非侵入式生物监测生态流量目标适应性快速评估优化方法与流程

1.本发明属于水生生态分析技术领域，具体涉及一种非侵入式生物监测生态流量目标适应性快速评估优化方法。


背景技术：

2.在生态环境需水研究之初，人们认为决定河流水生态系统内水生物种生存繁衍的最根本因素是河流低流量，因此各国学者对生态环境需水的定义多聚焦于河流最小流量。随着人们对水生物种研究的不断深入，新的生态模式被逐渐开发出来。该模式指出河流需要多种水流条件来维持河流生态系统的健康运行及水生物种的良性循环，生态环境需水不能只用一个最小值来表示，而应该是一个流量过程。
3.因此生态流量的后优化方法逐渐进入人们的视野，生态流量的后优化方法大致分为水文学、水力学、生态学及整体法等。其中水文学方法以tennant法和7q10法为代表，指利用中长期流量监测数据为基础，以天然流量过程为依据确定总流量及流量过程曲线；此方法操作简单，数据充分，被广泛应用于大尺度的生态流量目标制定和优化，但是该类方法基本没有考虑生态需求。水力学方法以湿周法和r2-cross为代表，是基于水动力学模型等模拟满足栖息地所需的流量水平，虽然水力学方法以栖息地的方式考虑了生物需求，但是该方法仍然没有直接考虑生物的动态变化来优化流量目标。以生态响应为基础的生态学方法或整体方法，直接生物需求为目标确定生态流量，准确性和科学性最佳，日益成为生态流量确定和优化的主要方法，但是该类方法需要大量长期的生态监测信息。
4.在进行生态监测时，其生态监测对象主要包括浮游植物、浮游动物以及鱼类等，浮游植物和浮游动物是河流食物网的基础，由于世代周期短，在瞬时响应和短期评估中发挥着重要作用；鱼类是河流生态系统的顶级营养级，对河流食物网结构和功能具有决定性作用，是当前诸多生态流量研究中的关键目标种群。由于流量减少、水质污染和栖息地丧失等影响，导致鱼类数量和密度越来越少，尤其是本就稀少的珍稀特有鱼类。在局部点位采用传统粘网、手撒网、电鱼、采集渔民标本等方法难以对低密度的稀有鱼类进行有效监测，而且采用拖网、电捕等方式又会对本已脆弱的河流水生生态系统造成二次伤害。总之，采用传统监测方法存在专业性要求高、历时长、代表性差等问题。因此，采用经济有效、可重复、快速、无创的方法对鱼类多样性进行监测和评估，是实现生态流量管理成效初期评估和优化的关键。
5.环境dna技术(edna)是从环境样本中获取dna，对其进行保存、提取、扩增、测序和分类，进而确定生物在采样环境中的分布。到目前为止，edna已被用于监测濒危物种和入侵物种的状态，并评估水生生物，特别是鱼类的生物量和多样性。
6.基于此，发明人进行了较多的研发，形成一种以快速无伤害的edna技术为基础，快速而全面的获取鱼类空间分布信息，以不同流量占比替代绝对流量的方式实现空间置换时间，在此基础上构建鱼类多样性对流量变化的响应关系，再利用情景模拟的方法评估当前生态流量管理成效并提出优化建议目标的方法。


技术实现要素：

7.本发明意在提供一种非侵入式生物监测生态流量目标适应性快速评估优化方法，本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题。
8.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案，非侵入式生物监测生态流量目标适应性快速评估优化方法，包括以下步骤，
9.步骤一，
10.采集样品；
11.步骤二，
12.dna提取；向待提取的样品内加入裂解液和锆珠，完成破碎匀浆；再加入蛋白酶k，水浴消解蛋白；再提取上清液并利用磁珠吸附dna，最后利用无酶水洗脱磁珠上吸附的dna；
13.基因扩增；配置pcr扩增溶液，再设定扩增程序，完成基因扩增；
14.高通量测序；首先将扩增后的dna平末端补齐，并将测序使用的接头与dna片段连接，再对连接有接头的dna片段进行pcr扩增，最后进行高通量测序；
15.生物信息处理；依次进行数据质量控制、去重复、otu聚类、分类预测、下游多样性分析，并得出结果；
16.步骤三，
17.鱼类群落多样性指数计算；采用margalef多样性指数(m)和香农多样性指数(h2’)进行表征，计算方法如下：
18.m＝(s-1)/ln(n)
[0019][0020]
步骤四，
[0021]
不同断面年/月平均绝对流量计算；依据不同断面逐日实测流量信息，计算不同断面的年/月平均流量值，计算公式如下：
[0022][0023]
步骤五，
[0024]
不同断面相对流量占比计算；
[0025]
(1)不同断面相对流量占比计算；确定参考断面，确定标准为该断面天然流量长期数据，计算参考断面的多年平均天然流量值(r
b_n
)；
[0026]
(2)利用gis技术，提取参考断面和其他断面的集水面积，计算参考断面与其他所需断面的集水面积比；
[0027][0028]
(3)c.假定不同断面集水面积比例即为天然流量比例，结合集水面积比例和参考断面的天然多年流量水平，确定所需断面的多年天然流量水平(r
i_n
)；
[0029]ri_n
＝r
b_n
*k
[0030]
(4)利用不同断面的实测年平均流量值除以该断面的天然多年流量值，作为该断
面的相对流量占比；
[0031]
pi＝r
i_ari_n
[0032]
步骤六，
[0033]
不同断面流量目标确定；确定参考断面，确定标准为该断面具有明确的生态流量目标；利用gis技术，提取参考断面和其他断面的集水面积，依据所需断面与参考断面的集水面积比例；结合集水面积比例和参考断面的生态流量目标值，确定所需断面的生态流量目标值；
[0034][0035]
步骤七，
[0036]
鱼类群落多样性对流量过程的响应关系构建；采用spss模型分析鱼类多样性对绝对流量值和相对流量占比的响应规律；利用spss回归分析模块在年际尺度上构建流量占比与鱼类多样性的对数回归拟合曲线；基于拟合回归曲线，以鱼类全年平均多样性指数大于0为下限目标，确定对应的全年平均流量占比值，对比当前的生态流量目标，得到还需提高生态流量目标设置比例的优化方案。
[0037]
在本发明的另一种优选实施方式中，采集样品时，每15-20l作为一个样本，并且利用dna富集过滤器完成水环境dna富集，每个样品富集水体体积为1-5l，每个采样点富集不少于3个平行样品。
[0038]
在本发明的另一种优选实施方式中，步骤二中，使用3mm和1mm粒径的锆珠配合。
[0039]
在本发明的另一种优选实施方式中，步骤二中，利用酶与碱基扩增后的dna片段的黏性末端补齐，生成平末端。
[0040]
在本发明的另一种优选实施方式中，步骤二中，高通量测序时，先将文库内的dna片段与测序微珠裹在微小的油滴中，使得每个油滴内含有1条dna片段、1个测序微珠及pcr反应溶液，使得每个测序微珠上连接数条完全相同的dna片段；再添加改性磁珠，将未连接dna片段的测序磁珠去除掉；将富集后的测序磁珠装载到测序芯片上；最后通过测定反应体系内的ph变化，得到目的dna片段的序列。
[0041]
在本发明的另一种优选实施方式中，生物信息处理使用基于ubuntu14.04版本下的ecoview2.0版本软件完成。
[0042]
在本发明的另一种优选实施方式中，使用iontorrent s5平台进行高通量测序。
[0043]
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
[0044]
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
[0045]
图1是本技术实施例1的方法步骤示意图。
[0046]
图2是本技术实施例1中不同断面流量占比与鱼类多样性对数回归拟合曲线。
[0047]
图3是本技术实施例中基因扩增管的纵向剖视图。
[0048]
说明书附图中的附图标记包括：管体1、盖体2、放置槽3、支撑板4、安装板5、限位槽
6、限位块7、振动块8、导热杆9、传导块10、传导环11、传导杆12、扩散铝片13、调节口14、调节橡胶层15、导杆16、移动块17、安装环18、移动环19、从动杆20。
具体实施方式
[0049]
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0050]
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“纵向”、“横向”、“竖向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
[0051]
在本发明的描述中，除非另有规定和限定，需要说明的是，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是机械连接或电连接，也可以是两个元件内部的连通，可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语的具体含义。
[0052]
实施例1：
[0053]
本发明提供了非侵入式生物监测生态流量目标适应性快速评估优化方法，具体如图1，包括以下步骤：
[0054]
步骤一，采集样品
[0055]
在采样点使用采水器采集表层水作为样品，且每份水样的体积为15-20l，水样利用无菌采水瓶或才采水袋进行临时保存。
[0056]
在采集后的3h之内，使用dna富集过滤器完成水环境dna富集工作，每个样品富集水体体积为1-5l，每个采样点富集不少于3个平行样品。
[0057]
再向样品内注入2.5ml常温保存剂，并摇晃均匀后保存。
[0058]
步骤二，室内宏条码实验分析
[0059]
(1)dna提取
[0060]
向样品内加入裂解液与不同粒径的锆珠，再利用匀浆仪进行破碎匀浆，使用3mm与1mm的锆珠进行配合；再加入蛋白酶k，水浴消解蛋白；混匀后，离心后取得上清液；利用磁珠将dna进行吸附，并利用洗液清理；最后利用无酶水将dna从磁珠上洗脱下来。
[0061]
(2)基因扩增
[0062]
配置总体积30ul的pcr扩增溶液，再使用引物设定pcr扩增程序，完成基因扩增。
[0063]
(3)高通量测序
[0064]
首先，利用利用酶与碱基将pcr扩增后的dna片段的黏性末端补齐，生成平末端；然后，将测序使用的接头连接到dna片段上；再对已连接接头的dna片段进行pcr扩增，增加文库浓度；再使用使用安捷伦2100(agilent bioanalyzer 2100)对所构建的文库质量进行质检；最后，进行完成高通测序。
[0065]
进行高通测序时，先将文库内的dna片段与测序微珠裹在微小的油滴中，使得每个油滴内含有1条dna片段、1个测序微珠及pcr反应溶液，使得每个测序微珠上连接数条完全
相同的dna片段；再添加改性磁珠，将未连接dna片段的测序磁珠去除掉；将富集后的测序磁珠装载到测序芯片上；最后通过测定反应体系内的ph变化，得到目的dna片段的序列
[0066]
(4)生物信息处理
[0067]
基于ubuntu 14.04版本下的ecoview 2.0版本软件对高通量测序的数据进行分析，通过qiime、mothur、usearch分析平台完成依次进行数据质量控制、去重复、otu聚类、分类预测、下游多样性分析步骤。
[0068]
步骤三，鱼类群落多样性指数计算
[0069]
多样性指数是表征群落物种丰富度的指标，采用margalef多样性指数(m)和香农多样性指数(h2’)进行表征，计算方法如下：
[0070]
m＝(s-1)/ln(n)
ꢀꢀ
(公式1)
[0071][0072]
公式1中，m为马格列夫多样性指数，s为底栖动物群落中物种数目，n为观察到的底栖动物个体总数。
[0073]
公式2中：h2’为香农多样性指数；n为物种总个体数；s为物种种类数；ni为第i种物种个体数。
[0074]
步骤四，不同断面年/月平均绝对流量计算
[0075]
依据不同断面逐日实测流量信息，计算不同断面的年/月平均流量值，计算公式如下：
[0076][0077]
公式3中：r
i_a
表示i断面平均流量；ri表示i断面的逐日流量，n
ij
为i断面计算时段总天数。
[0078]
步骤五，不同断面相对流量占比计算
[0079]
(1)确定参考断面，确定标准为该断面天然流量长期数据，计算参考断面的多年平均天然流量值(r
b_n
)；
[0080]
(2)利用gis技术，提取参考断面和其他断面的集水面积，计算参考断面与其他所需断面的集水面积比；
[0081][0082]
公式4中：k表示天然流量参考断面与所需断面的集水面积比例，si为i断面的集水面积，sb为天然流量参考断面的集水面积。
[0083]
(3)假定不同断面集水面积比例即为天然流量比例，结合集水面积比例和参考断面的天然多年流量水平，确定所需断面的多年天然流量水平(ri_n)；
[0084]ri_n
＝r
b_n
*k
ꢀꢀ
(公式5)
[0085]
公式5中：ri_n为所需i断面的天然多年流量值。
[0086]
(4)利用不同断面的实测年平均流量值除以该断面的天然多年流量值，作为该断面的相对流量占比；
[0087]
pi＝r
i_ari_n
ꢀꢀ
(公式6)
[0088]
公式6中：pi为所需i断面的相对流量占比值。
[0089]
步骤六，不同断面流量目标确定
[0090]
确定参考断面，确定标准为该断面具有明确的生态流量目标；利用gis技术，提取参考断面和其他断面的集水面积，依据所需断面与参考断面的集水面积比例；结合集水面积比例和参考断面的生态流量目标值，确定所需断面的生态流量目标值。
[0091][0092]
公式7中：
[0093]ri_eco
表示i断面生态流量目标值；si为i断面的集水面积，s
eco
为生态流量目标参考断面的集水面积，r
eco
表示该参考断面的生态流量目标值。
[0094]
步骤七，鱼类群落多样性对流量过程的响应关系构建
[0095]
(1)采用spss模型分析鱼类多样性对绝对流量值和相对流量占比的响应规律，具体如表1所示，结果表明绝对流量近在7月与鱼类多样性表现出显著相关关系，而相对流量占比在年内尺度(7月、8月和9月)和年际尺度(年平均)均表现出显著相关关系，说明相对于绝对流量指标，相对流量占比指标通过消除不同断面因集水面积大小不同产生的空间差异，更适合构建短期内的河流生态-水文响应关系。
[0096]
表1基于皮尔逊相关系数的绝对流量值和相对流量指数对鱼类多样性驱动显著性
[0097] 1月2月3月4月5月6月7月8月9月10月11月12月年平均绝对流量值-0.44-0.41-0.45-0.26-0.12-0.730.87*-0.54-0.67-0.7-0.81-0.75-0.67相对流量占比-0.23-0.170.360.650.670.810.90*0.91*0.91*0.82-0.14-0.550.9*
[0098]
(2)响应关系构建，为了评估全年生态流量目标设置的匹配性，利用spss回归分析模块在年际尺度上构建流量占比与鱼类多样性的对数回归拟合曲线。
[0099]
(3)如图2所示，基于拟合回归曲线，以鱼类全年平均多样性指数大于0为下限目标，确定对应的全年平均流量占比值至少为15％，对比当前的生态流量目标(洮儿河：冰冻期5％，平水期10％，丰水期15％)，得到还需提高生态流量目标设置比例的优化方案。
[0100]
实施例2：
[0101]
实施例2与实施例1的不同之处仅在于，本实施例使用基因扩增管完成基因扩增。如图3所示，基因扩增管包括管体1，管体1的底部呈倒置的平行式锥形，还包括用于对管体1顶部进行密封的盖体2。管体1的底部箱内凹陷形成放置槽3，放置槽3内设置有折叠板，折叠板包括两块铰接的支撑板4，放置槽3内竖向滑动连接有安装板5。安装板5的底部横向滑动连接两块滑块，支撑板4的顶部相互远离的一侧分别与两块滑块铰接。
[0102]
放置槽3的侧壁上限位槽6，限位槽6与放置槽3连通，限位槽6内滑动连接有限位块7，限位块7与限位槽6之间设置有弹簧，限位块7位于放置槽3内的一端呈半球状。支撑板4的底部均设置有拉环。
[0103]
管体1内部的底部设置有振动块8，振动块8上设置有导热杆9，导热杆9的顶部设置有传导块10，管体1上部的内侧设置有传导环11，管体1的内壁上设置有多跟与传导环11固定的传导杆12。传导杆12上设置有多块扩散铝片13。
[0104]
管体1的上部设置有调节口14，调节口14内设置有调节橡胶层15，调节橡胶层15向
管体1内部凹陷。调节橡胶层15的外侧设置有用于驱动调节橡胶层15移动的驱动件，驱动件包括安装架和滑动连接在安装架上的导杆16，导杆16靠近管体1的一端上固定有移动块17，移动块17与调节橡胶层15固定。导杆16上螺纹连接有移动环19，移动环19外转动连接有安装环18，安装环18上铰接有多根从动杆20。
[0105]
使用时，将原料投放至管体1内，再利用盖体2将管体1密封，并将管体1置于基因扩增设备内，对管体1进行加热。启动振动块8，振动块8带动导热杆9振动，在实现导热的过程中，通过传导块10带动传导环11移动，进而能够实现传导杆12振动，并带动扩散铝片13与之同步振动，起到更好的导热和振动效果，提高基因扩增的效果。
[0106]
而在基因扩增的过程中，管体1内的压强会增加，通常会进行泄压，但是泄压可能会导致原料泄漏的问题。本技术通过设置调节橡胶层15，当管体1内的压强增大时，会挤压调节橡胶层15，使得调节橡胶层15向外移动，并推动移动块17，使得移动块17发生转动，并向外滑动，使得调节橡胶层15向外膨胀，进而增加管体1内的空间，实现泄压。
[0107]
为了提高基因扩增时的传导效果，将管体1的底部设置为倒置的平顶式锥形，使得管体1单独放置时易倾倒。而通过设置支撑板4，向下拉动支撑板4时，并将支撑板4展平后，能够方便对管体1进行单独放置，并保持平稳。而在管体1使用时，将支撑板4滑入放置槽3内，再利用限位块7对安装板5进行限制，能够使得折叠板位于放置槽3内。
[0108]
在本说明书的描述中，参考术语“优选的实施方式”、“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0109]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。