人源化抗补体因子Bb抗体及其用途的制作方法

人源化抗补体因子bb抗体及其用途
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2020年4月20日提交的美国临时申请序列号63/012,590的优先权，将其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
3.本技术涉及人源化抗因子bb抗体以及所述抗体的用途。


背景技术：

4.补体系统是先天性免疫系统的一部分。其主要作用是“补充”抗体和吞噬细胞清除生物体中有害病原体的能力。补体系统包括三种单独的上游激活途径(经典途径、旁路途径和凝集素途径)，所有这些途径均汇聚在共同的末端途径上。因子b是补体旁路途径的组分，并且可以分解为因子ba和因子bb。因子b还含有丝氨酸蛋白酶(sp)结构域，并且当被激活时，它提供了旁路途径c3和c5转化酶的催化活性。补体系统的异常激活可以在多种病理环境(范围为从自身免疫性疾病到器官移植)中对宿主组织造成损害。仍然存在对于治疗与补体系统相关的疾病或障碍的需要。本发明解决了这一需要和其他需要。


技术实现要素：

5.在一些方面，本公开文本提供了人源化抗因子bb抗体、包含所述抗体的组合物、产生所述抗体的方法以及使用所述抗体例如用于治疗补体介导的疾病或障碍的方法。如本文提供的数据所示，本公开文本的人源化抗因子bb抗体的结合亲和力在母体抗体的结合亲和力的两倍以内。出乎意料的是，将亲本小鼠抗因子bb抗体人源化的最初尝试产生了大多数缺乏可接受的结合亲和力的变体。因此，为了产生具有适当结合亲和力的人源化形式(例如，以治疗补体介导的疾病或障碍)，需要多轮人源化。此外，仅某些vh和v
l
结构域才可以组合产生以可接受的结合亲和力与因子bb结合的抗体，参见例如实施例1表9中测试的抗体。
6.本公开文本的一些方面提供了一种人源化抗体，所述人源化抗体与人补体因子bb蛋白特异性结合并且包含含有seq id no:19的氨基酸序列的重链可变区(vh)和含有seq id no:27的氨基酸序列的轻链可变区(v
l
)。
7.本公开文本的其他方面提供了一种人源化抗体，所述人源化抗体与人补体因子bb蛋白特异性结合并且包含含有seq id no:17的氨基酸序列的vh和含有seq id no:26的氨基酸序列的v
l
。
8.在一些实施方案中，所述人源化抗体以10-6
至10-9
m的亲和力与所述人补体因子bb蛋白特异性结合。
9.在一些实施方案中，所述人源化抗体抑制补体途径活性。在一些实施方案中，所述补体途径活性是所述旁路途径(ap)活性。
10.在一些实施方案中，所述补体ap活性选自：ap介导的末端膜攻击复合物(mac)沉积、ap介导的溶血、红细胞或其他细胞类型上的c3片段沉积、c3b/bb介导的c3的切割和
c3bbb3b介导的c5的切割。
11.在一些实施方案中，所述人源化抗体是双特异性抗体或多特异性抗体。
12.在一些实施方案中，所述人源化抗体选自ig单体、fab片段、f(ab’)2片段、scfv、scab和fv。
13.在一些实施方案中，所述人源化抗体包含同种型igg1、igg2、igg3或igg4的重链恒定区。
14.在一些实施方案中，所述人源化抗体包含igg4恒定区或其变体。
15.在一些实施方案中，所述重链恒定区包含与seq id no:28-30中的任一个至少90％相同的氨基酸序列。
16.在一些实施方案中，所述人源化抗体包含含有seq id no:32-34中的任一个的氨基酸序列的重链和含有seq id no:35的氨基酸序列的轻链。
17.在一些实施方案中，所述人源化抗体包含含有seq id no:36-38中的任一个的氨基酸序列的重链和含有seq id no:39的氨基酸序列的轻链。
18.本文还提供了包含本公开文本的人源化抗体的缀合物。
19.在一些实施方案中，缀合物的人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:19的氨基酸序列的vh和含有seq id no:27的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，缀合物的人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:34的氨基酸序列的重链和含有seq id no:35的氨基酸序列的轻链。
20.在一些实施方案中，缀合物的人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:17的氨基酸序列的vh和含有seq id no:26的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，缀合物的人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:38的氨基酸序列的重链和含有seq id no:39的氨基酸序列的轻链。
21.本文进一步提供了包含本文所述的人源化抗体或本文所述的缀合物的药物组合物。
22.在一些实施方案中，药物组合物包含人源化抗因子bb抗体，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:19的氨基酸序列的vh和含有seq id no:27的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，药物组合物包含人源化抗因子bb抗体，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:34的氨基酸序列的重链和含有seq id no:35的氨基酸序列的轻链。
23.在一些实施方案中，药物组合物包含人源化抗因子bb抗体，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:17的氨基酸序列的vh和含有seq id no:26的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，药物组合物包含人源化抗因子bb抗体，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:38的氨基酸序列的重链和含有seq id no:39的氨基酸序列的轻链。
24.在一些实施方案中，药物组合物包含含有人源化抗因子bb抗体的缀合物，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:19的氨基酸序列的vh和含有seq id no:27的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，药物组合物包含含有人源化抗因子bb抗体的缀合物，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:34的氨基酸序列的重链和含有seq id no:35的氨基酸序列的轻链。
25.在一些实施方案中，药物组合物包含含有人源化抗因子bb抗体的缀合物，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:17的氨基酸序列的vh和含有seq id no:26的氨基
酸序列的v
l
。在一些实施方案中，药物组合物包含含有人源化抗因子bb抗体的缀合物，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:38的氨基酸序列的重链和含有seq id no:39的氨基酸序列的轻链。
26.在一些实施方案中，药物组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。
27.本文还提供了包含本文所述的人源化抗体、本文所述的缀合物或本文所述的药物组合物的装置。
28.在一些实施方案中，装置包含人源化抗因子bb抗体，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:19的氨基酸序列的vh和含有seq id no:27的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，装置包含人源化抗因子bb抗体，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:34的氨基酸序列的重链和含有seq id no:35的氨基酸序列的轻链。
29.在一些实施方案中，装置包含人源化抗因子bb抗体，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:17的氨基酸序列的vh和含有seq id no:26的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，装置包含人源化抗因子bb抗体，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:38的氨基酸序列的重链和含有seq id no:39的氨基酸序列的轻链。
30.在一些实施方案中，装置包含含有人源化抗因子bb抗体的缀合物，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:19的氨基酸序列的vh和含有seq id no:27的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，装置包含含有人源化抗因子bb抗体的缀合物，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:34的氨基酸序列的重链和含有seq id no:35的氨基酸序列的轻链。
31.在一些实施方案中，装置包含含有人源化抗因子bb抗体的缀合物，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:17的氨基酸序列的vh和含有seq id no:26的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，装置包含含有人源化抗因子bb抗体的缀合物，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:38的氨基酸序列的重链和含有seq id no:39的氨基酸序列的轻链。
32.在一些实施方案中，装置包含含有人源化抗因子bb抗体的药物组合物，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:19的氨基酸序列的vh和含有seq id no:27的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，装置包含含有人源化抗因子bb抗体的药物组合物，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:34的氨基酸序列的重链和含有seq id no:35的氨基酸序列的轻链。
33.在一些实施方案中，装置包含含有人源化抗因子bb抗体的药物组合物，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:17的氨基酸序列的vh和含有seq id no:26的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，装置包含含有人源化抗因子bb抗体的药物组合物，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:38的氨基酸序列的重链和含有seq id no:39的氨基酸序列的轻链。
34.在一些实施方案中，所述装置是可注射装置，例如注射器、笔或电子注射装置(e-device)。
35.本公开文本的又其他方面提供了治疗患有补体介导的疾病或障碍的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的人源化抗体、本文所述的缀合物或本文所述的药物组合物以治疗补体介导的病症或障碍。
36.在一些实施方案中，治疗患有补体介导的疾病或障碍的受试者的方法包括向所述受试者施用有效量的人源化抗因子bb抗体以治疗所述补体介导的疾病或障碍，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:19的氨基酸序列的vh和含有seq id no:27的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，治疗患有补体介导的疾病或障碍的受试者的方法包括向所述受试者施用有效量的人源化抗因子bb抗体以治疗所述补体介导的疾病或障碍，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:34的氨基酸序列的重链和含有seq id no:35的氨基酸序列的轻链。
37.在一些实施方案中，治疗患有补体介导的疾病或障碍的受试者的方法包括向所述受试者施用有效量的人源化抗因子bb抗体以治疗所述补体介导的疾病或障碍，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:17的氨基酸序列的vh和含有seq id no:26的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，治疗患有补体介导的疾病或障碍的受试者的方法包括向所述受试者施用有效量的人源化抗因子bb抗体以治疗所述补体介导的疾病或障碍，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:38的氨基酸序列的重链和含有seq id no:39的氨基酸序列的轻链。
38.在一些实施方案中，治疗患有补体介导的疾病或障碍的受试者的方法包括向所述受试者施用有效量的包含人源化抗因子bb抗体的缀合物以治疗所述补体介导的疾病或障碍，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:19的氨基酸序列的vh和含有seq id no:27的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，治疗患有补体介导的疾病或障碍的受试者的方法包括向所述受试者施用有效量的缀合物以治疗所述补体介导的病或障碍，所述缀合物包含含有seq id no:34的氨基酸序列的重链和含有seq id no:35的氨基酸序列的轻链。
39.在一些实施方案中，治疗患有补体介导的疾病或障碍的受试者的方法包括向所述受试者施用有效量的缀合物以治疗所述补体介导的疾病或障碍，所述缀合物包含含有seq id no:17的氨基酸序列的vh和含有seq id no:26的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，治疗患有补体介导的疾病或障碍的受试者的方法包括向所述受试者施用有效量的缀合物以治疗所述补体介导的疾病或障碍，所述缀合物包含含有seq id no:38的氨基酸序列的重链和含有seq id no:39的氨基酸序列的轻链。
40.在一些实施方案中，治疗患有补体介导疾病或障碍的受试者的方法包括向所述受试者施用有效量的包含人源化抗因子bb抗体的药物组合物以治疗所述补体介导的疾病或障碍，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:19的氨基酸序列的vh和含有seq id no:27的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，治疗患有补体介导的疾病或障碍的受试者的方法包括向所述受试者施用有效量的药物组合物以治疗所述补体介导的疾病或障碍，所述药物组合物包含含有seq id no:34的氨基酸序列的重链和含有seq id no:35的氨基酸序列的轻链。
41.在一些实施方案中，治疗患有补体介导的疾病或障碍的受试者的方法包括向所述受试者施用有效量的药物组合物以治疗所述补体介导的疾病或障碍，所述药物组合物包含含有seq id no:17的氨基酸序列的vh和含有seq id no:26的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，治疗患有补体介导的疾病或障碍的受试者的方法包括向所述受试者施用有效量的药物组合物以治疗所述补体介导的疾病或障碍，所述药物组合物包含含有seq id no:38的氨基酸序列的重链和含有seq id no:39的氨基酸序列的轻链。
42.在一些实施方案中，所述补体介导的疾病选自：iga肾病(伯杰氏病)、非典型溶血性尿毒综合征(ahus)、阵发性睡眠性血红蛋白尿(pnh)、特发性血小板减少性紫癜(itp)、血栓形成性血小板减少性紫癜(ttp)、狼疮性肾炎、anca血管炎、膜性肾病、c3肾小球肾炎(c3gn)、局灶性节段性肾小球硬化症(fsgs)、多发性硬化症、黄斑变性、年龄相关性黄斑变性(amd)、类风湿性关节炎、抗磷脂抗体综合征、哮喘、缺血再灌注损伤、ii型膜增生性肾小球肾炎(gn)、自发性胎儿丢失、少免疫性血管炎、大疱性表皮松解症、复发性胎儿丢失和创伤性脑损伤。
43.本公开文本的仍其他方面提供了抑制受试者的补体途径活性的方法。在一些实施方案中，所述补体途径活性是旁路途径(ap)活性。在一些实施方案中，抑制受试者的补体途径活性(例如，ap活性)的方法包括向所述受试者施用有效量的人源化抗因子bb抗体、包含人源化抗体bb抗体的缀合物或包含人源化抗因子bb抗体的药物组合物，以抑制所述补体途径活性。
44.在一些实施方案中，抑制受试者的补体途径活性(例如，ap活性)的方法包括向所述受试者施用有效量的人源化抗因子bb抗体以抑制所述补体途径活性，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:19的氨基酸序列的vh和含有seq id no:27的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，抑制受试者的补体途径活性(例如，ap活性)的方法包括向所述受试者施用有效量的人源化抗因子bb抗体以抑制所述补体途径活性，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:34的氨基酸序列的重链和含有seq id no:35的氨基酸序列的轻链。
45.在一些实施方案中，抑制受试者的补体途径活性(例如，ap活性)的方法包括向所述受试者施用有效量的人源化抗因子bb抗体以抑制所述补体途径活性，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:17的氨基酸序列的vh和含有seq id no:26的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，抑制受试者的补体途径活性(例如，ap活性)的方法包括向所述受试者施用有效量的人源化抗因子bb抗体以抑制所述补体途径活性，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:38的氨基酸序列的重链和含有seq id no:39的氨基酸序列的轻链。
46.在一些实施方案中，抑制受试者的补体途径活性(例如，ap活性)的方法包括向所述受试者施用有效量的包含人源化抗因子bb抗体的缀合物以抑制所述补体途径活性，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:19的氨基酸序列的vh和含有seq id no:27的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，抑制受试者的补体途径活性(例如，ap活性)的方法包括向所述受试者施用有效量的包含人源化抗因子bb抗体的缀合物以抑制所述补体途径活性，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:34的氨基酸序列的重链和含有seq id no:35的氨基酸序列的轻链。
47.在一些实施方案中，抑制受试者的补体途径活性(例如，ap活性)的方法包括向所述受试者施用有效量的包含人源化抗因子bb抗体的缀合物以抑制所述补体途径活性，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:17的氨基酸序列的vh和含有seq id no:26的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，抑制受试者的补体途径活性(例如，ap活性)的方法包括向所述受试者施用有效量的包含人源化抗因子bb抗体的缀合物以抑制所述补体途径活性，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:38的氨基酸序列的重链和含有seq id no:39的氨基酸序列的轻链。
48.在一些实施方案中，抑制受试者的补体途径活性(例如，ap活性)的方法包括向所
述受试者施用有效量的包含人源化抗因子bb抗体的药物组合物以抑制所述补体途径活性，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:19的氨基酸序列的vh和含有seq id no:27的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，抑制受试者的补体途径活性(例如，ap活性)的方法包括向所述受试者施用有效量的包含人源化抗因子bb抗体的药物组合物以抑制所述补体途径活性，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:34的氨基酸序列的重链和含有seq id no:35的氨基酸序列的轻链。
49.在一些实施方案中，抑制受试者的补体途径活性(例如，ap活性)的方法包括向所述受试者施用有效量的包含人源化抗因子bb抗体的药物组合物以所述抑制补体途径活性，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:17的氨基酸序列的vh和含有seq id no:26的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，抑制受试者的补体途径活性(例如，ap活性)的方法包括向所述受试者施用有效量的包含人源化抗因子bb抗体的药物组合物以抑制所述补体途径活性，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:38的氨基酸序列的重链和含有seq id no:39的氨基酸序列的轻链。
50.在一些实施方案中，所述补体ap活性选自：ap介导的末端膜攻击复合物(mac)沉积、ap介导的溶血、红细胞或其他细胞类型上的c3片段沉积、c3b/bb介导的c3的切割和c3bbb3b介导的c5的切割。在一些实施方案中，所述受试者患有补体介导的疾病或障碍。
51.在一些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用治疗剂。
52.在一些实施方案中，施用是静脉内、皮下或肌内的。
53.本文还提供了用于治疗补体介导的疾病或障碍的方法中的人源化抗因子bb抗体。本文进一步提供了用于治疗补体介导的疾病或障碍的方法中的包含人源化抗因子bb抗体的缀合物。本文进一步仍提供了用于治疗补体介导的疾病或障碍的方法中的包含人源化抗因子bb抗体的药物组合物。本文还进一步提供了用于治疗补体介导的疾病或障碍的方法中的包含人源化抗因子bb抗体的装置。
54.在一些实施方案中，用于治疗补体介导的疾病或障碍的方法中的人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:19的氨基酸序列的vh和含有seq id no:27的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，用于治疗补体介导的疾病或障碍的方法中的人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:34的氨基酸序列的重链和含有seq id no:35的氨基酸序列的轻链。
55.在一些实施方案中，用于治疗补体介导的疾病或障碍的方法中的人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:17的氨基酸序列的vh和含有seq id no:26的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，用于治疗补体介导的疾病或障碍的方法中的人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:38的氨基酸序列的重链和含有seq id no:39的氨基酸序列的轻链。
56.在一些实施方案中，用于治疗补体介导的疾病或障碍的方法中的缀合物包含人源化抗因子bb抗体，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:19的氨基酸序列的vh和含有seq id no:27的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，用于治疗补体介导的疾病或障碍的方法中的缀合物包含人源化抗因子bb抗体，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:34的氨基酸序列的重链和含有seq id no:35的氨基酸序列的轻链。
57.在一些实施方案中，用于治疗补体介导的疾病或障碍的方法中的缀合物包含人源化抗因子bb抗体，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:17的氨基酸序列的vh和含有seq id no:26的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，用于治疗补体介导的疾病或障碍
的方法中的缀合物包含人源化抗因子bb抗体，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:38的氨基酸序列的重链和含有seq id no:39的氨基酸序列的轻链。
58.在一些实施方案中，用于治疗补体介导的疾病或障碍的方法中的药物组合物包含人源化抗因子bb抗体，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:19的氨基酸序列的vh和含有seq id no:27的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，用于治疗补体介导的疾病或障碍的方法中的药物组合物包含人源化抗因子bb抗体，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:34的氨基酸序列的重链和含有seq id no:35的氨基酸序列的轻链。
59.在一些实施方案中，用于治疗补体介导的疾病或障碍的方法中的药物组合物包含人源化抗因子bb抗体，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:17的氨基酸序列的vh和含有seq id no:26的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，用于治疗补体介导的疾病或障碍的方法中的药物组合物包含人源化抗因子bb抗体，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:38的氨基酸序列的重链和含有seq id no:39的氨基酸序列的轻链。
60.在一些实施方案中，用于治疗补体介导的疾病或障碍的方法中的装置包含人源化抗因子bb抗体，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:19的氨基酸序列的vh和含有seq id no:27的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，用于治疗补体介导的疾病或障碍的方法中的装置包含人源化抗因子bb抗体，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:34的氨基酸序列的重链和含有seq id no:35的氨基酸序列的轻链。
61.在一些实施方案中，用于治疗补体介导的疾病或障碍的方法中的装置包含人源化抗因子bb抗体，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:17的氨基酸序列的vh和含有seq id no:26的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，用于治疗补体介导的疾病或障碍的方法中的装置包含人源化抗因子bb抗体，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:38的氨基酸序列的重链和含有seq id no:39的氨基酸序列的轻链。
62.在一些实施方案中，所述补体介导的疾病选自：iga肾病(伯杰氏病)、非典型溶血性尿毒综合征(ahus)、阵发性睡眠性血红蛋白尿(pnh)、特发性血小板减少性紫癜(itp)、血栓形成性血小板减少性紫癜(ttp)、狼疮性肾炎、anca血管炎、膜性肾病、c3肾小球肾炎(c3gn)、局灶性节段性肾小球硬化症(fsgs)、多发性硬化症、黄斑变性、年龄相关性黄斑变性(amd)、类风湿性关节炎、抗磷脂抗体综合征、哮喘、缺血再灌注损伤、ii型膜增生性gn、自发性胎儿丢失、少免疫性血管炎、大疱性表皮松解症、复发性胎儿丢失和创伤性脑损伤。
63.本文还提供了用于抑制补体途径活性(例如，ap活性)的方法中的人源化抗因子bb抗体。本文进一步提供了用于抑制补体途径活性(例如，ap活性)的方法中的包含人源化抗因子bb抗体的缀合物。本文进一步还提供了用于抑制补体途径活性(例如，ap活性)的方法中的包含人源化抗因子bb抗体的药物组合物。本文仍进一步提供了用于抑制补体途径活性(例如，ap活性)的方法中的包含人源化抗因子bb抗体的装置。
64.在一些实施方案中，用于抑制补体途径活性(例如，ap活性)的方法中的人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:19的氨基酸序列的vh和含有seq id no:27的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，用于抑制补体途径活性(例如，ap活性)的方法中的人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:34的氨基酸序列的重链和含有seq id no:35的氨基酸序列的轻链。
65.在一些实施方案中，用于抑制补体途径活性(例如，ap活性)的方法中的人源化抗
因子bb抗体包含含有seq id no:17的氨基酸序列的vh和含有seq id no:26的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，用于抑制补体途径活性(例如，ap活性)的方法中的人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:38的氨基酸序列的重链和含有seq id no:39的氨基酸序列的轻链。
66.在一些实施方案中，用于抑制补体途径活性(例如，ap活性)的方法中的缀合物包含人源化抗因子bb抗体，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:19的氨基酸序列的vh和含有seq id no:27的氨基酸序列的v
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。在一些实施方案中，用于抑制补体途径活性(例如，ap活性)的方法中的缀合物包含人源化抗因子bb抗体，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:34的氨基酸序列的重链和含有seq id no:35的氨基酸序列的轻链。
67.在一些实施方案中，用于抑制补体途径活性(例如，ap活性)的方法中的缀合物包含人源化抗因子bb抗体，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:17的氨基酸序列的vh和含有seq id no:26的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，用于抑制补体途径活性(例如，ap活性)的方法中的缀合物包含人源化抗因子bb抗体，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:38的氨基酸序列的重链和含有seq id no:39的氨基酸序列的轻链。
68.在一些实施方案中，用于抑制补体途径活性(例如，ap活性)的方法中的药物组合物包含人源化抗因子bb抗体，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:19的氨基酸序列的vh和含有seq id no:27的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，用于抑制补体途径活性(例如，ap活性)的方法中的药物组合物包含人源化抗因子bb抗体，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:34的氨基酸序列的重链和含有seq id no:35的氨基酸序列的轻链。
69.在一些实施方案中，用于抑制补体途径活性(例如，ap活性)的方法中的药物组合物包含人源化抗因子bb抗体，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:17的氨基酸序列的vh和含有seq id no:26的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，用于抑制补体途径活性(例如，ap活性)的方法中的药物组合物包含人源化抗因子bb抗体，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:38的氨基酸序列的重链和含有seq id no:39的氨基酸序列的轻链。
70.在一些实施方案中，用于抑制补体途径活性(例如，ap活性)的方法中的药物组合物包含人源化抗因子bb抗体，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:19的氨基酸序列的vh和含有seq id no:27的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，用于抑制补体途径活性(例如，ap活性)的方法中的药物组合物包含人源化抗因子bb抗体，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:34的氨基酸序列的重链和含有seq id no:35的氨基酸序列的轻链。
71.在一些实施方案中，用于抑制补体途径活性(例如，ap活性)的方法中的药物组合物包含人源化抗因子bb抗体，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:17的氨基酸序列的vh和含有seq id no:26的氨基酸序列的v
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。在一些实施方案中，用于抑制补体途径活性(例如，ap活性)的方法中的药物组合物包含人源化抗因子bb抗体，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:38的氨基酸序列的重链和含有seq id no:39的氨基酸序列的轻链。
72.本文还提供了编码或共同编码本文所述的人源化抗体的核酸或核酸集；包含本文所述的核酸或核酸集的载体或载体集；表达本文所述的人源化抗体、核酸或核酸集、或载体或载体集的细胞。
73.在一些实施方案中，核酸或核酸集编码或共同编码人源化抗因子bb抗体，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:19的氨基酸序列的vh和含有seq id no:27的氨基
酸序列的v
l
。在一些实施方案中，核酸或核酸集编码或共同编码人源化抗因子bb抗体，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:34的氨基酸序列的重链和含有seq id no:35的氨基酸序列的轻链。
74.在一些实施方案中，核酸或核酸集编码或共同编码人源化抗因子bb抗体，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:17的氨基酸序列的vh和含有seq id no:26的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，核酸或核酸集编码或共同编码人源化抗因子bb抗体，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:38的氨基酸序列的重链和含有seq id no:39的氨基酸序列的轻链。
75.在一些实施方案中，载体或载体集包含编码或共同编码人源化抗因子bb抗体的核酸或核酸集，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:19的氨基酸序列的vh和含有seq id no:27的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，载体或载体集包含编码或共同编码人源化抗因子bb抗体的核酸或核酸集，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:34的氨基酸序列的重链和含有seq id no:35的氨基酸序列的轻链。
76.在一些实施方案中，载体或载体集包含编码或共同编码人源化抗因子bb抗体的核酸或核酸集，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:17的氨基酸序列的vh和含有seq id no:26的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，载体或载体集包含编码或共同编码人源化抗因子bb抗体的核酸或核酸集，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:38的氨基酸序列的重链和含有seq id no:39的氨基酸序列的轻链。
77.在一些实施方案中，细胞包含人源化抗因子bb抗体，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:19的氨基酸序列的vh和含有seq id no:27的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，细胞包含人源化抗因子bb抗体，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:34的氨基酸序列的重链和含有seq id no:35的氨基酸序列的轻链。
78.在一些实施方案中，细胞包含人源化抗因子bb抗体，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:17的氨基酸序列的vh和含有seq id no:26的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，细胞包含人源化抗因子bb抗体，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:38的氨基酸序列的重链和含有seq id no:39的氨基酸序列的轻链。
79.在一些实施方案中，细胞包含编码或共同编码人源化抗因子bb抗体的核酸或核酸集，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:19的氨基酸序列的vh和含有seq id no:27的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，细胞包含编码或共同编码人源化抗因子bb抗体的核酸或核酸集，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:34的氨基酸序列的重链和含有seq id no:35的氨基酸序列的轻链。
80.在一些实施方案中，细胞包含编码或共同编码人源化抗因子bb抗体的核酸或核酸集，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:17的氨基酸序列的vh和含有seq id no:26的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，细胞包含编码或共同编码人源化抗因子bb抗体的核酸或核酸集，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:38的氨基酸序列的重链和含有seq id no:39的氨基酸序列的轻链。
81.在一些实施方案中，细胞包含含有编码或共同编码人源化抗因子bb抗体的核酸或核酸集的载体或载体集，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:19的氨基酸序列的vh和含有seq id no:27的氨基酸序列的v
l
。在一些实施方案中，细胞包含含有编码或共同编
码人源化抗因子bb抗体的核酸或核酸集的载体或载体集，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:34的氨基酸序列的重链和含有seq id no:35的氨基酸序列的轻链。
82.在一些实施方案中，细胞包含含有编码或共同编码人源化抗因子bb抗体的核酸或核酸集的载体或载体集，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:17的氨基酸序列的vh和含有seq id no:26的氨基酸序列的v
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。在一些实施方案中，细胞包含含有编码或共同编码人源化抗因子bb抗体的核酸或核酸集的载体或载体集，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:38的氨基酸序列的重链和含有seq id no:39的氨基酸序列的轻链。
83.在一些实施方案中，细胞是例如选自人胚肾(hek)细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞、ns0骨髓瘤细胞、sp2细胞、cos细胞和乳腺上皮细胞的哺乳动物细胞。
84.本公开文本的其他方面提供了产生本文所述的人源化抗体的方法，所述方法包括培养本文所述细胞以产生所述人源化抗体。在一些实施方案中，方法进一步包括分离所述人源化抗体。
85.在一些实施方案中，产生人源化抗因子bb抗体的方法包括培养细胞以产生所述人源化抗因子bb抗体，所述细胞包含编码人源化抗因子bb抗体的核酸或共同编码人源化抗因子bb抗体的核酸集，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:19的氨基酸序列的vh和含有seq id no:27的氨基酸序列的v
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。在一些实施方案中，产生人源化抗因子bb抗体的方法包括培养细胞，所述细胞包含编码人源化抗因子bb抗体的核酸或共同编码人源化抗因子bb抗体的核酸集，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:34的氨基酸序列的重链和含有seq id no:35的氨基酸序列的轻链。
86.在一些实施方案中，产生人源化抗因子bb抗体的方法包括培养细胞以产生所述人源化抗因子bb抗体，所述细胞包含编码人源化抗因子bb抗体的核酸或共同编码人源化抗因子bb抗体的核酸集，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:17的氨基酸序列的vh和含有seq id no:16的氨基酸序列的v
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。在一些实施方案中，产生人源化抗因子bb抗体的方法包括培养细胞，所述细胞包含编码人源化抗因子bb抗体的核酸或共同编码人源化抗因子bb抗体的核酸集，所述人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:28的氨基酸序列的重链和含有seq id no:39的氨基酸序列的轻链。
87.以上发明内容意在以非限制性方式说明本文所公开的技术的一些实施方案、优点、特征和用途。本文所公开的技术的其他实施方案、优点、特征和用途将从具体实施方式、附图、实施例和权利要求中清楚地看到。
附图说明
88.所附的附图并不旨在按比例绘制。在附图中，在各种附图中示出的每个相同或几乎相同的组分由相同的标记表示。为简明起见，可能在每个附图中不会标记出每个组分。在附图中：
89.图1a-图1d示出了使用单周期动力学测得的人源化抗体变体(第1组)与补体因子bb(因子bb)的结合。示出了人源化变体和对照抗体与因子bb结合的原始传感图和拟合的曲线(1:1结合模型)。在biacore t200上进行了动力学分析。在蛋白a cm5芯片上捕获每种抗体，然后注射渐增浓度的因子bb并且确定单个解离速率。*每个部分的标度相同并且x是从-200至1400以及y是从-5至40。
90.图2a-图2c示出了使用单周期动力学测得的人源化变体(第2组)与因子bb的结合。示出了重新设计的变体和对照抗体与因子bb结合的原始传感图和拟合的曲线(1:1结合模型)。在biacore t200上进行了动力学分析。在蛋白a cm5芯片上捕获每种抗体，然后注射渐增浓度的因子bb并且确定单个解离速率。
91.图3示出了蛋白a/sec后纯化的抗体的sds-page凝胶。将1μg的每种还原的抗体样品加载在nupage 4％-12％ bis-tris凝胶(thermofisher，英国拉夫堡)上并且在200v下运行35分钟。将凝胶用instantblue(expedeon，英国斯维夫西)染色。mk：pageruler
tm plus预染色的蛋白质梯(thermofisher，英国拉夫堡)。
92.图4a-图4c示出了使用多周期动力学测得的前导抗体(均来自第2组)与因子bb的结合。示出了人源化变体与因子bb结合的多周期传感图数据和拟合的曲线(1:1结合模型)。(图4a：嵌合vh0/vk0、vh4/vκ6；图4b：vh4/vκ7、vh6/vκ6；图4c：vh6/vκ7、vh7/vκ7)。
93.图5示出了人源化变体相比于亲本抗体的因子bb竞争酶联免疫吸附测定(elisa)。测试了连续稀释的抗因子bb变体相比于固定浓度的鼠亲本抗体与因子bb的结合。使用抗小鼠过氧化物酶缀合物和四甲基联苯胺(tmb)底物检测结合的鼠抗体。
94.图6a-图6c示出了使用人血清测得的人源化抗因子bb抗体在补体旁路途径(cap)(图6a)和ap介导的溶血(图6b-图6c)中的活性。
95.图7a-图7d示出了通过表面等离子共振测得的前导人源化变体对人因子b(图7a和图7b)或食蟹猴因子b(图7c和图7d)的激活形式(因子bb)的特异性。
96.图8a-图8b示出了嵌合母体抗体vh0/vk0-igg4v1(图8a)和代表性人源化变体抗体vh6/vk7-igg4v2(图8b)在各种补体蛋白之间仅与因子bb结合的特异性。
97.图9a-图9b示出了使用正常人(图9a)和食蟹猴(图9b)血清测得的vh6/vk7-igg4v2(由hek细胞产生)和vh6/vk7-igg4v2_cho(由cho细胞产生)在补体旁路途径(cap)测定中的活性。
98.图10a-图10b示出了使用正常人(图10a)和食蟹猴(图10b)血清测得的vh6/vk7-igg4v2(由hek产生)和vh6/vk7-igg4v2_cho在补体经典途径(ccp)测定中的活性。
99.图11示出了在正常人血清中兔rbc通过vh6/vk7-igg4v2_hek和vh6/vk7-igg4v2_cho实现的溶血。
100.图12示出了vh6/vk7-igg4v2_cho(左)和vh6/vk7-igg4v2_hek(右)与人bb蛋白结合的亲和力与多周期传感图原始数据和拟合曲线。
具体实施方式
101.本公开文本提供了结合补体因子bb蛋白的人源化抗体。这些抗体在本文中称为“人源化抗因子bb抗体”。本公开文本还提供了编码人源化抗因子bb抗体的核酸、包含所述抗体的组合物、产生所述抗体的方法(例如，重组产生方法)和使用所述抗体的方法(如治疗(至少一种)补体介导的疾病或障碍的方法)。
[0102]“抗体”涵盖任何同种型的抗体或免疫球蛋白，包括但不限于人源化抗体和嵌合抗体。抗体可以是单链抗体(scab)或单结构域抗体(dab)(例如，单结构域重链抗体或单结构域轻链抗体；参见holt等人(2003)trends biotechnol.21:484)。术语“抗体”还涵盖保持与
抗原特异性结合的抗体的片段(抗体片段)。“抗体”进一步包括单链可变片段(scfv)(其为用短接头肽连接的抗体的重链(vh)和轻链(v
l
)可变区的融合蛋白)和双抗体(其为包括通过小肽接头连接的vh和v
l
的scfv片段的非共价二聚体)(zapata等人,protein eng.8(10):1057-1062(1995))。包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白的其他融合蛋白也涵盖含在术语“抗体”中
[0103]“抗体片段”包括完整抗体的一部分，例如，完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括抗原结合片段(fab)、fab’、f(ab')2、可变结构域fv片段(fv)和fd片段以及嵌合抗原受体的抗原结合片段。
[0104]
抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段(称为“fab”片段，每个片段都有单个抗原结合位点)和一个残余的“fc”片段(这一名称反映了容易结晶的能力)。胃蛋白酶处理产生f(ab')2片段，其具有两个抗原结合位点并且仍能够使抗原交联。
[0105]“fv”是含有完全抗原识别和结合位点的最小抗体片段。此述区域包括一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的紧密非共价缔合的二聚体。在此构型中，每个可变结构域的三个cdr相互作用以将抗原结合位点限定在v
h-v
l
二聚体的表面上。总之，六个cdr赋予了抗体的抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包含三个对抗原具有特异性的cdr的半个fv)也具有识别和结合抗原的能力，但其亲和力低于整个结合位点。
[0106]“fab”片段含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(ch1)。fab片段与fab'片段的不同之处在于在重链ch1结构域的羧基末端添加了一些残基，所述残基包括至少一个来自抗体铰链区的半胱氨酸。fab'-sh是本文中fab'的名称，其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基带有游离巯基。f(ab')2抗体片段最初是作为fab'片段对产生的，它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
[0107]“scfv”抗体片段包含抗体的vh和v
l
，其中这些区域存在于单个多肽链中。在一些情况下，fv多肽进一步包含在vh与v
l
区域之间的多肽接头，这使得scfv能够形成抗原结合所需的结构。关于scfv的综述，参见pluckthun in the pharmacology of monoclonal antibodies,第113卷,rosenburg和moore编辑,springer-verlag,new york,第269-315页(1994)。
[0108]“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含与同一多肽链中的v
l
连接的vh(v
h-v
l
)。通过使用过短而不允许在同一条链上的两个结构域之间配对的接头，迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双抗体更全面地描述于例如，hollinger等人proc.natl.acad.sci.usa 90:6444-6448(1993)中。
[0109]
抗体可以是单价或二价的。抗体可以是ig单体，它是由四条多肽链组成的“y形”分子：通过二硫键连接的两条重链和两条轻链。
[0110]
例如，可以用放射性同位素、产生可检测产物的酶和/或荧光蛋白可检测地标记抗体。抗体可以进一步与其他部分(如特异性结合对的成员，例如，生物素-亲和素特异性结合对的生物素成员)缀合。抗体也可以与固体支持物(包括但不限于聚苯乙烯板和/或珠)结合。
[0111]“分离的”抗体是指从其自然环境的组分中鉴定并且分离和/或回收(即，不是天然存在的)的抗体。所述抗体的自然环境中的污染物组分是会干扰抗体的使用(例如，诊断或治疗用途)的物质，并且可以包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。在一些情况下，将
抗体纯化(1)至如通过lowry方法确定的按重量计大于90％、大于95％或大于98％的抗体，例如按重量计大于99％，(2)至足以获得通过使用旋转杯序列分析仪测得的至少15个n末端或内部氨基酸序列残基的程度，或(3)至通过在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或银染色剂的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)测得的同质性。分离的抗体涵盖重组细胞内的原位抗体，因为抗体的至少一种自然环境组分将不存在。在一些实施方案中，通过至少一个纯化步骤制备分离的抗体。
[0112]“单克隆抗体”是由一群相同的细胞产生的抗体，所有这些细胞都是通过重复的细胞复制从单个细胞产生的。也就是说，细胞克隆仅产生单一的抗体种类。虽然可以使用杂交瘤生产技术产生单克隆抗体，但是也可使用本领域技术人员已知的其他生产方法(例如源自抗体噬菌体展示文库的抗体)。
[0113]“互补决定区(cdr)”是在重链和轻链多肽的可变区内均可发现的非连续抗原结合位点。cdr已经描述于lefranc等人(2003)developmental and comparative immunology 27:55；kabat等人,j.biol.chem.252:6609-6616(1977)；kabat等人,u.s.dept.of health and human services,“sequences of proteins of immunological interest”(1991)；chothia等人,j.mol.biol.196:901-917(1987)；和maccallum等人,j.mol.biol.262:732-745(1996)中，其中定义包括相互比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，应用任一定义来指代抗体或移植的抗体或其变体的cdr旨在处于如本文所定义和使用的术语的范围内。
[0114]
如本文所用，术语“cdr-l1”、“cdr-l2”和“cdr-l3”分别是指轻链可变区中的第一、第二和第三cdr。如本文所用，术语“cdr-h1”、“cdr-h2”和“cdr-h3”分别是指重链可变区中的第一、第二和第三cdr。如本文所用，术语“cdr-1”、“cdr-2”和“cdr-3”分别是指任一链可变区的第一、第二和第三cdr。
[0115]
当关于抗体可变区使用时，“框架”包括抗体可变区内cdr区外的所有氨基酸残基。可变区框架通常是仅包括cdr之外的那些氨基酸的不连续的氨基酸序列。“框架区”包括由cdr分隔开的框架的每个结构域。
[0116]“人源化抗体”是包含不同来源的抗体部分的抗体，其中至少一部分包含人来源的氨基酸序列。例如，人源化抗体可以包含源自具有必需特异性的非人来源(如小鼠)的抗体和源自人来源的抗体序列(例如，嵌合免疫球蛋白)的部分，其通过常规技术(例如，合成)化学地连接在一起或使用基因工程化技术制备为连续多肽(例如，可以表达编码嵌合抗体的蛋白质部分的dna以产生连续多肽链)。人源化抗体的另一个例子是含有至少一条链的抗体，所述至少一条链包含源自非人来源的抗体的cdr和源自人来源的轻链和/或重链的框架区(例如有或没有框架变化的cdr移植的抗体)。术语人源化免疫球蛋白还包括嵌合或cdr移植的单链抗体。参见例如，cabilly等人,美国专利号4,816,567；cabilly等人,欧洲专利号0,125,023b1；boss等人,美国专利号4,816,397；boss等人,欧洲专利号0,120,694b1；neuberger,m.s.等人,wo 86/01533；neuberger,m.s.等人,欧洲专利号0,194,276b1；winter,美国专利号5,225,539；winter,欧洲专利号0,239,400b1；padlan,e.a.等人,欧洲申请专利号0,519,596a1。关于单链抗体，还参见ladner等人,美国专利号4,946,778；huston,美国专利号5,476,786；和bird,r.e.等人,science,242:423-426(1988)。
[0117]
在一些实施方案中，使用合成和/或重组核酸制备编码所需人源化链的基因(例如，cdna)来产生人源化抗体。例如，可以使用pcr诱变方法构建编码人源化可变区的核酸
(例如，dna)序列，以改变编码人或人源化链的dna序列，如来自先前人源化的可变区的dna模板(参见例如，kamman,m.,等人,nucl.acids res.,17:5404(1989)；sato,k.,等人,cancer research,53:851-856(1993)；daugherty,b.l.等人,nucleic acids res.,19(9):2471-2476(1991)；和lewis,a.p.和j.s.crowe,gene,101:297-302(1991))。使用这些或其他合适的方法，也可容易地产生变体。例如，可以诱变克隆的可变区，并且可以选择编码具有所需特异性的变体的序列(例如，从噬菌体文库；参见例如，krebber等人,美国专利号5,514,548；hoogenboom等人,wo 93/06213，1993年4月1日出版)。
[0118]
人源化抗因子bb抗体
[0119]
表1中提供了从中衍生本文所述的人源化抗因子bb抗体的小鼠单克隆抗因子bb抗体的氨基酸序列。在一些实施方案中，人源化抗因子bb抗体包含包括源自人免疫球蛋白框架的序列的重链可变区和/或轻链可变区的框架区。
[0120]
表1.小鼠单克隆抗因子bb抗体
[0121][0122][0123]
在一些实施方案中，本文所述的人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:12的氨基酸序列的重链可变区的重链互补决定区1(cdr-h1)、重链互补决定区2(cdr-h2)和重链互补决定区3(cdr-h3)。在一些实施方案中，本文所述的人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:13的氨基酸序列的轻链可变区的轻链互补决定区1(cdr-l1)、轻链互补决定区2(cdr-l2)和轻链互补决定区3(cdr-l3)。在一些实施方案中，人源化抗因子bb抗体进一步包含人源化重链框架区和/或人源化轻链框架区。
[0124]
在一些实施方案中，根据kabat定义，本文所述的人源化抗因子bb抗体包含含有
seq id no:1的氨基酸序列的cdr-h1、含有seq id no:2的氨基酸序列的cdr-h2和含有seq id no:3的氨基酸序列的cdr-h3。在一些实施方案中，根据kabat定义，本文所述的人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:4的氨基酸序列的cdr-l1、含有seq id no:5的氨基酸序列的cdr-l2和含有seq id no:6的氨基酸序列的cdr-l3。在一些实施方案中，人源化抗因子bb抗体进一步包含人源化重链框架区和/或人源化轻链框架区。
[0125]
在一些实施方案中，根据imgt定义，本文所述的人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:7的氨基酸序列的cdr-h1、含有seq id no:8的氨基酸序列的cdr-h2和含有seq id no:9的氨基酸序列的cdr-h3。在一些实施方案中，根据imgt定义，本文所述的人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:10的氨基酸序列的cdr-l1、含有seq id no:11的氨基酸序列的cdr-l2和含有seq id no:6的氨基酸序列的cdr-l3。在一些实施方案中，人源化抗因子bb抗体进一步包含人源化重链框架区和/或人源化轻链框架区。
[0126]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体包含含有与seq id no:12中所示的vh相比不多于20个氨基酸变化(例如，不多于20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变化)的vh。在一些实施方案中，本公开文本的抗因子bb抗体包含含有与seq id no:13中所示的v
l
相比不多于20个氨基酸变化(例如，不多于20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变化)的v
l
。
[0127]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体包含含有与seq id no:12中所示的vh至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)相同的氨基酸序列的vh。在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb包含含有与seq id no:13中所示的v
l
至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)相同的氨基酸序列的v
l
。
[0128]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体包含人源化vh，所述人源化vh包含具有seq id no:1(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-h1、具有seq id no:2(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-h2、具有seq id no:3(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-h3并且在所述框架区中含有与seq id no:12中所示的vh相比不多于20个氨基酸变化(例如，不多于20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变化)。在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体包含人源化v
l
，所述人源化v
l
包含具有seq id no:4(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-l1、具有seq id no:5(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-l2和具有seq id no:6(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-l3并且在所述框架区中含有与seq id no:13中所示的v
l
相比不多于20个氨基酸变化(例如，不多于20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变化)。
[0129]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体包含人源化vh，所述人源化vh包含具有seq id no:1(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-h1、具有seq id no:2(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-h2、具有seq id no:3(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-h3，其中所述vh的框架区与seq id no:12中所示的vh的框架区总共至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)相同。在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体包含人源化v
l
，所述人源化v
l
包含具有seq id no:4(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-l1、具有seq id no:5(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-l2和具有seq id no:6(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-l3，其中所述v
l
的框架区
与seq id no:13的任一个所示的v
l
的框架区总共至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)相同。
[0130]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体包含人源化vh，所述人源化vh包含具有seq id no:7(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-h1、具有seq id no:8(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-h2、具有seq id no:9(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-h3，并且在框架区中含有与seq id no:12中所示的vh相比不多于20个氨基酸变化(例如，不多于20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变化)。在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体包含人源化v
l
，所述人源化v
l
包含具有seq id no:10(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-l1、具有seq id no:11(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-l2和具有seq id no:6(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-l3，并且在框架区中含有与seq id no:13中所示的v
l
相比不多于20个氨基酸变化(例如，不多于20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变化)。
[0131]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体包含人源化vh，所述人源化vh包含具有seq id no:7(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-h1、具有seq id no:8(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-h2、具有seq id no:9(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-h3，其中所述vh的框架区与seq id no:12中所示的vh总共至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)相同。在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体包含人源化v
l
，所述人源化v
l
包含具有seq id no:10(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-l1、具有seq id no:11(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-l2和具有seq id no:6(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-l3，其中所述v
l
的框架区与seq id no:13的任一个所示的v
l
的框架区总共至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)相同。
[0132]
表2中提供了本文所述的人源化抗因子bb抗体的人源化重链可变区的氨基酸序列和dna编码序列的例子。表3中提供了本文所述的人源化抗因子bb抗体的人源化轻链可变区的氨基酸序列和dna编码序列的例子。
[0133]
表2.人源化重链可变区的例子
[0134]
[0135][0136]
根据kabat定义的cdr在氨基酸和dna序列中加粗
[0137]
表3.人源化轻链可变区的例子
[0138]
[0139][0140]
根据kabat定义的cdr在氨基酸和dna序列中加粗
[0141]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体包含人源化vh，所述人源化vh包含具有seq id no:1(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-h1、具有seq id no:2(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-h2、具有seq id no:3(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-h3，并且在框架区中含有与seq id no:14-20中任一个所示的vh相比不多于20个氨基酸变化(例如，不多于20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变化)。在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体包含人源化v
l
，所述人源化v
l
包含具有seq id no:4(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-l1、具有seq id no:5(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-l2和具有seq id no:6(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-l3，并且在框架区中含有与seq id no:21-27中任一个所示的v
l
相比不多于20个氨基酸变化(例如，不多于20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变化)。
[0142]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体包含人源化vh，所述人源化vh包含具有seq id no:1(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-h1、具有seq id no:2(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-h2、具有seq id no:3(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-h3，其中所述vh的框架区与seq id no:14-20中任一个所示的vh的框架区总共至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)相同。在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体包含人源化v
l
，所述人源化v
l
包含具有seq id no:4(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-l1、具有seq id no:5(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-l2和具有seq id no:6(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-l3，其中所述v
l
的框架区与seq id no:21-27中任一个所示的v
l
的框架区总共至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)相同。
[0143]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体包含人源化vh，所述人源化vh包含具有seq id no:7(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-h1、具有seq id no:8(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-h2、具有seq id no:9(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-h3，并且在框架区中含有与seq id no:14-20中任一个所示的vh相比不多于20个氨基酸变化(例如，不多于20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变化)。在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体包含人源化v
l
，
所述人源化v
l
包含具有seq id no:10(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-l1、具有seq id no:11(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-l2和具有seq id no:6(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-l3，并且在框架区中含有与seq id no:21-27中任一个所示的v
l
相比不多于20个氨基酸变化(例如，不多于20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变化)。
[0144]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体包含人源化vh，所述人源化vh包含具有seq id no:7(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-h1、具有seq id no:8(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-h2、具有seq id no:9(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-h3，其中所述vh的框架区与seq id no:14-20中任一个所示的vh的框架区至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)相同。在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体包含人源化v
l
，所述人源化v
l
包含具有seq id no:10(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-l1、具有seq id no:11(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-l2和具有seq id no:6(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-l3，其中所述v
l
的框架区与seq id no:21-27中任一个所示的v
l
的框架区总共至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)相同。
[0145]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体包含seq id no:14-20中任一个所示的人源化vh。在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体包含seq id no:21-27中任一个所示的人源化v
l
。表4提供了人源化抗因子bb抗体的例子，所述人源化抗因子bb抗体包含表2中提供的人源化vh中的一种和表3中提供的人源化v
l
中的一种。
[0146]
表4.人源化抗因子bb抗体的可变区的例子
[0147]
[0148][0149]-根据kabat定义的cdr在氨基酸序列中加粗
[0150]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:19的氨基酸序列的人源化vh和含有seq id no:27的氨基酸序列的人源化v
l
。
[0151]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:17的氨基酸序列的人源化vh和含有seq id no:26的氨基酸序列的人源化v
l
。
[0152]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:19的氨基酸序列的人源化vh和含有seq id no:26的氨基酸序列的人源化v
l
。
[0153]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:17的氨基酸序列的人源化vh和含有seq id no:27的氨基酸序列的人源化v
l
。
[0154]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:20的
氨基酸序列的人源化vh和含有seq id no:27的氨基酸序列的人源化v
l
。
[0155]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:14的氨基酸序列的人源化vh和含有seq id no:21中任一个的氨基酸序列的人源化v
l
。
[0156]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:14的氨基酸序列的人源化vh和含有seq id no:22中任一个的氨基酸序列的人源化v
l
。
[0157]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:14的氨基酸序列的人源化vh和含有seq id no:23中任一个的氨基酸序列的人源化v
l
。
[0158]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:14的氨基酸序列的人源化vh和含有seq id no:24中任一个的氨基酸序列的人源化v
l
。
[0159]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:14的氨基酸序列的人源化vh和含有seq id no:25中任一个的氨基酸序列的人源化v
l
。
[0160]
在一些实施方案中，本文所述的人源化抗因子bb抗体是全长igg、ig单体、fab片段、f(ab’)2片段、scfv、scab或fv。在一些实施方案中，本文所述的人源化抗因子bb抗体是全长igg。在一些实施方案中，本文所述的人源化抗因子bb抗体中的任一个的重链包含重链恒定区(ch)或其部分(例如，ch1、ch2、ch3或其组合)。所述重链恒定区可以是任何合适来源的，例如，人、小鼠、大鼠或兔。在一些实施方案中，所述重链恒定区来自人igg(γ重链)，例如igg1、igg2或igg4。
[0161]
在一些实施方案中，可以将突变引入本文所述的人源化抗因子bb抗体中的任一个的重链恒定区中。在一些实施方案中，将一个、两个或更多个突变(例如，氨基酸取代)引入重链恒定区(例如，在ch2结构域(人igg1的残基231-340)和/或ch3结构域(人igg1的残基341-447)和/或铰链区中，根据kabat编号系统(例如kabat中的eu索引)进行编号)，以增加或减少所述抗体对效应细胞表面上的fc受体(例如，激活的fc受体)的亲和力。抗体的fc区中的可降低或增加抗体对fc受体的亲和力的突变以及将这种突变引入fc受体或其片段的技术是本领域技术人员已知的。抗体的fc受体中的可以用于改变抗体对fc受体的亲和力的突变的例子描述于例如smith p等人,(2012)pnas 109:6181-6186，美国专利号6,737,056和国际公开号wo 02/060919；wo 98/23289；和wo 97/34631中，将其通过引用并入本文。
[0162]
在一些实施方案中，将一个、两个或更多个突变(例如，氨基酸取代)引入重链恒定区的铰链区(ch1结构域)中，使得如例如美国专利号5,677,425中所述改变(例如，增加或减少)铰链区中的半胱氨酸残基的数量。可以改变ch1结构域的铰链区中的半胱氨酸残基的数量以例如促进轻链和重链的组装，或改变(例如，增加或减少)抗体的稳定性或者促进接头缀合。
[0163]
在一些实施方案中，将一个、两个或更多个氨基酸突变(即，取代、插入或缺失)引入igg恒定结构域或其fcrn结合片段，以改变(例如，减少或增加)所述抗体在体内的半衰期。在一些实施方案中，将所述一个或多个突变引入fc或铰链fc结构域片段。对于将改变(例如，减少或增加)所述抗体在体内的半衰期的突变的例子，参见例如，国际公开号wo 02/060919；wo 98/23289；和wo 97/34631；和美国专利号5,869,046；6,121,022；6,277,375；和6,165,745。
[0164]
在一些实施方案中，本文所述的恒定区抗体是igg1恒定区并且包含位置252的甲硫氨酸(m)至酪氨酸(y)取代、位置254的丝氨酸(s)至苏氨酸(t)取代和位置256的苏氨酸
(d)至谷氨酸(e)取代，根据kabat中的eu索引编号。参见美国专利号7,658,921，将其通过引用并入本文。已证明这种类型的突变体igg(称为“yte突变体”)与相同抗体的野生型形式相比展示出半衰期增加四倍(参见dall'acqua w f等人,(2006)j biol chem 281:23514-24)。在一些实施方案中，抗体包含igg恒定结构域，所述igg恒定结构域在位置251-257、285-290、308-314、385-389和428-436处包含氨基酸残基的一个、两个、三个或更多个氨基酸取代，根据kabat中的eu索引编号。可以引入重链恒定区以增加抗体半衰期的其他突变是本领域已知的，所述突变是例如m428l/n434s(eu编号；m459l/n466s kabat编号)突变，如zalevsky等人,nat biotechnol.2010年2月；28(2):157-159中所述。
[0165]
在一些实施方案中，将一个、两个或更多个氨基酸取代引入igg恒定结构域fc区中以改变抗体的一种或多种效应子功能。改变对其亲和力的效应物配体可以是例如fc受体或补体的c1组分。这种方法更详细地描述于美国专利号5,624,821和5,648,260中。在一些实施方案中，恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其他手段)可以减少循环抗体的fc受体结合，从而增加肿瘤定位。关于缺失恒定结构域或使其失活从而增加肿瘤定位的突变的描述，参见例如，美国专利号5,585,097和8,591,886。在一些实施方案中，可以将至少一个氨基酸取代引入本文所述的抗体的fc区中，以移除fc区上的潜在的糖基化位点，这可以减少fc受体结合(参见例如，shields r l等人,(2001)j biol chem 276:6591-604)。
[0166]
在一些实施方案中，恒定区中的至少一个氨基酸可以被不同的氨基酸残基取代，使得抗体具有改变的clq结合和/或减少或消除的补体依赖性细胞毒性(cdc)。这种方法更详细地描述于美国专利号6,194,551(idusogie等人)中。在一些实施方案中，本文所述的抗体的ch2结构域的n末端区中的至少一个氨基酸残基被改变，从而改变抗体固定补体的能力。这种方法进一步描述于国际公开号wo 94/29351中。在一些实施方案中，本文所述的抗体的fc区被修饰以增加抗体介导抗体依赖性细胞毒性(adcc)的能力和/或增加抗体对fcγ受体的亲和力。这种方法进一步描述于国际公开号wo 00/42072中。
[0167]
在一些实施方案中，为了避免已知在天然igg4 mab情况下发生的fab臂交换引起的可能的复杂情况，本文提供的抗体可以包含稳定的“adair”突变(angal s.,等人,“a single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human(igg4)antibody,”mol immunol 30,105-108；1993)，其中丝氨酸228(eu编号；残基241kabat编号)被转化为脯氨酸，从而得到igg1样铰链序列。在一些实施方案中，为了减少残余抗体依赖性细胞毒性，将l235e(eu编号，对应于kabat编号中的l248e)突变引入重链恒定区，例如，描述于benhnia等人,journal of virology,2009年12月,第12355-12367页中。
[0168]
在一些实施方案中，本文所述的任何一种人源化抗因子bb抗体中的重链恒定区是igg4恒定区或其变体。表5中提供了igg4恒定区和变体的例子。
[0169]
表5.重链恒定区的例子
[0170][0171]
在一些实施方案中，本文所述的任一种人源化抗因子bb抗体的轻链可以进一步包含轻链恒定区(c
l
)。在一些例子中，c
l
是κ轻链。在其他例子中，c
l
是λ轻链。在一些实施方案中，c
l
是κ轻链，以下提供了其序列：
[0172]
rtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seq id no:31)
[0173]
其他抗体重链和轻链恒定区是本领域中熟知的，例如，imgt数据库(www.imgt.org)或www.vbase2.org/vbstat.php.中提供的那些，将其两者均通过引用并入本文。
[0174]
在一些实施方案中，本文所述的人源化抗因子bb抗体包含如下重链，所述重链包含表2中所列的任一个vh或其任何变体以及与seq id no:28-30中的任一个至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的重链恒定区。在一些实施方案中，本文所述的人源化抗因子bb抗体包含如下重链，所述重链包含表2中所列的任一个vh或其任何变体以及含有与seq id no:28-30中的任一个相比不多于20个氨基酸变化(例如，不多于20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变化)的重链恒定区。在一些实施方案中，本文所述的人源化抗因子bb抗体包含如下重链，所述重链包含表2中所列的任一个vh或其任何变体以及含有seq id no:28-30中的任一个的氨基酸序列的重链恒定区。
[0175]
在一些实施方案中，本文所述的人源化抗因子bb抗体包含如下轻链，所述轻链包含表3中所列的任一个v
l
或其任何变体以及与seq id no:31至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的轻链恒定区。在一些实施方案中，本文所述的人源化抗因子bb抗体包含如下轻链，所述轻链包含表3中所列的任一个v
l
或其任何变体以及含有与seq id no:31相比不多于20个氨基酸变化(例如，不多于20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变化)的轻链恒定区。在一些实施方案中，本文所述的人源化抗因子bb抗体包含如下轻链，所述轻链包含表3中所列的任一个v
l
或其任何变体以及含有seq id no:31的氨基酸序列的轻链恒定区。
[0176]
表6中提供了本文所述的人源化抗因子bb抗体的重链和轻链的氨基酸序列的例
子。
[0177]
表6.人源化抗因子bb抗体的重链和轻链的例子
[0178]
[0179]
[0180][0181]
在表6中：
[0182]-加粗：根据kabat定义的cdr
[0183]-斜体：vh/v
l
[0184]
在一些实施方案中，人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:32的氨基酸序列的重链和含有seq id no:35的氨基酸序列的轻链。
[0185]
在一些实施方案中，人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:33的氨基酸序列的重链和含有seq id no:35的氨基酸序列的轻链。
[0186]
在一些实施方案中，人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:34的氨基酸序列的重链和含有seq id no:35的氨基酸序列的轻链。
[0187]
在一些实施方案中，人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:36的氨基酸序列的重链和含有seq id no:39的氨基酸序列的轻链。
[0188]
在一些实施方案中，人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:37的氨基酸序列的重链和含有seq id no:39的氨基酸序列的轻链。
[0189]
在一些实施方案中，人源化抗因子bb抗体包含含有seq id no:38的氨基酸序列的重链和含有seq id no:39的氨基酸序列的轻链。
[0190]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体结合因子bb蛋白(例如，来自具有补体系统的哺乳动物、鱼或无脊椎动物的因子bb)。在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体结合哺乳动物因子bb蛋白。在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体结合人因子bb蛋白。在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体结合具有seq id no:40的氨基酸序列的因子bb蛋白。
[0191]
智人(homo sapiens)因子bb蛋白(seq id no:40)
[0192]
kivldpsgsmniylvldgsdsigasnftgakkclvnliekvasygvkpryglvtyatypkiwvkvseadssnadwvtkqlneinyedhklksgtntkkalqavysmmswpddvppegwnrtrhviilmtdglhnmggdpitvideirdllyigkdrknpredyldvyvfgvgplvnqvninalaskkdneqhvfkvkdmenledvfyqmidesqslslcgmvwehrkgtdyhkqpwqakisvirpskghescmgavvseyfvltaahcftvddkehsikvsvggekrdleievvlfhpnyningkkeagipefydydvaliklknklkygqtirpiclpctegttralrlpptttcqqqkeellpaqdikalfvseeekkltrkevyikngdkkgscerdaqyapgydkvkdisevvtprflctggvspyadpntcrgdsggplivhkrsrfiqvgviswgvvdvcknqkrqkqvpahardfhinlfqvlpwlkeklqdedlgfl
[0193]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体以约10-6
至10-11
nm，例如从
约10-6
m至约10-7
m、约10-7
m至约10-8
m、约10-8
m至约10-9
m、从约10-9
m至约10-10
m、或从约10-10
m至约10-11
m的亲和力结合补体bb蛋白。数值前的术语“约”意指所述数值的
±
10％。
[0194]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体展现出与对因子b的结合相比，对因子bb的优先结合。在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体与因子bb结合，但是基本上不与可溶性因子b结合。在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体以所述抗体对因子b的亲和力的至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少7.5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少75倍或至少100倍的亲和力与因子bb结合。在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体以所述抗体对因子b的亲和力的2倍至2.5倍、2.5倍至5倍、5倍至10倍、10倍至15倍、15倍至20倍、20倍至25倍、25倍至50倍、50倍至75倍或75倍至100倍的亲和力与因子bb结合。
[0195]
在一些实施方案中，与不存在人源化抗因子bb抗体的情况下的补体活性水平相比，本公开文本的人源化抗因子bb抗体抑制补体途径活性至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％。
[0196]
在一些实施方案中，与不存在人源化抗因子bb抗体的情况下的旁路途径(ap)活性的水平相比，本公开文本的人源化抗因子bb抗体抑制ap活性至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％。在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体以10-7
m至10-9
m的ic
50
，例如10-7
m至5x10-7
m、5x10-7
m至10-8
m、10-8
m至5x10-8
m或5x10-8
m至10-9
m的ic
50
抑制ap活性。在一些实施方案中，补体ap活性选自ap介导的末端膜攻击复合物(mac)沉积、ap介导的溶血、红细胞或其他细胞类型上的c3片段沉积、c3b/bb介导的c3的切割和c3bbb3b介导的c5的切割。在一些实施方案中，可以使用补体系统旁路途径试剂盒测量人源化抗因子bb抗体对补体ap活性的抑制。
[0197]
在一些实施方案中，与不存在抗因子bb抗体的情况下形成的膜攻击复合物(mac)的量相比，本公开文本的人源化抗因子bb抗体抑制mac形成至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％。
[0198]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体抑制c3b/bb介导的c3的切割。c3b/bb也称为“c3转化酶”。在一些实施方案中，与不存在抗因子bb抗体的情况下c3的切割相比，本公开文本的人源化抗因子bb抗体抑制c3b/bb介导的c3的切割至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％。在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体以从10-7
m至10-9
m的ic
50
，例如从10-7
m至5x10-7
m、从5x10-7
m至10-8
m、从10-8
m至5x10-8
m或从5x10-8
m至10-9
m的ic
50
抑制c3b/bb介导的c3的切割。
[0199]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体抑制c3b/bb介导的c3的切割，从而减少c3切割产物的产生。例如，与不存在抗因子bb抗体的情况下的c3切割产物的产生相比，本公开文本的人源化抗因子bb抗体可以抑制c3b/bb介导的c3的切割，从而减少c3切割产物(例如，c3a和/或c3b)的产生至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或
100％。
[0200]
在一些实施方案中，与不存在抗因子bb抗体的情况下的细胞裂解程度相比，本公开文本的人源化抗因子bb抗体抑制补体ap介导的细胞裂解至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％。可以使用细胞裂解测定来确定ap介导的细胞裂解的抑制程度。在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体以从10-7
m至10-9
m的ic
50
，例如从10-7
m至5x10-7
m、从5x10-7
m至10-8
m、从10-8
m至5x10-8
m或从5x10-8
m至10-9
m的ic
50
抑制ap介导的细胞裂解。
[0201]
在一些实施方案中，与不存在抗因子bb抗体的情况下的溶血程度相比，本公开文本的人源化抗因子bb抗体抑制补体ap介导的溶血至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％。可以使用兔红细胞(rbc)溶血测定来确定ap介导的溶血的抑制程度。在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体以从10-7
m至10-9
m的ic
50
，例如从10-7
m至5x10-7
m、从5x10-7
m至10-8
m、从10-8
m至5x10-8
m或从5x10-8
m至10-9
m的ic
50
抑制ap介导的溶血。
[0202]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体抑制ap介导的c3b、c3d或其他c3分裂产物在细胞或组织上的沉积。例如，与不存在抗因子bb施用抗体的情况下或施用抗因子bb抗体前c3b、c3d或其他c3分裂产物在细胞或组织上的沉积的量相比，本公开文本的人源化抗因子bb抗体可以抑制ap介导的c3b、c3d或其他c3分裂产物在细胞或组织上的沉积至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％。在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体以从10-7
m至10-9
m的ic
50
，例如从10-7
m至5x10-7
m、从5x10-7
m至10-8
m、从10-8
m至5x10-8
m或从5x10-8
m至10-9
m的ic
50
抑制ap介导的c3b、c3d或其他c3分裂产物在细胞或组织上的沉积。
[0203]
在一些实施方案中，与不存在人源化抗因子bb抗体的情况下c3b在细胞或组织上沉积的量相比，本公开文本的人源化抗因子bb抗体抑制ap介导的c3b在细胞或组织上的沉积至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％。在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体以从10-7
m至10-9
m的ic
50
，例如从10-7
m至5x10-7
m、从5x10-7
m至10-8
m、从10-8
m至5x10-8
m或从5x10-8
m至10-9
m的ic
50
抑制ap介导的c3b在细胞或组织上的沉积。
[0204]
在一些实施方案中，与不存在人源化抗因子bb抗体的情况下c3b在rbc上沉积的量相比，本公开文本的人源化抗因子bb抗体抑制ap介导的c3b在红细胞(rbc)或其他细胞类型上的沉积至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％。在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体以从10-7
m至10-9
m的ic
50
，例如从10-7
m至5x10-7
m、从5x10-7
m至10-8
m、从10-8
m至5x10-8
m或从5x10-8
m至10-9
m的ic
50
抑制ap介导的c3b在rbc上的沉积。
[0205]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体当施用至有需要的受试者时减少了受试者的循环中的因子bb的量。例如，与在不施用人源化抗因子bb抗体的情况下受试者的循环中的因子bb的量相比、或与在施用人源化抗因子bb抗体之前的受试者的循环
中的因子bb的量相比，本公开文本的人源化抗因子bb抗体当施用至有需要的受试者时可以使受试者的循环中的因子bb的量减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。
[0206]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体抑制c3bbb3b介导的c5的切割。在一些实施方案中，与不存在人源化抗因子bb抗体的情况下c3bbb3b介导的c5的切割相比，本公开文本的人源化抗因子bb抗体抑制c3bbb3b介导的c5的切割至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。
[0207]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体是双特异性或多特异性抗体。例如，人源化抗因子bb抗体可以是包含特异性结合补体bb蛋白中的表位的第一抗原结合部分和结合第二抗原的第二抗原结合部分的双特异性抗体。
[0208]
免疫缀合物
[0209]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体与另一种药剂缀合以形成免疫缀合物。例如，人源化抗因子bb抗体可以在羧基末端处包含游离硫醇(-sh)基团，其中所述游离硫醇基团可用于使所述抗体附接至第二多肽(例如，另一种抗体，包括人源化抗因子bb抗体)、支架、载体等。在一些实施方案中，人源化抗因子bb抗体包含至少一种非天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，所述非天然编码的氨基酸包含羰基基团、乙酰基基团、氨基氧基基团、肼基团、酰肼基团、氨基脲基团、叠氮基团或炔基团。关于合适的非天然存在的氨基酸，参见例如美国专利号7,632,924。包含非天然存在的氨基酸可以提供与聚合物、第二多肽、支架等的连接，例如，可通过使包含羰基基团的水溶性聚合物(例如，peg)与抗体反应来制造与水溶性聚合物连接的人源化抗因子bb抗体，其中所述抗体包含含有氨基氧基、肼、酰肼或氨基脲基团的非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，与水溶性聚合物连接的人源化抗因子bb抗体可以通过使包含含炔氨基酸的抗体与包含叠氮部分的水溶性聚合物(例如，peg)反应来制造。在一些实施方案中，叠氮或炔基团通过酰胺键与peg分子连接。
[0210]
在一些实施方案中，人源化抗因子bb抗体与聚合物(例如，除多肽之外的聚合物)连接(例如，共价连接)。合适的聚合物包括例如，生物相容性聚合物和水溶性生物相容性聚合物。合适的聚合物包括合成聚合物和天然存在的聚合物。合适的聚合物可以具有范围为从500da至50,000da，例如从5,000da至40,000da或从25,000至40,000da的平均分子量。
[0211]
在一些实施方案中，人源化抗因子bb抗体包含“不透射线的”标签，例如可使用例如x射线容易可视化的标签。不透射线材料是本领域技术人员熟知的。最常见的不透射线材料包括碘化物、溴化物或钡盐。其他不透射线材料也是已知的，并且包括但不限于有机铋衍生物(参见例如，美国专利号5,939,045)、不透射线多聚氨酯(multiurethane)(参见美国专利号5,346,981)、有机铋复合材料(参见例如，美国专利号5,256,334)和/或不透射线钡多聚体复合物(参见例如，美国专利号4,866,132)。
[0212]
在一些实施方案中，使用例如戊二醛、同源双官能交联剂或异源双官能交联剂使人源化抗因子bb抗体与第二部分(例如，脂质、除人源化抗因子bb抗体之外的多肽、合成聚合物和/或碳水化合物)共价连接。
[0213]
在一些实施方案中，将人源化抗因子bb抗体固定在固体支持物上。合适的支持物是本领域熟知的，并且尤其包括可商购获得的柱材料、聚苯乙烯珠、乳胶珠、磁珠、胶体金属
颗粒、玻璃和/或硅芯片和表面、硝化纤维素条、尼龙膜、片材、duracytes、反应盘的孔(例如、多孔板)、塑料管等。固体支持物可以包含多种物质(包括例如，玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、右旋糖酐、尼龙、直链淀粉、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿)中的任一种。将人源化抗因子bb抗体固定在固体支持物上的合适方法是熟知的，并且包括但不限于离子相互作用、疏水相互作用和/或共价相互作用。固体支持物例如在水溶液中可以是可溶的或不溶的。在一些实施方案中，合适的固体支持物在水溶液中通常是不溶的。
[0214]
在一些实施方案中，人源化抗因子bb抗体包含可检测标签。合适的可检测标签包括可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段检测的任何组成。合适的包括但不限于磁珠(例如，dynabeads
tm
)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白和/或黄色荧光蛋白)、放射性标签(例如，3h、
125
i、
35
s、
14
c或
32
p)、酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、萤光素酶和酶联免疫吸附测定(elisa)中常用的其他酶)和比色标签如胶体金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠。
[0215]
在一些实施方案中，人源化抗因子bb抗体包含造影剂或放射性同位素，其中所述造影剂或放射性同位素是适合于在成像(例如人上进行的成像程序)中使用的造影剂或放射性同位素。标签的非限制性例子包括放射性同位素(如
123
i(碘)、
18
f(氟)、
99
tc(锝)、
111
in(铟)和
67
ga(镓))以及造影剂(如钆(gd)、镝和铁)。放射性gd同位素(
153
gd)也是可用的并且适用于非人哺乳动物的成像程序。可以使用标准技术标记人源化抗因子bb抗体。例如，可以使用氯胺t或1,3,4,6-四氯-3α,6α-二苯基甘脲将人源化抗因子bb抗体碘化。关于碘化，在通过氟化物离子置换反应合成期间，将氟化物添加到人源化抗因子bb抗体中。关于合成具有此类放射性同位素的蛋白质的综述，参见muller-gartner,h.,tib tech.,16:122-130(1998)和saji,h.,crit.rev.ther.drug carrier syst.,16(2):209-244(1999)。也可以通过标准技术，用造影剂标记人源化抗因子bb抗体。例如，可以通过将低分子gd螯合物(gd二乙烯三胺五乙酸(gddtpa)或gd四氮杂环十二烷四乙酸(gddota))缀合至人源化抗因子bb抗体，用gd标记所述抗体。参见，caravan等人,chem.rev.99:2293-2352(1999)和lauffer等人,j.magn.reson.imaging,3:11-16(1985)。可以通过例如将聚赖氨酸-gd螯合物缀合至人源化抗因子bb抗体，用gd标记所述抗体。参见例如，curtet等人,invest.radiol.,33(10):752-761(1998)。可替代地，在一些实施方案中，可以通过将包括gd螯合物脂质的顺磁性聚合脂质体与亲和素和生物素化抗体一起孵育，用gd标记人源化抗因子bb抗体。参见例如，sipkins等人,nature med.,4:623-626(1998)。
[0216]
合适的荧光蛋白包括但不限于绿色荧光蛋白(gfp)或其变体、gfp的蓝色荧光变体(bfp)、gfp的青色荧光变体(cfp)、gfp的黄色荧光变体(yfp)、增强型gfp(egfp)、增强型cfp(ecfp)、增强型yfp(eyfp)、gfps65t、emerald、topaz(tyfp)、venus、citrine、mcitrine、gfpuv、不稳定型egfp(degfp)、不稳定型ecfp(decfp)、不稳定型eyfp(deyfp)、mcfpm、cerulean、t-sapphire、cypet、ypet、mko、hcred、t-hcred、dsred、dsred2、dsred单体、j-red、dimer2、t-dimer2(12)、mrfp1、杯型珊瑚色(pocilloporin)、renilla gfp、monster gfp、pagfp、kaede蛋白和点燃蛋白(kindling protein)、藻胆蛋白和藻胆蛋白缀合物(包括b-藻红蛋白、r-藻红蛋白和别藻蓝蛋白)。荧光蛋白的其他例子包括mhoneydew、mbanana、
morange、dtomato、tdtomato、mtangerine、mstrawberry、mcherry、mgrape1、mraspberry、mgrape2和/或mplum(shaner等人(2005)nat.methods 2:905-909)。适于使用来自珊瑚虫物种的多种荧光蛋白和有色蛋白中的任一种(如描述于例如matz等人(1999)nature biotechnol.17:969-973中)。
[0217]
在一些实施方案中，将人源化抗因子bb抗体与治疗剂缀合。本文公开的任何人源化抗因子bb抗体可用于形成抗体-药剂缀合物。可以将所述药剂与轻链的n末端、轻链的c末端、重链的n末端或重链的c末端附接。在一些实施方案中，可以将所述药剂附接至抗体的铰链或抗体上的至少一个其他位点。对于单链抗体，可以将所述药剂附接至单链抗体的n或c末端。可以使用本领域技术人员已知的技术将所述药剂与所述抗体直接缀合或经由接头缀合。所述接头可以是可切割的或不可切割的。此类治疗剂(例如用于疗法中)的例子是本领域技术人员已知的。
[0218]
在一些实施方案中，将人源化抗因子bb抗体与融合配偶体(例如，配体；表位标签；肽；和/或除抗体外的蛋白质)连接(例如，共价或非共价连接)。合适的融合配偶体包括这样的肽和多肽，所述肽和多肽赋予增强的体内稳定性(例如，延长的血清半衰期)；使得易于纯化，例如，(his)n，例如，6his；使得从细胞分泌融合蛋白；提供表位标签，例如，gst、血球凝集素(ha；例如，ypydvpdya；seq id no:55)、flag(例如，dykddddk；seq id no:56)和/或c-myc(例如，eqkliseedl；seq id no:57)；提供可检测信号，例如产生可检测产物的酶(例如，β-半乳糖苷酶、萤光素酶)或自身可检测的蛋白质(例如，绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白等)；和/或提供多聚化，例如多聚化结构域，如免疫球蛋白的fc部分。所述融合物还可以包含亲和结构域，包括可以与结合配偶体相互作用的可用于鉴定或纯化的肽序列，例如，如固定在固体支持物上的肽序列。连续的单一氨基酸(如组氨酸)当与蛋白质融合时可以通过与树脂柱(如镍琼脂糖)的高亲和力结合用于融合蛋白的一步式纯化。示例性亲和结构域包括his5(hhhhh)(seq id no:58)、hisx6(hhhhhh)(seq id no:59)、c-myc(eqkliseedl)(seq id no:60)、flag(dykddddk)(seq id no:61)、streptag(wshpqfek)(seq id no:62)、血球凝集素例如ha标签(ypydvpdya；seq id no:63)、谷胱甘肽-s-转移酶(gst)、硫氧还蛋白、纤维素结合结构域、ryirs(seq id no:66)、phe-his-his-thr(seq id no:64)、几丁质结合结构域、s-肽、t7肽、sh2结构域、c末端rna标签weaaareaccreccara(seq id no:65)、金属结合结构域，例如锌结合结构域或钙结合结构域，如来自钙结合蛋白的那些，例如钙调蛋白、肌钙蛋白c、钙调磷酸酶b、肌球蛋白轻链、恢复蛋白、s-调控蛋白、视锥蛋白、vilip、神经钙蛋白、海马钙结合蛋白、聚集蛋白、钙迁蛋白、钙蛋白酶大亚基、s100蛋白、小清蛋白、钙结合蛋白d9k、钙结合蛋白d28k和钙网膜蛋白、内含肽、生物素、链霉亲和素、myod、亮氨酸拉链序列和麦芽糖结合蛋白。
[0219]
产生人源化抗因子bb抗体的方法
[0220]
在一些实施方案中，可以通过使用已经被工程化以表达特异性人免疫球蛋白的可商购获得的小鼠获得全人抗体。设计用于产生更理想的(例如，全人抗体)或更稳健的免疫应答的转基因动物也可用于产生人源化抗体或人抗体。此类技术的例子是amgen,inc.(加利福尼亚州弗里蒙特)的xenomouser
tm
和medarex,inc.(新泽西州普林斯顿)的humab-mouser
tm
和tc mouse
tm
或harbour antibodies bv(荷兰)的h2l2小鼠。在另一个可替代方案中，可以通过噬菌体展示或酵母技术重组制造抗体。参见例如，美国专利号5,565,332；5,
580,717；5,733,743；和6,265,150；以及winter等人,(1994)annu.rev.immunol.12:433-455。可替代地，噬菌体展示技术(mccafferty等人,(1990)nature348:552-553)可用于从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(v)结构域基因库体外产生人抗体和抗体片段。
[0221]
可以经由常规方法制备完整抗体(全长抗体)的抗原结合片段。例如，可以通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生f(ab')2片段，并且可以通过还原f(ab')2片段的二硫桥产生fab片段。可以经由例如常规重组技术产生基因工程化抗体，如人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体和双特异性抗体。在一个例子中，可以使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合至编码单克隆抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离编码对靶抗原具有特异性的单克隆抗体的dna并对其测序。杂交瘤细胞用作这种dna的优选来源。分离后，可以将dna置于至少一种表达载体中，然后将其转染到原本不产生免疫球蛋白的宿主细胞(如大肠杆菌(escherichia coli)(e.coli)细胞、猿猴cos细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞、人hek293细胞或骨髓瘤细胞)中，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。参见例如，pct公开号wo 87/04462。然后，例如，可以通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列替代同源鼠序列(morrison等人,(1984)proc.nat.acad.sci.81:6851)或者通过将非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或部分共价连接到免疫球蛋白编码序列来修饰dna。以该方式，可以制备具有靶抗原的结合特异性的基因工程化抗体，如“嵌合”或“杂合”抗体。
[0222]
可以经由重组技术，例如，通过连接编码重链可变区的核苷酸序列和编码轻链可变区的核苷酸序列来制备单链抗体。在一些实施方案中，在两个可变区之间掺入柔性接头。
[0223]
可替代地，可以采用所述的用于产生单链抗体的技术(美国专利号4,946,778和4,704,692)，例如，以产生噬菌体或酵母scfv文库，并且可以按照常规程序从文库中鉴定对因子bb具有特异性的scfv克隆。可以使阳性克隆经受进一步筛选，以鉴定具有高因子bb结合亲和力的克隆。
[0224]
在一些实施方案中，通过如下文例示的重组技术制备人源化抗因子bb抗体。可以将编码本文所述的抗因子bb抗体的重链和轻链的核酸克隆到一个表达载体中，每个核苷酸序列与合适的启动子可操作地连接。在一个例子中，编码重链和轻链的每个核苷酸序列与不同的启动子可操作地连接。可替代地，编码重链和轻链的核苷酸序列可以与单个启动子可操作地连接，使得重链和轻链两者均从同一启动子表达。必要时，可以在重链编码序列与轻链编码序列之间插入内部核糖体进入位点(ires)。
[0225]
在一些例子中，编码抗体的两条链的核苷酸序列被克隆到两个载体中，这两个载体可以被引入到相同或不同的细胞中。当这两条链在不同的细胞中表达时，它们中的每一条都可以从表达这种链的宿主细胞中分离出来，并且分离出的重链和轻链可以在允许抗体形成的合适条件下混合和孵育。
[0226]
通常，可以使用本领域已知的方法将编码抗体的一条链或全部链的核酸序列克隆到合适的表达载体中且与合适的启动子可操作地连接。例如，核苷酸序列和载体可以在合适的条件下与限制酶接触，以在每个分子上创建互补末端，这些末端可以彼此配对并且用连接酶连接在一起。可替代地，合成核酸接头可以连接到基因的末端。这些合成接头含有对应于载体中特定限制性位点的核酸序列。表达载体/启动子的选择将取决于用于产生抗体的宿主细胞的类型。
[0227]
多种启动子可用于本文所述的抗体的表达，所述启动子包括但不限于巨细胞病毒
(cmv)中间早期启动子、病毒ltr(如rous肉瘤病毒ltr、hiv-ltr、htlv-1ltr)、猿猴病毒40(sv40)早期启动子、大肠杆菌lac uv启动子和单纯疱疹病毒tk病毒启动子。
[0228]
也可以使用可调节启动子。这种可调节启动子包括使用来自大肠杆菌的lac阻遏物作为转录调节剂以调节从携带lac操纵子的哺乳动物细胞启动子的转录的启动子[brown,m.等人,cell,49:603-612(1987)]；使用四环素阻遏物(tetr)的启动子[gossen,m.,和bujard,h.,proc.natl.acad.sci.usa 89:5547-555115(1992)；yao,f.等人,human gene therapy,9:1939-1950(1998)；shockelt,p.,等人,proc.natl.acad.sci.usa,92:6522-6526(1995)]。其他系统包括fk506二聚体、使用雌二醇的vp16或p65、ru486、二元酚米乐甾酮或雷帕霉素。诱导系统尤其可从invitrogen、clontech和ariad获得。
[0229]
可以使用包括具有操纵子的阻遏物的可调节启动子。在一个实施方案中，来自大肠杆菌的lac阻遏物可以用作转录调节剂以调节携带lac操纵子的哺乳动物细胞启动子的转录[m.brown等人,cell,49:603-612(1987)]；gossen和bujard(1992)；[m.gossen等人,natl.acad.sci.usa,89:5547-5551(1992)]将四环素阻遏物(tetr)与转录激活因子(vp 16)组合以创建tetr-哺乳动物细胞转录激活因子融合蛋白tta(tetr-vp16)，与源自人巨细胞病毒(hcmv)启动子的携带teto的哺乳动物启动子组合以创建tetr-tet操纵子系统来控制哺乳动物细胞中的基因表达。在一个实施方案中，使用四环素诱导型开关。当将四环素操纵子适当定位在cmvie启动子的tata元件下游时，单独的四环素阻遏物(tetr)(而不是tetr哺乳动物细胞转录因子融合物衍生物)可以用作有效的反式调节剂以调节哺乳动物细胞中的基因表达(yao等人,human gene therapy)。这种四环素诱导型开关的一个特别的优点是，它不需要使用四环素阻遏物哺乳动物细胞反式激活因子或阻遏物融合蛋白(在一些情况下，这可能对细胞有毒)(gossen 5等人,natl.acad.sci.usa,89:5547-5551(1992)；shockett等人,proc.natl.acad.sci.usa,92:6522-6526(1995))即可实现其可调节作用。
[0230]
此外，载体可以含有例如以下中的一些或全部：选择性标记基因，如用于在哺乳动物细胞中选择稳定或瞬时转染物的新霉素基因；用于高水平转录的来自人cmv的立即早期基因的增强子/启动子序列；对于mrna稳定性的来自sv40的转录终止和rna处理信号；用于适当附加型复制的sv40多瘤病毒复制起点和cole1；内部核糖体结合位点(ires)、通用多克隆位点；以及用于体外转录正义和反义rna的t7和sp6 rna启动子。合适的载体和用于产生含有转基因的载体的方法是本领域熟知的并且可用的。可用于实践本文所述方法的多腺苷酸化信号的例子包括但不限于人胶原i多腺苷酸化信号、人胶原ii多腺苷酸化信号和sv40多腺苷酸化信号。
[0231]
可以将至少一种包含编码任何所述抗体的核酸的载体(例如，表达载体)引入合适的宿主细胞中以产生所述抗体。可以将宿主细胞在合适的条件下培养以表达所述抗体或其任何多肽链。可以经由常规方法(例如，亲和纯化)从培养的细胞(例如从细胞或培养上清液)中回收此类抗体或其多肽链。如有必要，可以将抗体的多肽链在合适的条件下孵育合适的时间段，以允许产生所述抗体。
[0232]
在一些实施方案中，用于制备本文所述的抗体的方法涉及也如本文所述的编码抗因子bb抗体的重链和轻链两者的重组表达载体。可以将重组表达载体通过常规方法(例如，磷酸钙介导的转染)引入合适的宿主细胞(例如，二氢叶酸还原酶(dhfr)-cho细胞)中。可以在允许表达形成所述抗体的两条多肽链的合适条件下选择和培养阳性转化体宿主细胞，可
以从所述细胞或培养基中回收所述抗体。必要时，可以在允许形成抗体的适当条件下孵育从宿主细胞中回收的两条链。
[0233]
在一些实施方案中，提供两个重组表达载体，一个编码抗因子bb抗体的重链，另一个编码抗因子bb抗体的轻链。可以将这两个重组表达载体通过常规方法(例如，磷酸钙介导的转染)引入合适的宿主细胞(例如，dhfr-cho细胞)中。
[0234]
可替代地，可以将每个表达载体引入合适的宿主细胞中。可以在允许抗体的多肽链表达的合适条件下选择并且培养阳性转化体。当将这两个表达载体引入同一宿主细胞中时，可以从宿主细胞或培养基中回收从所述宿主细胞产生的抗体。如有必要，可以从宿主细胞或从培养基中回收多肽链，然后将其在允许形成所述抗体的适当条件下孵育。当将这两个表达载体引入不同的宿主细胞中时，它们中的每一个都可以从相应的宿主细胞或相应的培养基中回收。然后可以在合适的条件下孵育这两条多肽链以形成抗体。
[0235]
使用标准分子生物学技术来制备所述重组表达载体、转染所述宿主细胞、选择转化体、培养所述宿主细胞并且从所述培养基中回收所述抗体。例如，一些抗体可以通过亲和色谱与蛋白a或蛋白g偶联基质分离。
[0236]
编码本文所述抗因子bb抗体的重链、轻链或两者的任何核酸(例如，如表2和表3所提供的)、含有这种核酸的载体(例如，表达载体)；和包含所述载体的宿主细胞均在本公开文本的范围内。
[0237]
药物组合物和治疗方法
[0238]
本公开文本的其他方面提供了组合物，所述组合物包括包含本文所述的任一种人源化抗因子bb抗体的药物组合物。通常，药物组合物(本文也称为配制品)包含有效量的本文所述的任一种人源化抗因子bb抗体。“有效量”意指足以产生例如以下希望的结果的剂量：减少与补体介导的疾病或障碍相关的不良症状、改善补体介导的疾病或障碍的症状、减缓补体介导的疾病或障碍的进展等。通常，希望的结果至少是与对照组相比减少了补体介导的疾病或障碍的症状。
[0239]
在本公开文本的方法中，可以使用能够产生希望的治疗效果或诊断效果的便利手段向受试者施用人源化抗因子bb抗体。因此，可以将人源化抗因子bb抗体掺入多种配制品中以用于治疗性施用。更具体地，人源化抗因子bb抗体可以通过与适当的、药学上可接受的载体、药学上可接受的稀释剂或其他药学上可接受的赋形剂组合而被配制成药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含人源化抗因子bb抗体和药学上可接受的赋形剂。
[0240]
在药物剂型中，人源化抗因子bb抗体可以以其药学上可接受的盐的形式施用，或者它们还可以单独使用或与其他药学活性化合物适当联合使用以及组合使用。以下方法和赋形剂仅仅是示例性的，而决不是限制性的。
[0241]
对于口服制剂，人源化抗因子bb抗体可以单独使用或与适当的添加剂组合使用，以制成片剂、散剂、颗粒剂或胶囊剂。
[0242]
人源化抗因子bb抗体可以通过将抗体在水性或非水性溶剂中溶解、悬浮或乳化；以及如果需要，与常规添加剂(如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂)一起被配制成注射制剂。
[0243]
通过将具有所需纯度的人源化抗因子bb抗体与任选的生理学上可接受的载体、其他赋形剂、稳定剂、表面活性剂、缓冲剂和/或张度剂混合来制备包含人源化抗因子bb抗体
的药物组合物。可接受的载体、其他赋形剂和/或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒。在一些实施方案中，所述组合物包含缓冲液、抗氧化剂、氨基酸或其组合。
[0244]
药物组合物可以是液体形式、冻干形式或从冻干形式重构的液体形式，其中冻干制剂在施用之前用无菌溶液重构。用于重构冻干组合物的标准程序是添加回一定体积的纯水(通常等于冻干期间去除的体积)；然而，包含抗细菌剂的溶液可以用于产生肠胃外施用的药物组合物；还参见chen(1992)drug dev ind pharm 18,1311-54。
[0245]
抗体配制品中可包含张力剂以调节配制品的张力。在一些实施方案中，水性配制品是等渗的，但高渗或低渗溶液可能是合适的。术语“等渗”表示具有与其比较的某些其他溶液(如生理盐溶液或血清)相同张力的溶液。
[0246]
表面活性剂也可添加到抗体配制品中，以减少配制抗体的聚集和/或使配制品中颗粒的形成最小化和/或减少吸附。
[0247]
还可以添加冻干保护剂，以保护不稳定的活性成分(例如蛋白质)在冻干过程期间免受去稳定条件的影响。
[0248]
在一些实施方案中，本发明配制品包含人源化抗因子bb抗体和至少一种以上鉴定的试剂(例如，表面活性剂、缓冲液、稳定剂、张度剂)，并且基本上不含至少一种防腐剂。
[0249]
人源化抗因子bb抗体可用于经由吸入施用的气雾剂配制品中。人源化抗因子bb抗体可以被配制成加压可接受的推进剂。
[0250]
此外，通过与多种碱(如乳化碱或水溶性碱)混合可以将人源化抗因子bb抗体制成栓剂。人源化抗因子bb抗体可以经由栓剂直肠施用。
[0251]
其他施用方式也将可用于本公开文本的方法。例如，可以将人源化抗因子bb抗体配制成栓剂，并且在一些实施方案中配制成气雾剂和鼻内组合物。对于栓剂，媒介物组合物可以包含传统结合剂和载体。
[0252]
鼻内配制品通常将包含既不会刺激鼻粘膜也不会明显干扰纤毛功能的媒介物。可以采用稀释剂(如水、盐水溶液或其他已知物质)。鼻用配制品也可以含有防腐剂。可以存在表面活性剂以增强鼻粘膜对人源化抗因子bb抗体的吸收。
[0253]
人源化抗因子bb抗体可以作为可注射配制品施用。通常，可注射组合物被制备为液体溶液或悬浮液；还可以制备适合于在注射前溶解或悬浮于液体媒介物中的固体形式。也可以乳化所述制剂或将所述抗体封装在脂质体媒介物中。
[0254]
在一些实施方案中，将人源化抗因子bb抗体配制成控制释放配制品。在本公开文本的范围内的控制释放可以被理解为意指多种延长释放剂型中的任何一种。
[0255]
使用包括体内和离体方法以及全身性和局部施用途径的适用于药物递送的方法和途径向受试者施用人源化抗因子bb抗体。
[0256]
常规和药学上可接受的施用途径包括但不限于鼻内、肌内、气管内、鞘内、颅内、皮下、皮内、局部、静脉内、腹膜内、动脉内(例如，经由颈动脉)、脊髓或脑递送、直肠、鼻腔、口服、以及其他肠内和肠胃外施用途径。
[0257]
可以使用适合于递送常规药物的任何可用的常规方法和途径(包括全身或局部途径)向受试者施用本公开文本的抗体。一般而言，本公开文本考虑的施用途径包括但不限于肠内、肠胃外或吸入途径。
[0258]
在一些实施方案中，例如通过注射和/或递送至脑动脉中的部位或直接进入脑组
织来施用人源化抗因子bb抗体。还可以例如通过向靶位点的生物递送，将人源化抗因子bb抗体直接施用至靶位点。
[0259]
可以根据本文提供的方法治疗多种受试者。通常，此类受试者是“哺乳动物(mammals)”或“哺乳动物(mammalian)”，其中这些术语被广泛用于描述哺乳动物类中的生物，包括食肉动物(例如猫)、食草动物(例如牛、马和羊)、杂食动物(例如狗、山羊和猪)、啮齿动物(例如小鼠、豚鼠和大鼠)和灵长类动物(例如人、黑猩猩和猴)。在一些实施方案中，受试者具有补体系统，如哺乳动物、鱼或无脊椎动物。在一些实施方案中，受试者是含补体系统的哺乳动物、鱼或无脊椎伴生动物、农业动物、工作动物、动物园动物或实验室动物。在一些实施方案中，受试者是人。
[0260]“治疗”是指至少改善与困扰受试者的病理学病症相关的症状，其中广义上使用的改善是指至少减少与被治疗的病理学病症(如补体介导的疾病或障碍)相关的参数(例如症状)的量值。因此，治疗还包括以下情形，其中病理学病症或至少与其相关的症状和/或次级效应被完全抑制，例如，防止发生，或停止，例如终止，使得受试者不再患有所述病理学病症或至少表征所述病理学病症的症状。
[0261]
在一些实施方案中，“受试者”是哺乳动物，包括但不限于鼠(大鼠、小鼠)、非人灵长类动物、人、犬类、猫类、有蹄类动物(例如，马类、牛类、绵羊类、猪类、山羊类)等。这些术语还涵盖具有补体系统的任何动物，如哺乳动物、鱼和一些无脊椎动物。因此，这些术语包括含有补体系统的哺乳动物、鱼类和无脊椎伴生动物、农业动物、工作动物、动物园动物和实验室动物。
[0262]“生物样品”包括从受试者获得的各种样品类型，并且可以用于诊断或监测测定。所述定义包括生物来源的血液和其他液体样品、固体组织样品(如活检标本)或组织培养物或由组织培养物得到的细胞及其后代。所述定义还包括在采购后以任何方式进行操作的样品，如通过用试剂处理、增溶或富集某些组分(如多核苷酸)进行操作。术语“生物样品”包括临床样品，并且还包括培养中的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物流体和组织样品。术语“生物样品”包括尿液、唾液、脑脊液、间质液、眼液、滑液和/或血液级分，如血浆和血清。术语“生物样品”还包括固体组织样品、组织培养样品和细胞样品。
[0263]
本公开文本提供了用于施用至受试者的适合于容纳包含人源化抗因子bb抗体的组合物的装置或容器。例如，可以将人源化抗因子bb抗体置于适于容纳药物组合物的容器内。所述容器可以是，例如，瓶(例如，带有封闭装置，如盖子)、泡罩包装(例如，可以为每个泡罩中的至少一个剂量提供封闭)、小瓶、软包装(例如，密封的聚酯薄膜(mylar)或塑料袋)、安瓿(用于溶液形式的单次剂量)、滴管、注射器、薄膜和/或管。在一些实施方案中，容器(如无菌容器)包含本发明药物组合物。在一些实施方案中，所述容器是瓶或注射器。在一些实施方案中，所述容器是瓶。在一些实施方案中，所述容器是注射器。在一些实施方案中，所述装置是可注射装置，如注射器(例如，预填充注射器)、笔(例如，预填充笔)或电子注射装置(e-device)。
[0264]
本公开文本提供了治疗补体介导的疾病或障碍的方法。所述方法通常涉及向有需要的受试者施用有效量的本公开文本的人源化抗因子bb抗体。在一些实施方案中，施用人源化抗因子bb抗体调节受试者的细胞、组织或流体中的补体途径活性，并且治疗补体介导的疾病或障碍。
[0265]“有效量”是指抗补体因子bb抗体的如下量，当向哺乳动物或其他受试者施用以治疗疾病时，所述量足以实现所述疾病的这种治疗。“治疗有效量”将根据所述抗补体bb抗体、所述疾病及其严重程度和待治疗的受试者的年龄、体重等而变化。
[0266]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体的有效量是有效减少或抑制受试者的细胞、组织或流体中的补体途径活性的量。
[0267]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体的有效量是有效减少或抑制受试者的细胞、组织或流体中的mac形成的量。
[0268]
在一些实施方案中，本公开的人源化抗因子bb抗体的有效量是有效减少或抑制受试者的细胞、组织或流体中c3b/bb介导的c3的切割的量。
[0269]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体的有效量是有效减少或抑制c3b/bb介导的c3的切割从而减少c3切割产物的产生的量。
[0270]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体的有效量是有效减少或抑制受试者中补体ap介导的细胞裂解的量。
[0271]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体的有效量是有效减少或抑制受试者的细胞、组织或流体(例如，含rbc的流体)中的补体ap介导的溶血的量。
[0272]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体的有效量是有效减少或抑制过敏毒素产生的量。
[0273]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体的有效量是有效减少或抑制ap介导的c3b、c3d或其他c3分裂产物在受试者的细胞或组织上的沉积的量。
[0274]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体的有效量是有效减少或抑制ap介导的c3b在受试者的细胞或组织上的沉积的量。
[0275]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体的有效量是有效减少或抑制ap介导的c3b、c3d或其他c3分裂产物在受试者的rbc上的沉积的量。
[0276]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体的有效量是有效减少或抑制ap介导的c3b在受试者的rbc上的沉积的量。
[0277]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体当以至少一个剂量施用至有需要的受试者时减少受试者的循环中的因子bb的量。例如，与在不施用人源化抗因子bb抗体的情况下受试者的循环中的因子bb的量相比、或与施用人源化抗因子bb抗体之前的受试者的循环中的因子bb的量相比，本公开文本的人源化抗因子bb抗体当以至少一个剂量施用至有需要的受试者时可以使受试者的循环中的因子bb的量减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。
[0278]
在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗因子bb抗体当以至少一个剂量施用至有需要的受试者时减少受试者的血浆中因子bb的量。例如，与在不施用人源化抗因子bb抗体的情况下受试者的血浆中的因子bb的量相比、或与施用人源化抗因子bb抗体之前的受试者的血浆中的因子bb的量相比，本公开文本的人源化抗因子bb抗体当以至少一个剂量施用至有需要的受试者时可以使受试者的血浆中的因子bb的量减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。
[0279]
在一些实施方案中，本公开文本治疗患有补体介导的疾病或障碍的受试者的方法包括向所述受试者施用本公开文本的人源化抗因子bb抗体或药物组合物，所述药物组合物包含：a)本公开文本的人源化抗因子bb抗体；和b)适于向此类受试者施用的药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，所述受试者是人。施用可以通过本领域技术人员已知的任何途径，包括本文公开的那些途径。在一些实施方案中，施用是静脉内的。在一些实施方案中，施用是鞘内的。在一些实施方案中，施用是肌内的。在一些实施方案中，施用是皮下的。
[0280]
适于用本公开文本的人源化抗因子bb抗体治疗的补体介导的疾病和障碍包括与可替代补体途径相关的疾病和障碍。临床前动物模型和临床试验中的研究指示，旁路途径在组织损伤的发展和多种病症的发病机制中起着重要作用(holers等人,immunological reviews 223:300-316；cao等人,(2016)haematologica 101(11):1319-1326；schubart等人,(2019)pnas 116(16):7926-7931；thurman,(2015)am j kidney dis 65(1):156-168；vriese等人,(2015)am j kidney dis 65(1):156-168；和gold等人,(2006)nat.genet.38(4):458-462)。在一些实施方案中，适于用本公开文本的人源化抗因子bb抗体治疗的补体介导的疾病包括但不限于iga肾病(伯杰氏病)、非典型溶血性尿毒综合征(ahus)、阵发性睡眠性血红蛋白尿(pnh)、特发性血小板减少性紫癜(itp)、血栓形成性血小板减少性紫癜(ttp)、狼疮性肾炎、anca血管炎、膜性肾病、c3肾小球肾炎(c3gn)、局灶性节段性肾小球硬化症(fsgs)、多发性硬化症、黄斑变性、年龄相关性黄斑变性(amd)、类风湿性关节炎、抗磷脂抗体综合征、哮喘、缺血再灌注损伤、ii型膜增生性gn、自发性胎儿丢失、少免疫性血管炎、大疱性表皮松解症、复发性胎儿丢失和创伤性脑损伤。
[0281]
本公开文本的人源化抗因子bb抗体可以单独(例如，作为单一疗法)或在与至少一种另外的治疗剂的组合疗法中施用至有需要的受试者。
[0282]
如本文所用的“与
……
组合”是指在以下情况下使用：例如在施用第二化合物的过程期间施用第一化合物；施用第一化合物，持续与第二化合物的施用重叠的时间段，例如，在施用第二化合物的之前开始施用第一化合物，并且在施用第二化合物结束之前结束施用第一化合物；在施用第一化合物之前开始施用第二化合物，并且在施用第一化合物结束之前结束施用第二化合物；在开始施用第二化合物之前开始施用第一化合物并且在施用第一化合物结束之前结束施用第二化合物；在开始施用第一化合物之前开始施用第二化合物并且在施用第二化合物结束之前结束施用第一化合物。因此，“组合”也可以指涉及施用两种或更多种化合物的方案如本文所用的“与
……
组合”还指两种或更多种化合物的施用，所述两种或更多种化合物可以以相同或不同的配制品、通过相同或不同的途径、以及以相同或不相同的剂型类型施用。
[0283]
适于用人源化抗因子bb抗体治疗的受试者包括被诊断为患有补体介导的疾病或障碍的受试者；比普通群体有更大的风险患上补体介导的疾病或障碍的受试者(例如，具有患上补体介导的疾病或障碍的遗传倾向的受试者)。还包括患有上文所列的补体介导的疾病或障碍中的任一种的受试者。在一些实施方案中，所述受试者是成年人。在一些实施方案中，所述受试者是人类儿童。
[0284]
实施例
[0285]
实施例1：小鼠单克隆抗因子bb抗体的人源化
[0286]
扩增、克隆来自亲本抗因子bb抗体(参见表1)杂交瘤的可变区基并对其测序，从而鉴定出单个独特的vh结构域和单个独特的vκ结构域。
[0287]
最初，将使用composite human antibody
tm
技术设计的三个人源化vh区和五个人源化vκ区克隆到igg4v1重链和κ轻链载体中。母体抗体、两种对照抗体和所有15种人源化抗体组合在hek ebna细胞中瞬时表达。
[0288]
为了评估所有人源化变体的结合，对来自转染的细胞培养物的上清液进行单周期动力学分析。在运行biacore t200 control软件v2.0.1和evaluation软件v3.0的biacore t200(系列号1909913)(ge healthcare，瑞典乌普萨拉)上进行动力学实验。所有单周期动力学实验均在25℃下用hbs-p 运行缓冲液(ph 7.4)(ge healthcare，英国小查尔方顿)运行。
[0289]
根据通过elisa效价评估的浓度，将抗体在运行缓冲液中稀释至1μg/ml的终浓度。在每个周期开始时，将抗体加载到蛋白a芯片(ge healthcare，英国小查尔方顿)的fc2、fc3和fc4上。以10μl/min的流速捕获igg，以得到约63ru的固定水平(rl)，这是获得约50ru的rmax的理论值。然后使表面稳定。以因子bb(comptech，美国泰勒)作为分析物，以30μl/min的流速获得单周期动力学数据，以最小化任何潜在的质量传输限制。用参考嵌合抗体进行多次重复，以检查表面和分析物在动力学周期中的稳定性。从fc2、fc3和fc4的信号中减去来自参考通道fc1(无抗体)的信号以校正与参考表面的非特异性结合的差异。使用范围从0.78nm至6.25nm因子bb的四点二倍稀释，每个浓度之间无需再生。监测渐增浓度的因子bb的四次注射的缔合期，每次持续200秒，并且在最后一次注射因子bb后测量单个解离期持续200秒。使用两次注射10mm甘氨酸hcl(ph 1.5)进行蛋白a表面的再生。
[0290]
单周期动力学的传感图和拟合数据示于图1a-图1d中并且测量的因子bb与每种抗体的相互作用的动力学参数示于表7中。通过将vh0/vκ0参考抗体的kd除以同一实验中测定的人源化变体的kd来计算相对kd。
[0291]
表7.与因子bb结合的人源化变体和参考抗体的单周期动力学参数。
[0292][0293]
biacore分析表明，所有人源化变体都与因子bb结合，然而，在所有情况下，相对kd均是嵌合体的两倍差异，这表明一些结合亲和力已经丧失。为了解决这个问题，设计了另外的四条重链(vh4至vh7)和两条轻链(vκ6至vκ7)序列，并且将其克隆到适当的表达载体中。变体序列示于表2和表3中。
[0294]
重新设计的变体的表达和单周期动力学分析
[0295]
将五种对照抗体(vh0/vκ6、vh0/vκ7、vh5/vκ0、vh6/vκ0、vh7/vκ0)和人源化重链和轻链的组合(总共八种人源化配对，表8)使用pei转染方法瞬时转染到hek ebna贴壁细胞(目录号crl-10852
tm
)中。通过igg elisa监测igg上清液效价(表9)并且将转染物培养至多10天，然后收获上清液。
[0296]
表8.通过瞬时转染产生的变体的抗体效价(μg/ml)。
[0297] vκ0vκ6vκ7vh0-60.629.9vh4-4.714.75vh526.938.135.5vh65.88.59.7vh717.936.139.8
[0298]
如上所述使用细胞培养上清液进行单周期动力学。单周期动力学的传感图和拟合
数据示于图2a-图2c中。显示所有变体均与因子bb结合。单周期动力学数据(表9)表明，五种抗体(vh4/vκ6、vh4/vκ7、vh6/vκ6 vh6/vκ7和vh7/vκ7)与因子bb的结合在参考嵌合抗体的约两倍以内。通过将vh0/vκ0参考抗体的kd除以同一实验中测定的人源化变体的kd来计算相对kd。
[0299]
表9.与因子bb结合的人源化变体和参考抗体的单周期动力学参数。
[0300]
抗体ka(1/ms)kd(1/s)kd(m)chi2(ru2)相对kdvh0/vκ05.35x1059.49x10-4
1.77x10-9
0.008541.00vh0/vκ35.63x1051.28x10-3
2.27x10-9
0.005871.28vh0/vκ65.34x1051.26x10-3
2.37x10-9
0.007661.34vh0/vκ74.96x1051.05x10-3
2.11x10-9
0.003351.19vh4/vκ63.87x1058.59x10-4
2.22x10-9
0.004731.25vh4/vκ73.86x1059.03x10-4
2.34x10-9
0.004971.32vh5/vκ03.49x1031.45x10-3
4.16x10-7
0.11235.03vh5/vκ61.33x1051.73x10-2
1.30x10-7
0.17373.45vh5/vκ73.20x1031.66x10-3
5.21x10-7
0.153294.35vh6/vκ05.98x1051.97x10-3
3.29x10-9
0.004851.86vh6/vκ64.12x1051.58x10-3
3.84x10-9
0.005882.17vh6/vκ76.30x1052.21x10-3
3.51x10-9
0.003771.98vh7/vκ02.74x1052.07x10-3
7.53x10-9
0.006344.25vh7/vκ61.68x1053.03x10-3
1.80x10-8
0.0058710.17vh7/vκ74.83x1061.17x10-2
2.42x10-9
0.03841.37
[0301]
抗体的纯化
[0302]
在蛋白a琼脂糖柱(ge healthcare，英国小查尔方顿)上从细胞培养上清液中纯化vh4/vκ6、vh4/vκ7、vh6/vκ6、vh6/vκ7和vh7/vκ7以及嵌合抗体，然后使用16/60superdex 200柱(ge healthcare，英国小查尔方顿)使用pbs(ph 7.4)作为流动相进行尺寸排阻色谱法。使用基于预测的氨基酸序列的消光系数，通过od
280nm
对抗体进行定量。使用sds-page通过将1μg每种抗体加载到凝胶上来分析减少的抗体(图3)，并且观察对应于典型抗体谱的条带。
[0303]
抗体的多周期动力学分析
[0304]
为了建立对于因子bb的精确亲和力，使用运行biacore t200 evaluation软件v3.0.1的biacore t200(系列号1909913)仪器(瑞典乌普萨拉)，对纯化的嵌合抗体和五种前导抗体进行多周期动力学分析。将抗体在运行缓冲液中稀释至0.5μg/ml的终浓度。在每个周期开始时，将抗体加载到蛋白a芯片(ge healthcare，英国小查尔方顿)的fc2、fc3和fc4上。以10μl/min的流速捕获igg，以得到约63ru的固定水平(rl)，这是获得约50ru的rmax的理论值。然后使表面稳定。以因子bb作为分析物并且使用30μl/min的流速获得动力学数据，以最小化任何潜在的传质效应。将空白对照的多次重复和单一浓度的分析物的一次重复编程到动力学运行中，以检查表面和分析物两者在动力学周期中的稳定性。对于动力学分析，两倍稀释范围选自从12.5nm至0.391nm因子bb。监测因子bb的缔合期持续360秒，并且监测解离期持续600秒。使用两次注射10mm甘氨酸hcl(ph 1.5)进行蛋白a表面的再生。从
fc2、fc3和fc4的信号中减去来自参考通道fc1的信号以校正与参考表面的非特异性结合的差异，并且将全局rmax参数用于1比1结合模型中。
[0305]
嵌合抗体和人源化变体与因子bb的结合的传感图和拟合数据示于图4a-图4c中。通过将人源化变体的kd除以同一芯片上嵌合抗体的kd来计算相对kd。测量的因子bb与嵌合抗体和人源化变体的相互作用的动力学参数示于表10中。两种人源化变体(vh4/vκ6和vh4/vκ7(粗体))示出了在参考嵌合抗体的两倍以内的相对kd。
[0306]
表10.与因子bb结合的人源化变体和参考抗体的多周期动力学参数
[0307]
抗体ka(1/ms)kd(1/s)kd(m)chi2(ru2)相对kdvh0/vκ04.87x1059.69x10-4
1.99x10-9
0.05151.00vh4/vκ63.76x1058.05x10-4
2.14x10-9
0.03891.08vh4/vκ73.22x1058.41x10-4
2.61x10-9
0.6451.31vh0/vκ05.00x1059.54x10-4
1.91x10-9
0.0331.00vh6/vκ62.51x1051.30x10-3
5.17x10-9
0.03072.71vh6/vκ72.18x1051.24x10-3
5.70x10-9
0.06922.98vh0/vκ04.95x1059.40x10-4
1.90x10-9
0.04421.00vh7/vκ72.22x1052.11x10-3
9.51x10-9
0.02195.01
[0308]
因子bb竞争elisa
[0309]
使用针对鼠亲本抗体的竞争，测试前导纯化的变体和嵌合抗体与因子bb的结合。
[0310]
将因子bb在1x pbs中稀释至1.0μg/ml并且将100μl/孔在4℃下在96孔elisa板上包被过夜。第二天，将板在室温下用1％酪蛋白/pbs封闭两小时，然后用pbs(ph 7.4)洗涤2次。
[0311]
在96孔稀释板中，将固定浓度的鼠亲本抗体(0.5μg/ml，终浓度)以相等的体积添加到在封闭缓冲液中稀释的四倍滴定系列的测试抗体(从45μg/ml开始至0.01μg/ml终浓度)中。将板用pbs-t洗涤3次后，将100μl的嵌合/测试抗体混合物添加到elisa板中。在室温下孵育一小时后，将板用pbs-t洗涤3次，并且在室温下施加100μl的在pbs-t中以1:1000稀释的抗小鼠igg fc特异性hrp(sigma，英国多塞特)持续一小时，以检测结合的小鼠抗体。对于显影，将板用pbs-t洗涤3x，然后添加100μl的tmb底物，并且在室温下孵育大约五分钟。用50μl的3.0m盐酸终止反应并且在450nm下使用板读取器立即读取吸光度。
[0312]
绘制结果并且示于图5中。计算每种变体的ic50值，并且通过将人源化变体的ic50除以在同一板上测定的嵌合抗体的ic50来计算相对ic50值(表11)。所有前导变体展示了在母体抗体的两倍以内的ic50值。
[0313]
表11.从人源化前导抗体与因子bb的竞争elisa获得的半最大抑制浓度(ic50)值。
[0314]
变体ic50(nm)相对ic50(nm)vh0/vκ01.231.00vh4/vκ61.020.83vh4/vκ70.750.61vh6/vκ60.930.75vh6/vκ70.820.66
vh7/vκ71.431.16
[0315]
实施例2：人源化变体的活性
[0316]
人血清中抗因子bb人源化变体对ap的抑制作用
[0317]
使用补体系统旁路途径试剂盒测量人源化变体抑制补体ap活性的能力。在这种基于板的分析中，脂多糖(lps)包被的孔导致旁路途径的特异性激活，其中膜攻击复合物(mac)沉积的检测作为结果。将5.56％正常人血清(nhs)与稀释系列的亲本抗体和人源化变体连同以100μg/ml开始的人igg4对照抗体一起孵育。测量od 405nm并且与试剂盒阳性对照和阴性对照进行比较。将数据相对于板阳性对照绘图(图6a)。所有人源化变体均显示出与人血清中亲本抗体相似的对ap介导的mac沉积的抑制(表13)。
[0318]
表12.在ap测定中人源化抗因子bb抗体的活性。
[0319]
变体ap测定ic50(m)vh0/vk02.4x10-8
vh4/vk62.2x10-8
vh4/vk72.3x10-8
vh6/vk61.9x10-8
vh6/vk72.1x10-8
vh7/vk72.5x10-8
[0320]
在人血清中人源化变体对ap介导的溶血的抑制
[0321]
使用含有egta的缓冲液中的人或食蟹猴血清和兔红细胞抑制经典途径来确定对ap途径介导的溶血的抑制。将以200μg/ml开始的亲本抗体和人源化变体的稀释系列与20％人血清和10x106个兔红细胞(rbc)一起在37℃下孵育一小时。通过测量540nm处上清液的吸光度并且减去含有乙二胺四乙酸(edta)的对照孔中的背景吸光度来确定裂解物的量。结果示出在图6b中。在图6c中，显示了100μg/ml的每种变体的a540，其代表溶血量。如通过a540的最大减少所反映的，vh4/vk6和vh6/vk7示出了最大的溶血抑制。
[0322]
母体抗体和人源化变体与食蟹猴因子bb的结合
[0323]
为了确保人源化过程不会影响物种交叉反应性，使用octet red通过生物膜层干涉仪(bli)测试亲本抗体和人源化衍生物与人和食蟹猴因子bb的结合。简言之，将生物素化抗体加载到在pbs、0.1％ bsa、0.02％ tween-20(测定缓冲液)中平衡的sa生物传感器上。在测定缓冲液中60秒基线后，将抗体加载到探针上180秒，然后是另外的60秒基线。测量与人(comptech)或食蟹猴因子bb(内部纯化)的缔合持续300秒，然后是300秒解离。使用1:1结合模型通过octet分析软件计算动力学参数。数据总结于表13中，并且显示人源化不影响食蟹猴对因子bb的交叉反应性。
[0324]
表13.通过bli测得的人源化变体与人和食蟹猴bb的结合。
[0325]
抗体人bb的kd(m)食蟹猴bb的kd(m)表1中的抗因子bb抗体1.9x10-9
1.1x10-8
vh0/vk02.0x10-9
1.0x10-8
vh4/vk61.6x10-9
8.6x10-9
vh4/vk71.9x10-9
1.1x10-8
vh6/vk61.9x10-9
1.1x10-8
vh6/vk71.9x10-9
1.1x10-8
vh7/vk72.9x10-9
1.6x10-8
[0326]vh
4/vk6-igg4v2和vh6/vk7-igg4v2与人和食蟹猴因子bb的结合
[0327]
为了确定抗体的fc部分的修饰是否影响亲和力和物种交叉反应性，将vh4/vk6-igg4v2和vh6/vk7-igg4v2分别与其亲本抗体(vh4/vk6和vh6/vk7)一起通过bli测试它们结合人和食蟹猴因子bb的能力。vh4/vk6-igg4v2和vh6/vk7-igg4v2在fc区中含有增加对fc受体的亲和力的突变。如上文实施例所述进行实验，并且结果总结于表14中。正如预期的那样，fc的修饰不会影响结合。
[0328]
表14.通过bli的人源化抗因子bb抗体与人和食蟹猴因子bb的结合。
[0329]
抗体人bb的kd(m)食蟹猴bb的kd(m)v46/vk6-igg4v11.6x10-9
1.1x10-8vh
4/vk6-igg4v21.6x10-9
1.1x10-8vh
6/vk7-igg4v11.7x10-9
1.0x10-8vh
6/vk7-igg4v21.7x10-9
1.0x10-8
[0330]vh
4/vk6和vh6/vk7对因子bb(因子b的激活形式)的特异性
[0331]
使用biacore t200通过表面等离子体共振确定vh4/vk6和vh6/vk7与来自人和食蟹猴的酶原因子b和因子bb结合的能力。人因子b和因子bb购自comptech并且食蟹猴因子b和因子bb是内部纯化的。简言之，以30μl/min的流速在hbsp (10mm hepes，150mm nacl，0.05％ p20 ph 7.4)中的biacore series s蛋白a芯片上捕获单克隆抗体。使用单周期动力学测试每种分析物的五点浓度系列的结合，其中每种浓度的接触时间为180秒，然后在25℃和60μl/s的流速下进行600s的解离。人和食蟹猴因子b均以500nm的浓度开始，随后是2倍稀释液，而人和食猕猴因子bb分别以30nm和150nm的浓度开始，然后是2倍稀释液。使用1:1结合模型使用biacore评价软件分析数据。传感图示于图7a-图7d中。结果归纳于表15中。简言之，这两种人源化变体均显示出对人因子bb的亲和力是对食蟹猴因子bb的亲和力的约10倍。几乎无法检测到与人或食蟹猴因子b的结合，并且观察到的小信号主要是非特异性结合。
[0332]
表15.前导人源化变体对人或食蟹猴因子bb的特异性
[0333][0334]
嵌合亲本和代表性人源化变体与各种补体蛋白的结合
[0335]
为了确保人源化不引入与其他补体或血浆蛋白的非特异性结合或对它们的交叉反应性，测试嵌合母体抗体和代表性人源化变体vh6/vk7-igg4v2与以下的结合：ac1s(comptech a104)、c1r(comptech a102)、c2(comptech a112)、c2a(从c2制备)、thrombin(emd millipore 605195)、弹性蛋白酶(emd millipore 324682)、因子d(competech a136)和因子bb(comptech a155)。简言之，将补体和血浆蛋白在4℃下以在pbs中2.5μg/ml包被在elisa板上过夜。然后将板在室温下用酪蛋白封闭1小时并且用1x dpbs/0.05％ tween-20洗涤四次然后用1x dpbs洗涤一次。将以50μg/ml的生物素化嵌合亲本或vh6/vk7-igg4v2开始的系列稀释液添加到在pbs/0.1％酪蛋白/0.1％ tween-20中的板中，并且在室温下孵育2小时。将板如所述洗涤，并且将在pbs/0.1％酪蛋白/0.1％tween-20中的1:10,000稀释的链霉亲和素hrp(southern biotech 7100-05)添加到板中并且在室温下孵育30分钟。将板再次洗涤并且将ultra tmp elisa(thermo 34028)添加到板中持续1分钟，然后添加终止溶液。在板读取器上读取od 450nm并且减去620nm下的背景。嵌合亲本(图8a)和人源化变体(图8b)均示出了对因子bb的完全特异性。
[0336]
实施例3：从cho相比于hek产生的vh6/vk7-igg4v2表现相同
[0337]
为了确定hek细胞中产生的vh6/vk7-igg4v2与在cho细胞中产生的表现是否相同，通过在hek细胞中瞬时表达或通过在cho细胞中使用标准方法稳定表达产生vh6/vk7-igg4v2。
[0338]
根据制造商的说明，分别使用补体系统旁路途径和经典途径试剂盒确定抗体的补体旁路途径(cap)和经典途径(ccp)活性。为了确定cap活性，在5.56％正常人血清(图9a)和5.56％正常食蟹猴血清中测试抗体(图9b)。为了确定ccp活性，在1％正常人血清(图10a)和1％正常食蟹猴血清(图10b)中测试抗体。测量od
405nm
，并且将结果相对于抗体注射前的血清活性归一化。cho和hek中产生的vh6/vk7-igg4v2示出了相似的活性。计算两组抗体的ic
50
值并且示于图10a-图10b中。cho中产生的vh6/vk7-igg4v2示出了与hek中产生的vh6/vk7-igg4v2相似的效力。还比较了cho和hek中产生的vh6/vk7-igg4v2的ap途径介导的溶血。使用在含有egta的缓冲液中的20％正常人血清和兔红细胞抑制经典途径来确定溶
血。通过测量上清液的吸光度并且减去含有乙二胺四乙酸(edta)的对照孔中的背景吸光度来确定裂解物的量。cho和hek中产生的vh6/vk7-igg4v2示出了相似的溶血％(图11)。
[0339]
使用生物层干涉法对cho和hek产生的vh6/vk7-igg4v2抗体进行多周期动力学分析。将抗体在pbs 0.02％ tween 20、0.1％ bsa、0.05％叠氮化钠中稀释至10μg/ml并加载到抗higg fc传感器(在相同的缓冲液中预平衡)上持续90秒，然后是缓冲液中的60分钟基线。在相同缓冲液中的300秒缔合然后300秒解离步骤中测量在2倍稀释液中范围为从100nm至0.14nm的一系列浓度的人因子bb(complement technologies，#a155)的结合。两种抗体的结合曲线和拟合数据以及计算的kd示于图12中。
[0340]
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[0363]
本文(例如，在背景技术、发明内容、具体实施方式、实施例和/或参考文献部分中)提及的所有出版物、专利、专利申请、出版物和数据库条目(例如，序列数据库条目)通过引用以其整体特此并入，就好像每个单独的出版物、专利、专利申请、出版物和数据库条目通过引用被特别且单独地并入本文。在矛盾的情况下，将以包括任何本文定义在内的本技术为准。
[0364]
等效物和范围
[0365]
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[0366]
除非上下文明确指示相反或其他含义，否则诸如“一个/一种(a/an)”和“所述”等冠词可以意指至少不止一个/一种。除非上下文明确指示相反或其他含义，否则如果一个、多于一个或所有组成员存在，则包括一组的两个或更多个成员之间的“或”的权利要求或说明被视为满意的。在两个或更多个组成员之间包括“或”的组的公开内容提供了组中恰好一个成员存在的实施方案、组中多于一个成员存在的实施方案以及所有组成员都存在的实施方案。为简明起见，这些实施方案在本文中未单独阐明，但是应当理解，本文提供了这些实施方案中的每一个，并且这些实施方案中的每一个都可以被特别地要求保护或否认。
[0367]
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[0368]
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……
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……
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[0370]
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[0371]
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[0372]
此外，应当理解，本公开文本的任何特定实施方案可以从任何至少一项的权利要求中明确排除。在给定范围的情况下，所述范围内的任何值都可以明确地从任何至少一项
权利要求中排除。本公开文本的组合物和/或方法的任何实施方案、要素、特征、应用或方面可以从任何至少一项权利要求中排除。为简明起见，本文未明确示出排除的至少一个要素、特征、目的或方面的所有实施方案。
[0373]
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±
10％。