意指混合物(例如本文中所述的制剂或药物组合物)以其实践上并实际可行的这样的方式不含x。例如，如果混合物基本上不含x，则基于混合物的总重量，混合物中x的量可以为小于1重量％(例如，小于0.5重量％、小于0.4重量％、小于0.3重量％、小于0.2重量％、小于0.1重量％、小于0.09重量％、小于0.08重量％、小于0.07重量％、小于0.06重量％、小于0.05重量％、小于0.04重量％、小于0.03重量％、小于0.02重量％、小于0.01重量％、小于0.005重量％、小于0.001重量％)。[0844]因此，如果本文中所述的mrna制剂基本上不含柠檬酸阴离子，则基于mrna制剂的总重量，优选mrna制剂中柠檬酸阴离子的量小于1重量％(例如，小于0.5重量％、小于0.4重量％、小于0.3重量％、小于0.2重量％、小于0.1重量％、小于0.09重量％、小于0.08重量％、小于0.07重量％、小于0.06重量％、小于0.05重量％、小于0.04重量％、小于0.03重量％、小于0.02重量％、小于0.01重量％、小于0.005重量％、小于0.001重量％)。如果本文中所述的mrna制剂基本上不含无机磷酸阴离子，则基于mrna制剂的总重量，优选mrna制剂中无机磷酸阴离子的量小于1重量％(例如，小于0.5重量％、小于0.4重量％、小于0.3重量％、小于0.2重量％、小于0.1重量％、小于0.09重量％、小于0.08重量％、小于0.07重量％、小于0.06重量％、小于0.05重量％、小于0.04重量％、小于0.03重量％、小于0.02重量％、小于0.01重量％、小于0.005重量％、小于0.001重量％)。此外，如果本文中所述的药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子，则基于药物组合物的总重量，优选药物组合物中柠檬酸阴离子的量小于1重量％(例如，小于0.5重量％、小于0.4重量％、小于0.3重量％、小于0.2重量％、小于0.1重量％、小于0.09重量％、小于0.08重量％、小于0.07重量％、小于0.06重量％、小于0.05重量％、小于0.04重量％、小于0.03重量％、小于0.02重量％、小于0.01重量％、小于0.005重量％、小于0.001重量％)。如果本文中所述的药物组合物基本上不含无机磷酸阴离子，则基于药物组合物的总重量，优选药物组合物中无机磷酸阴离子的量小于1重量％(例如，小于0.5重量％、小于0.4重量％、小于0.3重量％、小于0.2重量％、小于0.1重量％、小于0.09重量％、小于0.08重量％、小于0.07重量％、小于0.06重量％、小于0.05重量％、小于0.04重量％、小于0.03重量％、小于0.02重量％、小于0.01重量％、小于0.005重量％、小于0.001重量％)。[0845]本文中使用的表述“柠檬酸阴离子”意指包含柠檬酸阴离子和在溶解在水性介质中时释放柠檬酸阴离子的任意化合物。包含柠檬酸阴离子和在溶于水性介质中时释放柠檬酸阴离子的化合物的一些实例包括柠檬酸和柠檬酸盐。[0846]本文中使用的表述“无机磷酸阴离子”意指包含无机磷酸阴离子和在溶解在水性介质中时释放无机磷酸阴离子的任意化合物。包含无机磷酸阴离子和在溶解在水性介质中时释放无机磷酸阴离子的化合物的一些实例包括磷酸和磷酸盐。优选地，表述“无机磷酸阴离子”不包括磷酸与一种或更多种有机醇的酯。因此，优选地，表述“无机磷酸阴离子”不涵盖核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸。[0847]本文中使用的表述“聚羧酸根阴离子”意指包含至少两个(优选至少三个)为游离形式(即，质子化)、酸酐形式或盐形式的羧酸基团的任意有机化合物。[0848]本文中使用的关于颗粒(例如lnp)的尺寸(z平均值)的表述“等于”意指在处理步骤之后(例如，在冻/融循环之后或在冷冻-干燥/重构循环之后)包含在组合物中的颗粒的z平均值值对应于在处理步骤之前(例如在冻/融循环之前或在冷冻-干燥/重构循环之前)颗粒的z平均值值±30％(优选±25％，更优选±20％，例如±15％、±10％、±5％或±1％)。例如，如果包含在还未经受冻/融循环(或冷冻-干燥/重构循环)的组合物中的颗粒(例如lnp)的尺寸(z平均值)值是90nm，并且包含在经受冻/融循环(或冷冻-干燥/重构循环)的组合物中的颗粒(例如lnp)的尺寸(z平均值)值是115nm，则在冻/融循环之后，即在将冷冻组合物解冻之后(或在冷冻干燥/重构循环之后，即在将冷冻干燥组合物重构之后)颗粒的尺寸(z平均值)被认为等于冻/融循环之前，即在将组合物冷冻之前(或在冷冻干燥/重构循环之前，即在将冷冻干燥组合物重构之前)的颗粒尺寸(z平均值)。本文中使用的关于颗粒(例如lnp)的尺寸分布或pdi的表述“等于”应被相应地理解。例如，如果包含在还未经受冻/融循环(或冷冻干燥/重构循环)的组合物中的颗粒(例如lnp)的pdi值是0.30，并且包含在经受冻/融循环(或冷冻干燥/重构循环)的组合物中的颗粒(例如lnp)的pdi值是0.38，则在冻/融循环之后，即在将冷冻组合物解冻之后(或在冷冻干燥/重构循环之后，即在将冷冻干燥组合物重构之后)颗粒的pdi被认为等于冻/融循环之前，即在将组合物冷冻之前(或在冷冻干燥/重构循环之前，即在将冷冻干燥组合物重构之前)的颗粒的pdi。[0849]根据本公开内容，本文中所述的mrnalnp制剂具有适合于mrna颗粒的稳定性，并且特别是适合于mrna稳定性的ph。特别地，本发明人出人意料地发现，当mrna制剂的ph低于阳离子可电离脂质的pka时，可提高包含阳离子可电离脂质的mrna制剂的稳定性。[0850]因此，根据本公开内容，本文中所述制剂的ph优选低于阳离子可电离脂质的pka。例如，本文中所述制剂的ph优选比阳离子可电离脂质的pka低至少2个ph值(更优选至少3个ph值)。例如，如果阳离子可电离脂质的pka为9.5，则优选本文中所述制剂的ph为至多7.5，更优选至多6.5。在一个实施方案中，本文中所述mrnalnp制剂的ph为至多6.5，例如至多6.4、至多6.3、至多6.2、至多6.1、至多6.0或约6.0。在一个实施方案中，本文中所述mrnalnp制剂的ph为约4.0至约8.0、约5.0至约7.5或5.5至6.5。[0851]不希望受到理论的束缚，在制剂的制备、储存和使用期间，缓冲剂体系的使用维持了本文中所述mrnalnp制剂的ph。在本公开内容的某些实施方案中，缓冲剂体系可包含溶剂(特别是水，例如去离子水，特别是注射用水)缓冲物质。缓冲物质优选地选自2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙烷磺酸(hepes)、2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇(tris)、乙酸盐和组氨酸。优选的缓冲物质是hepes。[0852]此外，本发明人出人意料地发现，当经受至少一个冻融循环时，包含阳离子可电离脂质的mrna制剂中nacl和/或kcl的存在对所述mrna制剂的稳定性具有不利影响，而省略添加nacl和/或kcl中的一者或二者产生了稳定的mrna制剂。此外，本发明人出人意料地发现，通过省略添加nacl和/或kcl中的一者或二者产生了可以更容易和/或更快地冷冻和/或冷冻干燥的mrna制剂。[0853]因此，根据本公开内容，优选在不添加nacl和/或kcl的情况下制备本文中所述的mrnalnp制剂。在一个实施方案中，使用去离子水(例如注射用水)和/或纯化形式的mrna制备mrnalnp制剂。优选地，基本上纯化形式的mrna包含小于0.2％w/v，例如小于0.15％w/v、小于0.10％w/v、小于0.05％w/v或小于0.01％w/v之组合浓度的nacl和kcl。在一个实施方案中，制备的mrnalnp制剂包含小于0.2％w/v，例如小于0.15％w/v、小于0.10％w/v、小于0.05％w/v或小于0.01％w/v之组合浓度的nacl和kcl。[0854]本文中所述的制剂还可包含冷冻保护剂和/或表面活性剂作为稳定剂，以避免产品品质的实质性损失，并且特别是在储存、冷冻和/或冻干期间mrna活性的实质性损失，例如以降低或防止聚集、颗粒塌陷、mrna降解和/或其他类型的损伤。[0855]在一个实施方案中，冷冻保护剂是碳水化合物。本文中使用的术语“碳水化合物”是指并且涵盖单糖、二糖、三糖、寡糖和多糖。[0856]在一个实施方案中，冷冻保护剂是单糖。本文中使用的术语“单糖”是指不能被水解成更简单的碳水化合物单元的单一碳水化合物单元(例如，简单的糖)。一些示例性的单糖冷冻保护剂包括葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、核糖等。[0857]在一个实施方案中，冷冻保护剂是二糖。本文中使用的术语“二糖”是指由2个单糖单元形成的化合物或化学部分，所述单糖单元通过糖苷键联(例如通过1-4键联或1-6键联)键合在一起。二糖可水解成两个单糖。一些示例性的二糖冷冻保护剂包括蔗糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖等。[0858]术语“三糖”意指连接在一起以形成一个分子的三个糖。三糖的一些实例包括棉子糖和松三糖。[0859]在一个实施方案中，冷冻保护剂是寡糖。本文中使用的术语“寡糖”是指由3至约15个、优选3至约10个单糖单元形成的化合物或化学部分，所述单糖单元通过糖苷键联(例如通过1-4键联或1-6键联)键合在一起以形成线性、分支或环状结构。一些示例性的寡糖冷冻保护剂包括环糊精、棉子糖、松三糖、麦芽三糖、水苏糖、阿卡波糖等。寡糖可以被氧化或还原。[0860]在一个实施方案中，冷冻保护剂是环状寡糖。本文中使用的术语“环状寡糖”是指由3至约15个、优选6、7、8、9或10个单糖单元形成的化合物或化学部分，所述单糖单元通过糖苷键联(例如通过1-4键联或1-6键联)键合在一起以形成环状结构。一些示例性的环状寡糖冷冻保护剂包括为离散化合物的环状寡糖，例如α环糊精、β环糊精或γ环糊精。[0861]另一些示例性的环状寡糖冷冻保护剂包括在较大分子结构中包含环糊精部分的化合物，例如包含环状寡糖部分的聚合物。环状寡糖可被氧化或还原，例如被氧化成二羰基形式。本文中使用的术语“环糊精部分”是指并入到较大分子结构(例如聚合物)或其一部分中的环糊精(例如α、β或γ环糊精)基团。环糊精部分可直接或通过任选的接头与一个或更多个另一些部分键合。环糊精部分可被氧化或还原，例如被氧化成二羰基形式。[0862]碳水化合物冷冻保护剂(例如环状寡糖冷冻保护剂)可以是衍生的碳水化合物。例如，在一个实施方案中，冷冻保护剂是衍生的环状寡糖，例如衍生的环糊精，例如2-羟丙基-β-环糊精，例如部分醚化的环糊精(例如，部分醚化的β环糊精)。[0863]示例性的冷冻保护剂是多糖。本文中使用的术语“多糖”是指由至少16个单糖单元形成的化合物或化学部分，并且包括包含多糖作为其骨架结构一部分的聚合物，所述单糖单元通过糖苷键联(例如通过1-4键联或1-6键联)键合在一起以形成线性、支化或环状结构。在骨架中，多糖可以是线性的或环状的。一些示例性的多糖冷冻保护剂包括糖原、淀粉酶、纤维素、葡聚糖、麦芽糖糊精等。[0864]在一个实施方案中，mrnalnp制剂可包含蔗糖。不希望受到理论的束缚，蔗糖发挥促进对制剂的冷冻保护，从而防止核酸(特别是mrna)颗粒聚集并维持组合物的化学和物理稳定性的功能。本公开内容中某些实施方案考虑了蔗糖的替代冷冻保护剂。替代的稳定剂包括但不限于海藻糖和葡萄糖。在一个具体实施方案中，蔗糖的替代稳定剂是海藻糖或者蔗糖与海藻糖的混合物。[0865]优选的冷冻保护剂选自蔗糖、海藻糖、葡萄糖、及其组合，例如蔗糖与海藻糖的组合。在一个优选实施方案中，冷冻保护剂是蔗糖。[0866]优选地，本文中所述的mrnalnp制剂包含使得基于制剂的总重量，制剂的渗量浓度为以下的浓度的冷冻保护剂：约100mosm/kg至约1osm/kg(例如约100mosm/kg至约900mosm/kg、约120mosm/kg至约800mosm/kg、约140mosm/kg至约700mosm/kg、约160mosm/kg至约600mosm/kg、约180mosm/kg至约500mosm/kg、或约200mosm/kg至约400mosm/kg)。[0867]在一个实施方案中，冷冻保护剂的浓度为约5％(w/v)至约15％(w/v)，例如约6％(w/v)至约14％(w/v)、约7％(w/v)至约13％(w/v)、或约8％(w/v)至约12％(w/v)。[0868]在一个优选实施方案中，mrnalnp制剂包含蔗糖和/或海藻糖作为冷冻保护剂以及hepes作为缓冲物质，优选以本文中指定的量/浓度。[0869]在一个实施方案中，本文中所述的制剂包含表面活性剂，例如非离子型三嵌段共聚物，其包含侧接有两个聚氧乙烯(聚(环氧乙烷)，例如2至130个环氧乙烷单元)亲水链的聚氧丙烯(聚(环氧丙烷)，例如15至67个环氧丙烷)的中心疏水链。一些示例性的非离子型三嵌段共聚物可以商标名synperonics、pluronic和kolliphor购得。一种特别有用的表面活性剂是泊洛沙姆(poloxamer)，例如泊洛沙姆188。[0870]本公开内容的某些实施方案考虑了螯合剂在本文中所述的mrnalnp制剂中的用途。螯合剂是指能够与金属离子形成至少两个配位共价键从而产生稳定的水溶性络合物的化合物。不希望受到理论的束缚，螯合剂降低了游离二价离子的浓度，其在本公开内容中可另外地诱导加速的rna降解。合适的螯合剂的一些实例包括但不限于乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid，edta)、edta盐、去铁敏b、去铁胺、二硫碳钠、青霉胺、喷替酸钙、喷替酸钠盐、琥巯酸(succimer)、曲恩汀(trientine)、次氮基三乙酸、反式二氨基环己烷四乙酸(trans-diaminocyclohexanetetraaceticacid，dcta)、二亚乙基三胺五乙酸(diethylenetriaminepentaaceticacid，dtpa)和双(氨基乙基)乙醇醚-n,n,n’,n’‑四乙酸。在某些实施方案中，螯合剂是edta或edta盐。在一个示例性实施方案中，螯合剂是edta二钠二水合物。在一些实施方案中，edta的浓度为约0.05mm至约5mm、约0.1mm至约2.5mm、或约0.25mm至约1mm。[0871]在另一个实施方案中，本文中所述的mrnalnp制剂不包含螯合剂。[0872]药物组合物[0873]本文中所述的mrnalnp制剂可用作或用于制备治疗性或预防性治疗的药物组合物或药物。[0874]本文中所述的mrnalnp可以以任何合适的药物组合物的形式施用。[0875]术语“药物组合物”涉及包含治疗有效剂，优选与可药用载体、稀释剂和/或赋形剂一起的治疗有效剂的组合物。所述药物组合物可用于通过向对象施用所述药物组合物来治疗、预防疾病或病症或者减轻疾病或病症的严重程度。在本公开内容的上下文中，药物组合物包含如本文中所述的mrnalnp。[0876]本公开内容的药物组合物可包含一种或更多种佐剂，或者可与一种或更多种佐剂一起施用。术语“佐剂”涉及延长、增强或加速免疫应答的化合物。佐剂包含化合物例如油乳剂(例如，弗氏佐剂(freund’sadjuvant))、矿物化合物(例如明矾)、细菌产物(例如百日咳鲍特菌(bordetellapertussis)毒素)或免疫刺激复合物的非均质组。佐剂的实例包括但不限于lps、gp96、cpg寡脱氧核苷酸、生长因子和细胞因子，例如单核因子、淋巴因子、白介素、趋化因子。趋化因子可以是il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-12、infa、inf-γ、gm-csf、lt-a。另一些已知的佐剂是氢氧化铝、弗氏佐剂或油剂例如isa51。用于本公开内容的另一些合适的佐剂包括脂肽例如pam3cys，以及亲脂性组分例如皂苷、海藻糖-6,6-二山嵛酸酯(tdb)、单磷酰脂质-a(mpl)、单分枝酰甘油(monomycoloylglycerol，mmg)或吡喃葡萄糖基脂质佐剂(glucopyranosyllipidadjuvant，gla)。[0877]本公开内容的药物组合物可以是可储存形式(例如，冷冻或冻干/冷冻干燥形式)或以“即用形式”(即，可立即施用于对象的形式，例如，无需任何处理例如稀释)。因此，在施用可储存形式的药物组合物之前，必须将该可储存形式处理或转化成即用或可施用的形式。例如，必须将冷冻的药物组合物解冻，或者必须将冷冻干燥药物组合物重构，优选通过使用合适的溶剂(例如，去离子水，例如注射用水)或液体(例如，水溶液)。[0878]在一个实施方案中，以可储存形式(例如，冷冻或冻干/冷冻干燥形式)的药物组合物可在约-30℃或更高(例如约-25℃或更高)的温度下储存。例如，本文中所述的冷冻的药物组合物(例如通过第一或第二方面的方法制备的冷冻的药物组合物，或者第三、第八、第九或第十方面的冷冻的药物组合物)可以在约-30℃至约-10℃(例如约-25℃至约-15℃或约-25℃至约-20℃)的温度下或者在约-20℃的温度下储存。本文中所述的冷冻干燥药物组合物(例如通过第一或第二方面的方法制备的冷冻干燥药物组合物，或者第四、第八、第九或第十方面的冷冻干燥药物组合物)可以在约-25至约室温(例如约-15℃至约8℃、约-10℃至约2℃或约-5℃至约0℃)的温度下储存。[0879]在以可储存形式(例如，以冷冻或冻干/冷冻干燥形式)的药物组合物的一个实施方案中，药物组合物可储存至少3个月，优选至少6个月，更优选至少12个月，更优选至少18个月，更优选至少24个月，更优选至少30个月，更优选至少36个月。[0880]在以冷冻形式的药物组合物的一个实施方案中，在将冷冻的药物组合物解冻之后lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi等于冷冻之前lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi。例如，如果即用型药物组合物是由本文中所述的冷冻的药物组合物制备的，则优选包含在即用型药物组合物中的lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi等于冷冻之前包含在冷冻的药物组合物中(例如包含在第一方面的方法的步骤(i)中制备的制剂中)的lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi。[0881]在以冻干/冷冻干燥形式的药物组合物的一个实施方案中，在将冷冻干燥药物组合物重构之后lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi等于冷冻干燥之前lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi。例如，如果即用型药物组合物是由本文中所述的冻干/冷冻干燥的药物组合物制备的，则优选包含在即用型药物组合物中的lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi等于冷冻干燥之前包含在冻干/冷冻干燥的药物组合物中(例如包含在第一方面的方法的步骤(i)中制备的制剂中)的lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi。[0882]根据本公开内容的药物组合物通常以“药物有效量”和以“可药用制剂”施加。[0883]术语“可药用的”是指不与药物组合物的活性组分的作用相互作用的物质的无毒性。[0884]术语“药物有效量”是指单独或与另一些剂量一起实现期望的反应或期望的作用的量。在治疗特定疾病的情况下，期望的反应优选地涉及抑制疾病进程。这包括减缓疾病的进展，并且特别是中断或逆转疾病的进展。治疗疾病的期望反应也可以为延迟所述疾病或所述病症的发作或预防其发作。本文中所述颗粒或药物组合物的有效量将取决于：待治疗的病症，疾病的严重程度，患者的个体参数包括年龄、生理状况、大小和体重，治疗的持续时间，伴随治疗(如果有的话)的类型，具体施用途径和类似因素。因此，本文中所述的颗粒或药物组合物的施用剂量可取决于多种这样的参数。在初始剂量下患者中的反应不充分的情况下，可使用更高的剂量(或通过不同的更局部的施用途径实现有效更高的剂量)。[0885]本公开内容的药物组合物可包含缓冲剂(特别是，来源于用于制备药物组合物的mrnalnp制剂)、防腐剂和任选的另一些治疗剂。在一个实施方案中，本公开内容的药物组合物，特别是即用型药物组合物，包含一种或更多种的可药用载体、稀释剂和/或赋形剂。[0886]用于本公开内容的药物组合物的合适的防腐剂包括但不限于苯扎氯铵、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。[0887]本文中使用的术语“赋形剂”是指可存在于本公开内容的药物组合物中但不是活性成分的物质。赋形剂的一些实例包括但不限于载体、黏合剂、稀释剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、矫味剂或着色剂。[0888]“可药用盐”包括，例如酸加成盐，其可例如通过使用可药用酸(例如盐酸、硫酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、乙酸、苯甲酸、柠檬酸、酒石酸、碳酸或磷酸)形成。此外，合适的可药用盐可包括碱金属盐(例如，钠盐或钾盐)；碱土金属盐(例如，钙盐或镁盐)；铵(nh4 )；以及与合适的有机配体(例如，使用反荷阴离子例如卤化物、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、烷基磺酸根和芳基磺酸根形成的季铵和胺阳离子)形成的盐。可药用盐的一些示例性实例包括但不限于：乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、精氨酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、溴化物、丁酸盐、乙二胺四乙酸钙、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、右旋樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、克拉维酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、二盐酸盐、十二烷基硫酸盐、乙二胺四乙酸盐、乙二磺酸盐、依托酸盐(estolate)、乙磺酸盐(esylate)、乙磺酸盐(ethanesulfonate)、甲酸盐、富马酸盐、半乳酸盐(galactate)、半乳糖醛酸盐、葡萄糖酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、甘油磷酸盐、乙醇酰阿散酸盐(glycolylarsanilate)、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、己基间苯二酚盐、海巴明(hydrabamine)、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、羟基萘酸盐、碘化物、异丁酸盐、异硫氰酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲烷磺酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、2-萘磺酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、n-甲基葡萄糖铵盐、油酸盐、草酸盐、扑酸盐(双羟萘酸盐)、棕榈酸盐、泛酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、邻苯二甲酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、硫酸盐、辛二酸盐、琥珀酸盐、鞣酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、甲苯磺酸盐、三乙基碘盐(triethiodide)、十一烷酸盐、戊酸盐等(参见，例如，s.m.bergeetal.,“pharmaceuticalsalts”,j.pharm.sci.,66,第1至19页(1977))。非可药用盐可用于制备可药用盐，并包括在本公开内容中。[0889]术语“稀释剂”涉及稀释剂(dilutingagent)和/或稀化剂(thinningagent)。此外，术语“稀释剂”包括流体、液体或固体悬浮剂和/或混合介质中的任一种或更多种。合适的稀释剂的一些实例包括乙醇、甘油和水。[0890]术语“载体”是指可以是天然的、合成的、有机的、无机的组分，在其中将活性组分组合以促进、增强或实现药物组合物的施用。本文中使用的载体可以是适合于施用于对象的一种或更多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。合适的载体包括但不限于无菌水、林格液(ringer)、乳酸林格液、无菌氯化钠溶液、等张盐水、聚亚烷基二醇、氢化萘，并且特别是生物相容的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物。在一个实施方案中，本公开内容的即用型药物组合物包括等张盐水。[0891]用于治疗用途的可药用载体、赋形剂或稀释剂在药学领域中是公知的，并且描述于例如remington’spharmaceuticalsciences,mackpublishingco.(a.rgennaroedit.1985)中。[0892]可根据预期的施用途径和标准药学实践来选择药物载体、赋形剂或稀释剂。[0893]药物组合物的施用途径[0894]在一个实施方案中，本文中所述的即用型药物组合物可以静脉内、动脉内、皮下、皮内、皮肤(dermally)、经鼻内、肌内或瘤内施用。在某些实施方案中，药物组合物配制成用于局部施用或全身性施用。全身性施用可包括涉及通过胃肠道吸收的肠施用，或肠胃外施用。本文中使用的“肠胃外施用”是指以除通过胃肠道之外的任何方式施用，例如通过静脉内注射。在一个优选实施方案中，药物组合物，特别是即用型药物组合物，配制成用于全身性施用。在另一个优选实施方案中，全身性施用是通过静脉内施用。[0895]药物组合物的用途[0896]本文中所述的mrna颗粒可用于多种疾病的治疗性或预防性治疗，特别是其中向对象提供肽或蛋白质导致治疗性或预防性作用的疾病。例如，提供来源于病毒的抗原或表位可用于治疗由所述病毒引起的病毒性疾病。提供肿瘤抗原或表位可用于治疗其中癌细胞表达所述肿瘤抗原的癌症疾病。提供功能性蛋白质或酶可用于治疗特征在于功能异常性蛋白质(例如溶酶体贮积病(例如黏多糖贮积症)中的功能异常性蛋白质)或因子缺乏的遗传性病症。提供细胞因子或细胞因子融合体可用于调节肿瘤微环境。[0897]术语“疾病”(在本文中也称为“病症”)是指影响个体身体的异常状况。疾病通常被解释为与特定症状和体征相关的医学病症。疾病可由最初来自外部来源的因素引起，例如感染性疾病，或者疾病可由内部功能障碍引起，例如自身免疫病。在人中，“疾病”通常被更广泛地用于指引起以下的任何病症：痛苦、功能障碍、困扰、社会问题、或所折磨个体的死亡、或与接触个体的那些类似的问题。从广义上讲，疾病有时包括损伤、残疾、病症、综合征、感染、孤立的症状、异常行为以及结构和功能的非典型变化，而在另一些情况下和出于其他目的，这些可被视为可区分的类别。疾病通常不仅在身体上影响个体而且在情感上影响个体，因为感染多种疾病和在有多种疾病的情况下生活可改变人对生活的看法和人的性格。[0898]在本发明上下文中，术语“治疗”及其变化形式或“治疗性干预”涉及出于对抗病症(例如疾病或障碍)的目的对对象的管理和护理。该术语旨在包括针对对象所遭受的给定病症的全谱治疗，例如施用治疗有效的化合物以减轻症状或并发症，延缓疾病、障碍或病症的进展，缓解或减轻症状和并发症，和/或治愈或消除疾病、障碍或病症以及预防病症，其中预防应当理解为出于对抗疾病、病症或障碍的目的对个体的管理和护理，并且包括施用活性化合物以预防症状或并发症的发作。[0899]术语“治疗性治疗”涉及改善健康状况和/或延长(提高)个体寿命的任何治疗。所述治疗可以在个体中消除疾病、在个体中阻止或减慢疾病的发展、在个体中抑制或减慢疾病的发展、在个体中降低症状的频率或严重程度、和/或在当前患有或以前患有疾病的个体中降低复发。[0900]术语“预防性治疗”或“防止性治疗”涉及旨在在个体中防止疾病发生的任何治疗。术语“预防性治疗”或“防止性治疗”在本文中可互换使用。[0901]术语“个体”和“对象”在本文中可互换使用。它们是指可能患有疾病或病症(例如，癌症、感染性疾病)或易于患有疾病或病症(例如，癌症、感染性疾病)但可患有或可未患有疾病或病症或者可需要预防性干预(例如疫苗接种)或者可需要进行干预(例如通过蛋白质替代)的人或另一些哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类)或任何其他非哺乳动物(包括鸟类(鸡)、鱼或任何其他动物物种)。在许多实施方案中，个体是人。除非另有说明，否则术语“个体”和“对象”不意指特定年龄，并因此涵盖成年人、老年人、儿童和新生儿。在本公开内容的一些实施方案中，“个体”或“对象”是“患者”。[0902]术语“患者”意指治疗的个体或对象，特别是患病的个体或对象。[0903]在本公开内容的一个实施方案中，目的是通过疫苗接种提供针对感染性疾病的保护。[0904]在本公开内容的一个实施方案中，目的是向对象，特别是有此需要的对象提供分泌的治疗性蛋白质，例如抗体、双特异性抗体、细胞因子、细胞因子融合蛋白、酶。[0905]在本公开内容的一个实施方案中，目的是向对象，特别是有此需要的对象提供蛋白质替代治疗，例如促红细胞生成素、因子vii、冯·维勒布兰德因子、β-半乳糖苷酶、α-n-乙酰葡糖胺糖苷酶的产生。[0906]在本公开内容的一个实施方案中，目的是调节/重编程血液中的免疫细胞。[0907]本领域技术人员将知道，免疫治疗和疫苗接种的原理之一是基于这样的事实：通过用在免疫学上与待治疗的疾病相关的抗原或表位对对象进行免疫接种来产生针对疾病的免疫保护反应。因此，本文中所述的药物组合物可用于诱导或增强免疫应答。因此，本文中所述的药物组合物可用于涉及抗原或表位的疾病的预防性和/或治疗性治疗。[0908]术语“免疫接种”或“疫苗接种”描述了以诱导免疫应答为目的例如出于治疗性或预防性的原因而向个体施用抗原的过程。[0909]本文中所引用的文件和研究的引证并不旨在承认任何前述内容是相关的现有技术。关于这些文件内容的所有陈述都是基于申请人可获得的信息，并不构成对这些文件内容正确性的任何承认。[0910]呈现该描述(包括以下实施例)是为了使本领域普通技术人员能够制备和使用多种实施方案。对特定装置、技术和应用的描述仅作为实例提供。对本文中所述实施例的多种修改对于本领域普通技术人员而言将是明显的，并且在不脱离多个实施方案的精神和范围的情况下，本文中定义的一般原理可应用于另一些实施例和应用。因此，多个实施方案不旨在限于本文中描述和示出的实施例，而是与符合与权利要求书相一致的范围。实施例[0911]方法[0912]rna脂质纳米粒的制备[0913]此处以dodma作为阳离子可电离脂质的实例，通过使用所谓的c12制剂作为实例来描述制备方案。同样的方案也适用于其他阳离子可电离脂质。因此，也可以如所述来制备和稳定具有阳离子可电离脂质与rna之间的比率(n/p比)(例如更高或更低的n/p比)的其他制剂，包括负电荷过量的那些。另外，可以使用其他脂质比率(磷脂、胆固醇、聚合物缀合的脂质)，以及其他类型的聚合物缀合的脂质(例如，聚肌氨酸脂质)。该方案也适用于没有任何聚合物缀合的脂质的产品。[0914]通过水性-乙醇混合方案来制备rna脂质纳米粒。简言之，将在hepes10mm、edta0.1mm、ph7.0的水性缓冲液条件下的rna与包含摩尔比分别为40:10:48:2的dodma、dope、胆固醇和c16-peg2000-神经酰胺的乙醇c12脂质混合物以3份rna和1份脂质混合物的体积比混合。使用基于标准注射泵的装置(set-up)以250ml/ml(对于水性组分为187.5ml/分钟，对于乙醇组分为62.5ml/分钟)的总流量使用y混合元件来实现混合。以1:1的体积比用hepes缓冲液20mm，ph6.0进一步稀释脂质纳米粒原胶体，并进一步相对于hepes缓冲液20mm，ph6.0进行切向流过滤，以进行缓冲液交换和除去乙醇。在渗滤完成之后，将制剂浓缩(upconcentrate)2倍。随后，用补充的hepes缓冲液20mm，ph6.0或选择的具有40％w/v蔗糖的另一些缓冲液来稀释缓冲液交换的脂质纳米粒，使得脂质纳米粒制剂中的最终rna浓度为0.2mg/ml，并且蔗糖含量为10％w/v。在基准设置中，以4:1的n/p比制备rna-脂质纳米粒。[0915]rna脂质复合物的制备[0916]通过水性-水性方案制备rna脂质复合物。简言之，将在hepes10mm、edta0.1mm、ph7.0的水性缓冲液条件下的rna与由5mm乙酸水溶液中的摩尔比分别为40:10:48:2的dodma、dope、胆固醇和c16-peg2000-神经酰胺构成的c12脂质体以1:1的体积比混合。使用基于标准注射泵的装置以250ml/ml(各相均为125ml/分钟)的总流量使用y混合元件来实现混合。然后用补充有50％w/v蔗糖的相应选择的缓冲液来稀释rna-脂质复合物原液，使得脂质复合物中的最终rna浓度为0.1mg/ml，并且蔗糖含量为10％w/v。在基准设置中，以4:1的n/p比制备rna-脂质纳米粒。[0917]rna制剂的表征[0918]使用dynaproplatereaderii(wyatt，dernbach，germany)通过动态光散射来确定颗粒尺寸分析。根据测量结果，使用dynamics7.8.1.3软件通过累积量分析来计算尺寸(z平均值)和多分散性指数(pdi)。使用毛细管凝胶电泳进一步分析rna的完整性。[0919]冻融研究[0920]通过将制剂从-20℃(过夜)到 25℃(2小时)循环三至五次进行冻融研究。测量冻融样品的制剂的颗粒尺寸和多分散性指数，并将结果与冷冻对照样品进行比较。[0921]长期稳定性研究[0922]通过将制剂在-20℃下长时期储存进行长期稳定性研究，并且定期评估物理化学特性，例如：1个月、3个月、6个月、12个月、18个月等。在每个时间点下，将制剂解冻至 25℃持续2小时，并评估物理化学特性，例如颗粒尺寸和多分散性指数。[0923]制剂的冷冻干燥[0924]使用具有一个面积为0.108m2的搁板(shelf)和4kg的冰冷凝器容量的epsilon2-4lsc冻干机(martinchristgefriertrocknungsanlagengmbh)进行冷冻干燥。简言之，使2r小瓶填充1ml制剂，并使用金属托盘将其装载在冷冻干燥机的搁板上。将搁板以1℃/分钟从20℃冷却至-40℃，并保持1小时。对于初步干燥，使搁板温度以1℃/分钟升高至-20℃，并且压力降低至60毫托(8pa)并保持15小时。对于二次干燥，使搁板温度以0.1℃/分钟升高至40℃，并在10毫托(1.3pa)下保持10小时。在二次干燥结束之后，将样品在20℃下卸载，使室填充有空气，并迅速人工密封小瓶以避免水凝结。将旨在用于储存稳定性实验的样品立即用铝盖密封。对于分析，将样品用1ml水重构。[0925]实施例1[0926]所有lnp均用以单批次相同的方法制备。将该批次相对于水进行透析，以便从主体相(bulkphase)中除去所有分子上溶解的部分，例如离子和乙醇。随后，用如所示的缓冲液/蔗糖混合物稀释该批次的级分，得到缓冲液浓度为20mm、ph6.0，蔗糖浓度为10％以及rna浓度为0.2mg/ml。仅在tris的情况下，浓度为10mm，ph为7.3，并且蔗糖浓度为9％。[0927]图1示出了来自将脂质纳米粒(lnp)在-20℃下冷冻和储存不同的冻融循环的结果。如可以看出的，对于某些缓冲液，出现了颗粒尺寸的增加，其中对于不同的缓冲液体系，尺寸增加的量是不同的。而对于hepes，颗粒尺寸实际上保持不变，其在存在所有其他缓冲液的情况下显著增加。[0928]实施例2[0929]使用水性-水性方案制备脂质复合物：将rna的水溶液与5mm乙酸中c12脂质体的水性分散体以4:1的n/p比混合。随后，用不同的缓冲液/蔗糖混合物进一步稀释主体脂质复合物(bulklipoplex)，使得脂质复合物中的最终rna浓度为0.1mg/ml，并且最终基质中的蔗糖含量为10％w/v。所有缓冲液的浓度均为20mm。hepes和组氨酸缓冲液的ph为6.0，而tris7.0构成，而乙醇相补充有20mm乙酸。阳离子可电离脂质:dope:胆固醇:c16-peg2000-神经酰胺的摩尔比分别为40:10:48:2。然后将脂质纳米粒原胶体相对于hepes缓冲液20mm、ph6.0进行透析，并进一步用hepes/suc混合物稀释，使得脂质纳米粒中的最终rna浓度为0.2mg/ml，并且蔗糖的最终浓度为10％w/v。[0939]图5a示出了在-20℃下三次冻融循环之前和之后rna脂质纳米粒的颗粒尺寸数据。如从图中明显的是，hepes/suc基质的稳定作用也适用于广泛范围的n/p比。图4b还示出了这些脂质纳米粒的长期稳定性，其进一步证实了冻融研究中的发现。还监测了所有其他的物理化学特性，例如ph、渗量浓度、亚可见颗粒、rna含量、rna包封和rna完整性。[0940]实施例6[0941]用水性-乙醇混合方案制备脂质纳米粒：将rna水溶液与如所示c12脂质混合物的乙醇溶液以3:1的体积比以12ml/分钟的总流量使用nanoassemblr装置(precisionnanosystems)混合，以实现4:1的n/p比。rna相缓冲液由hepes10mm、edta0.1mm，ph7.0构成，而乙醇相补充有浓度为20mm的如所示的不同酸化剂。阳离子可电离脂质:dope:胆固醇:c16-peg2000-神经酰胺的摩尔比分别为40:10:48:2。然后将脂质纳米粒原胶体相对于hepes缓冲液20mm、ph6.0进行透析，并进一步用hepes/suc混合物稀释，使得脂质纳米粒中的最终rna浓度为0.2mg/ml，并且蔗糖的最终浓度为10％w/v。[0942]图6a示出了在-20℃下三次冻融循环之前和之后rna脂质纳米粒的颗粒尺寸数据。如从图中明显的是，hepes/suc基质的稳定作用也适用于广泛范围的脂质相中的酸化剂，其对于颗粒形成至关重要。图6b还示出了这些脂质纳米粒的长期稳定性，其中可以看到与柠檬酸相比，乙酸是用于更高的稳定作用的优选酸化剂。还监测了所有其他的物理化学特性，例如ph、渗量浓度、亚可见颗粒、rna含量、rna包封和rna完整性。[0943]实施例7[0944]用水性-乙醇混合方案制备脂质纳米粒：将rna的水溶液与如所示c12脂质混合物的乙醇溶液以3:1的体积比以12ml/分钟的总流量使用nanoassemblr装置(precisionnanosystems)混合，以实现4:1的n/p比。rna相缓冲液由hepes10mm、edta0.1mm，ph7.0构成，而乙醇相补充有20mm乙酸。可电离脂质:dope:胆固醇:c16-peg2000-神经酰胺的摩尔比分别为40:10:48:2。然后将脂质纳米粒原胶体相对于20mmhepes缓冲液在如所示的不同ph下进行透析，并进一步用补充有suc的相应缓冲液稀释，使得脂质纳米粒中的rna的最终浓度为0.2mg/ml，并且蔗糖的最终浓度为10％w/v。[0945]图7示出了在一段时间内在-20℃下rna脂质纳米粒的颗粒尺寸。如从图中明显的是，与ph7.0中相比，hepes/suc基质的稳定作用在ph6.0时最有效。还监测了所有其他的物理化学特性，例如ph、渗量浓度、亚可见颗粒、rna含量、rna包封和rna完整性。[0946]实施例8[0947]所有lnp均用与单批次相同的方法制备。将该批次相对于水进行透析，以便从主体相中除去所有分子上溶解的部分，例如离子和乙醇。随后，用hepes/蔗糖混合物采用不同量的edta含量(如所示)来稀释该批次的级分，得到缓冲液浓度为20mm、ph6.0，蔗糖浓度为10％以及rna浓度为0.2mg/ml。[0948]图8示出了一段时间内在-20℃下rna脂质纳米粒的颗粒尺寸。如从图中明显的是，在不存在edta的情况下，实现了hepes/suc基质的最高的稳定作用；然而，在一定程度上，螯合剂可包含在基质中。[0949]实施例9[0950]图9示出了适用于以脱水状态稳定脂质纳米粒的冷冻干燥循环。简言之，将2r小瓶填充1ml制剂，并使用金属托盘将其装载在冷冻干燥机的隔板上。将搁板以1℃/分钟从20℃冷却至-40℃，并保持1小时。对于初步干燥，将搁板温度以1℃/分钟升高至-20℃，并且使压力降低至60毫托(8pa)并保持15小时。对于二次干燥，将搁板温度以0.1℃/分钟升高至40℃，并在10毫托(1.3pa)下保持10小时。在二次干燥结束之后，将样品在20℃下卸载，使室填充有空气，并迅速人工密封小瓶以避免水凝结。将旨在用于储存稳定性实验的样品立即用铝盖密封。对于分析，将样品用1ml水重构。[0951]实施例10[0952]所有lnp均用与单批次相同的方法制备。将该批次相对于水进行透析，以便从主体相中除去所有分子上溶解的部分，例如离子和乙醇。随后，用hepes/蔗糖混合物稀释该批次，得到缓冲液浓度为20mm、ph6.0，蔗糖浓度为10％以及rna浓度为0.2mg/ml。[0953]图10a示出了在4℃冷藏条件下冷冻干燥的rna脂质纳米粒的长期胶体稳定性作为颗粒尺寸的函数。如从图中明显的是，在存在hepes/suc基质的情况下冷冻干燥可在长时期内稳定rna脂质纳米粒的胶体特性。图10b和10c还分别示出了在25℃和40℃的较高温度下的稳定性。还监测了冷冻干燥的制剂的其他物理化学参数。*在t0处示出的颗粒尺寸对应于冷冻干燥之前的颗粒尺寸。[0954]实施例11[0955]所有lnp均用与单批次相同的方法制备。将该批次相对于水进行透析，以便从主体相中除去所有分子上溶解的部分，例如离子和乙醇。随后，用如所示的缓冲液/蔗糖混合物稀释该批次的级分，得到缓冲液浓度为20mm、ph6.0，蔗糖浓度为10％以及rna浓度为0.2mg/ml。仅在tris的情况下，最终ph设定为7.0并且所得缓冲液的浓度为10mm。[0956]图11示出了冷冻干燥对rna脂质纳米粒的胶体特性作为储存基质的函数的影响。如从图中明显的是，与组氨酸/suc和tris/suc基质的稳定作用相比，在脱水形式中hepes/suc基质对脂质纳米粒的稳定作用更高。[0957]另外的实验揭示了，所使用的填充剂(例如蔗糖或海藻糖)的类型没有影响。另一些实验揭示了，基质中蔗糖和/或缓冲液的浓度对hepes/suc的稳定作用也没有显著影响。[0958]还评价了离子对脂质纳米粒的冷冻干燥过程的影响，并且发现浓度为20mm的氯化钠对hepes/suc基质的稳定作用具有不利影响。[0959]在另一方面，发现泊洛沙姆对hepes/suc基质的稳定作用没有不利影响。[0960]冷冻干燥过程在两种不同浓度：0.2mg/ml和0.02mg/ml下进行，并且在存在hepes/suc基质的情况下没有观察到浓度的影响。[0961]此外，还使用hepes/suc作为储存基质来冷冻干燥具有不同阳离子可电离脂质的rna脂质纳米粒，并且观察到储存基质和冷冻干燥方案二者均可用于多种脂质纳米粒。类似地，也对具有不同n/p比的rna脂质纳米粒进行冷冻干燥，并且发现所提出的条件组适用于具有广泛范围n/p比(例如n/p4至8)的制剂。[0962]实施例12[0963]使用水性-水性方案制备脂质复合物：将rna的水溶液与5mm乙酸中c12脂质体的水性分散体以4:1的n/p比混合。rna相包含20mm乙酸钠缓冲液ph5.4。随后，用不同浓度的蔗糖溶液进一步稀释主体脂质复合物，使得脂质复合物中的最终rna浓度为0.1mg/ml，并且最终基质中的蔗糖含量如所示。[0964]图12示出了在-20℃下冷冻对分散在包含不同量蔗糖的水性介质中的rna脂质复合物的胶体特性的影响。如从图中明显的是，除了不具有蔗糖的制剂之外，对于-20℃下的1个冻融循环，包含蔗糖的所有制剂均维持胶体特性。[0965]实施例13[0966]使用水性-乙醇混合方案用经修饰lucrna制备rnalnp，并如实施例9中所述进行冷冻干燥。在使用图9中所示的循环对lnp进行冻干之后，分配于小瓶以用于在4、25和40℃的温度下进行长期储存。在稳定性实验期间进行的主要读出是分别使用pcs和片段分析仪测量的lnp的尺寸和rna完整性。[0967]该实施例中的脂质组合物(称为c12脂质纳米粒)包含dodma/dope/peg/胆固醇，并且在多种缓冲液中进行测试。3次冻干/稳定性运行(run)在三种不同的温度下进行。不同批次lnp情况下的两个实验中的缓冲液是hepes20mm，蔗糖10％w/v，ph6(图13至16)。在最后一次运行中(图17和18)中，测试了另一些缓冲液的组成、浓度、ph和冻干保护剂(参见下表)：[0968]不同缓冲液组成中的c12脂质纳米粒：[0969]组组成1hepes20mm,蔗糖10％w/v,ph6.0,浓度0.2mg/ml2hepes20mm,蔗糖10％w/v,ph6.0,浓度0.02mg/ml3hepes20mm,海藻糖10％w/v,ph6.0,浓度0.2mg/ml4组氨酸20mm,蔗糖10％w/v,ph6.0,浓度0.2mg/ml5tris10mm,蔗糖10％.ph7.0.浓度0.02mg/ml6hepes20mm,蔗糖5％w/v,ph6.0,浓度0.2mg/ml7hepes20mm,蔗糖10％w/v,nacl20mm,ph6.0,浓度0.2mg/ml8hepes20mm,蔗糖10％w/v,泊洛沙姆1880.1％w/v,ph6.0,浓度0.2mg/ml[0970]可以观察到，胶体稳定性取决于缓冲液类型：[0971]a.在冻干之后很快尺寸增加，但其大小(magnitude)取决于缓冲液，例如在tris缓冲液或在并入的nacl(spikednacl)下或者在组氨酸缓冲液中，尺寸显著增加。[0972]b.在4、25、40℃下长期储存期间，lnp的尺寸不变，除了在40℃下具有tris的缓冲液、具有并入的nacl的缓冲液之外。[0973]此外，rna完整性稳定性取决于温度，缓冲液组成对rna完整性稳定性影响很小甚至没有影响。其在4℃下稳定长达20个月，而其在25℃下在6个月内从80％降解至60％。40℃储存导致在2个月内快速降解。[0974]实施例14[0975]如实施例13所述进行制备和冷冻干燥。与实施例13相反，脂质组合物包含dodma/dspc/psar/胆固醇。所使用的缓冲液是hepes20mm，蔗糖10％w/v，ph6。除此之外，实验条件与上述相同。结果表明，在这种情况下，在冻干之后很快尺寸没有增加，并且其在4、25和40℃下胶体稳定至少6个月(图19)。rna完整性在4℃下稳定6个月(图20)。rna完整性稳定性取决于温度，缓冲液组成对rna完整性稳定性影响很小甚至没有影响。其在4℃下稳定长达20个月，而其在25℃下在6个月内从80％降解至60％。40℃储存导致在2个月内快速降解。当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：1.本公开内容总体上涉及这样的领域：包含颗粒(特别是脂质纳米粒(lipidnanoparticle，lnp))和mrna的药物组合物、用于制备和储存这样的药物组合物的方法以及药物组合物在治疗中的用途。
背景技术：
：：2.使用重组核酸(例如dna或rna)以将外来遗传信息递送到靶细胞中是公知的。使用rna的优点包括瞬时表达和非转化特征。rna不需要进入细胞核以进行表达，并且此外rna不会整合至宿主基因组中，从而消除多种风险例如肿瘤发生。3.重组核酸可以以裸形式施用于有此需要的对象；然而，通常使用药物组合物施用重组核酸。例如，rna可通过所谓的纳米粒制剂进行递送，所述纳米粒制剂包含rna和纳米粒形成载剂，例如，阳离子脂质(例如永久性带电荷的阳离子脂质)、阳离子脂质与一种或更多种另外的脂质的混合物、或阳离子聚合物。这样的纳米粒制剂的命运受多样的关键因素(例如，纳米粒的尺寸和尺寸分布；等)控制。例如，在2018年的fda“liposomedrugproductsguidance”中，这些因素被称为应进行分析和说明的特定属性。当前纳米粒制剂的临床应用的局限性可能在于缺乏均质、纯且良好表征的纳米粒制剂。4.与其他rna纳米粒产品相比，包含可电离脂质的lnp在靶向和效力方面可显示出优势。然而，获得如常规药物使用所需的足够保质期是具有挑战性的。例如，在适用于包含永久性带电荷阳离子脂质的类似基于脂质的纳米粒制剂的条件下，包含可电离脂质的lnp不能通过在-20℃下冷冻来稳定。此外，用于提高保质期稳定性的另一些技术，例如脱水，在标准方案的情况下是不可能的。相比之下，据说为了稳定，包含可电离脂质的lnp需要在低得多的温度例如-80℃下冷冻，这给冷链带来了巨大的挑战，或者它们只可在高于冷冻温度(例如5℃)的条件下储存，在该温度下只能获得有限的稳定性。5.因此，本领域仍然需要(i)这样的药物组合物，其包含含有可电离脂质和mrna的lnp，并且是稳定的并且可储存于符合药物实践中常规技术的温度下，特别是在约-25℃或甚至更高的温度下，以及(ii)用于制备和储存这样的组合物的方法。本公开内容解决了这些和另一些需求。6.本发明人出人意料地发现本文中所述的方法和药物组合物满足上述需求。特别地，表明了通过遵守某些参数(例如，将用于制备药物组合物的制剂的ph降低到低于所用的阳离子可电离脂质的pka；排除nacl和/或kcl的添加；排除制剂中的柠檬酸阴离子；和/或排除制剂中的磷酸阴离子)，可制备冷冻或冷冻干燥形式的药物组合物，其是稳定的并且可储存在约-25℃或甚至更高温度下。7.发明概述8.在第一方面中，本公开内容提供了用于制备药物组合物的方法，其包括以下步骤：9.(i)制备包含脂质纳米粒(lnp)的制剂，其中所述lnp包含阳离子可电离脂质和mrna，并且其中以下中一者或更多者适用：10.(i)步骤(i)不包括添加nacl和/或kcl；11.(ii)所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka；12.(iii)所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子；13.(iv)所述制剂基本上不含无机磷酸阴离子；以及14.(ii)将所述制剂冷冻至约-10℃或低于-10℃，从而获得冷冻形式的所述药物组合物。15.在一个实施方案中，特别地，如果期望制备冷冻干燥形式的药物组合物，第一方面的方法还包括步骤(iii)将所述冷冻制剂冷冻干燥，从而获得冷冻干燥形式的药物组合物。16.在第一方面的第一子组中，标准(i)至(iv)中的至少一者适用。例如，在该第一子组的一个实施方案中，至少步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl。在该第一子组的另一个实施方案中，至少所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka。在该第一子组的另一个实施方案中，至少所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子。在该第一子组的另一个实施方案中，至少所述制剂基本上不含无机磷酸阴离子。17.在第一方面的第二子组中，标准(i)至(iv)中的至少两者适用。例如，在该第二子组的一个实施方案中，至少所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl。在该第二子组的另一个实施方案中，至少所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl。在该第二子组的另一个实施方案中，至少所述制剂基本上不含无机磷酸阴离子，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl。在该第二子组的另一个实施方案中，至少所述制剂的ph低于阳离子可电离脂质的pka，并且所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子。在该第二子组的另一个实施方案中，至少所述制剂的ph低于阳离子可电离脂质的pka，并且所述制剂基本上不含无机磷酸阴离子。在该第二子组的另一个实施方案中，至少所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子。18.在第一方面的第三子组中，标准(i)至(iv)中的至少三者适用。例如，在该第三子组的一个实施方案中，至少所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka、所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl。在该第三子组的另一个实施方案中，至少所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka、所述制剂基本上不含无机磷酸阴离子并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl。在第三子组的另一个实施方案中，至少所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl。在第三子组的另一个实施方案中，至少所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka并且所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子。19.在第一方面的第四子组中，标准(i)至(iv)中的至少全部皆适用。即，在该第四子组中，至少所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka、所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl。20.在第一方面的一个实施方案中(特别是第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中)，所述制剂包含缓冲剂体系和/或冷冻保护剂。例如，在一个实施方案中(特别是第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中)，所述制剂包含缓冲剂体系。在另一个实施方案中(特别是第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的另一个实施方案中)，所述制剂包含冷冻保护剂。在另一个实施方案中(特别是第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的另一个实施方案中)，所述制剂包含缓冲剂体系和冷冻保护剂。因此，这些实施方案的一些具体实例为以下：21.(1)所述制剂包含缓冲剂体系，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；22.(2)所述制剂包含冷冻保护剂，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；23.(3)所述制剂包含缓冲剂体系和冷冻保护剂，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；24.(4)所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述制剂包含缓冲剂体系；25.(5)所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述制剂包含冷冻保护剂；26.(6)所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述制剂包含缓冲剂体系和冷冻保护剂；27.(7)所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子并且包含缓冲剂体系；28.(8)所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子并且包含冷冻保护剂；29.(9)所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子并且包含缓冲剂体系和冷冻保护剂；30.(10)所述制剂基本上不含无机磷酸阴离子并且包含缓冲剂体系；31.(11)所述制剂基本上不含无机磷酸阴离子并且包含冷冻保护剂；32.(12)所述制剂基本上不含无机磷酸阴离子，并且包含缓冲剂体系和冷冻保护剂；33.(13)所述制剂包含缓冲剂体系，所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；34.(14)所述制剂包含冷冻保护剂体系，所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；35.(15)所述制剂包含缓冲剂体系和冷冻保护剂，所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；36.(16)所述制剂包含缓冲剂体系并且基本上不含柠檬酸阴离子，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；37.(17)所述制剂包含冷冻保护剂并且基本上不含柠檬酸阴离子，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；38.(18)所述制剂包含缓冲剂体系和冷冻保护剂并且基本上不含柠檬酸阴离子，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；39.(19)所述制剂包含缓冲剂体系并且基本上不含无机磷酸阴离子，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；40.(20)所述制剂包含冷冻保护剂并且基本上不含无机磷酸阴离子，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；41.(21)所述制剂包含缓冲剂体系和冷冻保护剂并且基本上不含无机磷酸阴离子，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；42.(22)所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子并且包含缓冲剂体系；43.(23)所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子并且包含冷冻保护剂；44.(24)所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子并且包含缓冲剂体系和冷冻保护剂；45.(25)所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述制剂基本上不含无机磷酸阴离子并且包含缓冲剂体系；46.(26)所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述制剂基本上不含无机磷酸阴离子并且包含冷冻保护剂；47.(27)所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述制剂基本上不含无机磷酸阴离子，并且包含缓冲剂体系和冷冻保护剂；48.(28)所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子并且包含缓冲剂体系；49.(29)所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子并且包含冷冻保护剂；50.(30)所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子并且包含缓冲剂体系和冷冻保护剂；51.(31)所述制剂包含缓冲剂体系，所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；52.(32)所述制剂包含冷冻保护剂，所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；53.(33)所述制剂包含缓冲剂体系和冷冻保护剂，所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；54.(34)所述制剂包含缓冲剂体系，所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，所述制剂基本上不含无机磷酸阴离子，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；55.(35)所述制剂包含冷冻保护剂，所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，所述制剂基本上不含无机磷酸阴离子，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；56.(36)所述制剂包含缓冲剂体系和冷冻保护剂，所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，所述制剂基本上不含无机磷酸阴离子，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；57.(37)所述制剂包含缓冲剂体系，所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；58.(38)所述制剂包含冷冻保护剂，所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；59.(39)所述制剂包含缓冲剂体系和冷冻保护剂，所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；60.(40)所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子，并且所述制剂包含缓冲剂体系；61.(41)所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子，并且所述制剂包含冷冻保护剂；62.(42)所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子，并且所述制剂包含缓冲剂体系和冷冻保护剂；63.(43)所述制剂包含缓冲剂体系，所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；64.(44)所述制剂包含冷冻保护剂，所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl；65.(45)所述制剂包含缓冲剂体系和冷冻保护剂，所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子，并且步骤(i)不包括添加nacl或者不包括添加kcl或者不包括添加nacl和kcl。66.在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述制剂的ph为至多6.5，优选至多6.4、至多6.3、至多6.2、至多6.1或至多6.0。在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述制剂的ph的范围为5.5至6.5，例如5.6至6.4、5.7至6.6、5.8至6.2或5.9至6.1。在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上列出实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述制剂的ph为约6.0。67.在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述制剂包含缓冲剂体系，所述缓冲剂体系包含水(特别是去离子水，例如注射用水)和缓冲物质。在一个实施方案中，缓冲剂体系包含hepes、组氨酸、tris和乙酸中任一者作为缓冲物质，例如hepes、组氨酸和tris中任一者作为缓冲物质。在一个优选实施方案中，缓冲剂体系包含hepes作为缓冲物质。在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述制剂包含缓冲剂体系，所述缓冲剂体系包含水(特别是去离子水，例如注射用水)和hepes作为缓冲物质。68.在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述制剂包含缓冲剂体系，所述缓冲剂在所述制剂中的浓度为至多50mm，优选至多45mm，更优选至多40mm，更优选至多35mm，更优选至多30mm，更优选至多25mm，更优选至多20mm。在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述缓冲剂在所述制剂中的浓度为5mm至50mm，例如，5mm至40mm，10mm至30mm，或15mm至25mm。69.在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述制剂包含冷冻保护剂，所述冷冻保护剂包含一种或更多种碳水化合物。例如，冷冻保护剂可包含以下中的任一种：蔗糖、海藻糖、葡萄糖、或其组合。在第一方面的一个优选实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述制剂包含蔗糖和/或海藻糖作为冷冻保护剂。70.在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述制剂包含冷冻保护剂，所述冷冻保护剂在所述制剂中的浓度为至少1％w/v，例如至少2％w/v、至少3％w/v、至少4％w/v、至少5％w/v、至少6％w/v、至少7％w/v或至少8％w/v。在一个实施方案中，所述冷冻保护剂在所述制剂中的浓度为最高25％w/v，例如最高20％w/c、最高19％w/v、最高18％w/v、最高17％w/v、最高16％w/v、最高15％w/v、最高14％w/v、最高13％w/v、最高12％w/v或最高11％w/v。在一个实施方案中，所述冷冻保护剂在所述制剂中的浓度为1％w/v至20％w/v，例如2％w/v至19％w/v、3％w/v至18％w/v、4％w/v至17％w/v、5％w/v至16％w/v、5％w/v至15％w/v、6％w/v至14％w/v、7％w/v至13％w/v、8％w/v至12％w/v、9％w/v至11％w/v或约10％w/v。在第一方面一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述制剂包含冷冻保护剂(特别是蔗糖和/或海藻糖)，其浓度为5％w/v至15％w/v，例如6％w/v至14％w/v，7％w/v至13％w/v，8％w/v至12％w/v，或9％w/v至11％w/v，或浓度为约10％w/v。71.在第一方面的一个优选实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个优选实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述制剂包含缓冲剂体系和冷冻保护剂，所述缓冲剂体系包含hepes作为缓冲物质，并且所述冷冻保护剂包含蔗糖和/或海藻糖，优选地以上述限定的浓度。72.在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述制剂还包含泊洛沙姆(poloxamer)。73.在第一方面的替代实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，特别地其中所述制剂包含hepes作为缓冲物质，所述制剂不包含泊洛沙姆。74.在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述阳离子可电离脂质包含含有至少一个能够在生理条件下被质子化的氮原子的头基。例如，阳离子可电离脂质可具有式(i)结构：[0075][0076]或其可药用盐、互变异构体、前药或立体异构体，[0077]其中l1、l2、g1、g2、g3、r1、r2和r3如本文中所限定。优选地，所述阳离子可电离脂质选自以下：结构i-1至i-36(本文中所示)；和/或结构a至f(本文中所示)；和/或n,n-二甲基-2,3-二油烯基氧基丙胺(dodma)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(dodap)、三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(dlin-mc3-dma)和4-((二((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)氨基)氧基)-n,n-二甲基-4-氧代丁烷-1-胺(dpl-14)。[0078]在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，lnp还包含一种或更多种另外的脂质。优选地，所述一种或更多种另外的脂质选自聚合物缀合的脂质、中性脂质、类固醇、及其组合。在第一方面的一个优选实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，lnp包含如本文中所述的阳离子可电离脂质、聚合物缀合的脂质(例如聚乙二醇化脂质或聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂物质的缀合物)、中性脂质(例如，dspc)和类固醇(例如，胆固醇)。[0079]在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述lnp还包含聚合物缀合的脂质作为一种或更多种另外的脂质之一，所述聚合物缀合的脂质是聚乙二醇化脂质。例如，所述聚乙二醇化脂质可具有以下结构：[0080][0081]或其可药用盐、互变异构体或立体异构体，[0082]其中r12、r13和w如本文中所限定。[0083]在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述lnp还包含聚合物缀合的脂质作为一种或更多种另外的脂质之一，所述聚合物缀合的脂质是聚肌氨酸-脂质缀合物或者聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物。例如，聚肌氨酸-脂质缀合物或者聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物可以是选自以下的成员：聚肌氨酸-二酰基甘油缀合物、聚肌氨酸-二烷氧基丙基缀合物、聚肌氨酸-磷脂缀合物、聚肌氨酸-神经酰胺缀合物、及其混合物。[0084]在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述lnp还包含中性脂质作为一种或更多种另外的脂质之一，所述中性脂质是磷脂。这样的磷脂优选地选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂。磷脂的一些特定实例包括二硬脂酰基磷脂酰胆碱(distearoylphosphatidylcholine，dspc)、二油酰基磷脂酰胆碱(dioleoylphosphatidylcholine，dopc)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(dimyristoylphosphatidylcholine，dmpc)、双十五烷酰基磷脂酰胆碱、二月桂酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(dipalmitoylphosphatidylcholine，dppc)、二花生酰基磷脂酰胆碱(diarachidoylphosphatidylcholine，dapc)、二山萮炔酰基磷脂酰胆碱(dibehenoylphosphatidylcholine，dbpc)、双二十三烷酰基磷脂酰胆碱(ditricosanoylphosphatidylcholine，dtpc)、双二十四酰基磷脂酰胆碱(dilignoceroylphatidylcholine，dlpc)、棕榈酰基油酰基-磷脂酰胆碱(palmitoyloleoyl-phosphatidylcholine，popc)、1,2-二-o-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0二醚pc)、1-油酰基-2-胆甾醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(ochemspc)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(c16lysopc)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(dioleoylphosphatidylethanolamine，dope)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(distearoyl-phosphatidylethanolamine，dspe)、二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺(dipalmitoyl-phosphatidylethanolamine，dppe)、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(dimyristoyl-phosphatidylethanolamine，dmpe)、二月桂酰基-磷脂酰乙醇胺(dilauroyl-phosphatidylethanolamine，dlpe)和二植烷酰基-磷脂酰乙醇胺(diphytanoyl-phosphatidylethanolamine，dpype)。[0085]在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述lnp还包含类固醇作为一种或更多种另外的脂质之一，所述类固醇是固醇例如胆固醇。[0086]在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述制剂还包含螯合剂，例如edta。在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述制剂包含螯合剂，所述螯合剂在所述制剂中的浓度为至多20mm，优选至多15mm，更优选至多10mm，更优选至多5mm。[0087]在第一方面的一个替代实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个替代实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述制剂不包含螯合剂。[0088]在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，阳离子可电离脂质与mrna之比为2:1至12:1，例如2:1至10:1，或4:1至8:1。[0089]在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述mrna包封在所述lnp之内或者与所述lnp缔合。[0090]在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，mrna包含替代尿苷的经修饰核苷。例如，经修饰核苷可选自假尿苷(ψ)、n1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5u)。[0091]在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述mrna包含以下中的一者或更多者：(a)5’帽；(b)5’utr；(c)3’utr；和(d)poly-a序列，例如包含至少100个核苷酸的poly-a序列。[0092]在第一方面的一个优选实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个优选实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述mrna编码一种或更多种多肽。例如，所述一种或更多种多肽可包含用于在对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位。在一个优选实施方案中，所述mrna编码包含sars-cov-2s蛋白、其免疫原性变体或者所述sars-cov-2s蛋白或所述其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列。[0093]在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，将所述制剂冷冻至温度范围为约-30℃至约-10℃，例如约-25℃至约-15℃，或约-25℃至约-20℃，或者冷冻至温度为约-20℃。[0094]在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述方法包括步骤(iii)将所述冷冻制剂冷冻干燥，所述冷冻制剂被冷冻干燥直至所述药物组合物基本上不含包含在所述冷冻制剂中的水。例如，所述冷冻制剂可被冷冻干燥直至所述药物组合物包含小于1.0重量％的水，例如小于0.8重量％、小于0.7重量％、小于0.6重量％、小于0.5重量％、小于0.4重量％、小于0.3重量％、小于0.2重量％或小于0.1重量％的水。[0095]在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，步骤(i)包括(a)制备包含水(特别是去离子水，例如注射用水)和缓冲剂体系的mrna溶液；(b)制备包含阳离子可电离脂质和(如果存在的话)一种或更多种另外的脂质的乙醇溶液；以及(c)将(a)中制备的mrna溶液与(b)中制备的乙醇溶液混合，从而制备包含lnp的制剂。为了去除不期望的组分(例如，乙醇)，在一个优选实施方案中，步骤(i)在步骤(c)之后还包括一个或更多个选自稀释和过滤(例如切向流过滤和/或渗滤)的步骤。在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，在步骤(i)(a)中制备的mrna溶液包含小于0.2％w/v，例如小于0.15％w/v、小于0.10％w/v、小于0.05％w/v或小于0.01％w/v的组合浓度的nacl和kcl。[0096]在第一方面的一个替代实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个替代实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，步骤(i)包括(a’)制备阳离子可电离脂质和如果存在的话一种或更多种另外的脂质在水相中的脂质体或胶体制备物；和(b’)制备包含水和缓冲剂体系的mrna溶液；以及(c’)将(a’)中制备的脂质体或胶体制备物与(b’)中制备的mrna溶液混合。在一个优选实施方案中，步骤(i)在步骤(c’)之后还包括一个或更多个稀释步骤。在第一方面的一个实施方案中(特别是在第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，在步骤(i)(b’)中制备的mrna溶液包含小于0.2％w/v，例如小于0.15％w/v、小于0.10％w/v、小于0.05％w/v或小于0.01％w/v的组合浓度的nacl和kcl。[0097]在第二方面中，本公开内容提供了储存药物组合物的方法，其包括根据第一方面的方法制备药物组合物，并将所述药物组合物储存在约-30℃或更高，例如约-25℃或更高的温度下。例如，可将冷冻的药物组合物储存在约-30℃至约-10℃，例如约-25℃至约-15℃或约-25℃至约-20℃的温度范围下，或约-20℃的温度下。可将冷冻干燥的药物组合物储存在约-25℃至约室温，例如约-15℃至约8℃、约-10℃至约2℃或约-5℃至约0℃的温度范围下。在第二方面的一个实施方案中，将药物组合物储存至少3个月，优选至少6个月，更优选至少12个月，更优选至少18个月，更优选至少24个月，更优选至少30个月，更优选至少36个月。[0098]应当理解，在第一方面的情况中本文中所述的任何实施方案(特别地，第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的任何实施方案，例如以上所列实施方案(1)至(45)中的任何实施方案)也可适用于第二方面的任何实施方案。[0099]在第三方面中，本公开内容提供了冷冻的药物组合物，其可通过第一方面的所述方法制备。在第三方面的一个实施方案中，所述药物组合物可储存在约-30℃或更高，例如约-25℃或更高的温度下。例如，第三方面的冷冻的药物组合物可储存在约-30℃至约-10℃，例如约-25℃至约-15℃或约-25℃至约-20℃的温度范围下，或约-20℃的温度下。在第三方面的一个实施方案中，药物组合物可储存至少3个月，优选至少6个月，更优选至少12个月，更优选至少18个月，更优选至少24个月，更优选至少30个月，更优选至少36个月。在第三方面的一个实施方案中，在将所述冷冻的药物组合物解冻之后所述lnp的尺寸(z平均值)为约50nm至约500nm。在第三方面的一个实施方案中，在将所述冷冻的药物组合物解冻之后所述lnp的尺寸(z平均值)(和/或尺寸分布和/或多分散性指数(polydispersityindex，pdi))等于在冷冻之前所述lnp的尺寸(z平均值)(和/或尺寸分布和/或pdi)。在第三方面的一个实施方案中，在将所述冷冻的药物组合物解冻之后所述lnp的pdi小于0.3，优选小于0.2，更优选小于0.1，例如小于0.05。在第三方面的一个实施方案中，在将所述冷冻的药物组合物解冻之后所述lnp的尺寸(z平均值)为约50nm至约500nm，并且在将所述冷冻的药物组合物解冻之后所述lnp的尺寸(z平均值)(和/或尺寸分布和/或pdi)等于在冷冻之前所述lnp的尺寸(z平均值)(和/或尺寸分布和/或pdi)。在第三方面的一个实施方案中，在将所述冷冻的药物组合物解冻之后所述lnp的尺寸(z平均值)为约50nm至约500nm，并且在将所述冷冻的药物组合物解冻之后所述lnp的pdi小于0.3(优选小于0.2，更优选小于0.1，例如小于0.05)。[0100]应当理解，在第一或第二方面的情况中本文中所述的任何实施方案(特别地，第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的任何实施方案，例如以上所列实施方案(1)至(45)中的任何实施方案)也可适用于第三方面的任何实施方案。[0101]在第四方面中，本公开内容提供了冷冻干燥的药物组合物，其可通过第二方面的方法制备。在第四方面的一个实施方案中，所述药物组合物可储存在约-30℃或更高，例如约-25℃或更高的温度下。例如，第四方面的冷冻干燥的药物组合物可储存在约-25℃至约室温，例如约-15℃至约8℃、约-10℃至约2℃或约-5℃至约0℃的温度下。在第四方面的一个实施方案中，所述药物组合物可储存至少3个月，优选至少6个月，更优选至少12个月，更优选至少18个月，更优选至少24个月，更优选至少30个月，更优选至少36个月。在第四方面的一个实施方案中，在将所述冷冻干燥的药物组合物重构之后所述lnp的尺寸(z平均值)为约50nm至约500nm。在第四方面的一个实施方案中，在将所述冷冻干燥的药物组合物重构之后所述lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi等于冷冻干燥之前所述lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi。在第四方面的一个实施方案中，在将所述冷冻干燥的药物组合物重构之后所述lnp的pdi小于0.3，优选小于0.2，更优选小于0.1，例如小于0.05。在第四方面的一个实施方案中，在将所述冷冻干燥的药物组合物重构之后所述lnp的尺寸(z平均值)为约50nm至约500nm，并且在将所述冷冻干燥的药物组合物重构之后所述lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi等于冷冻干燥之前所述lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi。在第四方面的一个实施方案中，在将所述冷冻干燥的药物组合物重构之后所述lnp的尺寸(z平均值)为约50nm至约500nm，并且在将所述冷冻干燥的药物组合物重构之后所述lnp的pdi小于0.3(优选小于0.2，更优选小于0.1，例如小于0.05)。[0102]应当理解，在第一、第二或第三方面的情况中本文中所述的任何实施方案(特别地，第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的任何实施方案，例如以上所列实施方案(1)至(45)中的任何实施方案)也可适用于第四方面的任何实施方案。[0103]在第五方面中，本公开内容提供了用于制备即用型药物组合物的方法，所述方法包括以下步骤：提供通过第一方面所述的方法制备的冷冻的药物组合物并将所述冷冻的药物组合物解冻，从而获得所述即用型药物组合物。[0104]应当理解，在第一、第二、第三或第四方面的情况中本文中所述的任何实施方案(特别地，第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的任何实施方案，例如以上所列实施方案(1)至(45)中的任何实施方案)也可适用于第五方面的任何实施方案。[0105]在第六方面中，本公开内容提供了用于制备即用型药物组合物的方法，所述方法包括以下步骤：提供通过第二方面的所述方法制备的冷冻干燥的药物组合物并将所述冷冻的药物组合物重构，从而获得所述即用型药物组合物。[0106]应当理解，在第一、第二、第三、第四或第五方面的情况中本文所述的任何实施方案(特别地，第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的任何实施方案，例如以上所列实施方案(1)至(45)中的任何实施方案)也可适用于第六方面的任何实施方案。[0107]在第七方面中，本公开内容提供了即用型药物组合物，其可通过第五或第六方面所述的方法制备。[0108]应当理解，在第一、第二、第三、第四、第五或第六方面的情况中本文所述的任何实施方案(特别地，第一方面的以上第一、第二、第三或第四子组的任何实施方案，例如以上所列实施方案(1)至(45)中的任何实施方案)也可适用于第七方面的任何实施方案。[0109]在第八方面中，本公开内容提供了包含lnp的药物组合物，其中所述lnp包含阳离子可电离脂质和mrna，并且其中以下中一者或更多者适用：[0110](i)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量，所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于0.20重量％；[0111](ii)所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka；[0112](iii)所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子；[0113](iv)所述药物组合物基本上不含无机磷酸阴离子，[0114]其中所述药物组合物是冷冻形式或冷冻干燥形式。[0115]在第八方面的一个实施方案中，基于所述药物组合物中脂质和mrna的总重量，所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，优选小于9重量、优选小于8重量、优选小于7重量、优选小于6重量、优选小于5重量、优选小于4重量、优选小于3重量、优选小于2重量、优选小于1重量、优选小于0.9重量、优选小于0.8重量、优选小于0.7重量、优选小于0.6重量、优选小于0.5重量、优选小于0.4重量、优选小于0.3重量、优选小于0.2重量、优选小于0.1重量。[0116]在第八方面的第一子组中，标准(i)至(iv)中的至少一者适用。例如，在该第一子组的一个实施方案中，基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量，至少所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％。在该第一子组的另一个实施方案中，在以水性液体形式时，至少所述药物组合物的ph低于阳离子可电离脂质的pka。在该第一子组的另一个实施方案中，至少所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子。在该第一子组的另一个实施方案中，至少所述药物组合物基本上不含无机磷酸阴离子。[0117]在第八方面的第二子组中，标准(i)至(iv)中的至少两者适用。例如，在该第二子组的一个实施方案中，基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量，至少所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka。在该第二子组的另一个实施方案中，基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量，至少所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且基本上不含柠檬酸阴离子。在该第二子组的另一个实施方案中，基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量，所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且基本上不含无机磷酸阴离子。在该第二子组的另一个实施方案中，在以水性液体形式时至少所述药物组合物的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka并且所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子。在该第二子组的另一个实施方案中，在以水性液体形式时，至少所述药物组合物的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka并且所述药物组合物基本上不含无机磷酸阴离子。在该第二子组的另一个实施方案中，至少所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子。[0118]在第八方面的第三子组中，标准(i)至(iv)中的至少三者适用。例如，在该第三子组的一个实施方案中，基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量，至少所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子。在第三子组的另一个实施方案中，基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量，至少所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含无机磷酸阴离子。在第三子组的另一个实施方案中，基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量，至少所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子。在该第三子组的另一个实施方案中，在以水性液体形式时，至少所述药物组合物的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka并且所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子。[0119]在第八方面的第四子组中，标准(i)至(iv)中的至少所有均适用。即，在该第四子组中，基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量，至少所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％、所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka并且所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子。[0120]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中)，所述药物组合物包含缓冲剂体系和/或冷冻保护剂。例如，在一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中)，所述药物组合物包含缓冲剂体系。在另一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的另一个实施方案中)，所述药物组合物包含冷冻保护剂。在另一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的另一个实施方案中)，所述药物组合物包含缓冲剂体系和冷冻保护剂。因此，这些实施方案中的一些具体实例为下：[0121](1)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且包含缓冲剂体系；[0122](2)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且包含冷冻保护剂；[0123](3)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且包含缓冲剂体系和冷冻保护剂；[0124](4)所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka并且所述药物组合物包含缓冲剂体系；[0125](5)所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka并且所述药物组合物包含冷冻保护剂；[0126](6)所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka并且所述药物组合物包含缓冲剂体系和冷冻保护剂；[0127](7)所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子并且包含缓冲剂体系；[0128](8)所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子并且包含冷冻保护剂；[0129](9)所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子并且包含缓冲剂体系和冷冻保护剂；[0130](10)所述药物组合物基本上不含无机磷酸阴离子并且包含缓冲剂体系；[0131](11)所述药物组合物基本上不含无机磷酸阴离子并且包含冷冻保护剂；[0132](12)所述药物组合物基本上不含无机磷酸阴离子，并且包含缓冲剂体系和冷冻保护剂；[0133](13)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且包含缓冲剂体系，并且所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka；[0134](14)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且包含冷冻保护剂体系，并且所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka；[0135](15)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且包含缓冲剂体系和冷冻保护剂，并且所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka；[0136](16)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，所述药物组合物包含缓冲剂体系并且基本上不含柠檬酸阴离子；[0137](17)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，所述药物组合物包含冷冻保护剂并且基本上不含柠檬酸阴离子；[0138](18)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，所述药物组合物包含缓冲剂体系和冷冻保护剂并且基本上不含柠檬酸阴离子；[0139](19)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且所述药物组合物包含缓冲剂体系且基本上不含无机磷酸阴离子；[0140](20)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且所述药物组合物包含冷冻保护剂并且基本上不含无机磷酸阴离子；[0141](21)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且所述药物组合物包含缓冲剂体系和冷冻保护剂并且基本上不含无机磷酸阴离子；[0142](22)所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子并且包含缓冲剂体系；[0143](23)所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子并且包含冷冻保护剂；[0144](24)所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子并且包含缓冲剂体系和冷冻保护剂；[0145](25)所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含无机磷酸阴离子并且包含缓冲剂体系；[0146](26)所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含无机磷酸阴离子并且包含冷冻保护剂；[0147](27)所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含无机磷酸阴离子并且包含缓冲剂体系和冷冻保护剂；[0148](28)所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子并且包含缓冲剂体系；[0149](29)所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子并且包含冷冻保护剂；[0150](30)所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子并且包含缓冲剂体系和冷冻保护剂；[0151](31)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且所述药物组合物包含缓冲剂体系，所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子；[0152](32)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且所述药物组合物包含冷冻保护剂，所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子；[0153](33)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且所述药物组合物包含缓冲剂体系和冷冻保护剂，所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子；[0154](34)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且所述药物组合物包含缓冲剂体系，所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含无机磷酸阴离子；[0155](35)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且所述药物组合物包含冷冻保护剂，所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含无机磷酸阴离子；[0156](36)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且所述药物组合物包含缓冲剂体系和冷冻保护剂，所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含无机磷酸阴离子；[0157](37)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，所述药物组合物包含缓冲剂体系，并且基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子；[0158](38)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，所述药物组合物包含冷冻保护剂，并且基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子；[0159](39)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，所述药物组合物包含缓冲剂体系和冷冻保护剂，并且基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子；[0160](40)所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子，并且所述药物组合物包含缓冲剂体系；[0161](41)所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子，并且所述药物组合物包含冷冻保护剂；[0162](42)所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子，并且所述药物组合物包含缓冲剂体系和冷冻保护剂；[0163](43)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且所述药物组合物包含缓冲剂体系，所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子；[0164](44)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且所述药物组合物包含冷冻保护剂，所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子；[0165](45)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％，并且所述药物组合物包含缓冲剂体系和冷冻保护剂，所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子。[0166]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述药物组合物在以水性液体形式时其ph为至多6.5，优选至多6.4、至多6.3、至多6.2、至多6.1或至多6.0。在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述制剂的ph的范围为5.5至6.5，例如5.6至6.4、5.7至6.6、5.8至6.2或5.9至6.1。在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面所列实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述制剂的ph为约6.0。[0167]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述药物组合物包含缓冲剂体系，所述缓冲剂体系包含水(特别是去离子水，例如注射用水)和缓冲物质。在一个实施方案中，缓冲剂体系包含hepes、组氨酸、tris和乙酸中的任一者作为缓冲物质，例如hepes、组氨酸和tris中的任一者作为缓冲物质。在一个优选实施方案中，缓冲剂体系包含hepes作为缓冲物质。在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述制剂包含缓冲剂体系，所述缓冲剂体系包含水(特别是去离子水，例如注射用水)和hepes作为缓冲物质。[0168]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述药物组合物包含缓冲剂体系，所述药物组合物中缓冲物质的量为每克的所述药物组合物中脂质和mrna的总重量至多4mmol，优选至多3.6mmol，更优选至多3.2mmol、更优选至多2.8mmol、更优选至多2.4mmol、更优选至多2.0mmol、至多1.8mmol。在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述药物组合物中缓冲物质的量为每克的所述药物组合物中脂质和mrna的总重量0.4mmol至4mmol，例如0.4mmol至3.2mmol、0.8mmol至2.8mmol、0.8mmol至2.4mmol、1.2mmol至2.0mmol或1.4mmol至1.6mmol。[0169]在第八方面的一个实施方案中(特别地，在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述药物组合物包含冷冻保护剂，所述冷冻保护剂包含一种或更多种碳水化合物。例如，所述冷冻保护剂可包含以下中的任一种：蔗糖、海藻糖、葡萄糖中或其组合。在第八方面的一个优选实施方案中(特别地，在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述药物组合物包含蔗糖和/或海藻糖作为冷冻保护剂。[0170]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述药物组合物包含冷冻保护剂，所述冷冻保护剂在所述药物组合物中的浓度为至少80重量％，例如至少81重量％，至少82重量％，至少83重量％、至少84重量％、至少85重量％或至少86重量％(优选地：(i)在所述药物组合物为冷冻形式的情况下，基于不包含所述药物组合物中任何溶剂的所述药物组合物的总量，或(ii)在所述药物组合物为冷冻干燥形式的情况下，基于所述药物组合物的总量)。在一个实施方案中，所述冷冻保护剂在所述药物组合物中的浓度为最高95重量％，例如最高94重量％、最高93重量％、最高92重量％、最高91重量％或最高90重量％或最高89重量％(优选地：(i)在所述药物组合物为冷冻形式的情况下，基于不包含所述药物组合物中任何溶剂的所述药物组合物的总量，或(ii)在所述药物组合物为冷冻干燥形式的情况下，基于所述药物组合物的总量)。在一个实施方案中，所述冷冻保护剂在所述药物组合物中的浓度为80重量％至95重量％、例如81重量％至94重量％、82重量％至93重量％、83重量％至92重量％、84重量％至91重量％、84重量％至91重量％、85重量％至91重量％、86重量％至91重量％、87重量％至91重量％、88重量％至89重量％、或约89重量％(优选地，(i)在所述药物组合物为冷冻形式的情况下，基于不包含所述药物组合物中任何溶剂的所述药物组合物的总量，或(ii)在所述药物组合物为冷冻干燥形式的情况下，基于所述药物组合物的总量)。在第八方面的一个优选实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述药物组合物包含冷冻保护剂(特别是蔗糖和/或海藻糖)，其浓度为85重量％至95重量％、例如，85重量％至94重量％、86重量％至93重量％、87重量％至92重量％、或88重量％至91重量％(优选地，(i)在所述药物组合物为冷冻形式的情况下，基于不包含所述药物组合物中任何溶剂的所述药物组合物的总量，或(ii)在所述药物组合物为冷冻干燥形式的情况下，基于所述药物组合物的总量)。[0171]在第八方面的一个优选实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个优选实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述药物组合物包含缓冲剂体系和冷冻保护剂，所述缓冲剂体系包含hepes作为缓冲物质，并且所述冷冻保护剂包含蔗糖和/或海藻糖，优选地以上述限定的量/浓度。[0172]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述药物组合物还包含泊洛沙姆。[0173]在第八方面的一个替代实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，特别地其中所述药物组合物包含hepes作为缓冲物质，所述药物组合物不包含泊洛沙姆。[0174]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述阳离子可电离脂质包含含有至少一个能够在生理条件下被质子化的氮原子的头基。例如，所述阳离子可电离脂质可以具有式(i)结构：[0175][0176]或其可药用盐、互变异构体、前药或立体异构体，[0177]其中l1、l2、g1、g2、g3、r1、r2和r3如本文中所限定。优选地，所述阳离子可电离脂质选自以下：结构i-1至i-36(本文中所示)；和/或结构a至f(本文中所示)；和/或n,n-二甲基-2,3-二油烯基氧基丙胺(dodma)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(dodap)、三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(dlin-mc3-dma)和4-((二((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)氨基)氧基)-n,n-二甲基-4-氧代丁烷-1-胺(dpl-14)。[0178]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述lnp还包含一种或更多种另外的脂质。优选地，所述一种或更多种另外的脂质选自聚合物缀合的脂质、中性脂质、类固醇、及其组合。在第八方面的一个优选实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述lnp包含如本文中所述的阳离子可电离脂质、聚合物缀合的脂质(例如，聚乙二醇化脂质或聚肌氨酸-脂质缀合物或者聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物)、中性脂质(例如dspc)和类固醇(例如胆固醇)。[0179]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述lnp还包含聚合物缀合的脂质作为一种或更多种另外的脂质之一，所述聚合物缀合的脂质是聚乙二醇化脂质。例如，聚乙二醇化脂质可具有以下结构：[0180][0181]或其可药用盐、互变异构体或立体异构体，[0182]其中r12、r13和w如本文中所限定。[0183]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述lnp还包含聚合物缀合的脂质作为一种或更多种另外的脂质之一，所述聚合物缀合的脂质是聚肌氨酸-脂质缀合物或者聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物。例如，聚肌氨酸-脂质缀合物或者聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物可以是选自以下的成员：聚肌氨酸-二酰基甘油缀合物、聚肌氨酸-二烷氧基丙基缀合物、聚肌氨酸-磷脂缀合物、聚肌氨酸-神经酰胺缀合物、及其混合物。[0184]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述lnp还包含中性脂质作为一种或更多种另外的脂质之一，所述中性脂质是磷脂。这样的磷脂优选地选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂。磷脂的一些特定实例包括二硬脂酰基磷脂酰胆碱(dspc)、二油酰基磷脂酰胆碱(dopc)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(dmpc)、双十五烷酰基磷脂酰胆碱、二月桂酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(dppc)、二花生酰基磷脂酰胆碱(dapc)、二山萮炔酰基磷脂酰胆碱(dbpc)、双二十三烷酰基磷脂酰胆碱(dtpc)、双二十四酰基磷脂酰胆碱(dlpc)、棕榈酰基油酰基-磷脂酰胆碱(popc)、1,2-二-o-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0二醚pc)、1-油酰基-2-胆甾醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(ochemspc)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(c16lysopc)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(dspe)、二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺(dppe)、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(dmpe)、二月桂酰基-磷脂酰乙醇胺(dlpe)和二植烷酰基-磷脂酰乙醇胺(dpype)。[0185]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述lnp还包含类固醇作为一种或更多种另外的脂质之一，所述类固醇是固醇，例如胆固醇。[0186]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述药物组合物还包含螯合剂，例如edta。在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述药物组合物包含螯合剂，所述药物组合物中所述螯合剂的量为每克的所述药物组合物中脂质和mrna的总重量至多0.8mmol，优选至多0.6mmol，更优选0.4mmol，更优选至多0.2mmol。[0187]在第八方面的一个替代实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个替代实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述药物组合物不包含螯合剂。[0188]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，阳离子可电离脂质与mrna之比为2:1至12:1，例如2:1至10:1，或4:1至8:1。[0189]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述mrna包封在所述lnp之内或者与所述lnp缔合。[0190]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述mrna包含替代尿苷的经修饰核苷。例如，经修饰核苷可选自假尿苷(ψ)、n1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5u)。[0191]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述mrna包含以下中的一种或更多种：(a)5’帽；(b)5’utr；(c)3’utr；和(d)poly-a序列，例如包含至少100个核苷酸的poly-a序列。[0192]在第八方面的一个优选实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个优选实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述mrna编码一种或更多种多肽。例如，所述一种或更多种多肽可以包含用于在对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位。在一个优选实施方案中，mrna编码包含sars-cov-2s蛋白、其免疫原性变体或者所述sars-cov-2s蛋白或所述其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列。[0193]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，将所述制剂冷冻至温度为约-30℃至约-10℃，例如约-25℃至约-15℃或约-25℃至约-20℃，或冷冻至温度为约-20℃。[0194]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述药物组合物可储存在约-30℃或更高，例如约-25℃或更高的温度下。例如，第八方面所述冷冻的药物组合物可储存在约-30℃至约-10℃，例如约-25℃至约-15℃或约-25℃至约-20℃的温度下，或储存在约-20℃的温度下。第八方面所述冷冻干燥的药物组合物可储存在约-25℃至约室温，例如约-15℃至约8℃、约-10℃至约2℃或约-5℃至约0℃的温度下。[0195]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，所述药物组合物可储存至少3个月、优选至少6个月、更优选至少12个月、更优选至少18个月、更优选至少24个月、更优选至少30个月、更优选至少36个月。[0196]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，在将所述冷冻的药物组合物解冻之后或在将所述冷冻干燥的药物组合物重构之后所述lnp的尺寸(z平均值)为约50nm至约500nm。[0197]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，在将所述冷冻的药物组合物解冻之后所述lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi等于冷冻之前lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi，或者在将所述冷冻干燥的药物组合物重构之后所述lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi等于冷冻干燥之前lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi。在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，在将所述冷冻的药物组合物解冻之后或在将所述冷冻干燥的药物组合物重构之后所述lnp的pdi小于0.3，优选小于0.2，更优选小于0.1，例如小于0.05。[0198]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，在将所述冷冻的药物组合物解冻之后或在将所述冷冻干燥的药物组合物重构之后所述lnp的尺寸(z平均值)为约50nm至约500nm，并且(i)在将所述冷冻的药物组合物解冻之后所述lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi等于冷冻之前lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi，或者(ii)在将所述冷冻干燥的药物组合物重构之后所述lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi等于冷冻干燥之前lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi。在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，在将所述冷冻的药物组合物解冻之后或在将所述冷冻干燥的药物组合物重构之后lnp的尺寸(z平均值)为约50nm至约500nm，并且在将所述冷冻的药物组合物解冻之后或在将所述冷冻干燥的药物组合物重构之后所述lnp的pdi小于0.3(优选小于0.2，更优选小于0.1，例如小于0.05)。[0199]在第八方面的一个实施方案中(特别是在第八方面的以上第一、第二、第三或第四子组的一个实施方案中，例如在以上针对第八方面列出的实施方案(1)至(45)中的任一个中)，其中所述药物组合物为冷冻干燥形式，所述药物组合物基本上不含水。例如，基于所述药物组合物的总重量，所述药物组合物可包含小于1.0重量％的水，例如小于0.8重量％、小于0.7重量％、小于0.6重量％、小于0.5重量％、小于0.4重量％、小于0.3重量％、小于0.2重量％或小于0.1重量％的水。[0200]应当理解，在第一、第二、第三、第四、第五、第六或第七方面的情况中本文所述的任何实施方案也可适用于第八方面的任何实施方案。[0201]在第九方面中，本公开内容提供了第三、第四、第七和第八方面中任一方面的药物组合物，其用于治疗。[0202]应当理解，在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七或第八方面的情况中本文所述的任何实施方案也可适用于第九方面的任何实施方案。[0203]在第十方面中，本公开内容提供了第三、第四、第七和第八方面中任一方面所述的药物组合物，其用于诱导免疫应答。[0204]应当理解，在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八或第九方面的情况中本文所述的任何实施方案也可适用于第十方面的任何实施方案。[0205]本发明中要求保护的方法允许在保持产物活性和品质的情况下稳定包含mrna和阳离子可电离脂质的lnp组合物。特别地，产品特征例如颗粒尺寸、组分完整性、产品的活性和安全性，应保持至少12个月，更好是24个月，甚至更好是36个月的储存时间。[0206]另一些分项的实施方案如下：[0207]1.用于制备药物组合物的方法，其包括以下步骤：[0208](i)制备包含脂质纳米粒(lnp)的制剂，其中所述lnp包含阳离子可电离脂质和mrna，并且其中以下中一者或更多者适用：[0209](i)步骤(i)不包括添加nacl和/或kcl[0210](ii)所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka；[0211](iii)所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子；[0212](iv)所述制剂基本上不含无机磷酸阴离子；以及[0213](ii)将所述制剂冷冻至约-10℃或低于-10℃，从而获得冷冻形式的所述药物组合物。[0214]2.项1所述的方法，其还包括步骤(iii)将所述冷冻制剂冷冻干燥，从而获得冷冻干燥形式的所述药物组合物。[0215]3.项1或2所述的方法，其中所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka。[0216]4.项1或2所述的方法，其中所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子。[0217]5.项1或2所述的方法，其中所述制剂基本上不含无机磷酸阴离子。[0218]6.项1或2所述的方法，其中所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子。[0219]7.项1或2所述的方法，其中所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述制剂基本上不含无机磷酸阴离子。[0220]8.项1或2所述的方法，其中所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子。[0221]9.项1或2所述的方法，其中所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子。[0222]10.项1至9中任一项所述的方法，其中步骤(i)不包括添加nacl。[0223]11.项1至9中任一项所述的方法，其中步骤(i)不包括添加kcl。[0224]12.项1至9中任一项所述的方法，其中步骤(i)不包括添加nacl和kcl。[0225]13.项1至12中任一项所述的方法，其中所述制剂包含缓冲剂体系和/或冷冻保护剂。[0226]14.项1至12中任一项所述的方法，其中所述制剂包含缓冲剂体系，并且所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka。[0227]15.项1至12中任一项所述的方法，其中所述制剂包含冷冻保护剂，并且所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka。[0228]16.项1至12中任一项所述的方法，其中所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述制剂包含缓冲剂体系和冷冻保护剂。[0229]17.项1至12中任一项所述的方法，其中所述制剂包含缓冲剂体系并且基本上不含柠檬酸阴离子。[0230]18.项1至12中任一项所述的方法，其中所述制剂包含冷冻保护剂并且基本上不含柠檬酸阴离子。[0231]19.项1至12中任一项所述的方法，其中所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子，并且包含缓冲剂体系和冷冻保护剂。[0232]20.项1至12中任一项所述的方法，其中所述制剂包含缓冲剂体系并且基本上不含无机磷酸阴离子。[0233]21.项1至12中任一项所述的方法，其中所述制剂包含冷冻保护剂并且基本上不含无机磷酸阴离子。[0234]22.项1至12中任一项所述的方法，其中所述制剂基本上不含无机磷酸阴离子，并且包含缓冲剂体系和冷冻保护剂。[0235]23.项1至12中任一项所述的方法，其中所述制剂包含缓冲剂体系，并且基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子。[0236]24.项1至12中任一项所述的方法，其中所述制剂包含冷冻保护剂并且基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子。[0237]25.项1至12中任一项所述的方法，其中所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子，并且包含缓冲剂体系和冷冻保护剂。[0238]26.项1至12中任一项所述的方法，其中所述制剂包含缓冲剂体系，所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子和/或基本上不含无机磷酸阴离子。[0239]27.项1至12中任一项所述的方法，其中所述制剂包含冷冻保护剂，所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子和/或基本上不含无机磷酸阴离子。[0240]28.项1至12中任一项所述的方法，其中所述制剂包含缓冲剂体系和冷冻保护剂，所述制剂的ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述制剂基本上不含柠檬酸阴离子和/或基本上不含无机磷酸阴离子。[0241]29.项1至28中任一项所述的方法，其中所述制剂的ph为至多6.5，优选至多6.0。[0242]30.项13至29中任一项所述的方法，其中所述缓冲剂体系包含水和缓冲物质。[0243]31.项13至30中任一项所述的方法，其中所述缓冲剂体系包含hepes、组氨酸、tris和乙酸中的任一者作为缓冲物质。[0244]32.项13至31中任一项所述的方法，其中所述缓冲剂体系包含hepes、组氨酸和tris中的任一者作为缓冲物质。[0245]33.项13至32中任一项所述的方法，其中所述缓冲剂体系包含hepes作为缓冲物质。[0246]34.项13至33中任一项所述的方法，其中所述缓冲剂在所述制剂中的浓度为至多50mm，优选至多40mm，更优选至多20mm。[0247]35.项13至34中任一项所述的方法，其中所述冷冻保护剂包含一种或更多种碳水化合物。[0248]36.项13至35中任一项所述的方法，其中所述冷冻保护剂包含蔗糖、海藻糖、葡萄糖、或其组合。[0249]37.项13至36中任一项所述的方法，其中所述冷冻保护剂包含蔗糖和/或海藻糖。[0250]38.项13至37中任一项所述的方法，其中所述冷冻保护剂在所述制剂中的浓度为至少1％w/v。[0251]39.项13至38中任一项所述的方法，其中所述缓冲剂体系包含hepes作为缓冲物质，并且所述冷冻保护剂包含蔗糖和/或海藻糖。[0252]40.项1至39中任一项所述的方法，其中所述制剂还包含泊洛沙姆。[0253]41.项33或39所述的方法，其中所述制剂不包含泊洛沙姆。[0254]42.项1至41中任一项所述的方法，其中所述阳离子可电离脂质包含含有至少一个能够在生理条件下被质子化的氮原子的头基。[0255]43.项1至42中任一项所述的方法，其中所述阳离子可电离脂质具有式(i)结构：[0256][0257]或其可药用盐、互变异构体、前药或立体异构体，[0258]其中：[0259]l1或l2中一者是-o(c＝o)-、-(c＝o)o-、-c(＝o)-、-o-、-s(o)x-、-s-s-、-c(＝o)s-、sc(＝o)-、-nrac(＝o)-、-c(＝o)nra-、nrac(＝o)nra-、-oc(＝o)nra-或-nrac(＝o)o-，并且l1或l2中另一者是–o(c＝o)-、-(c＝o)o-、-c(＝o)-、-o-、-s(o)x-、-s-s-、-c(＝o)s-、sc(＝o)-、-nrac(＝o)-、-c(＝o)nra-、nrac(＝o)nra-、-oc(＝o)nra-或-nrac(＝o)o-或者直接键；[0260]g1和g2各自独立地是未经取代的c1-c12亚烷基或c2-c12亚烯基；[0261]g3是c1-c24亚烷基、c2-c24亚烯基、c3-c8亚环烷基、c3-c8亚环烯基；[0262]ra是h或c1-c12烷基；[0263]r1和r2各自独立地是c6-c24烷基或c6-c24烯基；[0264]r3是h、or5、cn、-c(＝o)or4、-oc(＝o)r4或–nr5c(＝o)r4；[0265]r4是c1-c12烷基；[0266]r5是h或c1-c6烷基；并且[0267]x是0、1或2。[0268]44.项1至43中任一项所述的方法，其中所述阳离子可电离脂质选自本文示出的结构i-1至i-36。[0269]45.项1至42中任一项所述的方法，其中所述阳离子可电离脂质选自本文示出的结构a至f。[0270]46.项1至42中任一项所述的方法，其中所述阳离子可电离脂质选自n,n-二甲基-2,3-二油烯基氧基丙胺(dodma)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(dodap)、三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(dlin-mc3-dma)和4-((二((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)氨基)氧基)-n,n-二甲基-4-氧代丁烷-1-胺(dpl-14)。[0271]47.项1至46中任一项所述的方法，其中所述lnp还包含一种或更多种另外的脂质，优选地选自聚合物缀合的脂质、中性脂质、类固醇、及其组合。[0272]48.项1至47中任一项所述的方法，其中所述lnp包含所述阳离子可电离脂质、聚合物缀合的脂质、中性脂质和类固醇。[0273]49.项47或48所述的方法，其中所述聚合物缀合的脂质包含聚乙二醇化脂质。[0274]50.项49所述的方法，其中所述聚乙二醇化脂质具有以下结构：[0275][0276]或其可药用盐、互变异构体或立体异构体，[0277]其中：[0278]r12和r13各自独立地是直链或支链、饱和或不饱和的包含10至30个碳原子的烷基链，其中所述烷基链任选地间插有一个或更多个酯键；并且w具有范围为30至60的平均值。[0279]51.项47或48所述的方法，其中所述聚合物缀合的脂质包含聚肌氨酸-脂质缀合物或者聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物。[0280]52.项51所述的方法，其中所述聚肌氨酸-脂质缀合物或者聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物是选自以下的成员：聚肌氨酸-二酰基甘油缀合物、聚肌氨酸-二烷氧基丙基缀合物、聚肌氨酸-磷脂缀合物、聚肌氨酸-神经酰胺缀合物、及其混合物。[0281]53.项47至52中任一项所述的方法，其中所述中性脂质是磷脂，优选地选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸或鞘磷脂。[0282]54.项53所述的方法，其中所述磷脂选自二硬脂酰基磷脂酰胆碱(dspc)、二油酰基磷脂酰胆碱(dopc)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(dmpc)、双十五烷酰基磷脂酰胆碱、二月桂酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(dppc)、二花生酰基磷脂酰胆碱(dapc)、二山萮炔酰基磷脂酰胆碱(dbpc)、双二十三烷酰基磷脂酰胆碱(dtpc)、双二十四酰基磷脂酰胆碱(dlpc)、棕榈酰基油酰基-磷脂酰胆碱(popc)、1,2-二-o-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0二醚pc)、1-油酰基-2-胆甾醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(ochemspc)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(c16lysopc)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(dspe)、二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺(dppe)、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(dmpe)、二月桂酰基-磷脂酰乙醇胺(dlpe)和二植烷酰基-磷脂酰乙醇胺(dpype)。[0283]55.项47至54中任一项所述的方法，其中所述类固醇包含固醇，例如胆固醇。[0284]56.项1至55中任一项所述的方法，其中所述制剂还包含螯合剂。[0285]57.项56所述的方法，其中所述螯合剂在所述制剂中的浓度为至多20mm，优选至多10mm，更优选至多5mm。[0286]58.项56或57所述的方法，其中所述螯合剂是edta。[0287]59.项1至55中任一项所述的方法，其中所述制剂不包含螯合剂。[0288]60.项1至59中任一项所述的方法，其中所述阳离子可电离脂质与mrna之比为2:1至12:1。[0289]61.项1至60中任一项所述的方法，其中所述mrna包封在所述lnp之内或者与所述lnp缔合。[0290]62.项1至61中任一项所述的方法，其中所述mrna包含替代尿苷的经修饰核苷。[0291]63.项62所述的方法，其中所述经修饰核苷选自假尿苷(ψ)、n1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5u)。[0292]64.项1至63中任一项所述的方法，其中所述mrna包含5’帽。[0293]65.项1至64中任一项所述的方法，其中所述mrna包含5’utr。[0294]66.项1至65中任一项所述的方法，其中所述mrna包含3’utr。[0295]67.项1至66中任一项所述的方法，其中所述mrna包含poly-a序列。[0296]68.项67所述的方法，其中所述poly-a序列包含至少100个核苷酸。[0297]69.项1至68中任一项所述的方法，其中所述mrna编码一种或更多种多肽。[0298]70.项69所述的方法，其中所述一种或更多种多肽包含用于在对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位。[0299]71.项69或70所述的方法，其中所述mrna编码包含sars-cov-2s蛋白、其免疫原性变体或者所述sars-cov-2s蛋白或所述其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列。[0300]72.项1至71中任一项所述的方法，其中将所述制剂冷冻至温度为约-30℃至约-10℃，例如约-25℃至约-15℃或约-25℃至约-20℃，或者冷冻至温度为约-20℃。[0301]73.项2至72中任一项所述的方法，其中将所述冷冻制剂冷冻干燥，直至所述药物组合物基本上不含包含在所述冷冻制剂中的水。[0302]74.项73所述的方法，其中将所述冷冻制剂冷冻干燥，直至所述药物组合物包含少于1.0重量％的水。[0303]75.项1至74中任一项所述的方法，其中步骤(i)包括(a)制备包含水和缓冲剂体系的mrna溶液；(b)制备包含阳离子可电离脂质和如果存在的话一种或更多种另外的脂质的乙醇溶液；以及(c)将(a)中制备的mrna溶液与(b)中制备的乙醇溶液混合，从而制备所述包含lnp的制剂。[0304]76.项1至74中任一项所述的方法，其中步骤(i)包括(a’)制备所述阳离子可电离脂质和如果存在的话一种或更多种另外的脂质在水相中的脂质体或胶体制备物；和(b’)制备包含水和缓冲剂体系的mrna溶液；以及(c’)将(a’)中制备的脂质体或胶体制备物与(b’)中制备的mrna溶液混合。[0305]77.项75或76所述的方法，其中步骤(i)在步骤(c)或(c’)之后还包括一个或更多个选自稀释和过滤例如切向流过滤的步骤。[0306]78.储存药物组合物的方法，其包括根据项1至77中任一项所述的方法制备药物组合物，并将所述药物组合物储存在约-30℃至约-10℃，例如约-25℃至约-15℃或约-25℃至约-20℃的温度下，或者储存在约-20℃的温度下。[0307]79.项78所述的方法，其中将所述药物组合物储存至少3个月，优选至少12个月，更优选至少24个月，更优选至少36个月。[0308]80.冷冻的药物组合物，其可通过项1至79中任一项所述的方法制备。[0309]81.项80所述的药物组合物，其中在将所述冷冻的药物组合物解冻之后lnp的尺寸(z平均值)为约50nm至约500nm。[0310]82.项80或81所述的药物组合物，其中在将所述冷冻的药物组合物解冻之后lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或多分散性指数(pdi)等于冷冻之前lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi。[0311]83.冷冻干燥的药物组合物，其可通过项2至79中任一项所述的方法制备。[0312]84.项83所述的药物组合物，其中在将所述冷冻干燥的药物组合物重构之后lnp的尺寸(z平均值)为约50nm至约500nm。[0313]85.项83或84所述的药物组合物，其中在将所述冷冻干燥的药物组合物重构之后lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi等于冷冻干燥之前lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi。[0314]86.用于制备即用型药物组合物的方法，所述方法包括以下步骤：提供通过项1至79中任一项所述的方法制备的冷冻的药物组合物，并将所述冷冻的药物组合物解冻，从而获得所述即用型药物组合物。[0315]87.用于制备即用型药物组合物的方法，所述方法包括以下步骤：提供通过项2至79中任一项所述的方法制备的冷冻干燥的药物组合物，并将所述冷冻的药物组合物重构，从而获得所述即用型药物组合物。[0316]88.即用型药物组合物，其可通过项86或87所述的方法制备。[0317]89.药物组合物，其包含lnp，其中所述lnp包含阳离子可电离脂质和mrna，并且其中以下中一者或更多者适用：[0318](i)基于所述药物组合物中脂质和mrna的总量，所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于10重量％；[0319](ii)所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka；[0320](iii)所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子；[0321](iv)所述药物组合物基本上不含无机磷酸阴离子，[0322]其中所述药物组合物是冷冻形式或冷冻干燥形式。[0323]90.项89所述的药物组合物，其中基于所述药物组合物中脂质和mrna的总重量，所述药物组合物包含的nacl和kcl的总量小于5重量％，优选小于1重量％。[0324]91.项89或90所述的药物组合物，其中所述制剂在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka。[0325]92.项89或90所述的药物组合物，其中所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子。[0326]93.项89或90所述的药物组合物，其中所述药物组合物基本上不含无机磷酸阴离子。[0327]94.项89或90所述的药物组合物，其中：[0328](1)所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子；[0329](2)所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含无机磷酸阴离子；[0330](3)所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子；或者[0331](4)所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子。[0332]95.项89至94中任一项所述的药物组合物，其中：[0333](1)所述药物组合物包含缓冲剂体系和/或冷冻保护剂；[0334](2)所述药物组合物包含缓冲剂体系，并且所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka；[0335](3)所述药物组合物包含冷冻保护剂，并且所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka；[0336](4)所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物包含缓冲剂体系和冷冻保护剂；[0337](5)所述药物组合物包含缓冲剂体系，并且基本上不含柠檬酸阴离子；[0338](6)所述药物组合物包含冷冻保护剂，并且基本上不含柠檬酸阴离子；[0339](7)所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子，并且包含缓冲剂体系和冷冻保护剂；[0340](8)所述药物组合物包含缓冲剂体系，并且基本上不含无机磷酸阴离子；[0341](9)所述药物组合物包含冷冻保护剂，并且基本上不含无机磷酸阴离子；[0342](10)所述药物组合物基本上不含无机磷酸阴离子，并且包含缓冲剂体系和冷冻保护剂；[0343](11)所述药物组合物包含缓冲剂体系，并且基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子；[0344](12)所述药物组合物包含冷冻保护剂，并且基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子；[0345](13)所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子且基本上不含无机磷酸阴离子，并且包含缓冲剂体系和冷冻保护剂；[0346](14)所述药物组合物包含缓冲剂体系，所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子和/或基本上不含无机磷酸阴离子；[0347](15)所述药物组合物包含冷冻保护剂，所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子和/或基本上不含无机磷酸阴离子；或者[0348](16)所述药物组合物包含缓冲剂体系和冷冻保护剂，所述药物组合物在以水性液体形式时其ph低于所述阳离子可电离脂质的pka，并且所述药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子和/或基本上不含无机磷酸阴离子。[0349]96.项89至95中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物在以水性液体形式时其ph为至多6.5，优选至多6.0。[0350]97.项95或96所述的药物组合物，其中所述缓冲剂体系包含水和缓冲物质。[0351]98.项95至97中任一项所述的药物组合物，其中所述缓冲剂体系包含hepes、组氨酸、tris和乙酸中的任一者作为缓冲物质。[0352]99.项95至98中任一项所述的药物组合物，其中所述缓冲剂体系包含hepes、组氨酸和tris中的任一者作为缓冲物质。[0353]100.项95至99中任一项所述的药物组合物，其中所述缓冲剂体系包含hepes作为缓冲物质。[0354]101.项95至100中任一项所述的药物组合物，其中所述缓冲剂在所述药物组合物中的量为，药物组合物中每1克脂质和mrna总重量中至多4mmol，优选至多3.6mmol，更优选至多1.8mmol。[0355]102.项95至101中任一项所述的药物组合物，其中所述冷冻保护剂包含一种或更多种碳水化合物。[0356]103.项95至102中任一项所述的药物组合物，其中所述冷冻保护剂包含蔗糖、海藻糖、葡萄糖、或其组合。[0357]104.项95至103中任一项所述的药物组合物，其中所述冷冻保护剂包含蔗糖和/或海藻糖。[0358]105.项95至104中任一项所述的药物组合物，其中(i)在所述药物组合物为冷冻形式的情况下，基于不包含所述药物组合物中任何溶剂的所述药物组合物的总量，所述冷冻保护剂在所述药物组合物中的量为至少80重量％，或者(ii)在所述药物组合物为冷冻干燥形式的情况下，基于所述药物组合物的总量，所述冷冻保护剂在所述药物组合物中的量为至少80重量％。[0359]106.项95至105中任一项所述的药物组合物，其中所述缓冲剂体系包含hepes作为缓冲物质，并且所述冷冻保护剂包含蔗糖和/或海藻糖。[0360]107.项89至106中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含泊洛沙姆。[0361]108.项100或106所述的药物组合物，其中所述制剂不包含泊洛沙姆。[0362]109.项89至108中任一项所述的药物组合物，其中所述阳离子可电离脂质包含含有至少一个能够在生理条件下被质子化的氮原子的头基。[0363]110.项89至109中任一项所述的药物组合物，其中所述阳离子可电离脂质具有式(i)结构：[0364][0365]或其可药用盐、互变异构体、前药或立体异构体，[0366]其中：[0367]l1或l2中一者是-o(c＝o)-、-(c＝o)o-、-c(＝o)-、-o-、-s(o)x-、-s-s-、-c(＝o)s-、sc(＝o)-、-nrac(＝o)-、-c(＝o)nra-、nrac(＝o)nra-、-oc(＝o)nra-或-nrac(＝o)o-，并且l1或l2中另一者是–o(c＝o)-、-(c＝o)o-、-c(＝o)-、-o-、-s(o)x-、-s-s-、-c(＝o)s-、sc(＝o)-、-nrac(＝o)-、-c(＝o)nra-、nrac(＝o)nra-、-oc(＝o)nra-或-nrac(＝o)o-或者直接键；[0368]g1和g2各自独立地是未经取代的c1-c12亚烷基或c2-c12亚烯基；[0369]g3是c1-c24亚烷基、c2-c24亚烯基、c3-c8亚环烷基、c3-c8亚环烯基；[0370]ra是h或c1-c12烷基；[0371]r1和r2各自独立地是c6-c24烷基或c6-c24烯基；[0372]r3是h、or5、cn、-c(＝o)or4、-oc(＝o)r4或–nr5c(＝o)r4；[0373]r4是c1-c12烷基；[0374]r5是h或c1-c6烷基；并且[0375]x是0、1或2。[0376]111.项89至110中任一项所述的药物组合物，其中所述阳离子可电离脂质选自本文示出的结构i-1至i-36。[0377]112.项89至109中任一项所述的药物组合物，其中所述阳离子可电离脂质选自本文示出的结构a至f。[0378]113.项89至109中任一项所述的药物组合物，其中所述阳离子可电离脂质选自n,n-二甲基-2,3-二油烯基氧基丙胺(dodma)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(dodap)、三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(dlin-mc3-dma)和4-((二((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)氨基)氧基)-n,n-二甲基-4-氧代丁烷-1-胺(dpl-14)。[0379]114.项89至113中任一项所述的药物组合物，其中所述lnp还包含一种或更多种另外的脂质，优选地选自聚合物缀合的脂质、中性脂质、类固醇、及其组合。[0380]115.项89至114中任一项所述的药物组合物，其中所述lnp包含所述阳离子可电离脂质、聚合物缀合的脂质、中性脂质和类固醇。[0381]116.项114或115所述的药物组合物，其中所述聚合物缀合的脂质包含聚乙二醇化脂质。[0382]117.项116所述的药物组合物，其中所述聚乙二醇化脂质具有以下结构：[0383][0384]或其可药用盐、互变异构体或立体异构体，[0385]其中：[0386]r12和r13各自独立地是直链或支链、饱和或不饱和的包含10至30个碳原子的烷基链，其中所述烷基链任选地间插有一个或更多个酯键；并且w具有范围为30至60的平均值。[0387]118.项114或115所述的药物组合物，其中所述聚合物缀合的脂质包含聚肌氨酸-脂质缀合物或者聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物。[0388]119.项118所述的药物组合物，其中所述聚肌氨酸-脂质缀合物或者聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物是选自以下的成员：聚肌氨酸-二酰基甘油缀合物、聚肌氨酸-二烷氧基丙基缀合物、聚肌氨酸-磷脂缀合物、聚肌氨酸-神经酰胺缀合物、及其混合物。[0389]120.项114至119中任一项所述的药物组合物，其中所述中性脂质是磷脂，优选地选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸或鞘磷脂。[0390]121.项120所述的药物组合物，其中所述磷脂选自二硬脂酰基磷脂酰胆碱(dspc)、二油酰基磷脂酰胆碱(dopc)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(dmpc)、双十五烷酰基磷脂酰胆碱、二月桂酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(dppc)、二花生酰基磷脂酰胆碱(dapc)、二山萮炔酰基磷脂酰胆碱(dbpc)、双二十三烷酰基磷脂酰胆碱(dtpc)、双二十四酰基磷脂酰胆碱(dlpc)、棕榈酰基油酰基-磷脂酰胆碱(popc)、1,2-二-o-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0二醚pc)、1-油酰基-2-胆甾醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(ochemspc)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(c16lysopc)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(dspe)、二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺(dppe)、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(dmpe)、二月桂酰基-磷脂酰乙醇胺(dlpe)和二植烷酰基-磷脂酰乙醇胺(dpype)。[0391]122.项114至121中任一项所述的药物组合物，其中所述类固醇包含固醇，例如胆固醇。[0392]123.项89至122中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含螯合剂。[0393]124.项123所述的药物组合物，其中所述药物组合物中所述螯合剂的量为，药物组合物中每1克脂质和mrna总重量中至多0.8mmol，优选至多0.4mmol，更优选至多0.2mmol。[0394]125.项123或124所述的药物组合物，其中所述螯合剂是edta。[0395]126.项89至122中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物不包含螯合剂。[0396]127.项89至126中任一项所述的药物组合物，其中所述阳离子可电离脂质与mrna之比为2:1至12:1。[0397]128.项89至127中任一项所述的药物组合物，其中所述mrna包封在所述lnp之内或者与所述lnp缔合。[0398]129.项89至128中任一项所述的药物组合物，其中所述mrna包含替代尿苷的经修饰核苷。[0399]130.项129所述的药物组合物，其中所述经修饰核苷选自假尿苷(ψ)、n1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5u)。[0400]131.项89至130中任一项所述的药物组合物，其中所述mrna包含5’帽。[0401]132.项89至131中任一项所述的药物组合物，其中所述mrna包含5’utr。[0402]133.项89至132中任一项所述的药物组合物，其中所述mrna包含3’utr。[0403]134.项89至133中任一项所述的药物组合物，其中所述mrna包含poly-a序列。[0404]135.项134所述的药物组合物，其中所述poly-a序列包含至少100个核苷酸。[0405]136.项89至135中任一项所述的药物组合物，其中所述mrna编码一种或更多种多肽。[0406]137.项136所述的药物组合物，其中所述一种或更多种多肽包含用于在对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位。[0407]138.项136或137所述的药物组合物，其中所述mrna编码包含sars-cov-2s蛋白、其免疫原性变体或者所述sars-cov-2s蛋白或所述其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列。[0408]139.项89至138中任一项所述的药物组合物，其中所述冷冻的药物组合物冷冻并可储存于约-30℃至约-10℃，例如约-25℃至约-15℃的温度下，或者冷冻并可储存于约-20℃的温度下，或者所述冷冻干燥的药物组合物可储存于约-25℃至约室温，例如约-15℃至约8℃、约-10℃至约2℃或约-5℃至约0℃的温度下。[0409]140.项89至139中任一项所述的药物组合物，其中在将所述冷冻的药物组合物解冻之后或在将所述冷冻干燥的药物组合物重构之后所述lnp的尺寸(z平均值)为约50nm至约500nm。[0410]141.项89至140中任一项所述的药物组合物，其中(i)在将所述冷冻的药物组合物解冻之后所述lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi等于冷冻之前所述lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi，或者(ii)在将所述冷冻干燥的药物组合物重构之后所述lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi等于冷冻干燥之前所述lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi。[0411]142.项80至85和88至141中任一项所述的药物组合物，其用于治疗。[0412]143.项80至85和88至141中任一项所述的药物组合物，其用于诱导免疫应答。[0413]本文中公开了本公开内容的另一些方面。[0414]附图简述[0415]图1示出了来自以下的结果：(a)将包含lnp的六种lnp组合物冷冻在-20℃下，以及(b)将其储存不同的冻/融循环，其中组合物的不同之处在于制备lnp时所用的缓冲剂体系。[0416]图2示出了来自以下的结果：(a)将三种脂质复合物(lipoplex)组合物冷冻在-20℃下，以及(b)储存不同的冻/融循环，其中所述组合物的不同之处在于制备该组合物时所用的缓冲剂体系。[0417]图3示出了来自以下的结果：(a)将三种脂质复合物组合物冷冻在-20℃下，以及(b)储存不同的冻/融循环，其中组合物包含泊洛沙姆，但不同之处在于制备该组合物时所用的缓冲剂体系。[0418]图4示出了来自以下的结果：(a)将包含lnp的四种lnp组合物冷冻在-20℃下，以及(b)储存不同的冻/融循环，其中四种组合物的不同之处在于制备组合物时所用的阳离子可电离脂质(dodma、mc3-dma或dpl-14)。[0419]图5示出了来自以下的结果：(a)将包含lnp的三种lnp组合物冷冻在-20℃下，以及(b)储存不同的冻/融循环，其中所述组合物的不同之处在于其n/p比。[0420]图6示出了来自以下的结果：(a)将包含lnp的两种lnp组合物冷冻在-20℃下，以及(b)储存不同的冻/融循环，其中所述组合物的不同之处在于制备该组合物时所用的酸。[0421]图7示出了来自以下的结果：将包含lnp的三种lnp组合物储存在-20℃下，其中所述组合物的不同之处在于制备该组合物时所用的ph。[0422]图8示出了来自以下的结果：将包含lnp的四种lnp组合物储存在-20℃下，其中所述组合物的不同之处在于组合物中存在的edta的量。[0423]图9示出了适用于以脱水状态稳定lnp的冷冻干燥循环。[0424]图10示出了在(a)4℃、(b)25℃或(c)40℃的温度下，冷冻干燥的lnp的长期稳定性作为颗粒尺寸的函数。[0425]图11示出了冷冻干燥对以下的影响：lnp的特性作为所用缓冲剂体系的函数。[0426]图12示出了在-20℃下冷冻对分散在包含不同量蔗糖的水性介质中的脂质复合物的特性的影响。[0427]图13示出了批次1中在4、25和40℃下c12脂质纳米粒的颗粒尺寸随储存持续时间的变化。0个月时的时间点是指冷冻干燥过程之前的尺寸。[0428]图14示出了批次1中在4、25和40℃下c12脂质纳米粒的rna完整性随储存持续时间laboratorypress,coldspringharbor1989)。[0440]在整个本说明书和随附的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含/包括”以及变化形式将被理解为暗含包括所述的成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，但不排除任何其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组。术语“基本上由......组成”意指排除任何实质意义的其他成员、整数或步骤。术语“包含/包括”涵盖术语“基本上由......组成”，“基本上由......组成”反过来又涵盖术语“由......组成”。因此，在本技术中每次出现时，术语“包含/包括”可用术语“基本上由......组成”或“由......组成”代替。同样，在本技术中每次出现时，术语“基本上由......组成”可用术语“由......组成”代替。[0441]除非在本文中另外指明或与上下文明显矛盾，否则在描述本公开内容的上下文中(尤其是在权利要求的上下文中)使用的没有数量词修饰的名词及类似的引用解释为覆盖复数和单数二者。本文中对数值范围的记载仅旨在用作单独的提及落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非本文另外说明，否则每个单独值被并入说明书中，如同在本文中单独地记载一样。除非本文中另外指明或者与上下文明显矛盾，否则本文中描述的所有方法均可以以任何合适的顺序进行。本文中提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅旨在更好地说明本公开内容，并且不对另外要求保护的本公开内容的范围构成限制。本说明书中的语言均不应被解释为指明对实践本公开内容必需的任何未要求保护的要素。[0442]本文中使用的“和/或”被认为是两个指定特征或组分具有或不具有二者中另一者中的每一种的特定公开内容。例如“x和/或y”被认为是(i)x、(ii)y以及(iii)x和y中每一种的特定公开内容，就如同各自单独地在本文中列出一样。[0443]在本公开内容的上下文中，术语“约”表示本领域普通技术人员将理解的精度区间以仍然确保所讨论特征的技术效果。该术语通常表示与指定数值偏差±5％、±4％、±3％、±2％、±1％、±0.9％、±0.8％、±0.7％、±0.6％、±0.5％、±0.4％、±0.3％、±0.2％、±0.1％、±0.05％，例如±0.01％。如普通技术人员将理解的，对于给定技术效果的数值的特定的这样的偏差将取决于技术效果的性质。例如，天然的或生物的技术效果的这样的偏差通常可比人造的或改造的技术效果的偏差更大。[0444]本文中对数值范围的记载仅旨在用作单独的提及落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非本文另外说明，否则每个单独值被并入说明书中，如同在本文中单独地记载一样。[0445]在本说明书的全文中引用了若干文献。无论是上文还是下文，本文引用的每篇文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指南等)都在此通过引用整体并入。本文中的任何内容均不应被解释为承认本发明无权由于在先发明而先于这样的公开内容。[0446]定义[0447]下面将提供适用于本公开内容所有方面的定义。除非另外指出，否则以下术语具有以下含义。任何未经定义的术语均具有其本领域公认的含义。[0448]本文中使用的术语例如“降低”或“抑制”意指引起水平总体降低例如约5％或更多、约10％或更多、约15％或更多、约20％或更多、约25％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多或者约75％或更多的能力。术语“抑制”或类似短语包括完全或基本上完全抑制，即降低至零或基本上至零。[0449]在一个实施方案中，术语例如“提高”或“增强”涉及提高或增强至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约80％、或至少约100％。[0450]本文中使用的“生理ph”是指约7.5的ph。[0451]本公开内容中使用的“％w/v”是指按体积计的重量百分比，其是测量溶质的量(以克(g)计)的浓度单位，表示为溶液总体积(以毫升(ml)计)的百分比。[0452]本公开内容中使用的“重量％”是指重量百分比，其是测量物质量(以克(g)计)的浓度单位，表示为总组合物总重量(以克(g)计)的百分比。[0453]关于二价离子，特别是二价阳离子的存在，在一个实施方案中，其浓度或有效浓度(游离离子的存在)由于螯合剂的存在而足够低以防止rna的降解。在一个实施方案中，二价离子的浓度或有效浓度低于用于水解rna核苷酸之间磷酸二酯键的催化水平。在一个实施方案中，游离二价离子的浓度为20μm或更小。在一个实施方案中，不存在或基本上不存在游离二价离子。[0454]“渗量浓度(osmolality)”是指特定溶质的浓度，表示为每千克溶剂的溶质的渗透压摩尔数。[0455]术语“冷冻”涉及液体的固化，通常伴随着热量的去除。[0456]术语“冻干”及其变化形式是指通过将物质冷冻并随后降低周围压力(例如，低于15pa，例如低于10pa、低于5pa或1pa或更低)以使物质中的冷冻介质直接从固相升华至气相而进行的物质的冷冻干燥。因此，术语“冻干(lyophilizing)”和“冷冻干燥(freeze-drying)”在本文中可互换使用。[0457]术语“重构”涉及向干燥产品添加溶剂(例如水)以使其返回液体状态，例如其原始液体状态。[0458]在本公开内容的上下文中的术语“重组”意指“通过遗传改造制备的”。在一个实施方案中，在本公开内容的上下文中的“重组物质”不是天然存在的。[0459]本文中使用的术语“天然存在的”是指物体可在自然界中发现的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中并且可从天然来源分离且没有在实验室中被人有意修饰的肽或核酸是天然存在的。术语“在自然界中存在”意指“存在于自然界中”并且包括已知的物体以及尚未从自然界发现和/或分离但可在将来从天然来源发现和/或分离的物体。[0460]本文中使用的术语“室温”和“环境温度”在本文中可互换使用，并且是指至少约15℃，优选约15℃至约35℃、约15℃至约30℃、约15℃至约25℃、或约17℃至约22℃的温度。这样的温度将包括15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃和22℃。[0461]术语edta是指乙二胺四乙酸二钠盐。所有浓度都是针对edta二钠盐给出的。[0462]术语“烷基”是指饱和直链或支链烃的单价基团(monoradical)。优选地，烷基包含1至12个(例如1至10个)碳原子，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个碳原子，缩写为c1-12烷基，(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子，缩写为c1-10烷基)，更优选1至8个碳原子，例如1至6或1至4个碳原子。示例性烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基(也称为2-丙基或1-甲基乙基)、丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、1,2-二甲基-丙基、异戊基、正己基、异己基、仲己基、正庚基、异庚基、正辛基、2-乙基-己基、正壬基、正癸基、正十一烷基、正十二烷基等。“经取代烷基”意指亚烷基的一个或更多个(例如1至与烷基结合的氢原子的最大数目，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或多达10个，例如1至5、1至4、或1至3、或者1或2个)氢原子被除氢之外的取代基替代(当替代多于一个氢原子时，取代基可以是相同或不同的)。优选地，除氢以外的取代基是第一级取代基，如本文中所述。经取代烷基的一些实例包括氯甲基、二氯甲基、氟甲基和二氟甲基。[0463]术语“亚烷基”是指饱和直链或支链烃的双基团(diradical)。优选地，亚烷基包含1至12个(例如1至10个)碳原子，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个碳原子(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子)，更优选1至8个碳原子，例如1至6或1至4个碳原子。一些示例性亚烷基包括亚甲基、亚乙基(即，1,1-亚乙基、1,2-亚乙基)、亚丙基(即，1,1-亚丙基、1,2-亚丙基(-ch(ch3)ch2-)、2,2-亚丙基(-c(ch3)2-)和1,3-亚丙基)、亚丁基异构体(例如，1,1-亚丁基、1,2-亚丁基、2,2-亚丁基、1,3-亚丁基、2,3-亚丁基(顺式或反式或其混合物)、1,4-亚丁基、1,1-异亚丁基、1,2-异亚丁基和1,3-异亚丁基)、亚戊基异构体(例如，1,1-亚戊基、1,2-亚戊基、1,3-亚戊基、1,4-亚戊基、1,5-亚戊基、1,1-异亚戊基、1,1-仲戊基、1,1-新戊基)、亚己基异构体(例如，1,1-亚己基、1,2-亚己基、1,3-亚己基、1,4-亚己基、1,5-亚己基、1,6-亚己基和1,1-异亚己基)、亚庚基异构体(例如，1,1-亚庚基、1,2-亚庚基、1,3-亚庚基、1,4-亚庚基、1,5-亚庚基、1,6-亚庚基、1,7-亚庚基和1,1-异亚庚基)、亚辛基异构体(例如，1,1-亚辛基、1,2-亚辛基、1,3-亚辛基、1,4-亚辛基、1,5-亚辛基、1,6-亚辛基、1,7-亚辛基、1,8-亚辛基和1,1-异亚辛基)等。每端具有至少3个碳原子和自由价的直链亚烷基部分也可称为亚甲基的倍数(例如，1,4-亚丁基也可称为四亚甲基)。通常，作为使用上述亚烷基部分的结尾“ylene(亚基)”的替代，还可使用结尾“diyl(二基)”(例如，1,2-亚丁基也可以称为丁烷-1,2-二基)。“经取代亚烷基”意指亚烷基的一个或更多个(例如1至与亚烷基结合的氢原子的最大数目，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或多达10个，例如1至5、1至4、1至3、或1或2个)氢原子被除氢之外的取代基替代(当多于一个氢原子被替代时，则取代基可相同或不同)。优选地，除氢以外的取代基是第一级取代基，如本文中所述。[0464]术语“烯基”是指具有至少一个碳-碳双键的不饱和直链或支链烃的单价基团。一般而言，烯基中碳-碳双键的最大数目可等于通过将烯基中碳原子的数目除以2而计算得到的整数，并且如果烯基中碳原子的数目是奇数，则将除法结果舍入到下一整数。例如，对于具有9个碳原子的烯基，碳-碳双键的最大数目为4。优选地，烯基具有1至6个(例如1至4个)，即1、2、3、4、5或6个碳-碳双键。优选地，烯基包含2至12个(例如2至10个)碳原子，即2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个碳原子(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子)，更优选2至8个碳原子，例如2至6个碳原子或2至4个碳原子。因此，在一个优选实施方案中，烯基包含2至12个碳原子(缩写为c2-12烯基)，(例如2至10个)碳原子，和1、2、3、4、5或6个(例如，1、2、3、4或5个)碳-碳双键，更优选地，其包含2至8个碳原子和1、2、3或4个碳-碳双键，例如2至6个碳原子和1、2或3个碳-碳双键或者2至4个碳原子和1或2个碳-碳双键。碳-碳双键可呈顺式(z)或反式(e)构型。一些示例性烯基包括乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基(即，烯丙基)、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基、1-庚烯基、2-庚烯基、3-庚烯基、4-庚烯基、5-庚烯基、6-庚烯基、1-辛烯基、2-辛烯基、3-辛烯基、4-辛烯基、5-辛烯基、6-辛烯基、7-辛烯基、1-壬烯基、2-壬烯基、3-壬烯基、4-壬烯基、5-壬烯基、6-壬烯基、7-壬烯基、8-壬烯基、1-癸烯基、2-癸烯基、3-癸烯基、4-癸烯基、5-癸烯基、6-癸烯基、7-癸烯基、8-癸烯基、9-癸烯基、1-十一碳烯基、2-十一碳烯基、3-十一碳烯基、4-十一碳烯基、5-十一碳烯基、6-十一碳烯基、7-十一碳烯基、8-十一碳烯基、9-十一碳烯基、10-十一碳烯基、1-十二碳烯基、2-十二碳烯基、3-十二碳烯基、4-十二碳烯基、5-十二碳烯基、6-十二碳烯基、7-十二碳烯基、8-十二碳烯基、9-十二碳烯基、10-十二碳烯基、11-十二碳烯基等。如果烯基与氮原子连接，则双键不可在氮原子的α位。“经取代烯基”意指烯基的一个或更多个(例如1至与烯基结合的氢原子的最大数目，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或多达10个，例如1至5、1至4、或1至3、或1或2个)氢原子被除氢之外的取代基替代(当多于一个氢原子被替代时，则取代基可以是相同或不同的)。优选地，除氢以外的取代基是第一级取代基，如本文中所述。[0465]术语“亚烯基”是指具有至少一个碳-碳双键的不饱和直链或支链烃的双基团。一般而言，亚烯基中碳-碳双键的最大数目可等于通过将亚烯基中碳原子的数目除以2而计算得到的整数，并且如果亚烯基中碳原子的数目是奇数，则将除法结果舍入到下一整数。例如，对于具有9个碳原子的亚烯基，碳-碳双键的最大数目为4。优选地，亚烯基具有1至6个(例如1至4个)，即1、2、3、4、5或6个碳-碳双键。优选地，亚烯基包含2至12个(例如2至10个)碳原子，即2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个碳原子(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子)，更优选2至8个碳原子，例如2至6个碳原子或2至4个碳原子。因此，在一个优选实施方案中，亚烯基包含2至12个(例如2至10个)碳原子和1、2、3、4、5或6个(例如，1、2、3、4或5个)碳-碳双键，更优选地，其包含2至8个碳原子和1、2、3或4个碳-碳双键，例如2至6个碳原子和1、2或3个碳-碳双键或者2至4个碳原子和1或2个碳-碳双键。碳-碳双键可呈顺式(z)或反式(e)构型。一些示例性亚烯基包括乙烯-1,2-二基、乙烯叉(vinylidene)(也称为亚乙烯基(ethenylidene))、1-丙烯-1,2-二基，1-丙烯-1,3-二基，1-丙烯-2,3-二基、烯丙基、1-丁烯-1,2-二基、1-丁烯-1,3-二基、1-丁烯-1,4-二基、1-丁烯-2,3-二基、1-丁烯-2,4-二基、1-丁烯-3,4-二基、2-丁烯-1,2-二基、2-丁烯-1,3-二基、2-丁烯-1,4-二基、2-丁烯-2,3-二基、2-丁烯-2,4-二基、2-丁烯-3,4-二基等。如果亚烯基与氮原子连接，则双键不可在氮原子的α位。“经取代亚烯基”意指亚烯基的一个或更多个(例如1至与亚烯基结合的氢原子的最大数目，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或多达10个，例如1至5、1至4、或1至3、或1或2个)氢原子被除氢之外的取代基替代(当多于一个氢原子被替代时，取代基可以是相同或不同的)。优选地，除氢以外的取代基是第一级取代基，如本文中所述。[0466]术语“亚环烷基”表示“亚烷基”的环状非芳族形式，并且是成对的、邻位的或分离的双基团。在某些实施方案中，亚环烷基(i)是单环或多环(例如双环或三环)和/或(ii)是3至14元(即，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14元，例如3至12元或3至10元)。在一个实施方案中，亚环烷基是单、双或三环3至14元(即，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14元，例如3至12元或3至10元)亚环烷基。通常，作为使用上述亚环烷基部分的结尾“亚基”的替代，还可使用结尾“二基”(例如，1,2-环亚丙基也可称为环丙烷-1,2-二基)。一些示例性的亚环烷基包括亚环己基、亚环庚基、亚环丙基、亚环丁基、亚环戊基、亚环辛基、双亚环[3.2.1]辛基、双亚环[3.2.2]壬基和亚金刚烷基(例如，三环[3.3.1.13,7]癸烷-2,2-二基)。“经取代亚环烷基”意指亚烷基的一个或更多个(例如1至与亚环烷基结合的氢原子的最大数目，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或多达10个，例如1至5、1至4、或1至3、或1或2个)氢原子被除氢之外的取代基替代(当多于一个氢原子被替代时，取代基可以是相同或不同的)。优选地，除氢以外的取代基是第一级取代基，如本文中所述。[0467]术语“亚环烯基”表示“亚烯基”的环状非芳族形式，并且是成对的、邻位的或分离的双基团。一般而言，亚环烯基中碳-碳双键的最大数目可等于通过将亚环烯基中碳原子的数目除以2而计算得到的整数，并且如果亚环烯基中碳原子的数目是奇数，则将除法结果舍入到下一整数。例如，对于具有9个碳原子的亚环烯基，碳-碳双键的最大数目为4。优选地，亚环烯基具有1至6个(例如1至4个)，即1、2、3、4、5或6个碳-碳双键。在某些实施方案中，亚环烯基(i)是单环或多环(例如双环或三环)和/或(ii)是3至14元(即，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14元，例如3至12元或3至10元)。在一个实施方案中，亚环烯基是单、双或三环3至14元(即，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14元，例如3至12元或3至10元)亚环烯基。一些示例性的亚环烯基包括亚环己烯、亚环庚烯、亚环丙烯、亚环丁烯、亚环戊烯和亚环辛烯。“经取代亚环烯基”意指亚环烯基的一个或更多个(例如1至与亚环烯基结合的氢原子的最大数目，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或多达10个，例如1至5、1至4、或1至3、或1或2个)氢原子被除氢之外的取代基替代(当多于一个氢原子被替代时，取代基可以是相同或不同的)。优选地，除氢以外的取代基是第一级取代基，如本文中所述。[0468]在烃的上下文中使用的术语“芳族”意指整个分子必须是芳族的。例如，如果单环芳基被氢化(部分或完全)，则出于本公开内容的目的，将所得氢化环状结构分类为环烷基。同样地，如果双环或多环芳基(例如萘基)被氢化，则出于本公开内容的目的，将所得氢化双环或多环结构(例如1,2-二氢萘基)分类为环烷基(即使一个环(例如在1,2-二氢萘基中)仍为芳香族的)。[0469]典型的第一级取代基优选选自c1-3烷基、苯基、卤素、-cf3、-oh、-och3、-sch3、-nh2-z(ch3)z、-c(＝o)oh和-c(＝o)och3，其中z是0、1或2，并且c1-3烷基是甲基、乙基、丙基或异丙基。特别优选的第一级取代基选自甲基、乙基、丙基、异丙基、卤素(例如f、cl或br)和-cf3，例如卤素(例如f、cl或br)和-cf3。[0470]在冷冻的药物组合物的情况中本文中使用的表述“在将冷冻的药物组合物解冻之后”意指在可进行测量特征(例如药物组合物中包含的lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi)之前，必须解冻冷冻的药物组合物。[0471]在冷冻干燥的药物组合物的情况中本文中使用的表述“在将冷冻干燥的药物组合物重构之后”意指在可进行测量特征(例如药物组合物中包含的lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi)之前，必须重构冷冻干燥的药物组合物(例如，通过添加去离子水例如注射用水)。[0472]在冷冻或冷冻干燥的药物组合物的情况中本文中使用的表述“在药物组合物以水性液体形式时其ph”意指在可测量药物组合物的ph之前，必须解冻冷冻的药物组合物并任选地用水(或水性介质)稀释，或者必须重构冷冻干燥的药物组合物(例如，通过添加去离子水例如注射用水)。[0473]术语“冷冻保护剂”涉及添加至制剂以在冷冻阶段期间保护活性成分的物质。[0474]根据本公开内容，术语“肽”包括寡肽和多肽，并且是指包含通过肽键彼此连接的约两个或更多个、约3个或更多个、约4个或更多个、约6个或更多个、约8个或更多个、约10个或更多个、约13个或更多个、约16个或更多个、约20个或更多个，并且最高约50个、约100个、或约150个连续氨基酸的物质。术语“蛋白质”是指大肽，特别是具有至少约151个氨基酸的肽，但是术语“肽”和“蛋白质”在本文中通常作为同义词使用。[0475]“治疗性蛋白质”当以治疗有效量向对象提供时，对该对象的病症或疾病状态具有积极或有利作用。在一个实施方案中，治疗性蛋白质具有治愈性或姑息治疗性特性并且可被施用以改善、缓解、减轻、逆转疾病或病症、延迟疾病或病症发作，或者减轻疾病或病症的一种或更多种症状的严重程度。治疗性蛋白质可具有预防特性，并且可用于延迟疾病发作或减轻这样的疾病或病理状况的严重程度。术语“治疗性蛋白质”包括完整的蛋白质或肽，并且也可指其治疗活性片段。其还可包括蛋白质的治疗活性变体。治疗活性蛋白质的一些实例包括但不限于用于疫苗接种的抗原以及免疫刺激剂(例如细胞因子)。[0476]根据本公开内容，优选的是编码肽或蛋白质的核酸(例如mrna)一旦被细胞摄取或者引入(即转染或转导)到细胞中，则导致所述肽或蛋白质的表达，所述细胞可存在于体外或对象中。细胞可在胞内(例如在胞质中和/或在细胞核中)表达编码的肽或蛋白质，可分泌编码的肽或蛋白质，或者可在表面上表达编码的肽或蛋白质。[0477]根据本公开内容，术语例如“表达……的核酸”和“编码……的核酸”或类似术语在本文中可互换使用，并且对于特定的肽或多肽，意指所述核酸，如果存在于合适的环境中，优选在细胞内，可被表达以产生所述肽或多肽。[0478]术语“部分(portion)”是指小部分(fraction)。对于例如氨基酸序列或蛋白质的特定结构，术语其“部分”可指所述结构的连续或不连续小部分。[0479]术语“一部分(part)”和“片段”在本文中可互换使用，并且是指连续元件。例如，结构(例如氨基酸序列或蛋白质)的一部分是指所述结构的连续元件。当在组合物的上下文中使用时，术语“部分”意指组合物的一部分。例如，组合物的一部分可以是所述组合物的0.1％至99.9％(例如0.1％、0.5％、1％、5％、10％、50％、90％或99％)的任何部分。[0480]关于氨基酸序列(肽或蛋白质)，“片段”是指氨基酸序列的一部分，即代表在n端和/或c端缩短的氨基酸序列的序列。在c端缩短的片段(n端片段)可例如通过翻译缺少开放阅读框的3’端的截短的开放阅读框来获得。在n端缩短的片段(c端片段)可例如通过翻译缺少开放阅读框的5’端的截短的开放阅读框来获得，只要截短的开放阅读框包含用于开始翻译的起始密码子即可。氨基酸序列的片段包含来自氨基酸序列的例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的氨基酸残基。氨基酸序列的片段优选地包含来自氨基酸序列的至少6个、特别地至少8个、至少12个、至少15个、至少20个、至少30个、至少50个或至少100个连续氨基酸。[0481]根据本公开内容，肽或蛋白质的一部分或片段优选地具有其所来源的肽或蛋白质的至少一种功能特性。这样的功能特性包括药理活性、与其他肽或蛋白质的相互作用、酶活性、与抗体的相互作用以及核酸的选择性结合。例如，肽或蛋白质的药理活性片段具有片段所来源的肽或蛋白质的至少一种药理活性。肽或蛋白质的一部分或片段优选地包含肽或蛋白质的至少6个，特别是至少8个、至少10个、至少12个、至少15个、至少20个、至少30个或至少50个连续氨基酸的序列。肽或蛋白质的一部分或片段优选地包含肽或蛋白质的最高8个，特别是最高10个、最高12个、最高15个、最高20个、最高30个或最高55个连续氨基酸的序列。[0482]本文中的“变体”意指由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本氨基酸序列的氨基酸序列。亲本氨基酸序列可以是天然存在的或野生型(wildtype，wt)氨基酸序列，或者可以是野生型氨基酸序列的经修饰形式。优选地，变体氨基酸序列与亲本氨基酸序列相比具有至少一个氨基酸修饰，例如与亲本相比具有1至约20个氨基酸修饰，并且优选1至约10或1至约5个氨基酸修饰。[0483]本文中的“野生型”或“wt”或“天然的”意指在自然界中存在的氨基酸序列，包括等位基因变化。野生型氨基酸序列、肽或蛋白质具有未经有意修饰的氨基酸序列。[0484]出于本公开内容的目的，氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)的“变体”包括氨基酸插入变体、氨基酸添加变体、氨基酸缺失变体和/或氨基酸替换变体。术语“变体”包括所有突变体、剪接变体、翻译后修饰的变体、构象体(conformation)、同种型、等位基因变体、物种变体和物种同源物，特别是天然存在的那些。术语“变体”特别地包括氨基酸序列的片段。[0485]氨基酸插入变体包括在特定氨基酸序列中单个或两个或更多个氨基酸的插入。在具有插入的氨基酸序列变体的情况下，一个或更多个氨基酸残基插入到氨基酸序列中的特定位点中，但是随机插入并对所得产物进行合适的筛选也是可以的。氨基酸添加变体包括一个或更多个氨基酸(例如1、2、3、5、10、20、30、50或更多个氨基酸)的氨基端和/或羧基端融合。氨基酸缺失变体的特征在于从序列中去除一个或更多个氨基酸，例如，去除1、2、3、5、10、20、30、50或更多个氨基酸。缺失可在蛋白质的任何位置中。包含蛋白质n端和/或c端末端缺失的氨基酸缺失变体也称为n端和/或c端截短变体。氨基酸替换变体的特征在于去除序列中的至少一个残基，并且在其位置插入另一个残基。优选在同源蛋白质或肽之间氨基酸序列中的非保守的位置处进行修饰和/或将氨基酸用具有类似特性的其他氨基酸替代。优选地，肽和蛋白质变体中的氨基酸变化是保守的氨基酸变化，即，类似带电荷或不带电荷氨基酸的替换。保守的氨基酸变化涉及在其侧链中相关的氨基酸家族之一的替换。天然存在的氨基酸一般分为四个家族：酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和不带电荷的极性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时一起被归类为芳族氨基酸。在一个实施方案中，保守氨基酸替换包括以下组内的替换：[0486]-甘氨酸，丙氨酸；[0487]-缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；[0488]-天冬氨酸，谷氨酸；[0489]-天冬酰胺，谷氨酰胺；[0490]-丝氨酸，苏氨酸；[0491]-赖氨酸，精氨酸；以及[0492]-苯丙氨酸，酪氨酸。[0493]优选地，给定氨基酸序列与作为所述给定氨基酸序列的变体的氨基酸序列之间的相似性，优选同一性的程度将为至少约60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％。相似性或同一性的程度优选地针对为参考氨基酸序列的全长的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的氨基酸区域给出。例如，如果参考氨基酸序列由200个氨基酸组成，则相似性或同一性的程度优选地针对至少约20个、至少约40个、至少约60个、至少约80个、至少约100个、至少约120个、至少约140个、至少约160个、至少约180个或约200个氨基酸，在一些实施方案中为连续氨基酸给出。在一些实施方案中，相似性或同一性的程度针对参考氨基酸序列的全长给出。用于确定序列相似性，优选序列同一性的比对可使用本领域已知的工具，优选地使用最佳序列比对，例如，使用align，使用标准设置，优选emboss::needle，matrix:blosum62，gapopen10.0，gapextend0.5来进行。[0494]“序列相似性”表示相同的或代表保守氨基酸替换的氨基酸的百分比。两个氨基酸序列之间的“序列同一性”表示所述序列之间相同的氨基酸的百分比。两个核酸序列之间的“序列同一性”表示所述序列之间相同的核苷酸的百分比。[0495]术语“％相同”和“％同一性”或类似术语特别地旨在是指待比较的序列之间在最佳比对中相同的核苷酸或氨基酸的百分比。所述百分比是纯统计学的，并且两个序列之间的差异可以(但不一定)是随机分布在待比较序列的整个长度上。两个序列的比较通常在关于区段或“比较窗口”进行最佳比对以鉴定相应序列的局部区域之后通过比较所述序列来进行。用于比较的最佳比对可人工进行，或者借助于smithandwaterman,1981,adsapp.math.2,482的局部同源性算法，借助于needlemanandwunsch,1970,j.mol.biol.48,443的局部同源性算法，借助于pearsonandlipman,1988,proc.natlacad.sci.usa88,2444的相似性检索算法，或借助于使用所述算法的计算机程序(gap、bestfit、fasta、blastp、blastn和tfasta，wisconsingeneticssoftwarepackage,geneticscomputergroup,575sciencedrive,madison,wis.)来进行。在一些实施方案中，使用可在美国国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation，ncbi)网站获得的blastn或blastp算法(例如，blast，ncbi·nlm·nih·gov/blast·cgi？page_type＝blastsearch&blast_spec＝blast2seq&ijnk_loc＝ahgn2seq)来确定两个序列的同一性百分比。在一些实施方案中，在ncbi网站上blastn算法使用的算法参数包括：(i)预期阈值设置为10；(ii)字长设置为28；(iii)查询范围内的最大匹配设置为0；(iv)匹配/不匹配评分设置为1、-2；(v)空位成本(gapcost)设置为线性；以及(vi)针对正在使用的低复杂性区域的筛选程序(filter)。在一些实施方案中，在ncbi网站上blastp算法使用的算法参数包括：(i)预期阈值设置为10；(ii)字长设置为3；(iii)查询范围内的最大匹配设置为0；(iv)矩阵设置为blosum62；(v)空位成本设置为存在11:延伸:1；以及(vi)条件组成评分矩阵调整。[0496]同一性百分比通过确定待比较序列所对应的相同位置的数目，将该数目除以所比较位置的数目(例如，参考序列中的位置数目)，并将该结果乘以100来获得。[0497]在一些实施方案中，相似性或同一性程度针对为参考序列全长的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的区域给出。例如，如果参考核酸序列由200个核苷酸组成，则同一性程度针对至少约100、至少约120、至少约140、至少约160、至少约180或约200个核苷酸，在一些实施方案中为连续核苷酸给出。在一些实施方案中，相似性或同一性程度针对参考序列的全长给出。[0498]根据本公开内容，同源氨基酸序列显示出氨基酸残基的至少40％，特别地至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，并且优选至少95％、至少98％或至少99％同一性。[0499]本文中所述的氨基酸序列变体可由技术人员例如通过重组dna操作来容易地制备。用于制备具有替换、添加、插入或缺失的肽或蛋白质的dna序列的操作在例如sambrooketal.(1989)中详细描述。此外，本文中所述的肽和氨基酸变体可借助于已知的肽合成技术例如如通过固相合成和类似方法来容易地制备。[0500]在一个实施方案中，氨基酸序列(肽或蛋白质)的片段或变体优选是“功能片段”或“功能变体”。术语氨基酸序列的“功能片段”或“功能变体”涉及表现出与该片段或变体所来源的氨基酸序列的功能特性相同或相似的一个或更多个功能特性(即，其是功能等同的)的任何片段或变体。关于抗原或抗原性序列，一种特定的功能是由该片段或变体所来源的氨基酸序列表现的一种或更多种免疫原性活性。本文中使用的术语“功能片段”或“功能变体”特别地是指这样的变体分子或序列，其包含与亲本分子或序列的氨基酸序列相比改变了一个或更多个氨基酸并且仍然能够实现亲本分子或序列的一种或更多种功能(例如诱导免疫应答)的氨基酸序列。在一个实施方案中，亲本分子或序列的氨基酸序列中的修饰不显著影响或改变分子或序列的特征。在不同的实施方案中，功能片段或功能变体的功能可降低，但仍然显著存在，例如，功能变体的免疫原性可以是亲本分子或序列的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。然而，在另一些实施方案中，与亲本分子或序列相比，功能片段或功能变体的免疫原性可以是增强的。[0501]“来源于”指定氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)的氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)是指第一氨基酸序列的来源。优选地，来源于特定氨基酸序列的氨基酸序列具有与该特定序列或其片段相同、基本上相同或同源的氨基酸序列。来源于特定氨基酸序列的氨基酸序列可以是该特定序列或其片段的变体。例如，本领域普通技术人员将理解，适用于本文中的抗原可被改变，使得它们的序列与它们所来源的天然存在或天然的序列不同，同时保留天然序列的期望活性。[0502]“分离的”意指从天然状态中改变或脱离天然状态。例如，天然存在于活的动物中的核酸或肽不是“分离的”，但从其天然状态的共存物质中部分或完全分离的同样的核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或者可存在于非天然环境，例如如宿主细胞中。在一个优选实施方案中，本公开内容中使用的mrna是基本上纯化的形式。在一个实施方案中，以基本上纯化形式的mrna的溶液(优选水溶液)包含小于0.2％w/v，例如小于0.15％w/v、小于0.10％w/v、小于0.05％w/v或小于0.01w/v之组合浓度的nacl和kcl。[0503]术语“遗传修饰”或简称“修饰”包括用核酸转染细胞。术语“转染”涉及将核酸，特别是rna引入到细胞中。出于本公开内容的目的，术语“转染”还包括将核酸引入到细胞中或由这样的细胞对核酸的摄取，其中细胞可存在于对象例如患者中。因此，根据本公开内容，用于转染本文中所述核酸的细胞可存在于体外或体内，例如，细胞可形成患者的器官、组织和/或生物体的一部分。根据本公开内容，转染可以是瞬时的或稳定的。对于转染的一些应用，如果仅瞬时表达所转染的遗传物质就已足够。可将rna转染到细胞中以瞬时表达其编码的蛋白质。由于在转染过程中引入的核酸通常不会整合到核基因组中，因此外源核酸将通过有丝分裂而被稀释或者降解。允许核酸进行游离扩增的细胞大大降低了稀释率。如果期望所转染的核酸实际上保留在细胞及其子细胞的基因组中，则必须发生稳定的转染。这样的稳定转染可通过使用用于转染的基于病毒的系统或基于转座子的系统来实现。一般而言，将编码抗原的核酸瞬时转染到细胞中。可将rna转染到细胞中以瞬时表达其编码的蛋白质。[0504]根据本公开内容，肽或蛋白质的类似物是其所来源的所述肽或蛋白质的经修饰形式，并且具有所述肽或蛋白质的至少一种功能特性。例如，肽或蛋白质的药理活性类似物具有类似物所来源的肽或蛋白质的至少一种药理活性。这样的修饰包括任何化学修饰，并且包括与蛋白质或肽缔合的任何分子例如碳水化合物、脂质和/或蛋白质或肽的单个或多个替换、缺失和/或添加。在一个实施方案中，蛋白质或肽的“类似物”包括由糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、棕榈酰化、肉豆蔻酰化、异戊二烯化、脂化、烷基化、衍生化、引入保护/封闭基团、蛋白水解切割或者与抗体或其他细胞配体结合得到的那些经修饰形式。术语“类似物”还延伸到所述蛋白质和肽的所有功能化学等同物。[0505]本文中使用的“活化”或“刺激”是指已被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的免疫效应细胞(例如t细胞)的状态。活化也可与信号传导途径的启动、诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能有关。术语“活化的免疫效应细胞”尤其是指正在经历细胞分裂的免疫效应细胞。[0506]术语“致敏”是指其中免疫效应细胞例如t细胞首次与其特异性抗原接触并导致分化成效应细胞例如效应t细胞的过程。[0507]术语“克隆扩增”或“扩增”是指其中特定实体倍增的过程。在本公开内容的上下文中，该术语优选地在免疫应答的情况下使用，在所述免疫应答中免疫效应细胞被抗原刺激，增殖，并且识别所述抗原的特异性免疫效应细胞扩增。优选地，克隆扩增导致免疫效应细胞的分化。[0508]根据本公开内容的“抗原”涵盖将引起免疫应答的任何物质和/或免疫应答或免疫机制(例如细胞应答)所针对的任何物质。这也包括其中抗原被加工成抗原肽并且免疫应答或免疫机制针对一种或更多种抗原肽的情况，特别是如果在mhc分子的情况下呈递的话。特别地，“抗原”涉及与抗体或t淋巴细胞(t细胞)特异性反应的任何物质，优选肽或蛋白质。根据本公开内容，术语“抗原”包括包含至少一个表位(例如t细胞表位)的任何分子。优选地，在本公开内容的上下文中的抗原是任选地在加工之后诱导免疫反应的分子，该免疫反应优选地针对该抗原(包括表达该抗原的细胞)具有特异性。在一个实施方案中，抗原是疾病相关抗原，例如肿瘤抗原、病毒抗原或细菌抗原，并且表位来源于这样的抗原。[0509]根据本公开内容，可使用作为免疫应答的候选物的任何合适的抗原，其中免疫应答可以是体液免疫应答和细胞免疫应答二者。在本公开内容的一些实施方案的情况下，抗原优选由细胞呈递，优选由抗原呈递细胞呈递(在mhc分子的情况下)，其导致针对抗原的免疫应答。抗原优选是对应于或来源于天然存在的抗原的产物。这样的天然存在的抗原可包括或可以来源于变应原、病毒、细菌、真菌、寄生物和其他感染原和病原体，或者抗原也可以是肿瘤抗原。根据本公开内容，抗原可对应于天然存在的产物，例如病毒蛋白质，或其一部分。[0510]术语“疾病相关抗原”以其最广泛的含义使用，是指与疾病相关的任何抗原。疾病相关抗原是这样的分子：其包含将刺激宿主的免疫系统以产生针对该疾病的细胞抗原特异性免疫应答和/或体液抗体应答的表位。疾病相关抗原包括病原体相关抗原，即，与由微生物感染相关的抗原，通常为微生物抗原(例如细菌或病毒抗原)，或与癌症相关的抗原，通常为肿瘤，例如肿瘤抗原。[0511]在一个优选实施方案中，抗原是肿瘤抗原，即，肿瘤细胞的一部分，特别是主要存在于胞内或作为肿瘤细胞表面抗原的抗原。在另一个实施方案中，抗原是病原体相关抗原，即，来源于病原体的抗原，例如，来源于病毒、细菌、单细胞生物或寄生物的抗原，例如病毒抗原(例如病毒核糖核蛋白或外壳蛋白)。特别地，抗原应由mhc分子呈递，其导致免疫系统的细胞，特别是cd4 和cd8 淋巴细胞的调节，特别是活化，特别是通过对t细胞受体的活性的调节。[0512]术语“肿瘤抗原”是指癌细胞的成分，其可来源于细胞质、细胞表面或细胞核。特别地，它是指在胞内产生或在肿瘤细胞上作为表面抗原产生的那些抗原。例如，肿瘤抗原包括癌胚抗原、α1-胎蛋白、异铁蛋白和胎儿磺基糖蛋白、α2-h-铁蛋白和γ-胎蛋白，以及多种病毒肿瘤抗原。根据本公开内容，肿瘤抗原优选地包含肿瘤或癌症的特征性的以及就类型和/或表达水平而言肿瘤或癌细胞特征性的任何抗原。[0513]术语“病毒抗原”是指具有抗原特性，即，能够在个体中引起免疫应答的任何病毒组分。病毒抗原可以是病毒核糖核蛋白或包膜蛋白。[0514]术语“细菌抗原”是指具有抗原特性，即，能够在个体中引起免疫应答的任何细菌成分。细菌抗原可来源于细菌的细胞壁或细胞质膜。[0515]术语“表位”是指分子(例如抗原)中的抗原决定簇，即，分子中被免疫系统识别，例如被t细胞或b细胞识别的一部分或片段，特别是当在mhc分子的情况下呈递时。蛋白质的表位优选地包含所述蛋白质的连续或不连续部分，并且长度优选约5至约100个氨基酸，优选约5至约50、更优选约8至约0、最优选约10至约25个氨基酸，例如，表位的长度可优选9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。特别优选的是在本公开内容的上下文中的表位是t细胞表位。[0516]术语例如“表位”、“抗原片段”、“免疫原性肽”和“抗原肽”在本文中可互换使用，并且优选地涉及抗原的不完整表示，其优选地能够引发针对抗原或者表达或包含并且优选呈递抗原的细胞的免疫应答。优选地，该术语涉及抗原的免疫原性部分。优选地，其为抗原的被t细胞受体识别(即，特异性结合)的部分，特别是如果在mhc分子的情况下呈递的话。某些优选的免疫原性部分与mhci类或ii类分子结合。术语“表位”是指分子(例如抗原)中被免疫系统识别的部分或片段。例如，表位可被t细胞、b细胞或抗体识别。抗原的表位可包含抗原的连续或不连续部分，并且长度可为约5至约100，例如约5至约50，更优选约8至约30，最优选约8至约25个氨基酸，例如表位的长度可优选为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在一个实施方案中，表位的长度为约10至约25个氨基酸。术语“表位”包括t细胞表位。[0517]术语“t细胞表位”是指当在mhc分子的情况下呈递时被t细胞识别的蛋白质的部分或片段。术语“主要组织相容性复合体”和缩写“mhc”包括i类mhc和ii类mhc分子，并且涉及存在于所有脊椎动物中的基因复合体。mhc蛋白或分子对于免疫反应中淋巴细胞与抗原呈递细胞或病变细胞之间的信号传导是重要的，其中mhc蛋白或分子结合肽表位并呈递它们以被t细胞上的t细胞受体识别。由mhc编码的蛋白质在细胞表面上表达，并将自身抗原(来自细胞本身的肽片段)和非自身抗原(例如，入侵微生物的片段)二者展示给t细胞。在i类mhc/肽复合物的情况下，结合肽通常约8至约10个氨基酸长，但是更长或更短的肽可以是有效的。在ii类mhc/肽复合体的情况下，结合肽通常约10至约25个氨基酸长，并且特别地约13至约18个氨基酸长，然而更长和更短的肽也可以是有效的。[0518]肽和蛋白质抗原的长度可以为2至100个氨基酸，包括例如5个氨基酸、10个氨基酸、15个氨基酸、20个氨基酸、25个氨基酸、30个氨基酸、35个氨基酸、40个氨基酸、45个氨基酸或50个氨基酸。在一些实施方案中，肽可大于50个氨基酸。在一些实施方案中，肽可大于100个氨基酸。[0519]肽或蛋白质抗原可以是可诱导免疫系统产生针对该肽或蛋白质的抗体和t细胞应答的能力或将该能力提高的任何肽或蛋白质。[0520]在一个实施方案中，疫苗抗原，即接种到对象体内诱导免疫应答的抗原，被免疫效应细胞识别。优选地，疫苗抗原如果被免疫效应细胞识别，则能够在存在适当的共刺激信号的情况下，诱导携带识别疫苗抗原的抗原受体的免疫效应细胞的刺激、致敏和/或扩增。在本公开内容实施方案的上下文中，疫苗抗原优选呈递或存在于细胞(优选抗原呈递细胞)的表面上。在一个实施方案中，抗原由病变细胞(例如肿瘤细胞或受感染细胞)呈递。在一个实施方案中，抗原受体是与在mhc的情况下呈递的抗原的表位结合的tcr。在一个实施方案中，当由t细胞表达和/或存在于t细胞上的tcr与由细胞例如抗原呈递细胞呈递的抗原的结合导致所述t细胞的刺激、致敏和/或扩增。在一个实施方案中，当由t细胞表达和/或存在于t细胞上的tcr与在病变细胞上呈递的抗原的结合导致病变细胞的细胞溶解和/或凋亡，其中所述t细胞优选地释放细胞毒性因子，例如，穿孔蛋白和颗粒酶。[0521]在一个实施方案中，抗原受体是与抗原中的表位结合的抗体或b细胞受体。在一个实施方案中，抗体或b细胞受体与抗原的天然表位结合。[0522]术语“在细胞表面上表达”或“与细胞表面缔合”意指分子(例如抗原)与细胞质膜缔合并位于细胞质膜，其中该分子的至少一部分朝向所述细胞的胞外空间并且可例如通过位于细胞外部的抗体从所述细胞的外部接近。在该情况下，部分为优选至少4个、优选至少8个、优选至少12个、更优选至少20个氨基酸。该缔合可以是直接的或间接的。例如，该缔合可以是通过一个或更多个跨膜结构域、一个或更多个脂质锚，或者是通过与可在细胞质膜外小叶上存在的任何其他蛋白质、脂质、糖类或其他结构的相互作用。例如，与细胞表面缔合的分子可以是具有胞外部分的跨膜蛋白，或者可以是通过与另一种是跨膜蛋白的蛋白质相互作用而与细胞表面缔合的蛋白质。[0523]“细胞表面”或“细胞的表面”根据其在本领域中的通常含义使用，并因此包括可通过蛋白质和其他分子结合可及的细胞外部。如果抗原位于细胞的表面并且可通过例如添加至所述细胞的抗原特异性抗体的结合可及，则所述抗原在所述细胞的表面上表达。[0524]在本公开内容的上下文中，术语“胞外部分”或“胞外结构域”是指朝向细胞的胞外空间并且优选地从所述细胞的外部可及(例如通过位于细胞外部的结合分子，例如抗体)的分子(例如，蛋白质)的一部分。优选地，该术语是指一个或更多个胞外环或结构域或者其片段。[0525]术语“t细胞”和“t淋巴细胞”在本文中可互换使用并且包括t辅助细胞(cd4 t细胞)和包括溶细胞性t细胞的细胞毒性t细胞(ctl，cd8 t细胞)。术语“抗原特异性t细胞”或类似术语涉及识别t细胞所靶向的抗原的t细胞，特别是当在mhc分子的情况下呈递在抗原呈递细胞或病变细胞(例如癌细胞)的表面上时，并且优选地发挥t细胞的效应子功能。如果t细胞杀伤表达抗原的靶细胞，则认为该t细胞对抗原具有特异性。可使用例如在铬释放测定或增殖测定内的多种标准技术中的任一种来评价t细胞特异性。或者，可测量淋巴因子(例如干扰素γ)的合成。在本公开内容的某些实施方案中，rna(特别是mrna)编码至少一个表位。[0526]术语“靶标”应意指作为免疫应答(例如细胞免疫应答)的靶标的物质，例如细胞或组织。靶标包括呈递抗原或抗原表位(即来源于抗原的肽片段)的细胞。在一个实施方案中，靶细胞是表达抗原并优选用i类mhc呈递所述抗原的细胞。[0527]“抗原加工”是指抗原降解成作为所述抗原的片段的加工产物(例如，蛋白质降解成肽)，以及这些片段中的一个或更多个与mhc分子缔合(例如通过结合)，以用于由细胞(优选抗原呈递细胞)呈递至特定的t细胞。[0528]“抗原应答性ctl”意指对由抗原呈递细胞表面的i类mhc呈递的抗原或来源于所述抗原的肽具有应答性的cd8 t细胞。[0529]根据本公开内容，ctl应答性可包括持续的钙通量、细胞分裂、细胞因子(例如ifn-γ和tnf-α)产生、活化标志物(例如cd44和cd69)上调、以及肿瘤抗原表达靶细胞的特异性细胞裂解性杀伤。ctl应答性也可使用精确指示ctl应答性的人工报告物来确定。[0530]术语“免疫应答”和“免疫反应”在本文中按其常规含义可互换使用，并且是指对抗原的整体身体应答，并且优选地是指细胞免疫应答、体液免疫应答或二者。根据本公开内容，关于物质(例如抗原、细胞或组织)的术语“对......的免疫应答”或“针对......的免疫应答”涉及针对所述物质的免疫应答，例如细胞应答。免疫应答可包括选自以下的一种或更多种反应：产生针对一种或更多种抗原的抗体和抗原特异性t淋巴细胞(优选cd4 和cd8 t淋巴细胞，更优选cd8 t淋巴细胞)的扩增，其可在体外的多种增殖或细胞因子产生测试中检测。[0531]在本公开内容的上下文中，术语“诱导免疫应答”和“引起免疫应答”和类似术语是指免疫应答的诱导，优选细胞免疫应答、体液免疫应答或二者的诱导。免疫应答可以是保护性/预先性/预防性和/或治疗性的。免疫应答可针对任何免疫原或抗原或抗原肽，优选针对肿瘤相关抗原或病原体相关抗原(例如，病毒(例如流感病毒(a、b或c)、cmv或rsv)的抗原)。在这种情况下，“诱导”可意指在诱导之前没有针对特定抗原或病原体的免疫应答，但其也可意指在诱导之前存在一定水平的针对特定抗原或病原体的免疫应答，并且在诱导之后，所述免疫应答增强。因此，在这种情况下，“诱导免疫应答”也包括“增强免疫应答”。优选地，在个体中诱导免疫应答之后，所述个体被保护免于发展疾病，例如感染性疾病或癌性疾病，或者通过诱导免疫应答来改善疾病状况。[0532]术语“细胞免疫应答”、“细胞应答”、“细胞介导的免疫”或类似术语意在包括针对以表达抗原和/或用mhci类或ii类呈递抗原为特征之细胞的细胞应答。细胞应答与称为t细胞或t淋巴细胞的细胞有关，这些细胞充当“辅助者”或“杀手”。辅助t细胞(也称为cd4 t细胞)通过调节免疫应答来发挥中心作用，并且杀伤细胞(也称为细胞毒性t细胞、细胞裂解性t细胞、cd8 t细胞或ctl)杀伤细胞(例如病变细胞)。[0533]术语“体液免疫应答”是指活生物体中的过程，其中响应于物质和生物体而产生抗体，所述抗体最终中和和/或消除所述物质和生物体。抗体应答的特异性由t和/或b细胞通过结合单一特异性的抗原的膜缔合受体介导的。在结合适当的抗原以及接收多种其他活化信号之后，b淋巴细胞分裂，这产生了记忆b细胞以及分泌抗体的浆细胞克隆，每个克隆产生识别与其抗原受体所识别的相同的抗原表位的抗体。记忆b淋巴细胞保持休眠状态，直至其随后被其特异性抗原活化。当再次暴露于特异性抗原时，这些淋巴细胞提供了记忆的细胞基础，并导致抗体应答的迅速增加。[0534]本文中使用的术语“抗体”是指能够与抗原上的表位特异性结合的免疫球蛋白分子。特别地，术语“抗体”是指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(heavy，h)链和两条轻(light，l)链的糖蛋白。术语“抗体”包括单克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体以及前述任意的组合。每条重链包含重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)。每条轻链包含轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)。可变区和恒定区在本文中也分别称为可变结构域和恒定结构域。vh和vl区可以进一步细分成称为互补决定区(complementaritydeterminingregion，cdr)的高变区，散布有称为框架区(frameworkregion，fr)的更保守的区域。每个vh和vl由从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列的三个cdr和四个fr构成：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。vh的cdr称为hcdr1、hcdr2和hcdr3，vl的cdr称为lcdr1、lcdr2和lcdr3。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区包含重链恒定区(ch)和轻链恒定区(cl)，其中ch可以进一步细分成恒定结构域ch1、铰链区以及恒定结构域ch2和ch3(从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：ch1、ch2、ch3)。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(c1q)。抗体可以是来源于天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫活性部分。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。抗体可以以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、fv、fab和f(ab)2，以及单链抗体和人源化抗体。[0535]术语“免疫球蛋白”涉及免疫球蛋白超家族的蛋白质，优选涉及抗原受体，例如抗体或b细胞受体(bcellreceptor，bcr)。免疫球蛋白的特征在于具有特征性免疫球蛋白(immunoglobulin，ig)折叠的结构性结构域(即免疫球蛋白结构域)。该术语涵盖膜结合的免疫球蛋白以及可溶性免疫球蛋白。膜结合的免疫球蛋白也称为表面免疫球蛋白或膜免疫球蛋白，其通常是bcr的一部分。可溶性免疫球蛋白通常称为抗体。免疫球蛋白通常包含通过二硫键连接的数条链，通常是两条相同的重链和两条相同的轻链。这些链主要由免疫球蛋白结构域构成，所述免疫球蛋白结构域例如vl(可变轻链)结构域、cl(恒定轻链)结构域、vh(可变重链)结构域和ch(恒定重链)结构域ch1、ch2、ch3和ch4。存在五种类型的哺乳动物免疫球蛋白重链，即α、δ、ε、γ和μ，其是不同种类的抗体(即，iga、igd、ige、igg和igm)的原因。与可溶性免疫球蛋白的重链相反，膜或表面免疫球蛋白的重链在其羧基末端包含跨膜结构域和短的胞质结构域。在哺乳动物中，有两种类型的轻链，即λ和κ。免疫球蛋白链包含可变区和恒定区。恒定区在免疫球蛋白的不同同种型内是基本上保守的，其中可变部分是高度多样化的并且负责抗原识别。[0536]术语“疫苗接种”和“免疫接种”描述了出于治疗或预防原因而治疗个体的过程，并且涉及以下程序：向个体施用一种或更多种如本文所述的免疫原或抗原或其衍生物(特别是以编码它们的rna(尤其是mrna)的形式)，以及刺激针对所述一种或更多种的免疫原或抗原或者特征在于呈递所述一种或更多种的免疫原或抗原的细胞的免疫应答。[0537]“特征在于呈递抗原的细胞”或“呈递抗原的细胞”或“在抗原呈递细胞表面上呈递抗原的mhc分子”或类似表述意指直接地或在mhc分子(优选mhci类和/或mhcii类分子，最优选mhci类分子)的情况下加工之后呈递抗原或抗原肽的细胞，例如病变细胞(特别是肿瘤细胞或感染细胞)或抗原呈递细胞。[0538]在本公开内容的上下文中，术语“转录”涉及其中dna序列中的遗传密码转录成rna(特别是mrna)的过程。随后，rna(特别是mrna)可以翻译成肽或蛋白质。[0539]关于rna，术语“表达”或“翻译”涉及通过其mrna的链指导组装氨基酸序列以产生肽或蛋白质之细胞的核糖体中的过程。[0540]本文中使用的术语“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件、状况或情况可发生或可不发生，并且所述描述包括其中所述事件、状况或情况发生的实例以及其中所述事件、状况或情况不发生的实例。[0541]本文中所述的特定化合物的前药是在向个体施用后在生理条件下发生化学转化以提供特定化合物的那些化合物。另外，前药可以在离体环境中通过化学或生物化学方法转化成特定化合物。例如，当例如将前药与合适的酶或化学试剂一起置于经皮贴剂储库中时，前药可以缓慢转化成特定化合物。一些示例性的前药在体内是可水解的酯(使用在特定化合物中包含的醇或羧基)或酰胺(使用在特定化合物中包含的氨基或羧基)。特别地，包含在特定化合物中并携有至少一个氢原子的任意氨基均可以转化成前药形式。典型的n-前药形式包括氨基甲酸酯、曼尼希碱(mannichbase)、烯胺和烯胺酮。[0542]“异构体”是具有相同分子式但结构不同(“结构异构体”)或者官能团和/或原子的几何(空间)位置不同(“立体异构体”)的化合物。“对映体”是作为彼此不可重叠镜像的立体异构体对。“外消旋混合物”或“外消旋体”包含等量的对映体对，并用前缀(±)表示。“非对映体”是不可重叠且彼此不是镜像的立体异构体。“互变异构体”是同一化学物质的结构异构体，其由于单个原子或原子团的迁移而自发和可逆地彼此转化，即使当是纯的时；即互变异构体处于彼此的动态化学平衡。互变异构体的一个实例是酮-烯醇-互变异构的异构体。“构象异构体”是仅通过围绕形式上的单键旋转即可相互转化的立体异构体，并且特别是包括导致(杂)环的不同3维形式(例如环己烷的椅型、半椅型、船型和扭船型)的那些。[0543]术语“平均直径”意指如通过动态光散射(dynamiclightscattering，dls)以及使用所谓的累积量算法进行数据分析而测得的颗粒的平均流体动力学直径，其提供的结果是长度维度的所谓的z平均值和无量纲的多分散性指数(pdi)(koppel,d.,j.chem.phys.57,1972,第4814至4820页,iso13321)。在此，颗粒的“平均直径”、“直径”或“尺寸”与该z平均值的值同义使用。[0544]“多分散性指数”优选地基于动态光散射测量通过如在“平均直径”的定义中提及的所谓的累积量分析来计算。在某些先决条件下，可将其视为对纳米粒系综(ensemble)的尺寸分布的量度(measure)。[0545]颗粒绕旋转轴的“回转半径”(本文中缩写为rg)是指某一点距旋转轴的径向距离，此处如果假设颗粒的整个质量都是集中的，则绕给定轴的转动惯量与其实际质量分布相同。从数学上讲，rg是颗粒组分距其质心或给定轴的均方根距离。例如，对于由n个质量元素、质量mi(i＝1，2，3，...，n)构成的、位于距质心固定距离si处的大分子，rg是所有质量元素上si2的质量平均值的平方根，并可如下计算：[0546][0547]回转半径可通过实验(例如通过使用光散射)进行确定或计算。特别地，对于小的散射矢量结构函数s如下定义：[0548][0549]其中n是组分的数目(guinier定律)。[0550]“d10值”(特别是关于颗粒的定量尺寸分布)是10％颗粒的直径小于该值时的直径。d10值是描述颗粒群内(例如在从场流分级(field-flowfractionation)中获得的颗粒峰内)最小颗粒比例的手段。[0551]“d50值”(特别是关于颗粒的定量尺寸分布)是50％颗粒的直径小于该值时的直径。d50值是描述颗粒群内(例如在从场流分级中获得的颗粒峰内)的平均颗粒尺寸的手段。[0552]“d90值”(特别是关于颗粒的定量尺寸分布)是90％颗粒的直径小于该值时的直径。“d95”、“d99”和“d100”值具有相应的含义。d90、d95、d99和d100值是描述颗粒群内(例如在从场流分级中获得的颗粒峰内)较大颗粒比例的手段。[0553]颗粒的“流体动力学半径”(有时称为“斯托克斯半径(stokesradius)”或“斯托克斯-爱因斯坦半径(stokes-einsteinradius)”)是以与所述颗粒相同的速率扩散的假设硬球的半径。流体动力学半径与颗粒的流动性有关，不仅考虑了尺寸还考虑了溶剂效应。例如，水合作用更强的更小带电荷颗粒可比水合作用更弱的更大带电荷颗粒具有更大的流体动力学半径。这是因为当更小的颗粒在溶液中运动时，会带着更多数目的水分子。由于溶剂中颗粒的实际尺寸无法直接测量，因此流体动力学半径可由斯托克斯-爱因斯坦方程定义：[0554][0555]其中κb是玻尔兹曼常数(boltzmannconstant)；t是温度；η是溶剂的黏度；d是扩散系数。扩散系数可通过实验(例如通过使用动态光散射(dls))来确定。因此，用于确定颗粒或颗粒群的流体动力学半径(例如本文公开的样品或对照组合物中包含的颗粒的流体动力学半径，或从使这样的样品或对照组合物经受场流分级获得的颗粒峰的流体动力学半径)的一种程序是测量所述颗粒或颗粒群的dls信号(例如本文公开的样品或对照组合物中包含的颗粒的dls信号，或从使这样的样品或对照组合物经受场流分级获得的颗粒峰的dls信号)。[0556]本文中使用的术语“聚集体”涉及其中颗粒是相同的或非常相似的并且以非共价方式(例如，通过离子相互作用、h桥相互作用、偶极相互作用和/或范德华相互作用)彼此附着的颗粒簇。[0557]本文中使用的表述“光散射”是指由于光通过的介质中的局部不均匀性，光被迫偏离直线轨迹一个或更多个路径的物理过程。[0558]术语“uv”意指紫外线，并指电磁波谱带，其波长为10nm至400nm，即，比可见光短但比x射线长。[0559]本文中使用的表述“多角度光散射”或“mals”涉及用于测量被样品散射到多个角度的光的技术。在这方面中，“多角度”意指如例如通过在包括选定的特定角度的范围内移动的单个检测器或固定在特定角度位置的检测器阵列测量的，可以以不同的离散角度检测散射光。在一个优选实施方案中，在mals中使用的光源是激光源(malls：多角度激光散射)。基于包含颗粒的组合物的mals信号并通过使用合适的形式(例如，zimm图、berry图或debye图)，可以确定回转半径(rg)，并因此确定所述颗粒的尺寸。优选地，zimm图是使用下式的图形表示：[0560][0561]其中c是溶剂中颗粒的质量浓度(g/ml)；a2是第二维里系数(mol·ml/g2)；p(θ)是与散射光强度对角度的依赖性相关的形状因子(formfactor)；rθ为超瑞利比(excessrayleighratio)(cm-1)；k*是等于4π2ηo(dn/dc)2λ0-4na-1的光学常数，其中ηo是溶剂在入射辐射(真空)波长下的折射率，λ0是入射辐射(真空)波长(nm)，na是阿伏伽德罗数(mol-1)，以及dn/dc是微分折射率增量(ml/g)(参见，例如，buchholzetal.(electrophoresis22(2001),4118-4128)；b.h.zimm(j.chem.phys.13(1945),141；p.debye(j.appl.phys.15(1944):338；以及w.burchard(anal.chem.75(2003),4279-4291)。优选地，berry图由以下项计算：[0562][0563]其中c、rθ和k*如上所定义。优选地，debye图由以下项计算：[0564][0565]其中c、rθ和k*如上所定义。[0566]本文中使用的表述“动态光散射”或“dls”是指确定颗粒的尺寸和尺寸分布谱，特别是关于颗粒的流体动力学半径的技术。单色光源(通常是激光)通过起偏器射出并射入样品中。然后散射光通过第二个起偏器，在那里被检测到并且产生的图像被投射到屏幕上。溶液中的颗粒被光击中，并向各个方向衍射光。来自颗粒的衍射光可以相长干涉(亮区)或相消干涉(暗区)。将该过程以短时间间隔重复，并且由自相关仪分析所得的散斑图组，所述自相关仪比较了随时间变化的每个点处的光强度。[0567]本文中使用的表述“静态光散射”或“sls”是指确定颗粒的尺寸和尺寸分布谱，特别是关于颗粒的回转半径和/或颗粒的摩尔质量的技术。在含有颗粒的溶液中发射高强度单色光，通常是激光。将一个或更多个探测器用于测量一个或许多个角度处的散射强度。需要角度依赖性以获得对所有半径大分子的摩尔质量和尺寸二者的精确测量。因此，在相对于入射光方向的多个角度下的同时测量结果(称为多角度光散射(multi-anglelightscattering，mals)或多角度激光散射(multi-anglelaserlightscattering，malls))通常被视为静态光散射的标准实现。[0568]术语“核酸”包括脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid，dna)、核糖核酸(ribonucleicacid，rna)、其组合及其经修饰形式。该术语包括基因组dna、cdna、mrna、重组产生和化学合成的分子。核酸可以作为单链或双链和线性或共价环状闭合的分子存在。核酸可以是分离的。根据本公开内容，术语“分离的核酸”意指这样的核酸：其(i)对于dna在体外扩增，例如通过聚合酶链反应(polymerasechainreaction，pcr)，或对于rna在体外转录(使用例如rna聚合酶)，(ii)通过克隆重组产生，(iii)被纯化，例如通过切割和通过凝胶电泳的分离，或者(iv)被合成，例如通过化学合成。[0569]术语“核苷”(本文中缩写为“n”)涉及可以被认为是没有磷酸基团的核苷酸的化合物。核苷是与糖(例如核糖或脱氧核糖)连接的核碱基，而核苷酸是由核苷和一个或更多个磷酸基团构成。核苷的实例包括胞苷、尿苷、假尿苷、腺苷和鸟苷。[0570]通常构成天然存在的核酸的五种标准核苷是尿苷、腺苷、胸苷、胞苷和鸟苷。五种核苷通常缩写为其单字母代码，分别为u、a、t、c和g。然而，胸苷更通常被写为“dt”(“d”代表“脱氧”)，因为其含有2’‑脱氧呋喃核糖部分而不是尿苷中存在的呋喃核糖环。这是因为胸苷存在于脱氧核糖核酸(dna)而不是核糖核酸(rna)中。相反，尿苷存在于rna而非dna中。其余的三种核苷可存在于rna和dna二者中。在rna中，其将表示为a、c和g，而在dna中，其将表示为da、dc和dg。[0571]经修饰的嘌呤(a或g)或嘧啶(c、t或u)碱基部分优选被一个或更多个烷基基团，更优选一个或更多个c1-4烷基基团，甚至更优选一个或更多个甲基基团修饰。经修饰的嘌呤或嘧啶碱基部分的一些具体实例包括n7-烷基-鸟嘌呤、n6-烷基-腺嘌呤、5-烷基-胞嘧啶、5-烷基-尿嘧啶和n(1)-烷基-尿嘧啶，例如n7-c1-4烷基-鸟嘌呤、n6-c1-4烷基-腺嘌呤、5-c1-4烷基-胞嘧啶、5-c1-4烷基-尿嘧啶和n(1)-c1-4烷基-尿嘧啶，优选n7-甲基-鸟嘌呤、n6-甲基-腺嘌呤、5-甲基-胞嘧啶、5-甲基-尿嘧啶和n(1)-甲基-尿嘧啶。[0572]在此，术语“dna”涉及包含脱氧核糖核苷酸残基的核酸分子。在一些优选实施方案中，dna包含全部或大部分的脱氧核糖核苷酸残基。如本文中使用的“脱氧核糖核苷酸”是指在β-d-呋喃核糖基的2’‑位缺少羟基的核苷酸。dna涵盖但不限于双链dna、单链dna、分离的dna(例如部分纯化的dna)、基本上纯的dna、合成dna、重组产生的dna以及通过添加、缺失、替换和/或改变一个或更多个核苷酸而不同于天然存在的dna之经修饰dna。这样的改变可以是指将非核苷酸物质添加至内部dna核苷酸或添加至dna末端。本文中还考虑了dna中的核苷酸可以是非标准核苷酸，例如化学合成的核苷酸或核糖核苷酸。对于本公开内容，这些改变的dna被认为是天然存在的dna的类似物。如果分子中脱氧核糖核苷酸残基的含量大于基于分子中核苷酸残基的总数的50％(例如至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)，则该分子包含“大部分脱氧核糖核苷酸残基”。分子中核苷酸残基的总数目是所有核苷酸残基的总和(无论核苷酸残基是标准(即天然存在)的核苷酸残基还是其类似物)。[0573]dna可以是重组dna并且可以通过克隆核酸(特别是cdna)来获得。cdna可通过rna的逆转录来获得。[0574]术语“rna”涉及包含核糖核苷酸残基的核酸分子。在一些优选实施方案中，rna包含全部或大部分的核糖核苷酸残基。如本文中使用的，“核糖核苷酸”是指在β-d-呋喃核糖基的2’‑位具有羟基的核苷酸。rna包括但不限于双链rna、单链rna、分离的rna(例如部分纯化的rna)、基本上纯的rna、合成rna、重组产生的rna，以及通过添加、缺失、替换和/或改变一个或更多个核苷酸而不同于天然存在的rna之经修饰rna。这样的改变可以是指将非核苷酸物质添加至内部rna核苷酸或添加至rna末端。本文中还考虑了rna中的核苷酸可以是非标准核苷酸，例如化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。对于本公开内容，这些改变/经修饰的核苷酸可以被称为天然存在的核苷酸的类似物，并且包含这样的改变/经修饰的核苷酸的相应rna(即，改变/经修饰rna)可以被称为天然存在的rna的类似物。如果分子中核糖核苷酸残基的含量大于基于分子中核苷酸残基总数的50％(例如至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)，则该分子包含“大部分核糖核苷酸残基”。分子中核苷酸残基的总数是所有核苷酸残基的总和(无论核苷酸残基是标准的(即，天然存在)的核苷酸残基还是其类似物)。[0575]“rna”包括mrna、trna、核糖体rna(ribosomalrna，rrna)、小核rna(smallnuclearrna，snrna)、自扩增rna(self-amplifyingrna，sarna)、单链rna(single-strandedrna，ssrna)、dsrna、抑制性rna(例如反义ssrna、小干扰rna(smallinterferingrna，sirna)或微rna(microrna，mirna))、激活rna(例如小激活rna)和免疫刺激性rna(immunostimulatoryrna，isrna)。[0576]本文中使用的术语“体外转录”或“ivt”意指以无细胞方式进行转录(即，rna的产生)。即，ivt不使用活的/培养的细胞，而是使用从细胞中提取的转录机器(例如，细胞裂解物或其分离的组分，包括rna聚合酶(优选t7、t3或sp6聚合酶))。[0577]mrna[0578]根据本公开内容，术语“mrna”意指“信使rna”，并且涉及可通过使用dna模板产生并且可以编码肽或蛋白质的“转录物”。通常，mrna包含5’‑utr、肽/蛋白质编码区和3’‑utr。在本公开内容的上下文中，mrna优选通过体外转录(invitrotranscription，ivt)从dna模板产生。如上所述，体外转录方法是技术人员已知的，并且多种体外转录试剂盒是可商购的。[0579]mrna是单链的，但可包含自身互补序列，所述序列允许mrna的一部分折叠并与其自身配对以形成双螺旋。[0580]根据本公开内容，“dsrna”意指双链rna，并且是具有两条部分或完全互补链的rna。[0581]在本公开内容的一些优选实施方案中，mrna涉及编码肽或蛋白质的rna转录物。[0582]在一个实施方案中，优选编码肽或蛋白质的mrna的长度为至少45个核苷酸(例如至少60个、至少90个、至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个、至少700个、至少800个、至少900个、至少1,000个、至少1,500个、至少2,000个、至少2,500个、至少3,000个、至少3,500个、至少4,000个、至少4,500个、至少5,000个、至少6,000个、至少7,000个、至少8,000个、至少9,000个核苷酸)，优选至多15,000个核苷酸，例如至多14,000、至多13,000个、至多12,000个核苷酸、至多11,000个核苷酸或至多10,000个核苷酸。[0583]如本领域中认可的，mrna通常包含5’非翻译区(5’‑untranslatedregion，5’‑utr)、肽编码区和3’非翻译区(3’‑untranslatedregion，3’‑utr)。在一些实施方案中，mrna通过体外转录或化学合成产生。在一个实施方案中，mrna使用dna模板通过体外转录产生。体外转录方法是技术人员已知的；参见，例如，molecularcloning:alaboratorymanual,2ndedition,j.sambrooketal.eds.,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor1989。此外，多种体外转录试剂盒是可商购的，例如来自thermofisherscientific(例如transcriptaidtmt7试剂盒、t7试剂盒、)、newenglandbiolabsinc.(例如hiscribetmt7试剂盒、hiscribetmt7arcamrna试剂盒)、promega(例如ribomaxtm、系统)、jenabioscience(例如sp6或t7转录试剂盒)和epicentre(例如ampliscribetm)。为了提供经修饰的mrna，可以在合成(优选体外转录)期间并入相应经修饰的核苷酸，例如经修饰的天然存在的核苷酸、非天然存在的核苷酸和/或经修饰的非天然存在的核苷酸，或者可以在转录之后在mrna中实现和/或添加修饰。[0584]在一个实施方案中，mrna是体外转录的mrna(ivt-rna)，并且可通过合适的dna模板的体外转录获得。用于控制转录的启动子可以是任何rna聚合酶的任何启动子。rna聚合酶的一些具体实例是t7、t3和sp6rna聚合酶。优选地，体外转录由t7或sp6启动子控制。用于体外转录的dna模板可通过克隆核酸，特别是cdna，并将其引入到用于体外转录的合适载体中而获得。cdna可通过rna的逆转录获得。[0585]在本公开内容的某些实施方案中，mrna是“复制子mrna”或简称为“复制子”，特别是“自复制mrna”或“自扩增mrna”。在一个特别优选的实施方案中，复制子或自复制mrna来源于或包含这样的元件：所述元件来源于ssrna病毒，特别是正链ssrna病毒例如甲病毒。甲病毒是正链rna病毒的典型代表。甲病毒在感染细胞的细胞质中复制(关于甲病毒生命周期的综述，参见joséetal.,futuremicrobiol.,2009,第4卷,第837至856页)。许多甲病毒的总基因组长度通常为11,000至12,000个核苷酸，并且基因组rna通常具有5’帽和3’poly(a)尾。甲病毒的基因组编码非结构蛋白(参与病毒rna的转录、修饰和复制以及蛋白质修饰)和结构蛋白(形成病毒颗粒)。基因组中通常有两个开放阅读框(openreadingframe，orf)。四种非结构蛋白(nsp1至nsp4)通常由自基因组5’端附近开始的第一orf一起编码，而甲病毒结构蛋白由存在于第一orf的下游并延伸靠近基因组3’端的第二orf一起编码。通常而言，第一orf大于第二orf，比例为大致2:1。在被甲病毒感染的细胞中，仅编码非结构蛋白的核酸序列从基因组rna翻译，而编码结构蛋白的遗传信息可从亚基因组转录物翻译，所述亚基因组转录物是类似于真核信使rna(messengerrna，mrna)的rna分子(gouldetal.,2010,antiviralres.,第87卷,第111至124页)。在感染之后，即在病毒生命周期的早期阶段，( )链基因组rna像信使rna一样直接用于翻译编码非结构多聚蛋白(nsp1234)的开放阅读框。已经提出将甲病毒来源载体用于将外来遗传信息递送至靶细胞或靶生物体中。在简单的方法中，将编码甲病毒结构蛋白的开放阅读框替换成编码目的蛋白的开放阅读框。基于甲病毒的反式复制系统依赖于两个分开的核酸分子上的甲病毒核苷酸序列元件：一个核酸分子编码病毒复制酶，而另一个核酸分子能够被所述复制酶反式复制(因此称为反式复制系统)。反式复制需要在给定的宿主细胞中存在这两种核酸分子。能够被复制酶反式复制的核酸分子必须包含某些甲病毒序列元件，以允许通过甲病毒复制酶进行识别和rna合成。[0586]在本公开内容的一个实施方案中，mrna包含一个或更多个修饰，例如，以便提高其稳定性和/或提高翻译效率和/或降低免疫原性和/或减少细胞毒性。例如，为了提高mrna的表达，可以在编码区(即编码所表达的肽或蛋白质的序列)内进行修饰，优选不改变所表达肽或蛋白质的序列。这样的修饰例如在wo2007/036366和pct/ep2019/056502中描述，并且包括以下：5’‑帽结构；天然存在的poly(a)尾的延伸或截短；5’‑和/或3’‑非翻译区(utr)的改变(例如引入与所述rna编码区无关的utr)；用合成核苷酸替换一个或更多个天然存在的核苷酸；以及密码子优化(例如，改变(优选提高)rna的gc含量)。根据本公开内容，在经修饰mrna的上下文中术语“修饰”优选地涉及mrna中非天然存在于所述mrna中的任何修饰。[0587]在一些实施方案中，mrna包含5’‑帽结构。在一个实施方案中，mrna不具有未加帽的5’‑三磷酸。在一个实施方案中，mrna可包含常规的5’‑帽和/或5’‑帽类似物。术语“常规5’‑帽”是指存在于mrna分子5’端的帽结构，并且通常由鸟苷5’‑三磷酸(gppp)组成，所述鸟苷5’‑三磷酸通过其三磷酸部分与mrna中下一个核苷酸的5’端连接(即鸟苷通过5’‑5’三磷酸键联与mrna的其余部分连接)。鸟苷可以在n7位甲基化(产生帽结构m7gppp)。术语“5’‑帽类似物”是指这样的5’‑帽，其基于常规5’‑帽但在m7鸟苷结构的2’‑或3’‑位被修饰以避免5’‑帽类似物在相反方向的整合(这样的5’‑帽类似物也被称为抗反向帽类似物(anti-reversecapanalog，arca))。特别优选的5’‑帽类似物是在磷酸桥中在桥接和非桥接氧处具有一个或更多个取代的那些，例如在β-磷酸处硫代磷酸酯修饰的5’‑帽类似物(例如m27，2′og(5′)ppsp(5′)g(称为beta-s-arca或β-s-arca))，如pct/ep2019/056502中所述。提供了具有如本文中所述5’‑帽结构的mrna可以在存在相应的5’‑帽化合物的情况下通过dna模板的体外转录来实现，其中所述5’‑帽结构被共转录并入到所产生的mrna链中，或者mrna可以例如通过体外转录来产生，并且5’‑帽结构可以使用加帽酶(例如痘苗病毒的加帽酶)在转录后与mrna连接。[0588]在一些实施方案中，mrna包含选自m27，2′og(5’)ppsp(5′)g(特别是其d1非对映体)、m27，3′og(5′)ppp(5′)g和m27，3′ogppp(m12′‑o)apg的5’‑帽结构。[0589]在一些实施方案中，mrna包含cap0、cap1或cap2，优选cap1或cap2。根据本公开内容，术语“cap0”意指结构“m7gpppn”，其中n是在2’位携有oh部分的任何核苷。根据本公开内容，术语“cap1”意指结构“m7gpppnm”，其中nm是在2’位携有och3部分的任何核苷。根据本公开内容，术语“cap2”意指结构“m7gpppnmnm”，其中每个nm独立地是在2’位携有och3部分的任何核苷。[0590]beta-s-arca(β-s-arca)的d1非对映体具有以下结构：[0591][0592]“β-s-arca的d1非对映体”或“β-s-arca(d1)”是β-s-arca的非对映体，其与β-s-arca的d2非对映体(β-s-arca(d2))相比首先在hplc柱上洗脱，并因此表现出较短的保留时间。hplc优选地是分析型hplc。在一个实施方案中，supelcosillc-18-trp柱，优选形式为：5μm，4.6×250mm用于分离，由此可以施加1.3ml/分钟的流量。在一个实施方案中，在15分钟内使用乙酸铵中甲醇的梯度，例如在0.05m乙酸铵中甲醇的0％至25％线性梯度，ph＝5.9。uv检测(vwd)可在260nm处进行，荧光检测(fluorescencedetection，fld)可在280nm下激发和337nm下检测进行。[0593]作为cap1构件的5’‑cap类似物m27，3′‑ogppp(m12′‑o)apg(也称为m27，3′og(5′)ppp(5′)m2′‑oapg)具有以下结构：al.,2006,blood,第108卷,第4009至4017页)。[0603]poly-a尾可具有任何长度。在一些实施方案中，poly-a尾包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：至少20个、至少30个、至少40个、至少80个或至少100个、并且至多500个、至多400个、至多300个、至多200个或至多150个a核苷酸，并且特别是约120个a核苷酸。在本上下文中，“基本上由……组成”意指poly-a尾中的大多数核苷酸，通常按poly-a尾中核苷酸的数目计至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％是a核苷酸，但允许其余核苷酸是除a核苷酸之外的核苷酸，例如u核苷酸(尿苷酸)、g核苷酸(鸟苷酸)或c核苷酸(胞苷酸)。在本上下文中，“由……组成”意指poly-a尾中的所有核苷酸，即按poly-a尾中核苷酸的数目计100％均是a核苷酸。术语“a核苷酸”或“a”是指腺苷酸。[0604]在一些实施方案中，基于在与编码链互补的链中包含重复的dt核苷酸(脱氧胸苷酸)的dna模板，在rna转录期间，例如在制备体外转录的rna期间，连接poly-a尾。编码poly-a尾的dna序列(编码链)称为poly(a)盒。[0605]在一些实施方案中，存在于dna编码链中的poly(a)盒基本上由da核苷酸组成，但被四种核苷酸(da、dc、dg和dt)的随机序列中断。这样的随机序列的长度可以是5至50、10至30或10至20个核苷酸。这样的盒公开于wo2016/005324a1中，其在此通过引用并入。wo2016/005324a1中公开的任何poly(a)盒均可用于本公开内容。涵盖以下：基本上由da核苷酸组成但被具有均等分布的四种核苷酸(da、dc、dg、dt)并且长度为例如5至50个核苷酸的随机序列中断的poly(a)盒显示，在dna水平上质粒dna在大肠杆菌(e.coli)中的恒定增殖，而在rna水平上仍与对于支持rna稳定性和翻译效率的有益特性相关。因此，在一些实施方案中，本文中所述mrna分子中包含的poly-a尾基本上由a核苷酸组成，但是被四种核苷酸(a、c、g、u)的随机序列中断。这样的随机序列的长度可以是5至50、10至30或10至20个核苷酸。[0606]在一些实施方案中，除a核苷酸之外，无核苷酸侧接poly-a尾其3’端，即，poly-a尾在其3’端未被除a之外的核苷酸掩蔽或跟随。[0607]在一些实施方案中，本公开内容中使用的mrna包含5’‑utr和/或3’‑utr。术语“非翻译区”或“utr”涉及dna分子中被转录但未被翻译成氨基酸序列的区域，或者涉及rna分子(例如mrna分子)中的相应区域。非翻译区(utr)可存在于开放阅读框的5’(上游)(5’‑utr)和/或开放阅读框的3’(下游)(3’‑utr)。5’‑utr(如果有的话)位于5’端，蛋白质编码区起始密码子的上游。5’‑utr位于5’‑帽(如果有的话)的下游，例如，与5’‑帽直接相邻。3’‑utr(如果有的话)位于3’端，蛋白质编码区终止密码子的下游，但是术语“3’‑utr”优选不包含poly-a序列。因此，3’‑utr位于poly-a序列(如果有的话)的上游，例如，与poly-a序列直接相邻。将3’‑utr并入到rna(优选mrna)分子的3’‑非翻译区中可导致翻译效率的提高。可以通过并入两个或更多个这样的3’‑utr(其优选以头至尾方向排列；参见例如，holtkampetal.,blood108,4009-4017(2006))来实现协同作用。3’‑utr对于它们待引入其中的rna(优选mrna)而言可以是自体的或异源的。在一个具体的实施方案中，3’‑utr来源于珠蛋白基因或mrna，例如α2-珠蛋白、α1-珠蛋白或β-珠蛋白，优选β-珠蛋白，更优选人β-珠蛋白的基因或mrna。例如，可以通过将现有3’‑utr替换成一个或更多个，优选两个拷贝的来源于珠蛋白基因例如α2-珠蛋白、α1-珠蛋白、β-珠蛋白，优选β-珠蛋白，更优选人β-珠蛋白的3’‑utr，或者插入一个或更多个，优选两个拷贝的来源于珠蛋白基因例如α2-珠蛋白、α1-珠蛋白、β-珠蛋白，优选β-珠蛋白，更优选人β-珠蛋白的3’‑utr，来对rna(优选mrna)进行修饰。[0608]mrna可具有经修饰的核糖核苷酸以便提高其稳定性和/或降低免疫原性和/或降低细胞毒性。例如，在一个实施方案中，本文中所述mrna中的尿苷被经修饰核苷替换(部分地或完全地，优选完全地)。在一些实施方案中，经修饰核苷是经修饰尿苷。[0609]在一些实施方案中，替代尿苷的经修饰尿苷选自假尿苷(ψ)、n1-甲基-假尿苷(m1ψ)、5-甲基-尿苷(m5u)及其组合。[0610]在一些实施方案中，替代(部分地或完全地，优选完全地)mrna中的尿苷的经修饰核苷可以是以下中的任一种或更多种：3-甲基-尿苷(m3u)、5-甲氧基-尿苷(mo5u)、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷(s2u)、4-硫代-尿苷(s4u)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho5u)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤代-尿苷(例如，5-碘代-尿苷或5-溴代-尿苷)、尿苷5-羟乙酸(cmo5u)、尿苷5-羟乙酸甲酯(mcmo5u)、5-羧甲基-尿苷(cm5u)、1-羧甲基-假尿苷、5-羧基羟甲基-尿苷(chm5u)、5-羧基羟甲基-尿苷甲酯(mchm5u)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm5u)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm5s2u)、5-氨甲基-2-硫代-尿苷(nm5s2u)、5-甲基氨甲基-尿苷(mnm5u)、1-乙基-假尿苷、5-甲基氨甲基-2-硫代-尿苷(mnm5s2u)、5-甲基氨甲基-2-硒代-尿苷(mnm5se2u)、5-氨甲酰基甲基-尿苷(ncm5u)、5-羧甲基氨甲基-尿苷(cmnm5u)、5-羧甲基氨甲基-2-硫代-尿苷(cmnm5s2u)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(τm5u)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷(τm5s2u)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷)、5-甲基-2-硫代-尿苷(m5s2u)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮杂-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮杂-假尿苷、二氢尿苷(d)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m5d)、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、n1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp3u)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨甲基)尿苷(inm5u)、5-(异戊烯基氨甲基)-2-硫代-尿苷(inm5s2u)、α-硫代-尿苷、2’‑o-甲基-尿苷(um)、5,2’‑o-二甲基-尿苷(m5um)、2’‑o-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫代-2’‑o-甲基-尿苷(s2um)、5-甲氧基羰基甲基-2’‑o-甲基-尿苷(mcm5um)、5-氨甲酰基甲基-2’‑o-甲基-尿苷(ncm5um)、5-羧甲基氨甲基-2’‑o-甲基-尿苷(cmnm5um)、3,2’‑o-二甲基-尿苷(m3um)、5-(异戊烯基氨甲基)-2’‑o-甲基-尿苷(inm5um)、1-硫代-尿苷、脱氧胸苷、2’‑f-阿糖-尿苷、2’‑f-尿苷、2’‑oh-阿糖-尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷、5-[3-(1-e-丙烯基氨基)尿苷或本领域中已知的任何其他经修饰尿苷。[0611]通过假尿苷(部分地或完全地，优选完全地替换尿苷)修饰的rna(优选mrna)在本文中称为“ψ修饰的”，而术语“m1ψ-修饰的”意指rna(优选mrna)包含n(1)-甲基假尿苷(部分地或完全地，优选完全地替换尿苷)。此外，术语“m5u修饰的”意指rna(优选mrna)包含5-甲基尿苷(部分地或完全地，优选完全地替换尿苷)。与其未经修饰形式相比，这样的ψ-或m1ψ-或m5u-修饰的rna通常表现出降低的免疫原性，并因此，优选其中需要避免或最小化免疫应答诱导的应用。[0612]可以进一步优化本公开内容中使用的mrna的密码子，例如，以提高rna的gc含量和/或将在待表达目的肽或蛋白质的细胞(或对象)中罕见的密码子替换成作为所述细胞(或对象)中同义的频繁密码子的密码子。在一些实施方案中，由本公开内容中使用的mrna编码的氨基酸序列由密码子优化和/或与野生型编码序列相比提高的g/c含量的编码序列编码。这也包括一些实施方案，其中编码序列的一个或更多个序列区域与野生型编码序列的相应序列区域相比是密码子优化的和/或g/c含量提高的。在一个实施方案中，密码子优化和/或g/c含量提高优选不改变所编码氨基酸序列的序列。[0613]术语“密码子优化”是指改变核酸分子的编码区中的密码子以反映宿主生物体的典型密码子使用而不优选改变由核酸分子编码的氨基酸序列。在本公开内容的上下文中，编码区优选是密码子优化的，以便在使用本文中所述mrna治疗的对象中进行最佳表达。密码子优化是基于这样的发现：翻译效率还由细胞中trna出现的不同频率决定。因此，可以修饰mrna的序列，使得插入频繁出现的trna可用的密码子来替代“罕见密码子”。[0614]在一些实施方案中，与野生型rna的相应编码序列的鸟苷/胞嘧啶(g/c)含量相比，本文中所述mrna的编码区的g/c含量提高，其中与野生型rna编码的氨基酸序列相比，所述mrna编码的氨基酸序列优选是未经修饰的。mrna序列的该修饰是基于这样的事实：任何待翻译的rna区域的序列对于该mrna的有效翻译均是重要的。与具有a(腺苷)/u(尿嘧啶)含量提高的序列相比，具有g(鸟苷)/c(胞嘧啶)含量提高的序列更稳定。关于数种密码子编码一种且相同氨基酸(所谓的遗传密码子简并性)的事实，可以确定对稳定性最有利的密码子(所谓的替代密码子使用)。取决于待由所述mrna编码的氨基酸，与其野生型序列相比，存在多种修饰mrna序列的可能性。特别地，可以通过用编码同一氨基酸但不含a和/或u或者含有较低含量的a和/或u核苷酸的另一些密码子替换这些密码子来修饰包含a和/或u核苷酸的密码子。[0615]在多个实施方案中，与野生型rna编码区的g/c含量相比，本文中所述mrna的编码区的g/c含量提高了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少55％或甚至更多。[0616]上述修饰(即5’‑帽结构的并入、poly-a序列的并入、poly-a序列的未掩蔽、5’‑和/或3’‑utr的改变(例如一个或更多个3’‑utr的并入)、用合成核苷酸替换一个或更多个天然存在的核苷酸(例如，用5-甲基胞苷替换胞苷和/或用假尿苷(ψ)或n(1)-甲基假尿苷(m1ψ)或5-甲基尿苷(m5u)替换尿苷)以及密码子优化)的组合对rna(优选mrna)的稳定性和翻译效率的提高具有协同影响。因此，在一个优选实施方案中，本公开内容中使用的mrna包含至少两种、至少三种、至少四种或所有五种上述修饰即以下的组合：(i)5’‑帽结构的并入，(ii)poly-a序列的并入，poly-a序列的未掩蔽；(iii)5’‑和/或3’‑utr的改变(例如一个或更多个3’‑utr的并入)；(iv)用合成核苷酸替换一个或更多个天然存在的核苷酸(例如，用5-甲基胞苷替换胞苷和/或用假尿苷(ψ)或n(1)-甲基假尿苷(m1ψ)或5-甲基尿苷(m5u)替换尿苷)以及(v)密码子优化。[0617]本公开内容的一些方面涉及将本文中公开的mrna靶向递送至某些细胞或组织。在一个实施方案中，本公开内容涉及靶向淋巴系统，特别是次级淋巴器官，更特别地是脾。如果施用的mrna是编码用于诱导免疫应答的抗原或表位的mrna，则特别优选的是靶向淋巴系统，特别是次级淋巴器官，更特别地是脾。在一个实施方案中，靶细胞是脾细胞。在一个实施方案中，靶细胞是抗原呈递细胞，例如脾中的专职抗原呈递细胞。在一个实施方案中，靶细胞是脾中的树突细胞。“淋巴系统”是循环系统的一部分并且是免疫系统的一个重要部分，其包含携有淋巴的淋巴管网络。淋巴系统由淋巴器官、淋巴管的传导网络和循环淋巴组成。初级或中枢淋巴器官从未成熟的祖细胞产生淋巴细胞。胸腺和骨髓构成初级淋巴器官。次级或外周淋巴器官(包括淋巴结和脾)维持成熟的初始淋巴细胞并启动适应性免疫应答。[0618]基于脂质的mrna递送系统对肝具有固有的偏好。肝积聚是由肝脉管系统或脂质代谢(脂质体和脂质或胆固醇缀合物)的不连续性质引起的。在一个实施方案中，靶器官是肝并且靶组织是肝组织。优选递送至这样的靶组织，特别是在期望在该器官或组织中存在mrna或编码的肽或蛋白质时，和/或者在期望表达大量编码的肽或蛋白质时，和/或者在期望或需要全身性存在编码的肽或蛋白质，特别是以显著的量时。[0619]在一个实施方案中，在施用本文中所述mrna颗粒之后，至少一部分mrna被递送至靶细胞或靶器官。在一个实施方案中，至少一部分mrna被递送至靶细胞的胞质溶胶。在一个实施方案中，mrna是编码肽或蛋白质的mrna，并且mrna被靶细胞翻译以产生肽或蛋白质。在一个实施方案中，靶细胞是肝中的细胞。在一个实施方案中，靶细胞是肌细胞。在一个实施方案中，靶细胞是内皮细胞。在一个实施方案中，靶细胞是肿瘤细胞或肿瘤微环境中的细胞。在一个实施方案中，靶细胞是血细胞。在一个实施方案中，靶细胞是淋巴结中的细胞。在一个实施方案中，靶细胞是肺中的细胞。在一个实施方案中，靶细胞是血细胞。在一个实施方案中，靶细胞是皮肤中的细胞。在一个实施方案中，靶细胞是脾细胞。在一个实施方案中，靶细胞是抗原呈递细胞，例如脾中的专职抗原呈递细胞。在一个实施方案中，靶细胞是脾中的树突细胞。在一个实施方案中，靶细胞是t细胞。在一个实施方案中，靶细胞是b细胞。在一个实施方案中，靶细胞是nk细胞。在一个实施方案中，靶细胞是单核细胞。因此，本文中所述的rna颗粒可用于将mrna递送至这样的靶细胞。因此，本公开内容还涉及用于在对象中将mrna递送至靶细胞的方法，所述方法包括向对象施用本文中所述的mrna颗粒。在一个实施方案中，mrna被递送至靶细胞的胞质溶胶。在一个实施方案中，mrna是编码肽或蛋白质的mrna，并且rna被靶细胞翻译以产生肽或蛋白质。[0620]“编码”是指多核苷酸(例如基因、cdna或mrna)中的特定核苷酸序列用作在生物过程中合成其他聚合物和大分子的模板的固有特性，所述其他聚合物和大分子具有限定的核苷酸序列(即，rrna、trna和mrna)或限定的氨基酸序列和由其产生的生物学特性。因此，如果与基因对应的mrna的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mrna序列相同且通常在序列表中提供)和非编码链(用作基因或cdna的转录模板)二者均可称为编码该蛋白质或者该基因或cdna的其他产物。[0621]在一个实施方案中，本公开内容中使用的mrna包含编码一种或更多种多肽(例如，肽或蛋白质、优选药物活性肽或蛋白质)的核酸序列。[0622]在一个优选实施方案中，本公开内容中使用的mrna包含编码肽或蛋白质、优选药物活性肽或蛋白质的核酸序列，并且能够表达所述肽或蛋白质，特别是如果转移到细胞或对象中的话。因此，本公开内容中使用的mrna优选地包含编码肽或蛋白质、优选地编码药物活性肽或蛋白质的编码区(开放阅读框(orf))。在这方面中，“开放阅读框”或“orf”是从起始密码子开始以终止密码子结束的连续的密码子区段。这样的编码药物活性肽或蛋白质的mrna在本文中也称为“药物活性mrna”。[0623]根据本公开内容，术语“药物活性肽或蛋白质”意指这样的肽或蛋白质，其可用于治疗个体(在该个体中肽或蛋白质的表达将是有益的)，例如，在改善疾病或病症的症状中。优选地，药物活性肽或蛋白质具有治愈或姑息特性，并且可被施用以改善、减轻、缓解、逆转疾病或病症的一种或更多种症状、延迟疾病或病症的一种或更多种症状的发作或者减轻疾病或病症的一种或更多种症状的严重程度。优选地，当以治疗有效量施用于个体时，药物活性肽或蛋白质对个体的病症或疾病状态具有积极或有利的作用。药物活性肽或蛋白质可具有预防特性，并且可用于延迟疾病或病症的发作或者减轻这样的疾病或病症的严重程度。术语“药物活性肽或蛋白质”包括完整的蛋白质或多肽，并且还可指其药物活性片段。它还可包括肽或蛋白质的药物活性类似物。[0624]药物活性肽和蛋白质的一些具体实例包括但不限于细胞因子、激素、黏附分子、免疫球蛋白、免疫活性化合物、生长因子、蛋白酶抑制剂、酶、受体、凋亡调节剂、转录因子、肿瘤抑制蛋白、结构蛋白、重编程因子、基因组工程蛋白和血液蛋白。[0625]术语“细胞因子”涉及分子量为约5至20kda并参与细胞信号传导(例如，旁分泌、内分泌和/或自分泌信号传导)的蛋白质。特别地，当释放时，细胞因子对其释放位置周围的细胞行为产生影响。细胞因子的一些实例包括淋巴因子、白介素、趋化因子、干扰素和肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor，tnf)。根据本公开内容，细胞因子不包括激素或生长因子。细胞因子与激素的不同之处在于：(i)它们通常以比激素更加可变的浓度发挥作用，以及(ii)通常由广泛范围的细胞产生(几乎所有有核细胞均可以产生细胞因子)。干扰素通常特征在于抗病毒、抗增殖和免疫调节活性。干扰素是通过与所调节细胞表面上的干扰素受体结合来改变和调节细胞内基因的转录从而防止细胞内病毒复制的蛋白质。干扰素可分为两种类型。ifn-γ是唯一的ii型干扰素；所有其他均为i型干扰素。细胞因子的一些具体实例包括促红细胞生成素(erythropoietin，epo)、集落刺激因子(colonystimulatingfactor，csf)、粒细胞集落刺激因子(granulocytecolonystimulatingfactor，g-csf)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor，gm-csf)、肿瘤坏死因子(tnf)、骨形态发生蛋白(bonemorphogeneticprotein，bmp)、α干扰素(interferonalfa，ifnα)、β干扰素(interferonbeta，ifnβ)、γ干扰素(interferongamma，infγ)、白介素2(il-2)、白介素4(il-4)、白介素10(il-10)、白介素11(il-11)、白介素12(il-12)和白介素21(il-21)。[0626]在一个实施方案中，药物活性肽或蛋白质包含替代蛋白。在该实施方案中，本公开内容提供了用于治疗患有需要蛋白质替代(proteinreplacement)的病症(例如，蛋白质缺乏症)的对象的方法，所述方法包括向对象施用编码替代蛋白质的如本文所述的rna。术语“蛋白质替代”是指将蛋白质(包括其功能变体)引入到缺乏这样的蛋白质的对象中。该术语还指以其他方式将蛋白质引入需要或受益于提供蛋白质的对象(例如患有蛋白质不足的对象)中。术语“特征在于蛋白质缺乏的病症”是指表现出由蛋白质缺乏或蛋白质的量不足而引起的病理状况的任何病症。该术语涵盖导致生物上无活性的蛋白质产物的蛋白质折叠病症，即构象病症。蛋白质不足可涉及感染性疾病、免疫抑制、器官衰竭、腺体问题、放射病、营养缺乏、中毒或其他环境或外部损伤。[0627]术语“激素”涉及由腺体产生的一类信号传导分子，其中信号传导通常包括以下步骤：(i)在特定组织中合成激素；(ii)储存和分泌；(iii)将激素转运至其靶标；(iv)受体与激素结合；(v)信号的传递和放大；以及(vi)激素的分解。激素与细胞因子的不同之处在于：(1)激素通常以较小的可变浓度发挥作用，以及(2)通常由特定种类的细胞产生。在一个实施方案中，“激素”是肽或蛋白质激素，例如胰岛素、升压素、催乳素、促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropichormone，acth)、甲状腺激素、生长激素(例如人生长激素或牛生长激素)、催产素、心房钠尿肽(atrial-natriureticpeptide，anp)、胰高血糖素、生长抑素、胆囊收缩素、胃泌素和瘦素。[0628]术语“黏附分子”涉及位于细胞表面上并且参与细胞与另一些细胞或与细胞外基质(extracellularmatrix，ecm)结合的蛋白质。黏附分子通常是跨膜受体，并且可分类为钙非依赖性(例如整合素、免疫球蛋白超家族、淋巴细胞归巢受体)和钙依赖性(钙黏着蛋白和选择素)。黏附分子的一些具体实例是整合素、淋巴细胞归巢受体、选择素(例如，p-选择素)和地址素。[0629]整合素也参与信号转导。特别地，在配体结合后，整合素调节细胞信号传导途径，例如跨膜蛋白激酶(例如受体酪氨酸激酶(receptortyrosinekinase，rtk))的途径。这样的调节可导致细胞生长、分裂、存活或分化或者凋亡。整合素的一些具体实例包括：α1β1、α2β1、α3β1、α4β1、α5β1、α6β1、α7β1、αlβ2、αmβ2、αiibβ3、αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8和α6β4。[0630]术语“免疫球蛋白”或“免疫球蛋白超家族”意指参与细胞的识别、结合和/或黏附过程的分子。属于该超家族的分子的共同特征是其包含被称为免疫球蛋白结构域或折叠的区域。免疫球蛋白超家族的一些成员包括抗体(例如，igg)、t细胞受体(tcellreceptor，tcr)、主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex，mhc)分子、共受体(例如，cd4、cd8、cd19)、抗原受体辅助分子(例如，cd-3γ、cd3-δ、cd-3ε、cd79a、cd79b)、共刺激性或抑制性分子(例如，cd28、cd80、cd86)等。[0631]术语“免疫活性化合物”涉及改变免疫应答的任何化合物，优选通过诱导和/或抑制免疫细胞成熟，诱导和/或抑制细胞因子生物合成，和/或通过刺激b细胞产生抗体改变体液免疫进行。免疫活性化合物具有有效的免疫刺激活性，包括但不限于抗病毒和抗肿瘤活性，并且还可下调免疫应答的另一些方面，例如将免疫应答从th2免疫应答移开，这对于治疗广泛的th2介导的疾病是有用的。免疫活性化合物可用作疫苗佐剂。免疫活性化合物的一些具体实例包括白介素、集落刺激因子(csf)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、促红细胞生成素、肿瘤坏死因子(tnf)、干扰素、整合素、地址素、选择素、归巢受体和抗原，特别是肿瘤相关抗原、病原体相关抗原(例如细菌、寄生物或病毒抗原)、变应原和自身抗原。优选的免疫活性化合物是疫苗抗原，即接种到对象中诱导免疫应答的抗原。[0632]术语“自身抗原”或“自体抗原”是指源自对象体内(即，自身抗原也可以称为“自体抗原”)并且其产生针对身体的该正常部分的异常剧烈免疫应答的抗原。这样的针对自身抗原的剧烈免疫反应可能是“自身免疫病”的原因。[0633]术语“变应原”是指源自对象身体外部(即，变应原也可称为“异源抗原”)并且其产生异常剧烈的免疫应答的一类抗原，其中对象的免疫系统对抗原本对对象无害的感知到的威胁。“变态反应”是由针对变应原的这样的剧烈免疫反应引起的疾病。变应原通常是能够在特应性个体中通过免疫球蛋白e(immunoglobuline，ige)应答刺激i型超敏反应的抗原。变应原的一些具体实例包括来源于花生蛋白(例如，arah2.02)、卵清蛋白、草花粉蛋白(例如，phlp5)和尘螨蛋白(例如，derp2)的变应原。[0634]术语“生长因子”是指能够刺激细胞生长、增殖、愈合和/或细胞分化的分子。通常而言，生长因子充当细胞之间的信号传导分子。术语“生长因子”包括与其靶细胞表面上的特定受体结合的特定细胞因子和激素。生长因子的一些实例包括骨形态发生蛋白(bmp)、成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor，fgf)、血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，vegf)(例如vegfa)、表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，egf)、胰岛素样生长因子、肝配蛋白(ephrin)、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、神经调节蛋白、神经营养因子(例如，脑源性神经营养因子(brain-derivedneurotrophicfactor，bdnf)、神经生长因子(nervegrowthfactor，ngf))、胎盘生长因子(placentalgrowthfactor，pgf)、血小板来源生长因子(platelet-derivedgrowthfactor，pdgf)、肾酶(renalase，rnls)(抗凋亡生存因子)、t细胞生长因子(t-cellgrowthfactor，tcgf)、血小板生成素(thrombopoietin，tpo)、转化生长因子(转化生长因子α(transforminggrowthfactoralpha，tgf-α)、转化生长因子β(transforminggrowthfactorbeta，tgf-β))和肿瘤坏死因子-α(tnf-α)。在一个实施方案中，“生长因子”是肽或蛋白质生长因子。[0635]术语“蛋白酶抑制剂”是指抑制蛋白酶功能的分子，特别是肽或蛋白质。蛋白酶抑制剂可通过被抑制的蛋白酶(例如，天冬氨酸蛋白酶抑制剂)或通过其作用机制(例如，自杀抑制剂，例如丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin))进行分类。蛋白酶抑制剂的一些具体实例包括丝氨酸蛋白酶抑制剂，例如α1-抗胰蛋白酶、抑肽酶和苯丁抑制素(bestatin)。[0636]术语“酶”是指加速化学反应的大分子生物催化剂。像任何催化剂一样，酶在其催化的反应中不被消耗，并且不改变所述反应的平衡。与许多另一些催化剂不同，酶的特异性要高得多。在一个实施方案中，酶对于对象的稳态是必不可少的，例如，酶的任何功能障碍(特别是活性降低，其可由突变、缺失或产生降低中的任一者引起)均导致疾病。酶的一些实例包括单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(herpessimplexvirustype1thymidinekinase，hsv1-tk)、己糖胺酶、苯丙氨酸羟化酶、假胆碱酯酶和乳糖酶。[0637]术语“受体”是指从细胞外接收信号(特别是称为配体的化学信号)的蛋白质分子。信号(例如配体)与受体的结合引起细胞的一些类型的响应，例如激酶的细胞内激活。受体包括跨膜受体(例如离子通道连接(离子移变)受体、g蛋白连接(代谢)受体和酶连接受体)以及胞内受体(例如胞质受体和核受体)。受体的一些具体实例包括类固醇激素受体、生长因子受体和肽受体(即，其配体为肽的受体)，例如p-选择素糖蛋白配体-1(p-selectinglycoproteinligand-1，psgl-1)。术语“生长因子受体”是指与生长因子结合的受体。[0638]术语“凋亡调节剂”是指调节凋亡的分子，特别是肽或蛋白质，即激活或抑制凋亡的分子。凋亡调节剂可分为两大类：调节线粒体功能的那些和调节胱天蛋白酶的那些。第一类包括用于通过阻止线粒体膜电位的损失和/或促凋亡蛋白质(例如细胞色素c)释放到胞质溶胶中来维持线粒体完整性的蛋白质(例如，bcl-2、bcl-xl)。促进细胞色素c释放的促凋亡蛋白(例如，bax、bak、bim)也属于第一类。第二类包括这样的蛋白质，例如凋亡蛋白抑制剂(例如，xiap)或flip，其阻断胱天蛋白酶的激活。[0639]术语“转录因子”涉及调节遗传信息从dna转录到信使rna的速率的蛋白质，特别是通过与特定dna序列结合来进行。转录因子可在整个生命中调节细胞分裂、细胞生长和细胞死亡；在胚胎发育期间调节细胞迁移和组织；和/或响应于来自细胞外的信号(例如激素)。转录因子包含至少一个与特定dna序列结合的dna结合结构域，通常与受转录因子调节的基因相邻。转录因子的一些具体实例包括mecp2、foxp2、foxp3、stat蛋白家族和hox蛋白家族。[0640]术语“肿瘤抑制蛋白”涉及保护细胞免于致癌途径上的一个步骤的分子，特别是肽或蛋白质。肿瘤抑制蛋白(通常由相应的肿瘤抑制基因编码)在调节细胞周期方面表现出弱化或抑制作用和/或促进凋亡。其功能可能是以下中的一种或更多种：抑制持续细胞周期所必需的基因；使细胞周期与dna损伤关联(只要细胞中存在受损的dna，就不应发生细胞分裂)；如果受损的dna无法修复，则启动凋亡；转移抑制(例如，阻止肿瘤细胞扩散，阻断接触抑制的损失以及抑制转移)；以及dna修复。肿瘤抑制蛋白的一些具体实例包括p53、磷酸酶和张力蛋白同源物(pten)、swi/snf(switch/不可发酵蔗糖)(switch/sucrosenon-fermentable)、vonhippel–lindau肿瘤抑制物(pvhl)、腺瘤性结肠息肉病(adenomatouspolyposiscoli，apc)、cd95、肿瘤发生抑制蛋白5(suppressionoftumorigenicity5，st5)、肿瘤发生抑制蛋白5(st5)、肿瘤发生抑制蛋白14(st14)和yippee样3(yippee-like，ypel3)。[0641]术语“结构蛋白”是指赋予原本为流体的生物组分以硬度和刚性的蛋白质。结构蛋白主要是纤维状的(例如胶原蛋白和弹性蛋白)，但也可以是球形的(例如肌动蛋白和微管蛋白)。通常而言，球形蛋白作为单体溶解，但是聚合以形成例如可以构成细胞骨架的长纤维。另一些结构蛋白是能够产生机械力的运动蛋白(例如肌球蛋白、驱动蛋白和动力蛋白)以及表面活性蛋白。结构蛋白的一些具体实例包括胶原蛋白、表面活性蛋白a、表面活性蛋白b、表面活性蛋白c、表面活性蛋白d、弹性蛋白、微管蛋白、肌动蛋白和肌球蛋白。[0642]术语“重编程因子”或“重编程转录因子”涉及这样的分子，特别是肽或蛋白质，当其在体细胞中表达(任选地与另一些试剂例如另一些重编程因子一起)时，导致所述体细胞重编程或去分化成具有干细胞特征，特别是多能性的细胞。重编程因子的一些具体实例包括oct4、sox2、c-myc、klf4、lin28和nanog。[0643]术语“基因组工程蛋白”涉及能够插入、缺失或替换对象基因组中dna的蛋白质。基因组工程蛋白的一些具体实例包括兆核酸酶、锌指核酸酶(zincfingernuclease，zfn)、转录激活因子样效应子核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornuclease，talen)和成簇规则间隔的短回文重复序列-crispr相关蛋白9(crispr-cas9)。[0644]术语“血液蛋白质”涉及存在于对象的血浆中，特别是健康对象的血浆中的肽或蛋白质。血液蛋白具有多种功能，例如运输(例如，白蛋白、转铁蛋白)、酶活性(例如，凝血酶或铜蓝蛋白)、血液凝固(例如，纤维蛋白原)、针对病原体的防御(例如，补体组分和免疫球蛋白)、蛋白酶抑制剂(例如，α1-抗胰蛋白酶)等。血液蛋白的一些具体实例包括凝血酶、血清白蛋白、因子vii、因子viii、胰岛素、因子ix、因子x、组织纤溶酶原激活剂、蛋白c、冯·维勒布兰德因子(vonwillebrandfactor)、抗凝血酶iii、葡糖脑苷脂酶、促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、经修饰因子viii和抗凝剂。[0645]因此，在一个实施方案中，药物活性肽或蛋白质是(i)细胞因子，优选选自促红细胞生成素(epo)、白介素4(il-2)和白介素10(il-11)，更优选epo；(ii)黏附分子，特别是整联蛋白；(iii)免疫球蛋白，特别是抗体；(iv)免疫活性化合物，特别是抗原；(v)激素，特别是升压素、胰岛素或生长激素；(vi)生长因子，特别是vegfa；(vii)蛋白酶抑制剂，特别是α1-抗胰蛋白酶；(viii)酶，优选选自单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(hsv1-tk)、己糖胺酶、苯丙氨酸羟化酶、假胆碱酯酶、胰酶和乳糖酶；(ix)受体，特别是生长因子受体；(x)凋亡调节剂，特别是bax；(xi)转录因子，特别是foxp3；(xii)肿瘤抑制蛋白，特别是p53；(xiii)结构蛋白，特别是表面活性蛋白b；(xiv)重编程因子，例如，选自oct4、sox2、c-myc、klf4、lin28和nanog；(xv)基因组工程蛋白，特别是成簇规则间隔的短回文重复序列-crispr相关蛋白9(crispr-cas9)；以及(xvi)血液蛋白，特别是纤维蛋白原。[0646]在一个实施方案中，药物活性肽或蛋白质包含一种或更多种抗原或者一种或更多种表位，即向对象施用所述肽或蛋白质在对象中引发针对所述一种或更多种抗原或者一种或更多种表位的免疫应答，其可以是治疗性的或者部分或完全保护性的。[0647]在某些实施方案中，mrna编码至少一个表位。[0648]在某些实施方案中，表位来源于肿瘤抗原。肿瘤抗原可以是“标准”抗原，通常已知其在多种癌症中表达。肿瘤抗原也可以是“新抗原”，其是个体的肿瘤所特有的，并且之前未被免疫系统识别。新抗原或新表位可以由癌细胞基因组中导致氨基酸变化的一个或更多个癌症特异性突变引起。肿瘤抗原的一些实例包括但不限于p53，art-4，bage，β-联蛋白/m，bcr-ablcamel，cap-1，casp-8，cdc27/m，cdk4/m，cea，密封蛋白家族的细胞表面蛋白例如密封蛋白-6、密封蛋白-18.2和密封蛋白-12，c-myc，ct，cyp-b，dam，elf2m，etv6-aml1，g250，gage，gnt-v，gap100，hage，her-2/neu，hpv-e7，hpv-e6，hast-2，htert(或htrt)，lage，ldlr/fut，mage-a优选mage-a1、mage-a2、mage-a3、mage-a4、mage-a5、mage-a6、mage-a7、mage-a8、mage-a9、mage-a10、mage-a11、或mage-a12、mage-b、mage-c，mart-1/melan-a，mc1r，肌球蛋白/m，muc1，mum-1，mum-2，mum-3，na88-a，nf1，ny-eso-1，ny-br-1，pl90minorbcr-abl，pml/rara，prame，蛋白酶3，psa，psm，rage，ru1或ru2，sage，sart-1或sart-3，scgb3a2，scp1，scp2，scp3，ssx，存活蛋白，tel/aml1，tpi/m，trp-1，trp-2，trp-2/int2，tpte，wt和wt-1。[0649]癌症突变随每个个体而异。因此，编码新的表位(新表位)的癌症突变在疫苗组合物和免疫治疗的开发中代表有吸引力的靶标。肿瘤免疫治疗的效力取决于能够在宿主内诱导强效免疫应答的癌症特异性抗原和表位的选择。rna可用于将患者特异性肿瘤表位递送至患者。驻留在脾中的树突细胞(dc)代表对免疫原性表位或抗原(例如肿瘤表位)的rna表达特别感兴趣的抗原呈递细胞。已表明，多表位的使用促进肿瘤疫苗组合物的治疗效力。肿瘤突变组的快速测序可为个体化疫苗提供多个表位，其可以由本文中所述的rna编码，例如作为单一多肽，其中表位任选地被接头分开。在本公开内容的某些实施方案中，mrna编码至少一个表位、至少两个表位、至少三个表位、至少四个表位、至少五个表位、至少六个表位、至少七个表位、至少八个表位、至少九个表位或至少十个表位。一些示例性的实施方案包括编码至少五个表位(称为“五表位(pentatope)”)的mrna和编码至少十个表位(称为“十表位(decatope)”)的mrna。[0650]在某些实施方案中，表位来源于病原体相关抗原，特别是来源于病毒抗原。在一个实施方案中，表位来源于sars-cov-2s蛋白、其免疫原性变体、或者sars-cov-2s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段。因此，在一个实施方案中，本公开内容中使用的mrna编码包含sars-cov-2s蛋白、其免疫原性变体或者sars-cov-2s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列。[0651]在本公开内容的一个实施方案中，抗原(例如肿瘤抗原或疫苗抗原)优选以在进入施用rna的对象的细胞时翻译成相应的蛋白质之单链5’加帽的mrna进行施用。优选地，rna包含针对rna在稳定性和翻译效率方面的最大效力而优化的结构元件(5’帽、5’utr、3’utr、poly(a)序列)。[0652]在一个实施方案中，β-s-arca(d1)用作mrna5’端的特定加帽结构。在一个实施方案中，m27，3’‑ogppp(m12’‑o)apg用作mrna5’端处的特定加帽结构。在一个实施方案中，5’‑utr序列来源于人α-珠蛋白mrna并且任选地具有优化的“kozak序列”以提高翻译效率。在一个实施方案中，将来源于“氨基末端分裂增强子”(aminoterminalenhancerofsplit，aes)mrna(称为f)和线粒体编码的12s核糖体rna(称为i)的两个序列元件(fi元件)的组合置于编码序列与poly(a)序列之间以确保更高的最大蛋白质水平和mrna的延长的持久性。在一个实施方案中，将来源于人β-珠蛋白mrna的两个重复的3’‑utr置于编码序列与poly(a)序列之间，以确保更高的最大蛋白质水平和mrna的延长的持久性。在一个实施方案中，使用测量长度为110个核苷酸的poly(a)序列，其由以下组成：30个腺苷残基区段，随后是10个核苷酸接头序列和另外70个腺苷残基。这种poly(a)序列被设计成用于增强rna稳定性和翻译效率。[0653]在一个实施方案中，编码抗原(例如肿瘤抗原或疫苗抗原)的mrna在所治疗对象的细胞中表达以提供抗原。在一个实施方案中，mrna在对象的细胞中瞬时表达。在一个实施方案中，mrna在体外转录。在一个实施方案中，抗原的表达在细胞表面。在一个实施方案中，抗原在mhc的背景下表达和呈递。在一个实施方案中，抗原的表达进入胞外空间，即抗原是分泌的。[0654]抗原分子或其加工产物(例如，其片段)可以与抗原受体(例如由免疫效应细胞携带的bcr或tcr)结合或者与抗体结合。[0655]通过施用编码肽和蛋白质抗原的mrna而向根据本公开内容的对象提供的肽和蛋白质抗原(其中所述抗原是疫苗抗原)优选导致在被提供肽或蛋白质抗原的对象中诱导免疫应答，例如体液和/或细胞免疫应答。所述免疫应答优选针对靶抗原。因此，疫苗抗原可包含靶抗原、其变体，或者其片段。在一个实施方案中，这样的片段或变体在免疫学上与靶抗原等同。在本公开内容的上下文中，术语“抗原的片段”或“抗原的变体”意指导致诱导免疫应答的试剂，所述免疫应答靶向该抗原(即靶抗原)。因此，疫苗抗原可对应于或可包含靶抗原，可对应于或可包含靶抗原的片段，或者可对应于或可包含与靶抗原或其片段同源的抗原。因此，根据本公开内容，疫苗抗原可包含靶抗原的免疫原性片段或与靶抗原的免疫原性片段同源的氨基酸序列。根据本公开内容的“抗原的免疫原性片段”优选地涉及能够诱导针对靶抗原的免疫应答的抗原片段。疫苗抗原可以是重组抗原。[0656]术语“免疫学上等同的”意指免疫学上等同的分子，例如免疫学上等同的氨基酸序列表现出相同或基本上相同的免疫特性和/或发挥相同或基本上相同的免疫学作用，例如对于免疫学作用类型而言。在本公开内容的上下文中，术语“免疫学上等同的”优选地关于用于免疫接种的抗原或抗原变体的免疫学作用或特性使用。例如，如果氨基酸序列在暴露于对象的免疫系统时诱导具有与参考氨基酸序列反应的特异性的免疫反应，则所述氨基酸序列与该参考氨基酸序列在免疫学上等同。[0657]在一个实施方案中，本公开内容中使用的mrna是非免疫原性的。编码免疫刺激剂的rna可根据本公开内容施用以提供佐剂作用。编码免疫刺激剂的rna可以是标准rna或非免疫原性rna。[0658]本文中使用的术语“非免疫原性rna”(例如“非免疫原性mrna”)是指在向例如哺乳动物施用时不诱导通过免疫系统的应答的rna，或相比于由相同rna(不同之处仅在于其没有经受使非免疫原性rna无免疫原性的修饰和处理)诱导，即相比于由标准rna(standardrna，stdrna)所诱导的应答，诱导更弱的应答的rna。在一个优选实施方案中，通过将抑制rna介导的固有免疫受体激活的经修饰核苷并入到rna中并除去双链rna(double-strandedrna，dsrna)使非免疫原性rna(本文中也称为经修饰rna(modifiedrna，modrna))无免疫原性。[0659]为了通过并入经修饰核苷而使得非免疫原性的rna(尤其是mrna)成为非免疫原性的，可使用任何经修饰核苷，只要其降低或抑制rna的免疫原性即可。特别优选的是抑制rna介导的固有免疫受体激活的经修饰核苷。在一个实施方案中，经修饰核苷包含用包含经修饰核碱基的核苷对一个或更多个尿苷的替换。在一个实施方案中，经修饰核碱基是经修饰尿嘧啶。在一个实施方案中，包含经修饰核碱基的核苷选自3-甲基尿苷(m3u)、5-甲氧基-尿苷(mo5u)、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷(s2u)、4-硫代-尿苷(s4u)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho5u)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤代-尿苷(例如，5-碘代-尿苷或5-溴代-尿苷)、尿苷5-羟乙酸(cmo5u)、尿苷5-羟乙酸甲酯(mcmo5u)、5-羧甲基-尿苷(cm5u)、1-羧甲基-假尿苷、5-羧基羟甲基-尿苷(chm5u)、5-羧基羟甲基-尿苷甲酯(mchm5u)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm5u)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm5s2u)、5-氨甲基-2-硫代-尿苷(nm5s2u)、5-甲基氨甲基-尿苷(mnm5u)、1-乙基-假尿苷、5-甲基氨甲基-2-硫代-尿苷(mnm5s2u)、5-甲基氨甲基-2-硒代-尿苷(mnm5se2u)、5-氨甲酰基甲基-尿苷(ncm5u)、5-羧甲基氨甲基-尿苷(cmnm5u)、5-羧甲基氨甲基-2-硫代-尿苷(cmnm5s2u)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(τm5u)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷(τm5s2u)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷)、5-甲基-2-硫代-尿苷(m5s2u)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮杂-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮杂-假尿苷、二氢尿苷(d)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m5d)、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、n1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp3u)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨甲基)尿苷(inm5u)、5-(异戊烯基氨甲基)-2-硫代-尿苷(inm5s2u)、α-硫代-尿苷、2’‑o-甲基-尿苷(um)、5,2’‑o-二甲基-尿苷(m5um)、2’‑o-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫代-2’‑o-甲基-尿苷(s2um)、5-甲氧基羰基甲基-2’‑o-甲基-尿苷(mcm5um)、5-氨甲酰基甲基-2’‑o-甲基-尿苷(ncm5um)、5-羧甲基氨甲基-2’‑o-甲基-尿苷(cmnm5um)、3,2’‑o-二甲基-尿苷(m3um)、5-(异戊烯基氨甲基)-2’‑o-甲基-尿苷(inm5um)、1-硫代-尿苷、脱氧胸苷、2’‑f-阿糖-尿苷、2’‑f-尿苷、2’‑oh-阿糖-尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷以及5-[3-(1-e-丙烯基氨基)尿苷。在一个特别优选的实施方案中，包含经修饰核碱基的核苷是假尿苷(ψ)、n1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5u)，特别是n1-甲基-假尿苷。[0660]在一个实施方案中，用包含经修饰核碱基的核苷替换一个或更多个尿苷包括替换至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少75％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的尿苷。[0661]在使用t7rna聚合酶通过体外转录(ivt)合成mrna期间，由于该酶的非常规活性产生了大量异常产物，包括双链rna(dsrna)。dsrna诱导炎性细胞因子并激活效应酶，导致蛋白质合成抑制。可以例如使用非多孔或多孔c-18聚苯乙烯-二乙烯基苯(polystyrene-divinylbenzene，ps-dvb)基质通过离子对反相hplc，将dsrna从rna(例如ivtrna)中去除。或者，可使用基于酶的方法，其使用特异性水解dsrna而非水解ssrna的大肠杆菌rnaseiii，从而从ivtrna制备物中消除dsrna污染物。此外，可通过使用纤维素材料将dsrna与ssrna分离。在一个实施方案中，使rna制备物与纤维素材料接触，并且在允许dsrna与纤维素材料结合并且不允许ssrna与纤维素材料结合的条件下使ssrna从纤维素材料中分离。用于提供ssrna的合适方法在例如wo2017/182524中公开。[0662]本文中使用的术语“去除”是指将第一物质群体(例如非免疫原性rna)的特征与第二物质群体(例如dsrna)的邻近区域分离，其中第一物质群体不一定缺少第二物质，并且第二物质群体不一定缺少第一物质。然而，与第一物质和第二物质的未分离混合物相比，以去除第二物质群体为特征的第一物质群体具有可测量的较低的第二物质含量。[0663]在一个实施方案中，从非免疫原性rna中去除dsrna(特别是mrna)包括去除dsrna，使得非免疫原性rna组合物中少于10％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％、少于1％、少于0.5％、少于0.3％或少于0.1％的rna是dsrna。在一个实施方案中，非免疫原性rna(特别是mrna)不含或基本上不含dsrna。在一些实施方案中，非免疫原性rna(特别是mrna)组合物包含单链核苷经修饰rna的纯化制备物。例如，在一些实施方案中，单链核苷经修饰rna(特别是mrna)的纯化制备物基本上不含双链rna(dsrna)。在一些实施方案中，相对于所有其他核酸分子(dna、dsrna等)，经纯化的制备物是至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少99.9％的单链核苷经修饰rna。[0664]在一个实施方案中，非免疫原性rna(特别是mrna)在细胞中的翻译比具有相同序列的标准rna更有效。在一个实施方案中，翻译相对于其未经修饰的对应物增强了2倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了3倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了4倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了5倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了6倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了7倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了8倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了9倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了10倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了15倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了20倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了50倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了100倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了200倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了500倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了1000倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了2000倍因数。在一个实施方案中，因数是10至1000倍。在一个实施方案中，因数是10至100倍。在一个实施方案中，因数是10至200倍。在一个实施方案中，因数是10至300倍。在一个实施方案中，因数是10至500倍。在一个实施方案中，因数是20至1000倍。在一个实施方案中，因数是30至1000倍。在一个实施方案中，因数是50至1000倍。在一个实施方案中，因数是100至1000倍。在一个实施方案中，因数是200至1000倍。在一个实施方案中，翻译增强了任何其他显著的量或量的范围。[0665]在一个实施方案中，非免疫原性rna(特别是mrna)表现出比具有相同序列的标准rna显著更少的固有免疫原性。在一个实施方案中，非免疫原性rna(特别是mrna)表现出是其未经修饰的对应物2倍少的固有免疫应答。在一个实施方案中，固有免疫原性降低了3倍因数。在一个实施方案中，固有免疫原性降低了4倍因数。在一个实施方案中，固有免疫原性降低了5倍因数。在一个实施方案中，固有免疫原性降低了6倍因数。在一个实施方案中，固有免疫原性降低了7倍因数。在一个实施方案中，固有免疫原性降低了8倍因数。在一个实施方案中，固有免疫原性降低了9倍因数。在一个实施方案中，固有免疫原性降低了10倍因数。在一个实施方案中，固有免疫原性降低了15倍因数。在一个实施方案中，固有免疫原性降低了20倍因数。在一个实施方案中，固有免疫原性降低了50倍因数。在一个实施方案中，固有免疫原性降低了100倍因数。在一个实施方案中，固有免疫原性降低了200倍因数。在一个实施方案中，固有免疫原性降低了500倍因数。在一个实施方案中，固有免疫原性降低了1000倍因数。在一个实施方案中，固有免疫原性降低了2000倍因数。[0666]术语“表现出显著更少的固有免疫原性”是指固有免疫原性的可检测的降低。在一个实施方案中，该术语是指降低使得可施用有效量的非免疫原性rna(特别是mrna)，而不触发可检测的固有免疫应答。在一个实施方案中，该术语是指降低使得可重复施用非免疫原性rna(特别是mrna)，而不引起足以可检测地降低由非免疫原性rna编码的蛋白质的产生的固有免疫应答。在一个实施方案中，该降低使得可重复施用非免疫原性rna(特别是mrna)，而不引起足以消除由非免疫原性rna编码的蛋白质的可检测地产生的固有免疫应答。[0667]“免疫原性”是外来物质(例如rna)在人或另一些动物身体中引发免疫应答的能力。固有免疫系统是免疫系统中相对非特异性和即时性的组成部分。其与适应性免疫系统一起，是脊椎动物免疫系统的两个主要组分之一。[0668]本文中使用的“内源性”是指来自或产生于生物体、细胞、组织或系统内部的任何物质。[0669]本文中使用的术语“外源性”是指从生物体、细胞、组织或系统外部引入或产生的任何物质。[0670]本文中使用的术语“表达”定义为特定核苷酸序列的转录和/或翻译。[0671]本文中使用的术语“连接的”、“融合的”或“融合/融合体”可互换使用。这些术语是指将两个或更多个要素或组分或结构域连接在一起。[0672]颗粒[0673]先前已描述了不同类型的包含rna的颗粒适合于以颗粒形式递送rna(参见，例如，kaczmarek,j.c.etal.,2017,genomemedicine9,60)。对于非病毒rna递送载剂，rna的纳米粒包封物理地保护rna免于降解，并且根据特定的化学性质，可协助细胞摄取和内体逃逸。[0674]带正电荷的分子(例如聚合物和脂质)与带负电荷的核酸之间的静电相互作用参与颗粒形成。这导致核酸颗粒的复合和自发形成。[0675]在本公开内容的上下文中，术语“颗粒”涉及由分子或分子复合物(特别是颗粒形成化合物)形成的结构化实体。优选地，颗粒包含由一种或更多种类型的两亲性物质(例如，两亲性脂质、两亲性聚合物和/或两亲性蛋白质/多肽)制成的包膜(例如，一层或更多层或薄层)。在本文中，表述“两亲性物质”意指物质具有亲水性和亲脂性特性二者。包膜还可包含不具有两亲性的另外的物质(例如，另外的脂质和/或另外的聚合物)。因此，颗粒可以是单层或多层结构，其中构成一层或更多层或薄层的物质包含一种或更多种类型的两亲性物质(特别是选自两亲性脂质、两亲性聚合物和/或两亲性蛋白质/多肽)，任选地与不具有两亲性的另外的物质(例如另外的脂质和/或另外的聚合物)组合。在一个实施方案中，术语“颗粒”涉及微米或纳米尺寸的结构，例如微米或纳米尺寸的密实结构。在该方面中，术语“微米尺寸”意指颗粒的所有三种外部尺寸均是微米级的，即为1至5μm。根据本公开内容，术语“颗粒”包括脂质复合物颗粒(lipoplexparticle，lpx)、脂质纳米粒(lnp)、聚合复合物颗粒(polyplexparticle)、脂质聚合复合物颗粒(lipopolyplexparticle)、病毒样颗粒(virus-likeparticle，vlp)及其混合物(例如，两种或更多种颗粒类型的混合物，例如lpx与vlp的混合物或lnp与vlp的混合物)。[0676]“核酸颗粒”可用于将核酸递送至目的靶位点(例如，细胞、组织、器官等)。核酸颗粒可以由至少一种阳离子或阳离子可电离脂质或类脂质物质、至少一种阳离子聚合物例如鱼精蛋白或其混合物以及核酸形成。核酸颗粒包括基于脂质纳米粒(lnp)的制剂和基于脂质复合物(lpx)的制剂。[0677]不旨在受任何理论的束缚，认为阳离子的或阳离子可电离的脂质或类脂质物质和/或阳离子聚合物与核酸结合在一起形成聚集体，并且该聚集体产生胶体稳定的颗粒。[0678]在一个实施方案中，除阳离子可电离脂质之外，本文中所述的颗粒还包含至少一种脂质或类脂质物质。[0679]在一些实施方案中，核酸颗粒(特别是mrna颗粒例如mrnalnp)包含多于一种类型的核酸分子，其中核酸分子的分子参数可彼此类似或不同，如关于摩尔质量或基本结构元素，例如分子结构、加帽、编码区或其他特征。[0680]如在本公开内容中使用的，“纳米粒”是指包含如本文中所述的核酸(特别是mrna)和至少一种阳离子脂质的颗粒，其中颗粒的所有三种外部尺寸均是纳米级的，即至少约1nm且低于约1000nm(优选地，10至990nm，例如15至900nm、20至800nm、30至700nm、40至600nm、或50至500nm)。优选地，最长轴和最短轴没有明显不同。优选地，颗粒的尺寸是其直径。[0681]本文中所述的核酸颗粒(特别是mrna颗粒，例如mrnalnp)可表现出多分散性指数(polydispersityindex，pdi)小于约0.5、小于约0.4、小于约0.3、小于约0.2、小于约0.1或小于约0.05。举例来说，核酸颗粒可表现出多分散性指数为约0.01至约0.4或约0.1至约0.3。[0682]在本公开内容的上下文中，术语“脂质复合物颗粒”涉及包含两亲性脂质(特别是阳离子两亲性脂质)和本文中所述核酸(特别是mrna)的颗粒。带正电荷的脂质体(由一种或更多种两亲性脂质，特别是阳离子两亲性脂质制成)与带负电荷的核酸(特别是mrna)之间的静电相互作用导致核酸脂质复合物颗粒的复合和自发形成。带正电荷的脂质体通常可以使用阳离子两亲性脂质(例如dotma)和另外的脂质(例如dope)来合成。在一个实施方案中，核酸(特别是mrna)脂质复合物颗粒是纳米粒。[0683]术语“脂质纳米粒”涉及纳米尺寸的含有脂质的颗粒。[0684]在本公开内容的上下文中，术语“聚合复合物颗粒”涉及包含两亲性聚合物(特别是阳离子两亲性聚合物)和如本文中所述核酸(特别是mrna)的颗粒。带正电荷的阳离子两亲性聚合物与带负电荷的核酸(特别是mrna)之间的静电相互作用导致核酸聚合复合物颗粒的复合和自发形成。适合于制备聚合复合物颗粒的带正电荷的两亲性聚合物包括鱼精蛋白、聚乙烯亚胺、聚-l-赖氨酸、聚-l-精氨酸和组蛋白。在一个实施方案中，核酸(特别是mrna)聚合复合物颗粒是纳米粒。[0685]术语“脂质聚合复合物颗粒”涉及包含如本文中所述的两亲性脂质(特别是阳离子两亲性脂质)、如本文中所述的两亲性聚合物(特别是阳离子两亲性聚合物)以及如本文中所述的核酸(特别是mrna)的颗粒。在一个实施方案中，核酸(特别是mrna)脂质聚合复合物颗粒是纳米粒。[0686]术语“病毒样颗粒”(本文中缩写为vlp)是指非常类似于病毒但其不包含所述病毒的任何遗传物质并因此是非感染性的分子。优选地，vlp包含如本文中所述的核酸(优选rna)，所述核酸(优选rna)对于vlp所源自的病毒是异源的。vlp可通过病毒结构蛋白的单独表达来合成，其然后可以自组装成病毒样结构。在一个实施方案中，来自不同病毒的结构衣壳蛋白的组合可用于产生重组vlp。vlp可由多种病毒家族的组分产生，所述病毒家族包括乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus，hbv)(小hbv来源表面抗原(hbsag))、细小病毒科(例如，腺相关病毒)、乳头瘤病毒科(例如，hpv)、逆转录病毒科(例如，hiv)、黄病毒科(例如，丙型肝炎病毒)以及噬菌体(例如，qβ、ap205)。[0687]术语“含有核酸的颗粒”涉及与核酸(特别是mrna)结合的如本文中所述的颗粒。在该方面中，核酸(特别是mrna)可黏附至颗粒的外表面(表面核酸(特别是表面mrna))和/或可包含在颗粒中(包封的核酸(特别是包封的mrna))。[0688]在一个实施方案中，在本公开内容的方法和用途中使用的颗粒的尺寸(优选直径，即半径加倍例如回转半径(rg)值加倍或流体动力学半径加倍)为约10至约2000nm，例如至少约15nm(优选至少约20nm、至少约25nm、至少约30nm、至少约35nm、至少约40nm、至少约45nm、至少约50nm、至少约55nm、至少约60nm、至少约65nm、至少约70nm、至少约75nm、至少约80nm、至少约85nm、至少约90nm、至少约95nm或至少约100nm)和/或至多1900nm(优选至多约1900nm、至多约1800nm、至多约1700nm、至多约1600nm、至多约1500nm、至多约1400nm、至多约1300nm、至多约1200nm、至多约1100nm、至多约1000nm、至多约950nm、至多约900nm、至多约850nm、至多约800nm、至多约750nm、至多约700nm、至多约650nm、至多约600nm、至多约550nm或至多约500nm)，优选为约20至约1500nm，例如约30至约1200nm、约40至约1100nm、约50至约1000nm、约60至约900nm、约70至800nm、约80至700nm、约90至600nm或约50至500nm或约100至500nm，例如为10至1000nm、15至500nm、20至450nm、25至400nm、30至350nm、40至300nm、50至250nm、60至200nm或70至150nm。[0689]关于rna脂质颗粒(特别是mrna颗粒例如mrnalnp)，n/p比率给出了脂质中氮基团与rna中磷酸基团数目的比率。其与电荷比相关，因为氮原子(取决于ph)通常带正电荷，而磷酸基团带负电荷。存在电荷平衡的n/p比率取决于ph。脂质制剂通常以大于4，高达12的n/p比率形成，因为认为带正电荷的纳米粒有利于转染。在这种情况下，认为rna与纳米粒完全结合。[0690]本文中所述的核酸颗粒(特别是mrna颗粒，例如mrnalnp)可使用广泛范围的方法制备，所述方法可涉及从至少一种阳离子或阳离子可电离的脂质和/或至少一种阳离子聚合物获得胶体，并将所述胶体与核酸混合以获得核酸颗粒。[0691]本文中使用的术语“胶体”涉及其中分散的颗粒不沉降的均匀混合物类型。混合物中的不溶性颗粒是微观的，颗粒尺寸为1至1000纳米。该混合物可称为胶体或胶体混悬液。有时，术语“胶体”仅指混合物中的颗粒，而不是整个混悬液。[0692]对于包含至少一种阳离子的或阳离子可电离的脂质和/或至少一种阳离子聚合物的胶体的制备，在本文中可应用常规用于制备脂质体囊泡并适当地进行调整的方法。最常用的用于制备脂质体囊泡的方法共有以下基本阶段：(i)脂质在有机溶剂中的溶解，(ii)将所得溶液干燥，以及(iii)将干燥脂质水合(使用多种水性介质)。[0693]在膜水合法中，首先将脂质溶解在合适的有机溶剂中，并完全干燥(drydown)以在烧瓶底部产生薄膜。使用适当的水性介质将获得的脂质膜水合以产生脂质体分散体。此外，可包括另外的缩减(downsizing)步骤。[0694]反相蒸发是用于制备脂质体囊泡的膜水合的替代方法，其涉及在水相与含有脂质的有机相之间形成油包水乳液。体系均质化需要对该混合物进行简短的声处理。在减压下除去有机相产生乳状凝胶，其随后变成脂质体混悬液。[0695]术语“乙醇注射技术”是指其中通过针将包含脂质的乙醇溶液快速注射到水溶液中的过程。该作用将脂质分散在整个溶液中并促进脂质结构形成，例如脂质囊泡形成例如脂质体形成。通常而言，本文中所述的核酸(特别是mrna)脂质复合物颗粒可通过将核酸(特别是mrna)添加至胶体脂质体分散体来获得。在一个实施方案中，使用乙醇注射技术，如下形成这样的胶体脂质体分散体：在搅拌下将包含脂质(例如阳离子脂质(如dotma)和另外的脂质)的乙醇溶液注射到水溶液中。在一个实施方案中，本文中所述的核酸(特别是mrna)脂质复合物颗粒无需挤出步骤即可获得。[0696]术语“挤出”及其变化形式是指产生具有固定的截面轮廓的颗粒。特别地，其是指颗粒的缩减，由此迫使颗粒通过具有限定孔的过滤器。[0697]根据本公开内容，也可使用具有无有机溶剂特征的另一些方法来制备胶体。[0698]lnp通常包含四种组分：可电离的阳离子脂质、中性脂质例如磷脂、类固醇例如胆固醇以及聚合物缀合的脂质。每种组分均负责有效载荷保护，并实现有效的胞内递送。可通过将溶解在乙醇中的脂质与核酸在水性缓冲液中迅速混合来制备lnp。[0699]先前已描述了不同类型的包含核酸的颗粒适合于以颗粒形式递送核酸(参见，例如，kaczmarek,j.c.etal.,2017,genomemedicine9,60)。对于非病毒核酸递送载剂，核酸的纳米粒包封物理地保护核酸免于降解，并且根据特定的化学性质，可有助于细胞摄取和内体逃逸。[0700]在一个优选实施方案中，本文中所述的包含mrna和至少一种阳离子可电离脂质的lnp还包含一种或更多种另外的脂质。[0701]在一个实施方案中，本文中所述的包含mrna和至少一种阳离子可电离脂质的lnp通过以下进行制备：(a)制备包含水和缓冲系统的mrna溶液；(b)制备包含阳离子可电离脂质和(如果有的话)一种或更多种另外的脂质的乙醇溶液；以及(c)将在(a)中制备的mrna溶液与在(b)中制备的乙醇溶液混合，从而制备包含lnp的制剂。在步骤(c)之后，可以接着进行一个或更多个选自稀释和过滤(例如切向流过滤)的步骤。[0702]在一个替代实施方案中，本文中所述的包含mrna和至少一种阳离子可电离脂质的lnp通过以下进行制备：(a’)制备阳离子可电离脂质和(如果有的话)一种或更多种另外的脂质在水相中的脂质体或胶体制备物；和(b’)制备包含水和缓冲系统的mrna溶液；以及(c’)将在(a’)中制备的脂质体或胶体制备物与在(b’)中制备的mrna溶液混合。在步骤(c’)之后，可以接着进行一个或更多个选自稀释和过滤(例如切向流过滤)的步骤。[0703]本公开内容描述了包含mrna(尤其是包含mrna的lnp)和至少一种与mrna缔合以形成核酸颗粒的阳离子可电离脂质的颗粒以及包含这样的颗粒的组合物。mrna颗粒可包含通过非共价相互作用以不同形式与颗粒复合的mrna。本文中所述的颗粒不是病毒颗粒，特别不是感染性的病毒颗粒，即它们不能病毒性地感染细胞。[0704]合适的阳离子可电离脂质是形成核酸颗粒的那些，并且包含在术语“颗粒形成组分”或“颗粒形成剂”中。术语“颗粒形成组分”或“颗粒形成剂”涉及与核酸缔合以形成核酸颗粒的任何组分。这样的组分包括可以是核酸颗粒一部分的任何组分。[0705]阳离子可电离脂质[0706]本文中所述的核酸颗粒包含至少一种阳离子可电离脂质作为颗粒形成剂。考虑用于本文的阳离子可电离脂质包括能够静电结合核酸的任何阳离子可电离脂质或类脂质物质。在一个实施方案中，考虑用于本文的阳离子可电离脂质可与核酸缔合，例如通过与核酸形成复合物或者形成其中围住或包封核酸的囊泡。[0707]如本文中使用的，“阳离子脂质”或“阳离子类脂质物质”是指具有净正电荷的脂质或类脂质物质。阳离子脂质或类脂质物质通过静电相互作用与带负电荷的核酸结合。通常而言，阳离子脂质具有亲脂性部分，例如固醇、酰基链、二酰基链或更多个酰基的链，并且脂质的头基通常带有正电荷。[0708]在某些实施方案中，阳离子脂质或类脂质物质仅在特定ph，特别是酸性ph下具有净正电荷，而在不同的优选更高的ph例如生理ph下，其优选不具有净正电荷，优选不具有电荷，即其是中性的。与在生理ph下保持阳离子的颗粒相比，这种可电离的行为被认为通过帮助内体逃逸和降低毒性来增强效力。[0709]如本文中使用的，“阳离子可电离脂质”是指具有净正电荷或中性的脂质或类脂质物质，即不是永久性阳离子的脂质。因此，取决于其中溶解阳离子可电离脂质的组合物的ph，阳离子可电离脂质是带正电荷的或中性的。[0710]在一个实施方案中，阳离子可电离脂质包含含有至少一个氮原子(n)的头基，所述氮原子带正电荷或者能够被质子化，优选在生理条件下。[0711]阳离子可电离脂质的一些实例公开于例如，wo2016/176330和wo2018/078053。在一些实施方案中，阳离子可电离脂质具有式(i)结构：[0712][0713]或其可药用盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：[0714]l1和l2中一者是-o(c＝o)-，-(c＝o)o-，-c(＝o)-，-o-，-s(o)x-，-s-s-，-c(＝o)s-，-sc(＝o)-，-nrac(＝o)-，-c(＝o)nra-，nrac(＝o)nra-，-oc(＝o)nra-或-nrac(＝o)o-，并且l1和l2中另一者是-o(c＝o)-，-(c＝o)o-，-c(＝o)-，-o-，-s(o)x-，-s-s-，-c(＝o)s-，sc(＝o)-，-nrac(＝o)-，-c(＝o)nra-，nrac(＝o)nra-，-oc(＝o)nra-或-nrac(＝o)o-或直接键；[0715]g1和g2各自独立地是未经取代的c1-c12亚烷基或c2-c12亚烯基；[0716]g3是c1-c24亚烷基、c2-c24亚烯基、c3-c8亚环烷基、c3-c8亚环烯基；[0717]ra是h或c1-c12烷基；[0718]r1和r2各自独立地是c6-c24烷基或c6-c24烯基；[0719]r3是h、or5、cn、-c(＝o)or4、-oc(＝o)r4或-nrsc(＝o)r4；[0720]r4是c1-c12烷基；[0721]r5是h或c1-c6烷基；并且[0722]x是0、1或2。[0723]在式(iii)之前述实施方案中的一些中，脂质具有以下结构(iiia)或(iiib)之一：[0724][0725]其中：[0726]a是3至8元的环烷基或亚环烷基；[0727]r6在每次出现时独立地是h、oh或c1-c24烷基；[0728]n是1至15的整数。[0729]在式(iii)之前述实施方案中的一些中，脂质具有结构(iiia)，并且在另一些实施方案中，脂质具有结构(iiib)。[0730]在式(i)的另一些实施方案中，脂质具有以下结构(ic)或(id)之一：[0731][0732]其中y和z各自独立地是1至12的整数。[0733]在式(i)之前述实施方案中的任一个中，l1和l2中一者是-o(c＝o)-。例如，在一些实施方案中，l1和l2各自均是-o(c＝o)-。在任意前述中的一些不同实施方案中，l1和l2各自独立地是-(c＝o)o-或-o(c＝o)-。例如，在一些实施方案中，l1和l2各自是-(c＝o)o-。[0734]在式(i)的一些不同实施方案中，脂质具有以下结构(ie)或(if)之一：[0735][0736]在式(i)之前述实施方案中的一些中，脂质具有以下结构(ig)、(ih)、(ij)或(ik)之一：[0737][0738]在式(i)之前述实施方案中的一些中，n是2至12的整数，例如2至8或2至4。例如，在一些实施方案中，n是3、4、5或6。在一些实施方案中，n是3。在一些实施方案中，n是4。在一些实施方案中，n是5。在一些实施方案中，n是6。[0739]在式(i)之前述实施方案中的另一些实施方案中，y和z各自独立地是2至10的整数。例如，在一些实施方案中，y和z各自独立地是4至9或4至6的整数。[0740]在式(i)前述实施方案中的一些中，r6是h。在前述实施方案中的另一些中，r6是c1-c24烷基。在另一些实施方案中，r6是oh。[0741]在式(i)的一些实施方案中，g3是未经取代的。在另一些实施方案中，g3是经取代的。在多个不同的实施方案中，g3是线性c1-c24亚烷基或线性c2-c24亚烯基。[0742]在式(i)的另一些前述实施方案中，r1或r2或二者均是c6至c24烯基。例如，在一些实施方案中，r1和r2各自独立地具有以下结构：[0743][0744]其中：[0745]r7a和r7b在每次出现时独立地是h或c1-c12烷基；并且[0746]a是2至12的整数，[0747]其中r7a、r7b和a各自选择成使得r1和r2各自独立地包含6至20个碳原子。例如，在一些实施方案中，a为5至9或8至12的整数。[0748]在式(i)前述实施方案中的一些中，r7a的至少一次出现是h。例如，在一些实施方案，r7a在每次出现时均是h。在前述中的另一些不同实施方案中，r7b的至少一次出现是c1-c8烷基。例如，在一些实施方案中，c1-c8烷基是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基或正辛基。[0749]在式(i)一些不同实施方案中，r1或r2或二者具有以下结构之一：[0750][0751]在式(i)之前述实施方案中的一些中，r3是oh、cn、-c(＝o)or4、-oc(＝o)r4或-nhc(＝o)r4。在一些实施方案中，r4是甲基或乙基。[0752]在多个不同的实施方案中，式(i)阳离子脂质具有下述结构之一。[0753]式(i)代表性化合物。[0754][0755][0756][0757][0758][0759]在多个不同的实施方案中，阳离子可电离脂质具有下表中所述的结构之一。[0760][0761]在多个不同的实施方案中，阳离子可电离脂质选自n,n-二甲基-2,3-二油烯基氧基丙胺(dodma)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(dodap)、三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(dlin-mc3-dma)和4-((二((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)氨基)氧基)-n’,n’‑二甲基-4-氧代丁烷-1-胺(dpl-14)。[0762]阳离子可电离脂质的另一些实例包括但不限于3-(n-(n’,n’‑二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(dc-chol)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(dodap)；1,2-二酰氧基-3-二甲基铵丙烷；1,2-二烷氧基-3-二甲基铵丙烷、1,2-二硬脂基氧基-n,n-二甲基-3-氨基丙烷(dsdma)、1,2-二乙烯基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlindma)、1,2-二亚麻基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlendma)、双十八烷基酰胺基甘氨酰精胺(dogs)、3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁烷-4-氧基)-1-(顺式,顺式-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(clindma)、2-[5’‑(胆甾-5-烯-3-β-氧基)-3’‑氧杂戊氧基)-3-二甲基-1-(顺式,顺式-9’,12’‑十八碳二烯氧基)丙烷(cplindma)、n,n-二甲基-3,4-二油烯基氧基苄胺(dmoba)、1,2-n,n′‑二油烯基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(docarbdap)、2,3-二亚油酰基氧基-n,n-二甲基丙胺(dlindap)、1,2-n,n’‑二亚油基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(dlincarbdap)、1,2-二亚油酰基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(dlincdap)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(dlin-k-dma)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(dlin-k-xtc2-dma)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(dlin-kc2-dma)、三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(dlin-mc3-dma)、2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-n,n-二甲基-3-[(9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(辛基-clindma)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-二甲基铵-丙烷(dmdap)、1,2-二棕榈酰基-3-二甲基铵-丙烷(dpdap)、n1-[2-((1s)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基甲酰氨基)乙基]-3,4-二[油烯基氧基]-苯甲酰胺(mvl5)、二((z)-壬-2-烯-1-基)8,8’‑((((2(二甲基氨基)乙基)硫基)羰基)氮烷二基)二辛酸酯(atx)、n,n-二甲基-2,3-双(十二烷基氧基)丙烷-1-胺(dldma)、n,n-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)丙烷-1-胺(dmdma)、二((z)-壬-2-烯-1-基)-9-((4-(二甲基氨基丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(l319)、n-十二烷基-3-((2-十二烷基氨基甲酰基-乙基)-{2-[(2-十二烷基氨基甲酰基-乙基)-2-{(2-十二烷基氨基甲酰基-乙基)-[2-(2-十二烷基氨基甲酰基-乙基氨基)-乙基]-氨基}-乙基氨基)丙酰胺(lipidoid98n12-5)、1-[2-[双(2-羟基十二烷基)氨基]乙基-[2-[4-[2-[双(2羟基十二烷基)氨基]乙基]哌嗪-1-基]乙基]氨基]十二烷-2-醇(lipidoidc12-200)。[0763]在一些实施方案中，阳离子可电离脂质可占颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约100mol％、约20mol％至约100mol％、约30mol％至约100mol％、约40mol％至约100mol％、或约50mol％至约100mol％。[0764]在一个实施方案中，其中本文中所述的颗粒(特别是lnp，优选包含mrna的lnp)包含阳离子可电离脂质和一种或更多种另外的脂质，阳离子可电离脂质占颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约80mol％、约20mol％至约60mol％、约25mol％至约55mol％、约30mol％至约50mol％、约35mol％至约45mol％、或约40mol％。[0765]在一个实施方案中，本文中所述的颗粒(特别是lnp，优选包含mrna的lnp)包含40至55mol％、40至50mol％、41至49mol％、41至48mol％、42至48mol％、43至48mol％、44至48mol％、45至48mol％、46至48mol％、47至48mol％或47.2至47.8mol％的阳离子可电离脂质。一个实施方案中，颗粒(特别是lnp，优选包含mrna的lnp)包含约47.0、47.1、47.2、47.3、47.4、47.5、47.6、47.7、47.8、47.9或48.0mol％的阳离子可电离脂质。[0766]另外的脂质[0767]本文中所述的颗粒还可包含除阳离子可电离脂质之外的脂质或类脂质物质，即非阳离子脂质或类脂质物质(包括非阳离子可电离脂质或类脂质物质)。阴离子脂质或类脂质物质和中性脂质或类脂质物质在本文中统称为非阳离子脂质或类脂质物质。除阳离子可电离脂质之外，还通过添加其他疏水性部分(例如胆固醇和脂质)对核酸颗粒的制剂进行优化可以增强颗粒稳定性和核酸递送的效力。[0768]术语“脂质”和“类脂质物质”在本文中被广泛定义为包含一个或更多个疏水性部分或基团以及任选地一个或更多个亲水性部分或基团的分子。包含疏水性部分和亲水性部分的分子也经常被称为两亲体。脂质通常难溶于水。在水性环境中，两亲性性质允许分子自组装成有组织的结构和不同的相。那些相之一由脂质双层组成，当它们存在于囊泡、多层/单层脂质体或水环境中的膜时。可通过包含非极性基团来赋予疏水性，所述非极性基团包括但不限于长链饱和和不饱和脂族烃基以及被以下取代的这样的基团：一个或更多个芳族、脂环族或杂环基团。亲水性基团可包含极性和/或带电荷基团，并且包括碳水化合物、磷酸根、羧基、硫酸根、氨基、巯基、硝基、羟基和其他类似基团。[0769]如本文中使用的，术语“两亲”是指具有极性部分和非极性部分二者的分子。两亲化合物通常具有与长疏水尾连接的极性头部。在一些实施方案中，极性部分可溶于水，而非极性部分不溶于水。另外，极性部分可具有形式正电荷(formalpositivecharge)或形式负电荷(formalnegativecharge)。或者，极性部分可具有形式正电荷和负电荷二者，并且可以是两性离子或内盐。处于本公开内容的目的，两亲化合物可以是但不限于一种或更多种的天然或非天然脂质和类脂质化合物。[0770]术语“类脂质物质”、“类脂质化合物”或“类脂质分子”涉及与脂质在结构和/或功能上相关但在严格意义上不能视为脂质的物质。例如，该术语包括当其存在于囊泡、多层/单层脂质体或水环境中的膜时能够形成两亲层的化合物，并且包括表面活性剂或具有亲水性和疏水性部分二者的合成化合物。一般而言，该术语是指这样的分子，其包含亲水性和疏水性部分，其具有可以与或可以不与脂质类似的不同结构组织。除非本文中另外指出或明显与上下文相矛盾，否则如本文中使用的术语“脂质”应被解释为包括脂质和类脂质物质二者。[0771]可包含在两亲层中的两亲化合物的一些具体实例包括但不限于磷脂、氨基脂质和鞘脂。[0772]在某些实施方案中，两亲化合物是脂质。术语“脂质”是指特征在于不溶于水，但可溶于许多有机溶剂的一组有机化合物。通常而言，脂质可分成八个类别：脂肪酸、甘油脂质、甘油磷脂、鞘脂、糖脂、聚酮(来源于酮酯酰亚基的缩合)、固醇脂质和孕烯醇酮脂类(来源于异戊二烯亚基的缩合)。尽管有时将术语“脂质”用作脂肪的同义词，但脂肪是称为甘油三酯的脂质亚组。脂质还涵盖分子例如脂肪酸及其衍生物(包括甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和磷脂)，以及类固醇即包含固醇的代谢物例如胆固醇或其衍生物。胆固醇衍生物的一些实例包括但不限于胆甾烷醇(cholestanol)、胆甾烷酮(cholestanone)、胆甾烯酮(cholestenone)、粪甾烷醇(coprostanol)、胆甾醇基-2’‑羟乙基醚、胆甾醇基-4’‑羟丁基醚、生育酚及其衍生物，及其混合物。[0773]脂肪酸或脂肪酸残基是由终止于羧酸基团的烃链构成的不同分子基团；这种排列赋予该分子以极性的亲水端和不溶于水的非极性疏水端。通常长为4至24个碳的碳链可以是饱和或不饱和的，并且可与包含氧、卤素、氮和硫的官能团连接。如果脂肪酸包含双键，则可能存在顺式或反式几何异构，这显著影响分子构型。顺式双键导致脂肪酸链弯曲，即一种与链中更多的双键复合的效应。脂肪酸类别中的另一些主要脂质种类是脂肪酯和脂肪酰胺。[0774]甘油脂质由单取代甘油、双取代甘油和三取代甘油构成，最著名的是甘油脂肪酸三酯，称为甘油三酯。词语“三酰甘油”有时与“甘油三酯”同义使用。在这些化合物中，甘油的三个羟基通常各自被不同的脂肪酸酯化。另外的甘油脂质亚类以糖基甘油为代表，其特征在于存在通过糖苷键与甘油连接的一个或更多个糖残基。[0775]甘油磷脂是两亲性分子(包含疏水区和亲水区二者)，其包含通过酯键联与两个脂肪酸来源的“尾”连接和通过磷酸根键联与一个“头”基连接的甘油核心。甘油磷脂(通常称为磷脂(尽管鞘磷脂也被归类为磷脂))的一些实例是磷脂酰胆碱(也称为pc、gpcho或卵磷脂)、磷脂酰乙醇胺(pe或gpetn)和磷脂酰丝氨酸(ps或gpser)。[0776]鞘脂是享有共同的结构特征——鞘氨醇碱(sphingoidbase)骨架的复杂的化合物家族。哺乳动物中主要的鞘氨醇碱通常被称为鞘氨醇。神经酰胺(n-酰基-鞘氨醇碱)是具有酰胺连接的脂肪酸的鞘氨醇碱衍生物的主要亚类。脂肪酸通常是饱和的或单不饱和的，链长度为16至26个碳原子。哺乳动物的主要磷酸鞘脂(phosphosphingolipid)是鞘磷脂(神经酰胺磷酸胆碱)，而昆虫主要包含神经酰胺磷酸乙醇胺并且真菌具有植物神经酰胺磷酸肌醇和含甘露糖的头基。鞘糖脂是由通过糖苷键与鞘氨醇碱连接的一个或更多个糖残基构成的不同分子家族。这些中的一些实例是简单和复杂的鞘糖脂，例如脑苷脂和神经节苷脂。[0777]固醇脂质(例如胆固醇及其衍生物或者生育酚及其衍生物)与甘油磷脂和鞘磷脂一起是膜脂质的重要组分。[0778]糖脂描述的是其中脂肪酸与糖骨架直接连接从而形成与膜双层相容的结构的化合物。在糖脂中，单糖替代了存在于甘油脂质和甘油磷脂中的甘油骨架。最熟悉的糖脂是革兰氏阴性菌中脂多糖的脂质a组分的酰化葡糖胺前体。典型的脂质a分子是葡糖胺的二糖，其被多达七个脂肪酰基链衍生化。在大肠杆菌中生长所需的最小脂多糖是kdo2-脂质a，即被两个3-脱氧-d-甘露糖-辛酮糖酸(kdo)残基糖基化的葡糖胺六酰化二糖。[0779]聚酮是通过经典酶以及与脂肪酸合酶共享机械特征的迭代和多模块酶通过乙酰基和丙酰基亚基的聚合而合成的。它们包含来自动物、植物、细菌、真菌和海洋来源的大量次级代谢物和天然产物，并且具有大的结构多样性。许多聚酮是其骨架通常通过糖基化、甲基化、羟基化、氧化或另一些过程进一步修饰的环状分子。[0780]根据本公开内容，脂质和类脂质物质可以是阳离子的、阴离子的或中性的。中性脂质或类脂质物质在选定的ph下以不带电荷或中性两性离子的形式存在。[0781]阳离子脂质和类脂质物质或阳离子可电离脂质和类脂质物质可用于与rna静电结合。阳离子可电离的脂质和类脂质物质是优选地仅在酸性ph下带正电荷的物质。与在生理ph下保持阳离子的颗粒相比，这种可电离的行为被认为通过帮助内体逃逸和降低毒性来增强效力。颗粒还可包含非阳离子脂质或类脂质物质。阴离子的脂质或类脂质物质以及中性的脂质或类脂质物质在本文中统称为非阳离子的脂质或类脂质物质。除可电离/阳离子的脂质或类脂质物质之外还通过添加其他疏水性部分(例如胆固醇和脂质)对rna颗粒的制剂进行优化增强了颗粒稳定性并且可显著增强rna递送的效力。[0782]可以并入可影响或可不影响核酸颗粒的总电荷的一种或更多种另外的脂质。在某些实施方案中另外的脂质或更多种另外的脂质是非阳离子脂质或类脂质物质。非阳离子脂质可包含例如一种或更多种阴离子脂质和/或中性脂质。本文中使用的“阴离子脂质”是指在选定ph下带负电荷的任何脂质。本文中使用的“中性脂质”是指在选定ph下以不带电荷或中性两性离子形式存在的许多脂质物质中的任一种。[0783]在某些实施方案中，本文中所述的核酸颗粒(特别是包含mrna的lnp)包含阳离子可电离脂质和一种或更多种另外的脂质。[0784]不希望受到理论的束缚，与一种或更多种另外的脂质的量相比，阳离子可电离脂质的量可影响重要的核酸颗粒特征，例如核酸的生物活性、电荷、颗粒尺寸、稳定性和组织选择性。因此，在一些实施方案中，阳离子可电离脂质与一种或更多种另外的脂质的摩尔比为约10:0至约1:9，约4:1至约1:2，或约3:1至约1:1。[0785]在一个实施方案中，包含在本文中所述的核酸颗粒(特别是包含mrna的lnp)中的一种或更多种另外的脂质包含以下中一种或更多种：中性脂质、类固醇、聚合物缀合的脂质、及其组合。[0786]在一个实施方案中，一种或更多种另外的脂质包含是磷脂的中性脂质。优选地，磷脂选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂。可使用的特定磷脂包括但不限于磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸或鞘磷脂。这样的磷脂特别是包括二酰基磷脂酰胆碱(diacylphosphatidylcholine)，例如二硬脂酰基磷脂酰胆碱(dspc)、二油酰基磷脂酰胆碱(dopc)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(dmpc)、双十五烷酰基磷脂酰胆碱、二月桂酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(dppc)、二花生酰基磷脂酰胆碱(dapc)、二萮炔酰基磷脂酰胆碱(dbpc)、双二十三烷酰基磷脂酰胆碱(dtpc)、双二十四酰基磷脂酰胆碱(dlpc)、棕榈酰基油酰基-磷脂酰胆碱(popc)、1,2-二-o-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0二醚pc)、1-油酰基-2-胆甾醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(ochemspc)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(c16lysopc)和磷脂酰乙醇胺，特别是二酰基磷脂酰乙醇胺，例如二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(dspe)、二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺(dppe)、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(dmpe)、二月桂酰基-磷脂酰乙醇胺(dlpe)、二植烷酰基-磷脂酰乙醇胺(dpype)、1,2-二-(9z-十八碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dopg)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1’‑外消旋甘油)(dppg)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(pope)、n-棕榈酰基-d-赤-鞘氨醇磷酸胆碱(sm)，以及具有不同疏水链的另一些磷脂酰乙醇胺脂质。在一个实施方案中，中性脂质选自dspc、dopc、dmpc、dppc、popc、dope、dopg、dppg、pope、dppe、dmpe、dspe和sm。在一个实施方案中，中性脂质选自dspc、dppc、dmpc、dopc、popc、dope和sm。在一个实施方案中，中性脂质是dspc。[0787]因此，在一个实施方案中，本文中所述的核酸颗粒(特别是包含mrna的lnp)包含阳离子可电离脂质和dspc。[0788]在一个实施方案中，中性脂质以5至15mol％、7至13mol％或9至11mol％的浓度存在于本文中所述的颗粒(特别是lnp，优选包含mrna的lnp)中。在一个实施方案中，中性脂质以本文中所述颗粒(特别是包含mrna的lnp)中存在的总脂质的约9.5、10或10.5mol％的浓度存在。[0789]在一个实施方案中，类固醇是胆固醇。因此，在一个实施方案中，核酸颗粒(特别是包含mrna的lnp)包含阳离子可电离脂质和胆固醇。[0790]在一个实施方案中，类固醇以30至50mol％、35至45mol％或38至43mol％的浓度存在于颗粒(特别是lnp，优选包含mrna的lnp)中。在一个实施方案中，类固醇以本文中所述颗粒(特别是包含mrna的lnp)中存在的总脂质的约40、41、42、43、44、45或46mol％的浓度存在。[0791]在某些优选实施方案中，本文中所述的核酸颗粒(特别是包含mrna的lnp)包含dspc和胆固醇，优选以上文给出的浓度。[0792]在一些实施方案中，中性脂质(特别是一种或更多种磷脂)和类固醇(特别是胆固醇)的组合浓度可占本文中所述的核酸颗粒(特别是包含mrna的lnp)中存在的总脂质的约0mol％至约90mol％、约0mol％至约80mol％、约0mol％至约70mol％、约0mol％至约60mol％、或约0mol％至约50mol％，例如约20mol％至约80mol％、约25mol％至约75mol％、约30mol％至约70mol％、约35mol％至约65mol％、或约40mol％至约60mol％。[0793]在一个实施方案中，聚合物缀合的脂质是聚乙二醇化脂质或聚肌氨酸-脂质缀合物或者聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物。[0794]术语“聚乙二醇化脂质”是指包含脂质部分和聚乙二醇部分二者的分子。聚乙二醇化脂质是本领域已知的。在一个实施方案中，聚合物缀合的脂质是聚乙二醇化脂质。在一个实施方案中，聚乙二醇化脂质具有以下结构：[0795][0796]或其可用盐、互变异构体或立体异构体，其中r12和r13各自独立地是含有10至30个碳原子的直链或支链烷基或烯基链，其中烷基或烯基链任选地间插有一个或更多个酯键；并且w的平均值为30至60。在一个实施方案中，r12和r13各自独立地是含有12至16个碳原子的直链饱和烷基链。在一个实施方案中，w的平均值为40至55。在一个实施方案中，平均w为约45。在一个实施方案中，r12和r13各自独立地是含有约14个碳原子的直链饱和烷基链，并且w的平均值为约45。[0797]在一个实施方案中，聚乙二醇化脂质是dmg-peg2000，例如，具有以下结构：[0798][0799]在一个实施方案中，本文中所述的核酸颗粒(特别是包含mrna的lnp)包含阳离子可电离的脂质和聚乙二醇化脂质，例如，如上定义的聚乙二醇化脂质。[0800]在一个实施方案中，聚乙二醇化脂质以本文中所述颗粒(特别是包含mrna的lnp)中存在的总脂质的1至10mol％、1至5mol％或1至2.5mol％的浓度存在于颗粒(特别是lnp，优选包含mrna的lnp)中。[0801]在一个实施方案中，聚合物缀合的脂质是聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物，即包含聚肌氨酸(聚(n-甲基甘氨酸))的脂质或类脂质物质。聚肌氨酸可包含乙酰化的(中性端基)或另一些官能化的端基。在rna-脂质颗粒的情况下，在一个实施方案中聚肌氨酸与颗粒中包含的非阳离子脂质或类脂质物质缀合，优选与其共价结合。[0802]在某些实施方案中，聚肌氨酸的端基可用以下来官能化：赋予某些特性(例如正电荷或负电荷)的一种或更多种分子部分，或者将颗粒定向到特定细胞类型、细胞群(collection)或组织的靶向剂。[0803]本领域已知多种合适的靶向剂。靶向剂的一些非限制性实例包括肽、蛋白质、酶、核酸、脂肪酸、激素、抗体、碳水化合物、单糖、寡糖或多糖、肽聚糖、糖肽等。例如，可使用与靶细胞表面上的抗原结合的多种不同物质中的任一种。靶细胞表面抗原的抗体通常会表现出对靶标的必要特异性。除抗体之外，还可使用合适的免疫反应性片段，例如fab、fab’、f(ab’)2或者scfv片段或单结构域抗体(例如骆驼科动物vhh片段)。本领域中已获得适合用于形成靶向机制的许多抗体片段。类似地，可适当使用靶细胞表面上任何受体的配体作为靶向剂。这些包括与存在于所期望的靶细胞表面处的细胞表面受体、蛋白质或糖蛋白特异性结合的任何天然或合成的小分子或生物分子。[0804]在某些实施方案中，聚肌氨酸包含2至200、2至190、2至180、2至170、2至160、2至150、2至140、2至130、2至120、2至110、2至100、2至90、2至80、2至70、5至200、5至190、5至180、5至170、5至160、5至150、5至140、5至130、5至120、5至110、5至100、5至90、5至80、5至70、10至200、10至190、10至180、10至170、10至160、10至150、10至140、10至130、10至120、10至110、10至100、10至90、10至80、或10至70个肌氨酸单元。[0805]在某些实施方案中，聚肌氨酸包含以下通式(ii)：[0806][0807]其中x是指肌氨酸单元的数目。通过该键中之一聚肌氨酸可与颗粒形成组分或疏水性组分连接。通过另一个键聚肌氨酸可与h、亲水性基团、可电离基团，或者与接头、与功能部分(例如靶向部分)连接。[0808]聚肌氨酸可与任何颗粒形成组分(例如脂质或类脂质物质)缀合，特别是与其共价结合或连接。聚肌氨酸-脂质缀合物是其中聚肌氨酸与本文中所述的脂质(例如阳离子脂质或阳离子可电离脂质或另外的脂质)缀合的分子。或者，聚肌氨酸与不同于阳离子可电离脂质或者一种或更多种另外的脂质的脂质或类脂质物质缀合。[0809]在某些实施方案中，聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物包含以下通式(iia)：[0810][0811]其中r1和r2中一者包含疏水性基团并且另一者是h、亲水性基团、可电离基团或任选地包含靶向部分的官能团。在一个实施方案中，疏水性基团包含线性或支链烷基或芳基，其优选地包含10至50、10至40或12至20个碳原子。在一个实施方案中，包含疏水性基团的r1或r2包含与一个或更多个线性或支链烷基连接的部分例如杂原子，特别是n。[0812]在某些实施方案中，聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物包含以下通式(iib)：[0813][0814]其中r是h、亲水性基团、可电离基团或任选地包含靶向部分的官能团。[0815]本文中通式，例如通式(iia)和(iib)中的符号“x”是指肌氨酸单元的数目，并且可以是本文中限定的数目。[0816]在某些实施方案中，聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物是选自以下的成员：聚肌氨酸-二酰基甘油缀合物、聚肌氨酸-二烷氧基丙基缀合物、聚肌氨酸-磷脂缀合物、聚肌氨酸-神经酰胺缀合物，及其混合物。[0817]通常而言，聚肌氨酸部分具有2至200、5至200、5至190、5至180、5至170、5至160、5至150、5至140、5至130、5至120、5至110、5至100、5至90、5至80、10至200、10至190、10至180、10至170、10至160、10至150、10至140、10至130、10至120、10至110、10至100、10至90、或10至80个肌氨酸单元。[0818]因此，在一个实施方案中，本文中所述的核酸颗粒(特别是包含mrna的lnp)包含阳离子可电离脂质和聚肌氨酸-脂质缀合物或者聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物，例如，如上所述的聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物。[0819]在某些情况下，聚肌氨酸-脂质缀合物可占本文中所述的核酸颗粒(特别是包含mrna的lnp)中存在的总脂质的约0.2mol％至约50mol％、约0.25mol％至约30mol％、约0.5mol％至约25mol％、约0.75mol％至约25mol％、约1mol％至约25mol％、约1mol％至约20mol％、约1mol％至约15mol％、约1mol％至约10mol％、约1mol％至约5mol％、约1.5mol％至约25mol％、约1.5mol％至约20mol％、约1.5mol％至约15mol％、约1.5mol％至约10mol％、约1.5mol％至约5mol％、约2mol％至约25mol％、约2mol％至约20mol％、约2mol％至约15mol％、约2mol％至约10mol％、或约2mol％至约5mol％。[0820]在一些实施方案中，一种或更多种另外的脂质包含以下组分之一：(1)中性脂质；(2)类固醇；(3)聚合物缀合的脂质；(4)中性脂质和类固醇的混合物；(5)中性脂质和聚合物缀合的脂质的混合物；(6)类固醇和聚合物缀合的脂质的混合物；或者(7)中性脂质、类固醇和聚合物缀合的脂质的混合物，优选各自以以上给定浓度。在一些实施方案中，一种或更多种另外的脂质包含以下组分之一：(1)磷脂；(2)胆固醇；(3)聚乙二醇化脂质；(4)磷脂和胆固醇的混合物；(5)磷脂和聚乙二醇化脂质的混合物；(6)胆固醇和聚乙二醇化脂质的混合物；或者(7)磷脂、胆固醇和聚乙二醇化脂质的混合物，优选各自以以上给定浓度。[0821]因此，在一些优选实施方案中，本文中所述的核酸颗粒(特别是包含mrna的lnp)包含阳离子可电离脂质和以下脂质或脂质混合物之一：(1)中性脂质；(2)类固醇；(3)聚合物缀合的脂质；(4)中性脂质和类固醇的混合物；(5)中性脂质和聚合物缀合的脂质的混合物；(6)类固醇和聚合物缀合的脂质的混合物；或(7)中性脂质、类固醇和聚合物缀合的脂质的混合物，优选各自以以上给定浓度。在一个具体实施方案中，阳离子可电离脂质以40至50mol％的浓度存在；中性脂质以5至15mol％的浓度存在；类固醇以35至45mol的浓度存在；以及聚合物缀合的脂质以1至10mol％的浓度存在，其中mrna包封在lnp内或与lnp缔合。[0822]在一些更优选实施方案中，本文中所述的核酸颗粒(特别是包含mrna的lnp)包含阳离子可电离脂质和以下脂质或脂质混合物之一：(1)磷脂；(2)胆固醇；(3)聚乙二醇化脂质；(4)磷脂和胆固醇的混合物；(5)磷脂和聚乙二醇化脂质的混合物；(6)胆固醇和聚乙二醇化脂质的混合物；或(7)磷脂、胆固醇和聚乙二醇化脂质的混合物，优选各自以以上给定浓度。在一个具体实施方案中，阳离子可电离脂质以40至50mol％的浓度存在；磷脂以5至15mol％的浓度存在；胆固醇以35至45mol的浓度存在；以及聚乙二醇化脂质以1至10mol％的浓度存在，其中mrna包封在lnp内或与lnp缔合。[0823]n/p值优选为至少约4。在一些实施方案中，n/p值为4至20、4至12、4至10、4至8或5至7。在一个实施方案中，n/p值为约6。[0824]在一个实施方案中，本文中所述的lnp的平均直径可为约30nm至约200nm，或约60nm至约120nm。[0825]一般来说，包含本文中所述mrna的lnp是可用于将rna递送至目的靶位点(例如，细胞、组织、器官等)的“rna-脂质颗粒”。rna-脂质颗粒通常由以下形成：阳离子可电离脂质(例如dodma)和一种或更多种另外的脂质，所述另外的脂质例如磷脂(例如，dspc)、类固醇(例如，胆固醇或其类似物)，以及聚合物缀合的脂质(例如，聚乙二醇化脂质或聚肌氨酸-脂质缀合物或者聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物)。[0826]不旨在受任何理论的束缚，认为阳离子可电离脂质和一种或更多种另外的脂质与rna组合在一起以形成胶体稳定的颗粒，其中核酸与脂质基质结合。[0827]在一些实施方案中，rna-脂质颗粒包含多于一种类型的rna分子，其中rna分子的分子参数可彼此类似或不同，如关于摩尔质量或基本结构要素，例如分子构造、加帽、编码区或其他特征。[0828]在一些实施方案中，mrna-脂质lnp除rna之外还包含(i)阳离子可电离脂质，其可占颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约80mol％、约20mol％至约60mol％、约25mol％至约55mol％、约30mol％至约50mol％、约35mol％至约45mol％、或约40mol％，(ii)中性脂质和/或类固醇(例如，一种或更多种磷脂和/或胆固醇)，其可占颗粒中存在的总脂质的约0mol％至约90mol％、约20mol％至约80mol％、约25mol％至约75mol％、约30mol％至约70mol％、约35mol％至约65mol％、或约40mol％至约60mol％，以及(iii)聚合物缀合的脂质(例如，聚乙二醇化脂质，其可占颗粒中存在的总脂质的1mol％至10mol％、1mol％至5mol％、或1mol％至2.5mol％；或者聚肌氨酸-脂质缀合物，其可占颗粒中存在的总脂质的约0.2mol％至约50mol％、约0.25mol％至约30mol％、约0.5mol％至约25mol％、约0.75mol％至约25mol％、约1mol％至约25mol％、约1mol％至约20mol％、约1mol％至约15mol％、约1mol％至约10mol％、约1mol％至约5mol％、约1.5mol％至约25mol％、约1.5mol％至约20mol％、约1.5mol％至约15mol％、约1.5mol％至约10mol％、约1.5mol％至约5mol％、约2mol％至约25mol％、约2mol％至约20mol％、约2mol％至约15mol％、约2mol％至约10mol％、或约2mol％至约5mol％)。[0829]在某些优选实施方案中，中性脂质包含磷脂，其为颗粒中存在的总脂质的约5mol％至约50mol％、约5mol％至约45mol％、约5mol％至约40mol％、约5mol％至约35mol％、约5mol％至约30mol％、约5mol％至约25mol％或约5mol％至约20mol％。[0830]在某些优选实施方案中，类固醇包含胆固醇或其衍生物，其为颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约80mol％、约10mol％至约70mol％、约15mol％至约65mol％、约20mol％至约60mol％、约25mol％至约55mol％或约30mol％至约50mol％。[0831]在某些优选实施方案中，中性脂质和类固醇包含以下的混合物：(i)磷脂例如dspc，其为颗粒中存在的总脂质的约5mol％至约50mol％、约5mol％至约45mol％、约5mol％至约40mol％、约5mol％至约35mol％、约5mol％至约30mol％、约5mol％至约25mol％、或约5mol％至约20mol％；以及(ii)胆固醇或其衍生物例如胆固醇，其为颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约80mol％、约10mol％至约70mol％、约15mol％至约65mol％、约20mol％至约60mol％、约25mol％至约55mol％或约30mol％至约50mol％。作为一个非限制性实例，包含磷脂和胆固醇之混合物的mrnalnp可包含dspc，其为颗粒中存在的总脂质的约5mol％至约50mol％、约5mol％至约45mol％、约5mol％至约40mol％、约5mol％至约35mol％、约5mol％至约30mol％、约5mol％至约25mol％、或约5mol％至约20mol％，以及胆固醇，其为颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约80mol％、约10mol％至约70mol％、约15mol％至约65mol％、约20mol％至约60mol％、约25mol％至约55mol％、或约30mol％至约50mol％。[0832]在一些实施方案中，rna-脂质颗粒除mrna之外还包含(i)阳离子可电离脂质(例如dodma)，其可占颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约80mol％、约20mol％至约60mol％、约25mol％至约55mol％、约30mol％至约50mol％、约35mol％至约45mol％、或约40mol％，(ii)dspc，其可占颗粒中存在的总脂质的约5mol％至约50mol％、约5mol％至约45mol％、约5mol％至约40mol％、约5mol％至约35mol％、约5mol％至约30mol％、约5mol％至约25mol％、或约5mol％至约20mol％，(iii)胆固醇，其可占颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约80mol％、约10mol％至约70mol％、约15mol％至约65mol％、约20mol％至约60mol％、约25mol％至约55mol％、或约30mol％至约50mol％，以及(iv)聚乙二醇化脂质，其可占颗粒中存在的总脂质的1mol％至10mol％、1mol％至5mol％、或1mol％至2.5mol％；或者(iv’)聚肌氨酸-脂质缀合物，其可占颗粒中存在的总脂质的约0.2mol％至约50mol％、约0.25mol％至约30mol％、约0.5mol％至约25mol％、约0.75mol％至约25mol％、约1mol％至约25mol％、约1mol％至约20mol％、约1mol％至约15mol％、约1mol％至约10mol％、约1mol％至约5mol％、约1.5mol％至约25mol％、约1.5mol％至约20mol％、约1.5mol％至约15mol％、约1.5mol％至约10mol％、约1.5mol％至约5mol％、约2mol％至约25mol％、约2mol％至约20mol％、约2mol％至约15mol％、约2mol％至约10mol％、或约2mol％至约5mol％。[0833]在一个实施方案中，本文中所述的mrnalnp的平均直径为约30nm至约1000nm、约30nm至约800nm、约30nm至约700nm、约30nm至约600nm、约30nm至约500nm、约30nm至约450nm、约30nm至约400nm、约30nm至约350nm、约30nm至约300nm、约30nm至约250nm、约30nm至约200nm、约30nm至约190nm、约30nm至约180nm、约30nm至约170nm、约30nm至约160nm、约30nm至约150nm、约50nm至约500nm、约50nm至约450nm、约50nm至约400nm、约50nm至约350nm、约50nm至约300nm、约50nm至约250nm、约50nm至约200nm、约50nm至约190nm、约50nm至约180nm、约50nm至约170nm、约50nm至约160nm、或约50nm至约150nm。[0834]在某些实施方案中，本文中所述的mrnalnp的平均直径为约40nm至约800nm、约50nm至约700nm、约60nm至约600nm、约70nm至约500nm、约80nm至约400nm、约150nm至约800nm、约150nm至约700nm、约150nm至约600nm、约200nm至约600nm、约200nm至约500nm、或约200nm至约400nm。[0835]本文中所述的mrnalnp(例如通过本文中所述方法制备的mrnalnp)表现出多分散性指数小于约0.5、小于约0.4、小于约0.3、小于约0.2、小于约0.1或约0.05或更小。举例来说，mrnalnp可表现出多分散性指数为约0.05至约0.2，例如约0.05至约0.1。[0836]在本公开内容的某些实施方案中，本文中所述的mrnalnp中的mrna的浓度为约0.002mg/ml至约5mg/ml、约0.002mg/ml至约2mg/ml、约0.005mg/ml至约2mg/ml、约0.01mg/ml至约1mg/ml、约0.05mg/ml至约0.5mg/ml、或约0.1mg/ml至约0.5mg/ml。在一些具体实施方案中，mrna的浓度为约0.005mg/ml至约0.1mg/ml、约0.005mg/ml至约0.09mg/ml、约0.005mg/ml至约0.08mg/ml、约0.005mg/ml至约0.07mg/ml、约0.005mg/ml至约0.06mg/ml或约0.005mg/ml至约0.005mg/ml[0837]包含rna颗粒的制剂[0838]本文中所述的制剂包含mrnalnp，优选多个mrnalnp。术语“多个mrnalnp”或“多个mrna-脂质颗粒”是指一定数目颗粒的群体。在某些实施方案中，该术语是指超过10、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019、1020、1021、1022或1023或更多个颗粒的群体。[0839]对本领域技术人员来说将明显的是，所述多个颗粒可包括前述范围的任何分数或其中的任意范围。[0840]在一些实施方案中，本文中所述的制剂是液体或固体，固体是指冷冻形式或冻干形式。[0841]本发明人出人意料地发现，在mrnalnp制剂中某些多价阴离子(例如柠檬酸或无机磷酸阴离子)的存在可导致在所述制剂被冷冻并随后解冻时(即在所述制剂经受至少一个冻融循环时)颗粒尺寸的增加，并且基本上不含柠檬酸和/或无机磷酸阴离子的mrna制剂可以在不增加颗粒尺寸的情况下冷冻和解冻。[0842]因此，根据本公开内容，本文中所述的制剂优选基本上不含柠檬酸和/或无机磷酸阴离子。在一个实施方案中，本文中所述的制剂优选基本上不含聚羧酸根阴离子和/或无机磷酸阴离子。[0843]本文中使用的表述“基本上不含x”意指混合物(例如本文中所述的制剂或药物组合物)以其实践上并实际可行的这样的方式不含x。例如，如果混合物基本上不含x，则基于混合物的总重量，混合物中x的量可以为小于1重量％(例如，小于0.5重量％、小于0.4重量％、小于0.3重量％、小于0.2重量％、小于0.1重量％、小于0.09重量％、小于0.08重量％、小于0.07重量％、小于0.06重量％、小于0.05重量％、小于0.04重量％、小于0.03重量％、小于0.02重量％、小于0.01重量％、小于0.005重量％、小于0.001重量％)。[0844]因此，如果本文中所述的mrna制剂基本上不含柠檬酸阴离子，则基于mrna制剂的总重量，优选mrna制剂中柠檬酸阴离子的量小于1重量％(例如，小于0.5重量％、小于0.4重量％、小于0.3重量％、小于0.2重量％、小于0.1重量％、小于0.09重量％、小于0.08重量％、小于0.07重量％、小于0.06重量％、小于0.05重量％、小于0.04重量％、小于0.03重量％、小于0.02重量％、小于0.01重量％、小于0.005重量％、小于0.001重量％)。如果本文中所述的mrna制剂基本上不含无机磷酸阴离子，则基于mrna制剂的总重量，优选mrna制剂中无机磷酸阴离子的量小于1重量％(例如，小于0.5重量％、小于0.4重量％、小于0.3重量％、小于0.2重量％、小于0.1重量％、小于0.09重量％、小于0.08重量％、小于0.07重量％、小于0.06重量％、小于0.05重量％、小于0.04重量％、小于0.03重量％、小于0.02重量％、小于0.01重量％、小于0.005重量％、小于0.001重量％)。此外，如果本文中所述的药物组合物基本上不含柠檬酸阴离子，则基于药物组合物的总重量，优选药物组合物中柠檬酸阴离子的量小于1重量％(例如，小于0.5重量％、小于0.4重量％、小于0.3重量％、小于0.2重量％、小于0.1重量％、小于0.09重量％、小于0.08重量％、小于0.07重量％、小于0.06重量％、小于0.05重量％、小于0.04重量％、小于0.03重量％、小于0.02重量％、小于0.01重量％、小于0.005重量％、小于0.001重量％)。如果本文中所述的药物组合物基本上不含无机磷酸阴离子，则基于药物组合物的总重量，优选药物组合物中无机磷酸阴离子的量小于1重量％(例如，小于0.5重量％、小于0.4重量％、小于0.3重量％、小于0.2重量％、小于0.1重量％、小于0.09重量％、小于0.08重量％、小于0.07重量％、小于0.06重量％、小于0.05重量％、小于0.04重量％、小于0.03重量％、小于0.02重量％、小于0.01重量％、小于0.005重量％、小于0.001重量％)。[0845]本文中使用的表述“柠檬酸阴离子”意指包含柠檬酸阴离子和在溶解在水性介质中时释放柠檬酸阴离子的任意化合物。包含柠檬酸阴离子和在溶于水性介质中时释放柠檬酸阴离子的化合物的一些实例包括柠檬酸和柠檬酸盐。[0846]本文中使用的表述“无机磷酸阴离子”意指包含无机磷酸阴离子和在溶解在水性介质中时释放无机磷酸阴离子的任意化合物。包含无机磷酸阴离子和在溶解在水性介质中时释放无机磷酸阴离子的化合物的一些实例包括磷酸和磷酸盐。优选地，表述“无机磷酸阴离子”不包括磷酸与一种或更多种有机醇的酯。因此，优选地，表述“无机磷酸阴离子”不涵盖核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸。[0847]本文中使用的表述“聚羧酸根阴离子”意指包含至少两个(优选至少三个)为游离形式(即，质子化)、酸酐形式或盐形式的羧酸基团的任意有机化合物。[0848]本文中使用的关于颗粒(例如lnp)的尺寸(z平均值)的表述“等于”意指在处理步骤之后(例如，在冻/融循环之后或在冷冻-干燥/重构循环之后)包含在组合物中的颗粒的z平均值值对应于在处理步骤之前(例如在冻/融循环之前或在冷冻-干燥/重构循环之前)颗粒的z平均值值±30％(优选±25％，更优选±20％，例如±15％、±10％、±5％或±1％)。例如，如果包含在还未经受冻/融循环(或冷冻-干燥/重构循环)的组合物中的颗粒(例如lnp)的尺寸(z平均值)值是90nm，并且包含在经受冻/融循环(或冷冻-干燥/重构循环)的组合物中的颗粒(例如lnp)的尺寸(z平均值)值是115nm，则在冻/融循环之后，即在将冷冻组合物解冻之后(或在冷冻干燥/重构循环之后，即在将冷冻干燥组合物重构之后)颗粒的尺寸(z平均值)被认为等于冻/融循环之前，即在将组合物冷冻之前(或在冷冻干燥/重构循环之前，即在将冷冻干燥组合物重构之前)的颗粒尺寸(z平均值)。本文中使用的关于颗粒(例如lnp)的尺寸分布或pdi的表述“等于”应被相应地理解。例如，如果包含在还未经受冻/融循环(或冷冻干燥/重构循环)的组合物中的颗粒(例如lnp)的pdi值是0.30，并且包含在经受冻/融循环(或冷冻干燥/重构循环)的组合物中的颗粒(例如lnp)的pdi值是0.38，则在冻/融循环之后，即在将冷冻组合物解冻之后(或在冷冻干燥/重构循环之后，即在将冷冻干燥组合物重构之后)颗粒的pdi被认为等于冻/融循环之前，即在将组合物冷冻之前(或在冷冻干燥/重构循环之前，即在将冷冻干燥组合物重构之前)的颗粒的pdi。[0849]根据本公开内容，本文中所述的mrnalnp制剂具有适合于mrna颗粒的稳定性，并且特别是适合于mrna稳定性的ph。特别地，本发明人出人意料地发现，当mrna制剂的ph低于阳离子可电离脂质的pka时，可提高包含阳离子可电离脂质的mrna制剂的稳定性。[0850]因此，根据本公开内容，本文中所述制剂的ph优选低于阳离子可电离脂质的pka。例如，本文中所述制剂的ph优选比阳离子可电离脂质的pka低至少2个ph值(更优选至少3个ph值)。例如，如果阳离子可电离脂质的pka为9.5，则优选本文中所述制剂的ph为至多7.5，更优选至多6.5。在一个实施方案中，本文中所述mrnalnp制剂的ph为至多6.5，例如至多6.4、至多6.3、至多6.2、至多6.1、至多6.0或约6.0。在一个实施方案中，本文中所述mrnalnp制剂的ph为约4.0至约8.0、约5.0至约7.5或5.5至6.5。[0851]不希望受到理论的束缚，在制剂的制备、储存和使用期间，缓冲剂体系的使用维持了本文中所述mrnalnp制剂的ph。在本公开内容的某些实施方案中，缓冲剂体系可包含溶剂(特别是水，例如去离子水，特别是注射用水)缓冲物质。缓冲物质优选地选自2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙烷磺酸(hepes)、2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇(tris)、乙酸盐和组氨酸。优选的缓冲物质是hepes。[0852]此外，本发明人出人意料地发现，当经受至少一个冻融循环时，包含阳离子可电离脂质的mrna制剂中nacl和/或kcl的存在对所述mrna制剂的稳定性具有不利影响，而省略添加nacl和/或kcl中的一者或二者产生了稳定的mrna制剂。此外，本发明人出人意料地发现，通过省略添加nacl和/或kcl中的一者或二者产生了可以更容易和/或更快地冷冻和/或冷冻干燥的mrna制剂。[0853]因此，根据本公开内容，优选在不添加nacl和/或kcl的情况下制备本文中所述的mrnalnp制剂。在一个实施方案中，使用去离子水(例如注射用水)和/或纯化形式的mrna制备mrnalnp制剂。优选地，基本上纯化形式的mrna包含小于0.2％w/v，例如小于0.15％w/v、小于0.10％w/v、小于0.05％w/v或小于0.01％w/v之组合浓度的nacl和kcl。在一个实施方案中，制备的mrnalnp制剂包含小于0.2％w/v，例如小于0.15％w/v、小于0.10％w/v、小于0.05％w/v或小于0.01％w/v之组合浓度的nacl和kcl。[0854]本文中所述的制剂还可包含冷冻保护剂和/或表面活性剂作为稳定剂，以避免产品品质的实质性损失，并且特别是在储存、冷冻和/或冻干期间mrna活性的实质性损失，例如以降低或防止聚集、颗粒塌陷、mrna降解和/或其他类型的损伤。[0855]在一个实施方案中，冷冻保护剂是碳水化合物。本文中使用的术语“碳水化合物”是指并且涵盖单糖、二糖、三糖、寡糖和多糖。[0856]在一个实施方案中，冷冻保护剂是单糖。本文中使用的术语“单糖”是指不能被水解成更简单的碳水化合物单元的单一碳水化合物单元(例如，简单的糖)。一些示例性的单糖冷冻保护剂包括葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、核糖等。[0857]在一个实施方案中，冷冻保护剂是二糖。本文中使用的术语“二糖”是指由2个单糖单元形成的化合物或化学部分，所述单糖单元通过糖苷键联(例如通过1-4键联或1-6键联)键合在一起。二糖可水解成两个单糖。一些示例性的二糖冷冻保护剂包括蔗糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖等。[0858]术语“三糖”意指连接在一起以形成一个分子的三个糖。三糖的一些实例包括棉子糖和松三糖。[0859]在一个实施方案中，冷冻保护剂是寡糖。本文中使用的术语“寡糖”是指由3至约15个、优选3至约10个单糖单元形成的化合物或化学部分，所述单糖单元通过糖苷键联(例如通过1-4键联或1-6键联)键合在一起以形成线性、分支或环状结构。一些示例性的寡糖冷冻保护剂包括环糊精、棉子糖、松三糖、麦芽三糖、水苏糖、阿卡波糖等。寡糖可以被氧化或还原。[0860]在一个实施方案中，冷冻保护剂是环状寡糖。本文中使用的术语“环状寡糖”是指由3至约15个、优选6、7、8、9或10个单糖单元形成的化合物或化学部分，所述单糖单元通过糖苷键联(例如通过1-4键联或1-6键联)键合在一起以形成环状结构。一些示例性的环状寡糖冷冻保护剂包括为离散化合物的环状寡糖，例如α环糊精、β环糊精或γ环糊精。[0861]另一些示例性的环状寡糖冷冻保护剂包括在较大分子结构中包含环糊精部分的化合物，例如包含环状寡糖部分的聚合物。环状寡糖可被氧化或还原，例如被氧化成二羰基形式。本文中使用的术语“环糊精部分”是指并入到较大分子结构(例如聚合物)或其一部分中的环糊精(例如α、β或γ环糊精)基团。环糊精部分可直接或通过任选的接头与一个或更多个另一些部分键合。环糊精部分可被氧化或还原，例如被氧化成二羰基形式。[0862]碳水化合物冷冻保护剂(例如环状寡糖冷冻保护剂)可以是衍生的碳水化合物。例如，在一个实施方案中，冷冻保护剂是衍生的环状寡糖，例如衍生的环糊精，例如2-羟丙基-β-环糊精，例如部分醚化的环糊精(例如，部分醚化的β环糊精)。[0863]示例性的冷冻保护剂是多糖。本文中使用的术语“多糖”是指由至少16个单糖单元形成的化合物或化学部分，并且包括包含多糖作为其骨架结构一部分的聚合物，所述单糖单元通过糖苷键联(例如通过1-4键联或1-6键联)键合在一起以形成线性、支化或环状结构。在骨架中，多糖可以是线性的或环状的。一些示例性的多糖冷冻保护剂包括糖原、淀粉酶、纤维素、葡聚糖、麦芽糖糊精等。[0864]在一个实施方案中，mrnalnp制剂可包含蔗糖。不希望受到理论的束缚，蔗糖发挥促进对制剂的冷冻保护，从而防止核酸(特别是mrna)颗粒聚集并维持组合物的化学和物理稳定性的功能。本公开内容中某些实施方案考虑了蔗糖的替代冷冻保护剂。替代的稳定剂包括但不限于海藻糖和葡萄糖。在一个具体实施方案中，蔗糖的替代稳定剂是海藻糖或者蔗糖与海藻糖的混合物。[0865]优选的冷冻保护剂选自蔗糖、海藻糖、葡萄糖、及其组合，例如蔗糖与海藻糖的组合。在一个优选实施方案中，冷冻保护剂是蔗糖。[0866]优选地，本文中所述的mrnalnp制剂包含使得基于制剂的总重量，制剂的渗量浓度为以下的浓度的冷冻保护剂：约100mosm/kg至约1osm/kg(例如约100mosm/kg至约900mosm/kg、约120mosm/kg至约800mosm/kg、约140mosm/kg至约700mosm/kg、约160mosm/kg至约600mosm/kg、约180mosm/kg至约500mosm/kg、或约200mosm/kg至约400mosm/kg)。[0867]在一个实施方案中，冷冻保护剂的浓度为约5％(w/v)至约15％(w/v)，例如约6％(w/v)至约14％(w/v)、约7％(w/v)至约13％(w/v)、或约8％(w/v)至约12％(w/v)。[0868]在一个优选实施方案中，mrnalnp制剂包含蔗糖和/或海藻糖作为冷冻保护剂以及hepes作为缓冲物质，优选以本文中指定的量/浓度。[0869]在一个实施方案中，本文中所述的制剂包含表面活性剂，例如非离子型三嵌段共聚物，其包含侧接有两个聚氧乙烯(聚(环氧乙烷)，例如2至130个环氧乙烷单元)亲水链的聚氧丙烯(聚(环氧丙烷)，例如15至67个环氧丙烷)的中心疏水链。一些示例性的非离子型三嵌段共聚物可以商标名synperonics、pluronic和kolliphor购得。一种特别有用的表面活性剂是泊洛沙姆(poloxamer)，例如泊洛沙姆188。[0870]本公开内容的某些实施方案考虑了螯合剂在本文中所述的mrnalnp制剂中的用途。螯合剂是指能够与金属离子形成至少两个配位共价键从而产生稳定的水溶性络合物的化合物。不希望受到理论的束缚，螯合剂降低了游离二价离子的浓度，其在本公开内容中可另外地诱导加速的rna降解。合适的螯合剂的一些实例包括但不限于乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid，edta)、edta盐、去铁敏b、去铁胺、二硫碳钠、青霉胺、喷替酸钙、喷替酸钠盐、琥巯酸(succimer)、曲恩汀(trientine)、次氮基三乙酸、反式二氨基环己烷四乙酸(trans-diaminocyclohexanetetraaceticacid，dcta)、二亚乙基三胺五乙酸(diethylenetriaminepentaaceticacid，dtpa)和双(氨基乙基)乙醇醚-n,n,n’,n’‑四乙酸。在某些实施方案中，螯合剂是edta或edta盐。在一个示例性实施方案中，螯合剂是edta二钠二水合物。在一些实施方案中，edta的浓度为约0.05mm至约5mm、约0.1mm至约2.5mm、或约0.25mm至约1mm。[0871]在另一个实施方案中，本文中所述的mrnalnp制剂不包含螯合剂。[0872]药物组合物[0873]本文中所述的mrnalnp制剂可用作或用于制备治疗性或预防性治疗的药物组合物或药物。[0874]本文中所述的mrnalnp可以以任何合适的药物组合物的形式施用。[0875]术语“药物组合物”涉及包含治疗有效剂，优选与可药用载体、稀释剂和/或赋形剂一起的治疗有效剂的组合物。所述药物组合物可用于通过向对象施用所述药物组合物来治疗、预防疾病或病症或者减轻疾病或病症的严重程度。在本公开内容的上下文中，药物组合物包含如本文中所述的mrnalnp。[0876]本公开内容的药物组合物可包含一种或更多种佐剂，或者可与一种或更多种佐剂一起施用。术语“佐剂”涉及延长、增强或加速免疫应答的化合物。佐剂包含化合物例如油乳剂(例如，弗氏佐剂(freund’sadjuvant))、矿物化合物(例如明矾)、细菌产物(例如百日咳鲍特菌(bordetellapertussis)毒素)或免疫刺激复合物的非均质组。佐剂的实例包括但不限于lps、gp96、cpg寡脱氧核苷酸、生长因子和细胞因子，例如单核因子、淋巴因子、白介素、趋化因子。趋化因子可以是il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-12、infa、inf-γ、gm-csf、lt-a。另一些已知的佐剂是氢氧化铝、弗氏佐剂或油剂例如isa51。用于本公开内容的另一些合适的佐剂包括脂肽例如pam3cys，以及亲脂性组分例如皂苷、海藻糖-6,6-二山嵛酸酯(tdb)、单磷酰脂质-a(mpl)、单分枝酰甘油(monomycoloylglycerol，mmg)或吡喃葡萄糖基脂质佐剂(glucopyranosyllipidadjuvant，gla)。[0877]本公开内容的药物组合物可以是可储存形式(例如，冷冻或冻干/冷冻干燥形式)或以“即用形式”(即，可立即施用于对象的形式，例如，无需任何处理例如稀释)。因此，在施用可储存形式的药物组合物之前，必须将该可储存形式处理或转化成即用或可施用的形式。例如，必须将冷冻的药物组合物解冻，或者必须将冷冻干燥药物组合物重构，优选通过使用合适的溶剂(例如，去离子水，例如注射用水)或液体(例如，水溶液)。[0878]在一个实施方案中，以可储存形式(例如，冷冻或冻干/冷冻干燥形式)的药物组合物可在约-30℃或更高(例如约-25℃或更高)的温度下储存。例如，本文中所述的冷冻的药物组合物(例如通过第一或第二方面的方法制备的冷冻的药物组合物，或者第三、第八、第九或第十方面的冷冻的药物组合物)可以在约-30℃至约-10℃(例如约-25℃至约-15℃或约-25℃至约-20℃)的温度下或者在约-20℃的温度下储存。本文中所述的冷冻干燥药物组合物(例如通过第一或第二方面的方法制备的冷冻干燥药物组合物，或者第四、第八、第九或第十方面的冷冻干燥药物组合物)可以在约-25至约室温(例如约-15℃至约8℃、约-10℃至约2℃或约-5℃至约0℃)的温度下储存。[0879]在以可储存形式(例如，以冷冻或冻干/冷冻干燥形式)的药物组合物的一个实施方案中，药物组合物可储存至少3个月，优选至少6个月，更优选至少12个月，更优选至少18个月，更优选至少24个月，更优选至少30个月，更优选至少36个月。[0880]在以冷冻形式的药物组合物的一个实施方案中，在将冷冻的药物组合物解冻之后lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi等于冷冻之前lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi。例如，如果即用型药物组合物是由本文中所述的冷冻的药物组合物制备的，则优选包含在即用型药物组合物中的lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi等于冷冻之前包含在冷冻的药物组合物中(例如包含在第一方面的方法的步骤(i)中制备的制剂中)的lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi。[0881]在以冻干/冷冻干燥形式的药物组合物的一个实施方案中，在将冷冻干燥药物组合物重构之后lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi等于冷冻干燥之前lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi。例如，如果即用型药物组合物是由本文中所述的冻干/冷冻干燥的药物组合物制备的，则优选包含在即用型药物组合物中的lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi等于冷冻干燥之前包含在冻干/冷冻干燥的药物组合物中(例如包含在第一方面的方法的步骤(i)中制备的制剂中)的lnp的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi。[0882]根据本公开内容的药物组合物通常以“药物有效量”和以“可药用制剂”施加。[0883]术语“可药用的”是指不与药物组合物的活性组分的作用相互作用的物质的无毒性。[0884]术语“药物有效量”是指单独或与另一些剂量一起实现期望的反应或期望的作用的量。在治疗特定疾病的情况下，期望的反应优选地涉及抑制疾病进程。这包括减缓疾病的进展，并且特别是中断或逆转疾病的进展。治疗疾病的期望反应也可以为延迟所述疾病或所述病症的发作或预防其发作。本文中所述颗粒或药物组合物的有效量将取决于：待治疗的病症，疾病的严重程度，患者的个体参数包括年龄、生理状况、大小和体重，治疗的持续时间，伴随治疗(如果有的话)的类型，具体施用途径和类似因素。因此，本文中所述的颗粒或药物组合物的施用剂量可取决于多种这样的参数。在初始剂量下患者中的反应不充分的情况下，可使用更高的剂量(或通过不同的更局部的施用途径实现有效更高的剂量)。[0885]本公开内容的药物组合物可包含缓冲剂(特别是，来源于用于制备药物组合物的mrnalnp制剂)、防腐剂和任选的另一些治疗剂。在一个实施方案中，本公开内容的药物组合物，特别是即用型药物组合物，包含一种或更多种的可药用载体、稀释剂和/或赋形剂。[0886]用于本公开内容的药物组合物的合适的防腐剂包括但不限于苯扎氯铵、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。[0887]本文中使用的术语“赋形剂”是指可存在于本公开内容的药物组合物中但不是活性成分的物质。赋形剂的一些实例包括但不限于载体、黏合剂、稀释剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、矫味剂或着色剂。[0888]“可药用盐”包括，例如酸加成盐，其可例如通过使用可药用酸(例如盐酸、硫酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、乙酸、苯甲酸、柠檬酸、酒石酸、碳酸或磷酸)形成。此外，合适的可药用盐可包括碱金属盐(例如，钠盐或钾盐)；碱土金属盐(例如，钙盐或镁盐)；铵(nh4 )；以及与合适的有机配体(例如，使用反荷阴离子例如卤化物、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、烷基磺酸根和芳基磺酸根形成的季铵和胺阳离子)形成的盐。可药用盐的一些示例性实例包括但不限于：乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、精氨酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、溴化物、丁酸盐、乙二胺四乙酸钙、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、右旋樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、克拉维酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、二盐酸盐、十二烷基硫酸盐、乙二胺四乙酸盐、乙二磺酸盐、依托酸盐(estolate)、乙磺酸盐(esylate)、乙磺酸盐(ethanesulfonate)、甲酸盐、富马酸盐、半乳酸盐(galactate)、半乳糖醛酸盐、葡萄糖酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、甘油磷酸盐、乙醇酰阿散酸盐(glycolylarsanilate)、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、己基间苯二酚盐、海巴明(hydrabamine)、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、羟基萘酸盐、碘化物、异丁酸盐、异硫氰酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲烷磺酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、2-萘磺酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、n-甲基葡萄糖铵盐、油酸盐、草酸盐、扑酸盐(双羟萘酸盐)、棕榈酸盐、泛酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、邻苯二甲酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、硫酸盐、辛二酸盐、琥珀酸盐、鞣酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、甲苯磺酸盐、三乙基碘盐(triethiodide)、十一烷酸盐、戊酸盐等(参见，例如，s.m.bergeetal.,“pharmaceuticalsalts”,j.pharm.sci.,66,第1至19页(1977))。非可药用盐可用于制备可药用盐，并包括在本公开内容中。[0889]术语“稀释剂”涉及稀释剂(dilutingagent)和/或稀化剂(thinningagent)。此外，术语“稀释剂”包括流体、液体或固体悬浮剂和/或混合介质中的任一种或更多种。合适的稀释剂的一些实例包括乙醇、甘油和水。[0890]术语“载体”是指可以是天然的、合成的、有机的、无机的组分，在其中将活性组分组合以促进、增强或实现药物组合物的施用。本文中使用的载体可以是适合于施用于对象的一种或更多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。合适的载体包括但不限于无菌水、林格液(ringer)、乳酸林格液、无菌氯化钠溶液、等张盐水、聚亚烷基二醇、氢化萘，并且特别是生物相容的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物。在一个实施方案中，本公开内容的即用型药物组合物包括等张盐水。[0891]用于治疗用途的可药用载体、赋形剂或稀释剂在药学领域中是公知的，并且描述于例如remington’spharmaceuticalsciences,mackpublishingco.(a.rgennaroedit.1985)中。[0892]可根据预期的施用途径和标准药学实践来选择药物载体、赋形剂或稀释剂。[0893]药物组合物的施用途径[0894]在一个实施方案中，本文中所述的即用型药物组合物可以静脉内、动脉内、皮下、皮内、皮肤(dermally)、经鼻内、肌内或瘤内施用。在某些实施方案中，药物组合物配制成用于局部施用或全身性施用。全身性施用可包括涉及通过胃肠道吸收的肠施用，或肠胃外施用。本文中使用的“肠胃外施用”是指以除通过胃肠道之外的任何方式施用，例如通过静脉内注射。在一个优选实施方案中，药物组合物，特别是即用型药物组合物，配制成用于全身性施用。在另一个优选实施方案中，全身性施用是通过静脉内施用。[0895]药物组合物的用途[0896]本文中所述的mrna颗粒可用于多种疾病的治疗性或预防性治疗，特别是其中向对象提供肽或蛋白质导致治疗性或预防性作用的疾病。例如，提供来源于病毒的抗原或表位可用于治疗由所述病毒引起的病毒性疾病。提供肿瘤抗原或表位可用于治疗其中癌细胞表达所述肿瘤抗原的癌症疾病。提供功能性蛋白质或酶可用于治疗特征在于功能异常性蛋白质(例如溶酶体贮积病(例如黏多糖贮积症)中的功能异常性蛋白质)或因子缺乏的遗传性病症。提供细胞因子或细胞因子融合体可用于调节肿瘤微环境。[0897]术语“疾病”(在本文中也称为“病症”)是指影响个体身体的异常状况。疾病通常被解释为与特定症状和体征相关的医学病症。疾病可由最初来自外部来源的因素引起，例如感染性疾病，或者疾病可由内部功能障碍引起，例如自身免疫病。在人中，“疾病”通常被更广泛地用于指引起以下的任何病症：痛苦、功能障碍、困扰、社会问题、或所折磨个体的死亡、或与接触个体的那些类似的问题。从广义上讲，疾病有时包括损伤、残疾、病症、综合征、感染、孤立的症状、异常行为以及结构和功能的非典型变化，而在另一些情况下和出于其他目的，这些可被视为可区分的类别。疾病通常不仅在身体上影响个体而且在情感上影响个体，因为感染多种疾病和在有多种疾病的情况下生活可改变人对生活的看法和人的性格。[0898]在本发明上下文中，术语“治疗”及其变化形式或“治疗性干预”涉及出于对抗病症(例如疾病或障碍)的目的对对象的管理和护理。该术语旨在包括针对对象所遭受的给定病症的全谱治疗，例如施用治疗有效的化合物以减轻症状或并发症，延缓疾病、障碍或病症的进展，缓解或减轻症状和并发症，和/或治愈或消除疾病、障碍或病症以及预防病症，其中预防应当理解为出于对抗疾病、病症或障碍的目的对个体的管理和护理，并且包括施用活性化合物以预防症状或并发症的发作。[0899]术语“治疗性治疗”涉及改善健康状况和/或延长(提高)个体寿命的任何治疗。所述治疗可以在个体中消除疾病、在个体中阻止或减慢疾病的发展、在个体中抑制或减慢疾病的发展、在个体中降低症状的频率或严重程度、和/或在当前患有或以前患有疾病的个体中降低复发。[0900]术语“预防性治疗”或“防止性治疗”涉及旨在在个体中防止疾病发生的任何治疗。术语“预防性治疗”或“防止性治疗”在本文中可互换使用。[0901]术语“个体”和“对象”在本文中可互换使用。它们是指可能患有疾病或病症(例如，癌症、感染性疾病)或易于患有疾病或病症(例如，癌症、感染性疾病)但可患有或可未患有疾病或病症或者可需要预防性干预(例如疫苗接种)或者可需要进行干预(例如通过蛋白质替代)的人或另一些哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类)或任何其他非哺乳动物(包括鸟类(鸡)、鱼或任何其他动物物种)。在许多实施方案中，个体是人。除非另有说明，否则术语“个体”和“对象”不意指特定年龄，并因此涵盖成年人、老年人、儿童和新生儿。在本公开内容的一些实施方案中，“个体”或“对象”是“患者”。[0902]术语“患者”意指治疗的个体或对象，特别是患病的个体或对象。[0903]在本公开内容的一个实施方案中，目的是通过疫苗接种提供针对感染性疾病的保护。[0904]在本公开内容的一个实施方案中，目的是向对象，特别是有此需要的对象提供分泌的治疗性蛋白质，例如抗体、双特异性抗体、细胞因子、细胞因子融合蛋白、酶。[0905]在本公开内容的一个实施方案中，目的是向对象，特别是有此需要的对象提供蛋白质替代治疗，例如促红细胞生成素、因子vii、冯·维勒布兰德因子、β-半乳糖苷酶、α-n-乙酰葡糖胺糖苷酶的产生。[0906]在本公开内容的一个实施方案中，目的是调节/重编程血液中的免疫细胞。[0907]本领域技术人员将知道，免疫治疗和疫苗接种的原理之一是基于这样的事实：通过用在免疫学上与待治疗的疾病相关的抗原或表位对对象进行免疫接种来产生针对疾病的免疫保护反应。因此，本文中所述的药物组合物可用于诱导或增强免疫应答。因此，本文中所述的药物组合物可用于涉及抗原或表位的疾病的预防性和/或治疗性治疗。[0908]术语“免疫接种”或“疫苗接种”描述了以诱导免疫应答为目的例如出于治疗性或预防性的原因而向个体施用抗原的过程。[0909]本文中所引用的文件和研究的引证并不旨在承认任何前述内容是相关的现有技术。关于这些文件内容的所有陈述都是基于申请人可获得的信息，并不构成对这些文件内容正确性的任何承认。[0910]呈现该描述(包括以下实施例)是为了使本领域普通技术人员能够制备和使用多种实施方案。对特定装置、技术和应用的描述仅作为实例提供。对本文中所述实施例的多种修改对于本领域普通技术人员而言将是明显的，并且在不脱离多个实施方案的精神和范围的情况下，本文中定义的一般原理可应用于另一些实施例和应用。因此，多个实施方案不旨在限于本文中描述和示出的实施例，而是与符合与权利要求书相一致的范围。实施例[0911]方法[0912]rna脂质纳米粒的制备[0913]此处以dodma作为阳离子可电离脂质的实例，通过使用所谓的c12制剂作为实例来描述制备方案。同样的方案也适用于其他阳离子可电离脂质。因此，也可以如所述来制备和稳定具有阳离子可电离脂质与rna之间的比率(n/p比)(例如更高或更低的n/p比)的其他制剂，包括负电荷过量的那些。另外，可以使用其他脂质比率(磷脂、胆固醇、聚合物缀合的脂质)，以及其他类型的聚合物缀合的脂质(例如，聚肌氨酸脂质)。该方案也适用于没有任何聚合物缀合的脂质的产品。[0914]通过水性-乙醇混合方案来制备rna脂质纳米粒。简言之，将在hepes10mm、edta0.1mm、ph7.0的水性缓冲液条件下的rna与包含摩尔比分别为40:10:48:2的dodma、dope、胆固醇和c16-peg2000-神经酰胺的乙醇c12脂质混合物以3份rna和1份脂质混合物的体积比混合。使用基于标准注射泵的装置(set-up)以250ml/ml(对于水性组分为187.5ml/分钟，对于乙醇组分为62.5ml/分钟)的总流量使用y混合元件来实现混合。以1:1的体积比用hepes缓冲液20mm，ph6.0进一步稀释脂质纳米粒原胶体，并进一步相对于hepes缓冲液20mm，ph6.0进行切向流过滤，以进行缓冲液交换和除去乙醇。在渗滤完成之后，将制剂浓缩(upconcentrate)2倍。随后，用补充的hepes缓冲液20mm，ph6.0或选择的具有40％w/v蔗糖的另一些缓冲液来稀释缓冲液交换的脂质纳米粒，使得脂质纳米粒制剂中的最终rna浓度为0.2mg/ml，并且蔗糖含量为10％w/v。在基准设置中，以4:1的n/p比制备rna-脂质纳米粒。[0915]rna脂质复合物的制备[0916]通过水性-水性方案制备rna脂质复合物。简言之，将在hepes10mm、edta0.1mm、ph7.0的水性缓冲液条件下的rna与由5mm乙酸水溶液中的摩尔比分别为40:10:48:2的dodma、dope、胆固醇和c16-peg2000-神经酰胺构成的c12脂质体以1:1的体积比混合。使用基于标准注射泵的装置以250ml/ml(各相均为125ml/分钟)的总流量使用y混合元件来实现混合。然后用补充有50％w/v蔗糖的相应选择的缓冲液来稀释rna-脂质复合物原液，使得脂质复合物中的最终rna浓度为0.1mg/ml，并且蔗糖含量为10％w/v。在基准设置中，以4:1的n/p比制备rna-脂质纳米粒。[0917]rna制剂的表征[0918]使用dynaproplatereaderii(wyatt，dernbach，germany)通过动态光散射来确定颗粒尺寸分析。根据测量结果，使用dynamics7.8.1.3软件通过累积量分析来计算尺寸(z平均值)和多分散性指数(pdi)。使用毛细管凝胶电泳进一步分析rna的完整性。[0919]冻融研究[0920]通过将制剂从-20℃(过夜)到 25℃(2小时)循环三至五次进行冻融研究。测量冻融样品的制剂的颗粒尺寸和多分散性指数，并将结果与冷冻对照样品进行比较。[0921]长期稳定性研究[0922]通过将制剂在-20℃下长时期储存进行长期稳定性研究，并且定期评估物理化学特性，例如：1个月、3个月、6个月、12个月、18个月等。在每个时间点下，将制剂解冻至 25℃持续2小时，并评估物理化学特性，例如颗粒尺寸和多分散性指数。[0923]制剂的冷冻干燥[0924]使用具有一个面积为0.108m2的搁板(shelf)和4kg的冰冷凝器容量的epsilon2-4lsc冻干机(martinchristgefriertrocknungsanlagengmbh)进行冷冻干燥。简言之，使2r小瓶填充1ml制剂，并使用金属托盘将其装载在冷冻干燥机的搁板上。将搁板以1℃/分钟从20℃冷却至-40℃，并保持1小时。对于初步干燥，使搁板温度以1℃/分钟升高至-20℃，并且压力降低至60毫托(8pa)并保持15小时。对于二次干燥，使搁板温度以0.1℃/分钟升高至40℃，并在10毫托(1.3pa)下保持10小时。在二次干燥结束之后，将样品在20℃下卸载，使室填充有空气，并迅速人工密封小瓶以避免水凝结。将旨在用于储存稳定性实验的样品立即用铝盖密封。对于分析，将样品用1ml水重构。[0925]实施例1[0926]所有lnp均用以单批次相同的方法制备。将该批次相对于水进行透析，以便从主体相(bulkphase)中除去所有分子上溶解的部分，例如离子和乙醇。随后，用如所示的缓冲液/蔗糖混合物稀释该批次的级分，得到缓冲液浓度为20mm、ph6.0，蔗糖浓度为10％以及rna浓度为0.2mg/ml。仅在tris的情况下，浓度为10mm，ph为7.3，并且蔗糖浓度为9％。[0927]图1示出了来自将脂质纳米粒(lnp)在-20℃下冷冻和储存不同的冻融循环的结果。如可以看出的，对于某些缓冲液，出现了颗粒尺寸的增加，其中对于不同的缓冲液体系，尺寸增加的量是不同的。而对于hepes，颗粒尺寸实际上保持不变，其在存在所有其他缓冲液的情况下显著增加。[0928]实施例2[0929]使用水性-水性方案制备脂质复合物：将rna的水溶液与5mm乙酸中c12脂质体的水性分散体以4:1的n/p比混合。随后，用不同的缓冲液/蔗糖混合物进一步稀释主体脂质复合物(bulklipoplex)，使得脂质复合物中的最终rna浓度为0.1mg/ml，并且最终基质中的蔗糖含量为10％w/v。所有缓冲液的浓度均为20mm。hepes和组氨酸缓冲液的ph为6.0，而tris7.0构成，而乙醇相补充有20mm乙酸。阳离子可电离脂质:dope:胆固醇:c16-peg2000-神经酰胺的摩尔比分别为40:10:48:2。然后将脂质纳米粒原胶体相对于hepes缓冲液20mm、ph6.0进行透析，并进一步用hepes/suc混合物稀释，使得脂质纳米粒中的最终rna浓度为0.2mg/ml，并且蔗糖的最终浓度为10％w/v。[0939]图5a示出了在-20℃下三次冻融循环之前和之后rna脂质纳米粒的颗粒尺寸数据。如从图中明显的是，hepes/suc基质的稳定作用也适用于广泛范围的n/p比。图4b还示出了这些脂质纳米粒的长期稳定性，其进一步证实了冻融研究中的发现。还监测了所有其他的物理化学特性，例如ph、渗量浓度、亚可见颗粒、rna含量、rna包封和rna完整性。[0940]实施例6[0941]用水性-乙醇混合方案制备脂质纳米粒：将rna水溶液与如所示c12脂质混合物的乙醇溶液以3:1的体积比以12ml/分钟的总流量使用nanoassemblr装置(precisionnanosystems)混合，以实现4:1的n/p比。rna相缓冲液由hepes10mm、edta0.1mm，ph7.0构成，而乙醇相补充有浓度为20mm的如所示的不同酸化剂。阳离子可电离脂质:dope:胆固醇:c16-peg2000-神经酰胺的摩尔比分别为40:10:48:2。然后将脂质纳米粒原胶体相对于hepes缓冲液20mm、ph6.0进行透析，并进一步用hepes/suc混合物稀释，使得脂质纳米粒中的最终rna浓度为0.2mg/ml，并且蔗糖的最终浓度为10％w/v。[0942]图6a示出了在-20℃下三次冻融循环之前和之后rna脂质纳米粒的颗粒尺寸数据。如从图中明显的是，hepes/suc基质的稳定作用也适用于广泛范围的脂质相中的酸化剂，其对于颗粒形成至关重要。图6b还示出了这些脂质纳米粒的长期稳定性，其中可以看到与柠檬酸相比，乙酸是用于更高的稳定作用的优选酸化剂。还监测了所有其他的物理化学特性，例如ph、渗量浓度、亚可见颗粒、rna含量、rna包封和rna完整性。[0943]实施例7[0944]用水性-乙醇混合方案制备脂质纳米粒：将rna的水溶液与如所示c12脂质混合物的乙醇溶液以3:1的体积比以12ml/分钟的总流量使用nanoassemblr装置(precisionnanosystems)混合，以实现4:1的n/p比。rna相缓冲液由hepes10mm、edta0.1mm，ph7.0构成，而乙醇相补充有20mm乙酸。可电离脂质:dope:胆固醇:c16-peg2000-神经酰胺的摩尔比分别为40:10:48:2。然后将脂质纳米粒原胶体相对于20mmhepes缓冲液在如所示的不同ph下进行透析，并进一步用补充有suc的相应缓冲液稀释，使得脂质纳米粒中的rna的最终浓度为0.2mg/ml，并且蔗糖的最终浓度为10％w/v。[0945]图7示出了在一段时间内在-20℃下rna脂质纳米粒的颗粒尺寸。如从图中明显的是，与ph7.0中相比，hepes/suc基质的稳定作用在ph6.0时最有效。还监测了所有其他的物理化学特性，例如ph、渗量浓度、亚可见颗粒、rna含量、rna包封和rna完整性。[0946]实施例8[0947]所有lnp均用与单批次相同的方法制备。将该批次相对于水进行透析，以便从主体相中除去所有分子上溶解的部分，例如离子和乙醇。随后，用hepes/蔗糖混合物采用不同量的edta含量(如所示)来稀释该批次的级分，得到缓冲液浓度为20mm、ph6.0，蔗糖浓度为10％以及rna浓度为0.2mg/ml。[0948]图8示出了一段时间内在-20℃下rna脂质纳米粒的颗粒尺寸。如从图中明显的是，在不存在edta的情况下，实现了hepes/suc基质的最高的稳定作用；然而，在一定程度上，螯合剂可包含在基质中。[0949]实施例9[0950]图9示出了适用于以脱水状态稳定脂质纳米粒的冷冻干燥循环。简言之，将2r小瓶填充1ml制剂，并使用金属托盘将其装载在冷冻干燥机的隔板上。将搁板以1℃/分钟从20℃冷却至-40℃，并保持1小时。对于初步干燥，将搁板温度以1℃/分钟升高至-20℃，并且使压力降低至60毫托(8pa)并保持15小时。对于二次干燥，将搁板温度以0.1℃/分钟升高至40℃，并在10毫托(1.3pa)下保持10小时。在二次干燥结束之后，将样品在20℃下卸载，使室填充有空气，并迅速人工密封小瓶以避免水凝结。将旨在用于储存稳定性实验的样品立即用铝盖密封。对于分析，将样品用1ml水重构。[0951]实施例10[0952]所有lnp均用与单批次相同的方法制备。将该批次相对于水进行透析，以便从主体相中除去所有分子上溶解的部分，例如离子和乙醇。随后，用hepes/蔗糖混合物稀释该批次，得到缓冲液浓度为20mm、ph6.0，蔗糖浓度为10％以及rna浓度为0.2mg/ml。[0953]图10a示出了在4℃冷藏条件下冷冻干燥的rna脂质纳米粒的长期胶体稳定性作为颗粒尺寸的函数。如从图中明显的是，在存在hepes/suc基质的情况下冷冻干燥可在长时期内稳定rna脂质纳米粒的胶体特性。图10b和10c还分别示出了在25℃和40℃的较高温度下的稳定性。还监测了冷冻干燥的制剂的其他物理化学参数。*在t0处示出的颗粒尺寸对应于冷冻干燥之前的颗粒尺寸。[0954]实施例11[0955]所有lnp均用与单批次相同的方法制备。将该批次相对于水进行透析，以便从主体相中除去所有分子上溶解的部分，例如离子和乙醇。随后，用如所示的缓冲液/蔗糖混合物稀释该批次的级分，得到缓冲液浓度为20mm、ph6.0，蔗糖浓度为10％以及rna浓度为0.2mg/ml。仅在tris的情况下，最终ph设定为7.0并且所得缓冲液的浓度为10mm。[0956]图11示出了冷冻干燥对rna脂质纳米粒的胶体特性作为储存基质的函数的影响。如从图中明显的是，与组氨酸/suc和tris/suc基质的稳定作用相比，在脱水形式中hepes/suc基质对脂质纳米粒的稳定作用更高。[0957]另外的实验揭示了，所使用的填充剂(例如蔗糖或海藻糖)的类型没有影响。另一些实验揭示了，基质中蔗糖和/或缓冲液的浓度对hepes/suc的稳定作用也没有显著影响。[0958]还评价了离子对脂质纳米粒的冷冻干燥过程的影响，并且发现浓度为20mm的氯化钠对hepes/suc基质的稳定作用具有不利影响。[0959]在另一方面，发现泊洛沙姆对hepes/suc基质的稳定作用没有不利影响。[0960]冷冻干燥过程在两种不同浓度：0.2mg/ml和0.02mg/ml下进行，并且在存在hepes/suc基质的情况下没有观察到浓度的影响。[0961]此外，还使用hepes/suc作为储存基质来冷冻干燥具有不同阳离子可电离脂质的rna脂质纳米粒，并且观察到储存基质和冷冻干燥方案二者均可用于多种脂质纳米粒。类似地，也对具有不同n/p比的rna脂质纳米粒进行冷冻干燥，并且发现所提出的条件组适用于具有广泛范围n/p比(例如n/p4至8)的制剂。[0962]实施例12[0963]使用水性-水性方案制备脂质复合物：将rna的水溶液与5mm乙酸中c12脂质体的水性分散体以4:1的n/p比混合。rna相包含20mm乙酸钠缓冲液ph5.4。随后，用不同浓度的蔗糖溶液进一步稀释主体脂质复合物，使得脂质复合物中的最终rna浓度为0.1mg/ml，并且最终基质中的蔗糖含量如所示。[0964]图12示出了在-20℃下冷冻对分散在包含不同量蔗糖的水性介质中的rna脂质复合物的胶体特性的影响。如从图中明显的是，除了不具有蔗糖的制剂之外，对于-20℃下的1个冻融循环，包含蔗糖的所有制剂均维持胶体特性。[0965]实施例13[0966]使用水性-乙醇混合方案用经修饰lucrna制备rnalnp，并如实施例9中所述进行冷冻干燥。在使用图9中所示的循环对lnp进行冻干之后，分配于小瓶以用于在4、25和40℃的温度下进行长期储存。在稳定性实验期间进行的主要读出是分别使用pcs和片段分析仪测量的lnp的尺寸和rna完整性。[0967]该实施例中的脂质组合物(称为c12脂质纳米粒)包含dodma/dope/peg/胆固醇，并且在多种缓冲液中进行测试。3次冻干/稳定性运行(run)在三种不同的温度下进行。不同批次lnp情况下的两个实验中的缓冲液是hepes20mm，蔗糖10％w/v，ph6(图13至16)。在最后一次运行中(图17和18)中，测试了另一些缓冲液的组成、浓度、ph和冻干保护剂(参见下表)：[0968]不同缓冲液组成中的c12脂质纳米粒：[0969]组组成1hepes20mm,蔗糖10％w/v,ph6.0,浓度0.2mg/ml2hepes20mm,蔗糖10％w/v,ph6.0,浓度0.02mg/ml3hepes20mm,海藻糖10％w/v,ph6.0,浓度0.2mg/ml4组氨酸20mm,蔗糖10％w/v,ph6.0,浓度0.2mg/ml5tris10mm,蔗糖10％.ph7.0.浓度0.02mg/ml6hepes20mm,蔗糖5％w/v,ph6.0,浓度0.2mg/ml7hepes20mm,蔗糖10％w/v,nacl20mm,ph6.0,浓度0.2mg/ml8hepes20mm,蔗糖10％w/v,泊洛沙姆1880.1％w/v,ph6.0,浓度0.2mg/ml[0970]可以观察到，胶体稳定性取决于缓冲液类型：[0971]a.在冻干之后很快尺寸增加，但其大小(magnitude)取决于缓冲液，例如在tris缓冲液或在并入的nacl(spikednacl)下或者在组氨酸缓冲液中，尺寸显著增加。[0972]b.在4、25、40℃下长期储存期间，lnp的尺寸不变，除了在40℃下具有tris的缓冲液、具有并入的nacl的缓冲液之外。[0973]此外，rna完整性稳定性取决于温度，缓冲液组成对rna完整性稳定性影响很小甚至没有影响。其在4℃下稳定长达20个月，而其在25℃下在6个月内从80％降解至60％。40℃储存导致在2个月内快速降解。[0974]实施例14[0975]如实施例13所述进行制备和冷冻干燥。与实施例13相反，脂质组合物包含dodma/dspc/psar/胆固醇。所使用的缓冲液是hepes20mm，蔗糖10％w/v，ph6。除此之外，实验条件与上述相同。结果表明，在这种情况下，在冻干之后很快尺寸没有增加，并且其在4、25和40℃下胶体稳定至少6个月(图19)。rna完整性在4℃下稳定6个月(图20)。rna完整性稳定性取决于温度，缓冲液组成对rna完整性稳定性影响很小甚至没有影响。其在4℃下稳定长达20个月，而其在25℃下在6个月内从80％降解至60％。40℃储存导致在2个月内快速降解。当前第1页12当前第1页12
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