冷冻保存的昆虫及其生产方法与流程

1.本发明提供了用于冷冻保存包含绒毛膜层和蜡质层的昆虫胚胎的方法，特别是可用于大规模饲养有益蝇成虫的包括黑水虻(bsf，hermetia illucens)在内的蝇胚胎，以及具有一致的健康且能生育的成虫恢复率的冷冻保存胚胎。


背景技术：

2.昆虫可用于各种不同应用，例如害虫管理、食品和动物饲料行业的蛋白质生产、制药行业的原料生产等等。
3.为了支持大规模生产用于这些应用的昆虫，它们的养殖必须工业化且扩大规模。当今的大多数昆虫工厂需要有现场设施来维持生物体的整个生命周期，以便获得昆虫的所需生长阶段和/或从其衍生的物质。整个过程包括繁育成虫以产卵，卵孵化成幼虫。为所述幼虫提供食物和水以促进生长和发育。经过一段时间(例如一至六周，取决于昆虫种类)，幼虫开始变态成蛹，然后变成成虫。
4.昆虫生产者和研究机构正在通过遗传修饰或经典育种开发新的昆虫品系。这些品系的保存具有挑战性，因为目前做到这一点的唯一方法是通过维持一个活的群落。这个过程需要大量资源，并且由于种群中的自然遗传漂移或污染也可能导致重要遗传物质的损失。
5.此外，卵的产量每周可以发生巨大变化，并且昆虫群落经常遭受生产力下降甚至突然崩溃的影响。这使得在每个地点卵的自生产效率低下且成本高昂，并且需要不断地过量生产卵以跟上生产需求。
6.昆虫卵的大规模冷冻保存可以使卵的生产与昆虫和/或昆虫物质制造系统中的其他步骤脱钩。即用型冷冻保存卵具有延长的保质期(相比于数天，达数年或数十年)，并且它的使用将提高生产能力并提高生长效率。冷冻保存的卵必须不仅保持胚胎的活力，而且要保持胚胎达到成虫形式的能力。对于在为各种不同的昆虫用途保存遗传品系的具有挑战性的任务中使用冷冻保存的卵来说，达到能生育的成虫形式是先决条件。
7.正在进行一项研究，以试图开发用于成功冷冻保存和复苏昆虫的方法(参见例如mazur p.等，1992.science,258:1932-1935；leopold ra等，2001.ann ent soc am 94(5):695-701；luo l等，2006.cryoletters 27(6),341-352；tsang w h.和chow k l.2012，在《冷冻生物学的当今前沿》(current frontiers in cryobiology)(ed.katkov i.)第10章，第259-281页中；rajamohan a等，2014.j.med.entomol.51(2):360-367)。冷冻保存是一个复杂的过程，需要经过培训的人员和特殊设备。文献描述了小规模实验，这些实验产生的能生存的冷冻保存胚胎的产量低，并且从冷冻保存胚胎发育为成蝇的比率变化很大。一些昆虫物种更加敏感，因此需要特殊方法才能在冷冻保存后成功复活。例如，黑水虻对低温敏感，并且被认为是不耐冻的物种(villazana j和a alyokhin a.2019.journal of economic entomology,toz186,doi.org/10.1093/jee/toz186；holmes l.a.等，2016,jiff,2(4):255-262；chia s y等，2018.plos one 13(11):e0206097.doi.org/10.1371/
journal.pone.0206097)。
8.美国专利申请公开号2012/0009590涉及使用昆虫幼虫作为研究工具，用于候选化合物的毒理学和生物活性的高通量筛选，公开了通过使用含有无毒环萜烯和无毒表面活性剂、优选非离子型表面活性剂的溶液除去壳的蜡质层以使昆虫胚胎通透化的组合物和方法。最近，abidalla和roversi(abidalla m和roversi p f.2018.advances in entomology 6:213-225)研究了在大蜡螟(galleria mellonella)的冷冻保存中使用u.s.2012/0009590中描述的组合物作为通透化溶液。然而，尽管已经证明了所述胚胎被冷冻保存剂高效通透化和装载，但冷冻保存的胚胎的存活率不值一提，并且所述过程不稳定。
9.li等人(li k.等，2017.cryobiology 78:101-5)描述了一种萤火虫胚胎的冷冻保存方法，所述方法是在人工检查胚胎发育阶段后对卵进行去绒毛膜和通透化，然后进行冷冻保护剂装载和玻璃化。观察到在胚胎升温后令人满意的幼虫孵化率；然而，尚未跟踪幼虫发育为成虫的情况。此外，这种方法不适用于更大规模。
10.对成功且可重复的胚胎冷冻保存和复活方法存在着需求，并且拥有这些方法将是非常有利的。这样的胚胎将有利地用于生产有益昆虫的幼虫和/或能生育的成虫。


技术实现要素：

11.本发明满足了以经济且高效的方式产生可运输、稳定的有益昆虫胚胎(特别是黑水虻(bsf，hermetia illucens)胚胎)的储用物的需要，所述储用物是保存商业遗传品系和/或包括繁殖、幼虫生产在内的昆虫大规模生产的各个步骤中所需要的。所述昆虫用于农业、医药和研究用途，也可用作饲料、食品或食品成分。本发明提供了用于冷冻保存蝇胚胎的方法，所述方法提供了将所述胚胎以恒定速率恢复为活的、能生育的成虫形式，以便根据目标用途进行繁殖和大规模生产饲养。本发明的方法有利地适用于极度冷敏感的蝇种，包括bsf。本发明还提供了能够进行幼虫孵化、蛹化、从蛹羽化和交配的冷冻保存的蝇胚胎。
12.本发明部分是基于下述出人意料的发现，即在特定发育阶段用包含柠檬烯和环保有机溶剂2-甲基四氢呋喃(2-methf，也被称为2-甲基氧杂环戊烷，cas no.96-47-9)的通透化组合物将蝇胚胎的蜡质层通透化，有利于为所述胚胎装载冷冻保护剂(cpa)。随后在尽可能统一的冷冻保存温度下冷冻所述胚胎，然后置于特定的解冻条件下，导致商业上可行且一致的孵化率和存活率。本发明的方法优于迄今为止已知的用于蝇冷冻保存的方法，至少是因为所述方法也适用于蝇的中到大规模的可重复生产，并且获得了为冷冻保存而获取的原始胚胎群达到健康状态的成蝇阶段的可重复的百分比。本发明还首次提供了准确的bsf胚胎发育阶段时间线。不希望受到任何特定理论或作用机制限制，在发育阶段14-16将bsf胚胎暴露到冷冻保存过程可以使这种冷敏感物种的冷冻保存的胚胎成功复活。
13.根据一个方面，本发明提供了一种用于大规模冷冻保存蝇胚胎的方法，所述方法包括：
14.(a)从至少一部分蝇胚胎表面除去绒毛膜层，其中所述蝇胚胎处于头部内卷开始与中肠胃盲肠外翻结束之间的发育阶段，从而获得具有至少一部分暴露的蜡质层的蝇胚胎表面；
15.(b)通过将所述暴露的蜡质层与通透化组合物接触将所述层通透化，从而获得至少一部分蜡质层被通透化的胚胎，所述通透化组合物包含选自环萜烯和/或包含它们的精
油；有机溶剂；表面活性剂及其任何组合的通透化化合物；
16.(c)向步骤(b)获得的胚胎装载至少一种冷冻保护剂(cpa)，从而获得装载有至少一种cpa的胚胎；和
17.(d)将步骤(c)获得的所述胚胎暴露于低温；
18.由此获得冷冻保存的存活胚胎。
19.根据某些实施方案，所述通透化组合物包含通透化化合物的组合。
20.根据某些实施方案，所述通透化化合物的组合包含至少一种环萜烯和/或包含它们的精油与至少一种有机溶剂。
21.根据某些实施方案，所述有机溶剂选自基于生物质的有机溶剂和基于石油的有机溶剂。
22.根据某些实施方案，所述基于生物质的有机溶剂选自2-甲基四氢呋喃(2-methf)、环戊基甲基醚(cpme)、二甲醚、碳酸二甲酯、乳酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯及其任何组合。每种可能性代表本发明的独立实施方案。
23.根据某些实施方案，所述基于生物质的有机溶剂是2-methf。
24.根据某些实施方案，所述基于石油的有机溶剂是烷烃。根据某些实施方案，所述烷烃选自庚烷、己烷、辛烷及其任何组合。
25.根据某些当前示例性的实施方案，所述通透化组合物包含至少一种环萜烯和/或包含它们的精油与2-methf的组合。
26.根据某些示例性实施方案，所述通透化组合物由所述环萜烯和/或包含它们的精油与2-methf的组合组成。根据这些实施方案，所述组合包含环萜烯浓度为相对于所述组合物的总体积约70％至约95％v/v的所述至少一种环萜烯或包含它们的精油，和浓度为相对于所述组合物的总体积约5％至约30％v/v的2-methf。
27.根据某些实施方案，所述至少一种环萜烯选自柠檬烯、蒎烯(也称为月桂烯)、大麻衍生的环萜烯、桉油精(也称为桉树脑)、香芹酮、芳樟醇、石竹烯及其任何组合。每种可能性代表本发明的独立实施方案。根据某些实施方案，所述环萜烯是柠檬烯。根据某些示例性实施方案，所述柠檬烯是d-柠檬烯。
28.根据某些实施方案，所述通透化化合物的组合包含至少一种环萜烯和/或包含它们的精油与至少一种表面活性剂。
29.所述至少一种环萜烯如上文中所述。根据某些实施方案，所述至少一种表面活性剂选自烷基聚(环氧乙烷)、椰油酰胺二乙醇胺(dea)、乙氧基化醇、乙氧基化椰子醇、醇乙氧基化物(c
9-11
)、聚(环氧乙烷)和聚(环氧丙烷)的共聚物、烷基多糖苷、脂肪醇、椰油酰胺单乙醇胺(mea)、聚山梨醇酯、乙氧基化脂肪醇醚和月桂基醚、乙氧基化烷基酚、辛基苯氧基聚乙氧基乙醇化合物、改性的氧乙基化和/或氧丙基化直链醇、聚乙二醇单油酸酯化合物、聚山梨醇酯化合物、酚类脂肪醇醚及其任何组合。每种可能性代表本发明的独立实施方案。根据某些实施方案，所述至少一种表面活性剂选自椰油酰胺dea、乙氧基化醇、聚乙二醇和非离子型表面活性剂。
30.根据某些实施方案，所述通透化组合物包含单一通透化化合物。根据这些实施方案，所述通透化化合物选自有机溶剂和环萜烯和/或包含它们的精油。所述有机溶剂和环萜烯和/或包含它们的精油如上文中所述。
31.所述通透化组合物内每种通透化化合物或其组合的浓度使得所述组合物对所述蝇胚胎无毒。
32.根据某些实施方案，所述方法还包括所述冷冻保存的胚胎的复活。根据某些实施方案，所述复活包括下述步骤：
33.(1)将所述冷冻保存的胚胎转移到复活溶液；
34.(2)将所述胚胎在所述复活溶液中在约20℃至约35℃的温度下温育；任选地
35.(3)更换所述复活溶液至少一次；和
36.(4)将所述复活的胚胎在适合于获得幼虫的孵化条件下温育。
37.根据某些实施方案，所述复活还包括将所述幼虫在适合于获得蛹化和随后成蝇的羽化的生长条件下温育。
38.所述冷冻保存的胚胎向所述复活溶液的转移时间应该保持尽可能短，在数秒的范围内。
39.正如本领域技术人员已知的，所述孵化条件将根据蝇种来确定。
40.根据某些实施方案，当所述复活的胚胎是bsf胚胎时，所述孵化条件包括在约25℃至约30℃和60-90％湿度下温育。温育在本领域中已知的适合的生长培养基上进行。
41.根据某些实施方案，所述胚胎的复活还包括在步骤(1)之前将所述冷冻保存的胚胎暴露于-70℃至-150℃范围内的温度。
42.根据某些实施方案，所述包括除去绒毛膜层、通透化和胚胎的冷冻保存在内的整个冷冻保存过程发生在发育阶段13(头部内卷开始)至17(空气渗入气管树)之间。
43.根据某些示例性实施方案，当所述胚胎是bsf胚胎时，所述包括除去绒毛膜层、通透化和胚胎的冷冻保存在内的整个冷冻保存过程发生在发育阶段14a(bolwig器官样发育)与阶段16(中肠胃盲肠外翻)之间。
44.根据某些实施方案，所述cpa装载的bsf胚胎暴露于低温在本发明中首次公开的作为黑水虻的独特发育特点的胚胎姿态旋转(阶段14b)之后直至阶段16进行。
45.正如本领域技术人员已知的，在每个发育阶段胚胎的时龄(产卵后的时间-ael)将取决于蝇种和温育条件。
46.根据某些实施方案，所述蝇选自hermetia illucens(黑水虻)、ceratitis capitata(地中海实蝇或地中海果蝇)、drosophila melanogaster(黑腹果蝇)、cochliomyia hominivorax(嗜人锥蝇)、anastrepha ludens(墨西哥按实蝇)、musca domestica(家蝇)和calliphoridae(丽蝇科)。
47.本发明的冷冻保存和复活方法非常适用于冷敏感蝇胚胎。根据某些示例性实施方案，所述蝇是已知对低温非常敏感的黑水虻，其胚胎迄今为止尚未被成功冷冻保存和复活。根据这些实施方案，除去绒毛膜层和将蜡质层通透化(步骤a-b)、向所述胚胎装载至少一种cpa和将所述装载的胚胎暴露于低温(步骤c-d)使用时龄为约31h至60hael的胚胎进行。根据某些示例性实施方案，步骤a-d在约35h ael至50h ael的胚胎时龄时进行。根据某些另外的示例性实施方案，步骤a-d在约38h ael至48h ael的胚胎时龄时进行。根据某些实施方案，所述卵保持在约30℃的温度和大于80％的湿度下。
48.根据某些示例性实施方案，从至少一部分胚胎表面除去绒毛膜层包括将所述胚胎与次氯酸钠(naclo)溶液接触。根据某些示例性实施方案，所述次氯酸钠具有0.5％至6％范
围内的浓度。根据特定示例性实施方案，所述次氯酸钠具有约1.5％的浓度。根据某些实施方案，所述整个绒毛膜层基本上被除去。
49.根据某些实施方案，所述方法还包括清洗步骤(a)得到的具有至少一部分暴露的蜡质层的胚胎。根据某些实施方案，将所述步骤(a)得到的胚胎用水性溶液清洗。可以使用本领域中已知的任何适合的水性溶液。根据某些示例性实施方案，所述水性溶液是双蒸(dd)h2o。
50.向昆虫胚胎装载至少一种cpa的方法是本领域已知的。根据某些实施方案，向至少一部分蜡质层被通透化的胚胎装载至少一种冷冻保护剂(cpa)包括将所述胚胎在包含至少一种cpa的溶液中温育至少一个温育期。根据某些实施方案，将所述胚胎在包含至少一种cpa的溶液中温育至少两个温育期。根据某些示例性实施方案，将所述胚胎在包含至少一种cpa的溶液中温育四个连续温育期。
51.通常，cpa装载通过将所述胚胎在增加水从胚胎外流的高渗溶液中温育造成所述胚胎逐渐脱水来进行。
52.根据某些示例性实施方案，所述cpa能够穿透至少一部分胚胎细胞的膜。根据这些实施方案，所述包含至少一种cpa的溶液还包含至少一种不能穿透胚胎细胞膜的化合物(“非渗透化合物”)，其对所述组合物的高渗透压有贡献。根据某些示例性实施方案，所述非渗透化合物选自海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、聚乙二醇(peg)及其组合。每种可能性代表本发明的独立实施方案。根据某些实施方案，在每个温育时间后，将所述胚胎干燥。
53.根据本发明的教导，可以使用本领域中已知的任何冷冻保存剂，通常为能够穿透胚胎组织的cpa。根据某些实施方案，所述cpa选自乙二醇、甘油、dmso(二甲基亚砜)、丙二醇、乙酰胺及其任何组合。每种可能性代表本发明的独立实施方案。
54.根据某些示例性实施方案，所述cpa是乙二醇。
55.根据其他某些示例性实施方案，所述包含至少一种cpa的溶液包含乙二醇、海藻糖和pvp。
56.根据某些实施方案，在连续的温育期中，所述至少一种cpa、非渗透化合物或其组合的浓度逐渐提高。根据这些实施方案，所述至少一种cpa、非渗透化合物或其组合的浓度从约10％逐渐提高到约75％(整个组合物体积的v/v)。根据某些实施方案，所述至少一种cpa、非渗透化合物或其组合的浓度从约10％逐渐提高到约65％。
57.本发明现在公开，商业上可行的方法优选地包括将所述胚胎统一且尽可能同时冷冻。这可以通过将多个含有至少一种cpa的通透化的胚胎暴露于某个统一的低温，导致显著部分直至整个胚胎群体同时冷冻来实现。不希望受到任何理论或作用机制限制，同时暴露于特定低温导致玻璃化以及所述胚胎孵化和发育成健康、能生育的成蝇形式的能力。同时暴露于特定低温还获得高的胚胎孵化百分率和以工业规模应用所述方法的能力。
58.根据本发明的教导，可以使用本领域已知的用于将多个胚胎同时暴露于某个统一冷冻保存温度的任何方法。
59.根据某些示例性实施方案，所述统一冷冻保存温度由预冷的水平表面提供。使用预冷的水平表面能够使装载cpa的胚胎暴露于-70℃至-150℃范围内的相对高的低温。
60.因此，根据某些示例性实施方案，将包含至少一种cpa的胚胎暴露于低温包括将所
述胚胎置于预冷的水平表面上，所述表面处于-90℃或-100℃或-110℃或-120℃或-140℃的温度下。
61.根据其他示例性实施方案，所述统一冷冻保存温度由预冷液体提供。根据某些实施方案，所述预冷液体选自乙醇、异丙醇、硅油、乙烷、具有适合的冻结温度的其他液体，或其任何组合。每种可能性代表本发明的独立实施方案。使用预冷液体能够使装载cpa的胚胎暴露于如上文中所述的相对高的低温。
62.根据某些实施方案，在将包含至少一种cpa的胚胎暴露于低温后，将所述胚胎转移到-196℃或-80℃的温度进行储存。
63.根据某些可选实施方案，将所述包含至少一种cpa的胚胎暴露于低温包括将所述胚胎置于-110℃至-135℃范围内的温度下，然后将所述胚胎暴露于-196℃的温度。根据某些其他实施方案，将所述包含至少一种cpa的胚胎暴露于低温包括将所述胚胎暴露于-196℃的温度。
64.根据某些示例性实施方案，将所述胚胎暴露于-110℃至-135℃范围内的温度通过将所述胚胎暴露于液氮蒸气来进行。
65.根据某些示例性实施方案，将所述胚胎暴露于-196℃的温度包括将所述胚胎放置在液氮中。
66.根据某些实施方案，所述方法包括多个蝇胚胎的冷冻保存和复活。根据这些实施方案，所述方法导致达到成蝇形式的复活胚胎的可重复的百分率。根据某些实施方案，至少95％、优选99％和更多的成蝇是能生育的。根据某些示例性实施方案，所述达到成蝇形式的复活胚胎的数目为从相应的多个未冷冻保存的蝇胚胎获得的成蝇形式数目的约1％至约10％。能生育成蝇这种可重复的高百分率对于维持商业和研究目的所需的蝇类遗传品系来说是非常重要的。
67.根据其他实施方案，所述包括多个蝇胚胎的冷冻保存和复活的方法导致达到成蝇形式的复活胚胎的数目为从相应的多个未冷冻保存的蝇胚胎获得的成蝇形式数目的至少40％。根据某些实施方案，所述达到成蝇形式的复活胚胎的数目为从相应的多个未冷冻保存的蝇胚胎获得的成蝇形式数目的至少45％、50％、55％、60％、65％、70％或更多。每种可能性代表本发明的独立实施方案。
68.本发明的冷冻保存的蝇胚胎、特别是bsf胚胎还可用于幼虫的大规模生产。根据某些实施方案，所述多个bsf胚胎的冷冻保存和复活导致孵化的幼虫的数目为从相应的未冷冻保存的蝇胚胎群体孵化的幼虫数目的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％和更多。每种可能性代表本发明的独立实施方案。
69.本发明的冷冻保存和复活方法也非常适合于具有大卵的蝇种的胚胎。根据某些实施方案，所述大卵具有至少0.015mm3的体积。
70.根据其他方面，本发明提供了多个高度冷敏感的冷冻保存的蝇胚胎，其特征在于孵化的幼虫达到能生育的成蝇形式的数目为从未冷冻保存的胚胎孵化的幼虫的成蝇形式的数目的至少1％。根据某些实施方案，所述数目为从未冷冻保存的胚胎获得的成蝇形式的数目的至少2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或更多。根据某些实施方案，所述数目在1-10％之间。
71.根据某些示例性实施方案，本发明提供了多个冷冻保存的黑水虻胚胎，其特征在
hominivorax)、墨西哥按实蝇(anastrepha ludens)、家蝇(musca domestica)和calliphoridae(丽蝇科)。黑水虻(hermetia illucens)和家蝇(musca domestica)工业饲养广泛用于饲料和食品行业并用于垃圾管理。地中海实蝇(ceratitis capitate)、嗜人锥蝇(cochliomyia hominivorax)和墨西哥按实蝇(anastrepha ludens)用于害虫控制。黑腹果蝇(drosophila melanogaster)通常用于遗传研究，并且丽蝇科(calliphoridae)用于医学应用(蛆疗法)。根据某些示例性实施方案，本发明涉及黑水虻胚胎的冷冻保存和复活。
87.当在本文中使用时，术语“成蝇”和“成蝇形式”是指从蛹孵化后的蝇的生命周期的最后阶段。
88.本文使用的黑腹果蝇的胚胎发生阶段改编自campos-ortega和hartenstein(1985，《黑腹果蝇的胚胎发育》(development of drosophila melanogaster)，springer-verlag,berlin heidelberg.第9-84页)的bowne阶段。
89.本文使用的黑水虻的胚胎发生阶段由本发明的发明人表征，并在本文中首次如下文和图1中所述呈现。
90.出人意料的是，本发明现在显示，使用冷冻保存方法的不同步骤时的胚胎发育阶段非常重要：当冷冻保存过程在如上所述的特定发育阶段进行时，获得了高百分比的成活成蝇。不希望受到任何特定理论或作用机制限制，在姿态旋转(阶段14b)时将装载cpa的bsf胚胎暴露于冷冻保存温度是非常重要的。
91.当在本文中使用时，术语“冷冻保存”(或“低温保存”)和相应的动词是指通过冷却到非常低的温度(通常在-70℃至-196℃之间)来保存细胞、整个组织或整个生物体的过程。在足够低的温度下，可能引起生物材料损伤或导致进一步发育的任何酶或化学活性均被有效地停止。冷冻保存方法力图达到低温，同时通常通过使细胞最佳脱水来避免/显著减少由冷冻期间冰晶的形成而对细胞/组织/生物体造成的损伤。
92.术语“玻璃化”意味着物质转化成非结晶无定形固体。当在本文中使用时，玻璃化是一种冷冻保存类型，其优点是不会由于冰晶形成而造成损伤。根据本发明的教导并且不希望受到任何理论或作用机制限制，术语“冷冻保存”和“玻璃化”在本文中可互换使用。
93.术语“复活”和相应的动词以及“复苏”和相应的动词在本文中可互换使用，并且是指通常通过解冻使冷冻保存的细胞或组织达到存活和活跃状态的过程。
94.对于蝇胚胎周围的层、特别是蜡质层而言，术语“通透化”、相关的动词和“可穿透的”是指化合物或试剂更容易通过所述层并到达其中包围的胚胎细胞的能力。具体来说，所述术语是指通常不可穿透蜡质层的化合物或试剂到达胚胎细胞的能力的提高。根据本发明的某些示例性实施方案，所述试剂是冷冻保存剂(cpa)。
95.当在本文中使用时，术语“通透化组合物”是指包含至少一种化合物的组合物，所述化合物的活性增强蝇胚胎周围的层对另一种化合物或试剂的通透性。根据本发明的教导，可以使用几种通透化组合物，其每种都增强蝇胚胎蜡质层对至少一种cpa的通透性。
96.当在本文中使用时，对于通透化组合物来说，术语“无毒的”是指组合物包含的每种通透化化合物或其组合的浓度对蝇胚胎的健康没有显著有害影响，并且无需冷冻保存能够使其在最佳生长条件下发育至成虫形式。
97.当在本文中使用时，术语“冷冻保存剂”(cpa)是指用于保护昆虫细胞、特别是蝇胚胎细胞免于冷冻损伤的物质。此外，所述冷冻保存剂(也可以称为“低温防护剂”)可以保护
胚胎细胞在冷冻保存期间免于冷和热冲击、脱水和低温毒性。所述冷冻保存剂可以是细胞穿透性或不穿透性的。低温防护剂的非限制性实例包括甘油、乙二醇、dmso(二甲基亚砜)、丙二醇、乙酰胺和甲醇。
98.当在本文中使用时，对于蝇胚胎或其部分和化合物或组合物来说，术语“接触”意味着使所述胚胎或其部分与所述化合物或组合物紧密接近，使得所述化合物或组合物可以影响所述胚胎或其部分。根据某些实施方案，术语“接触”是指将所述胚胎或其部分在组合物中温育或漂洗，或将所述化合物或组合物细胞内施用到所述胚胎或其部分。
99.当在本文中使用时，术语“相应的多个未冷冻保存的蝇胚胎”和“相应的从未冷冻保存的胚胎孵化的幼虫的成蝇形式”是指胚胎达到成蝇形式的典型百分率，其中卵和孵化的幼虫在适合的条件下生长。应该明确地理解，适合的生长条件不包括冷冻保存。黑水虻从卵到成虫的存活率约为50-80％。
100.当在本文中使用时，对于蝇卵来说，术语“大卵”是指体积大于0.015mm3的卵。
101.当在本文中使用时，术语“预冷的水平表面”是指任何能够达到并维持低温的各种不同形状的装置、工具、器具、器械或仪器，并且在整个表面上具有均匀的温度分布。
102.当在本文中使用时，术语“预冷液体”是指能够维持低温，并且在整个液体中具有均匀的温度分布的任何液体。根据某些实施方案，所述液体选自乙醇、异丙醇、硅油、乙烷和具有适合的冻结温度的其他液体。
103.黑水虻(hermetia illucens)在其整个生命周期中对寒冷条件(低于16℃的温度)高度敏感，特别是在胚胎期过程中。因此，将bsf胚胎暴露于冷冻保存温度可能对胚胎是致命的。此外，冷却包括bsf在内的具有大卵的蝇种的胚胎的最内部部分是一项具有挑战性的任务，因为内部胚胎组织未被冷却到所需的温度。目前，还没有关于bsf胚胎成功冷冻保存的报道，特别是在中到大规模生产中。
104.当在本文中使用时，术语“约”应该被理解为在本领域的正常公差范围之内，例如在平均值的2个标准偏差之内。约可以被理解为在所陈述的值的
±
10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、或0.01％以内。本文提供的所有值都应被理解为由术语约修饰。
105.根据一个方面，本发明提供了一种用于冷冻保存蝇胚胎的方法，所述方法包括：
106.(a)从至少一部分蝇胚胎表面除去绒毛膜层，其中所述蝇胚胎处于头部内卷开始与中肠胃盲肠外翻结束之间的发育阶段，从而获得具有至少一部分暴露的蜡质层的蝇胚胎表面；
107.(b)通过将所述暴露的蜡质层与通透化组合物接触将所述层通透化，从而获得至少一部分蜡质层被通透化的胚胎，所述通透化组合物包含选自环萜烯和/或包含它们的精油；有机溶剂；表面活性剂及其任何组合的通透化化合物；
108.(c)向步骤(b)获得的胚胎装载至少一种冷冻保护剂(cpa)，从而获得装载有至少一种cpa的胚胎；和
109.(d)将步骤(c)获得的所述胚胎暴露于低温，由此获得冷冻保存的存活胚胎。
110.根据某些实施方案，在剥离胚胎之前，将所述表面通过与异丙醇温育，然后在空气中干燥进行脱水。
111.根据某些示例性实施方案，从至少一部分胚胎表面除去绒毛膜层包括将所述胚胎
与次氯酸钠(naclo)溶液接触。根据某些示例性实施方案，所述次氯酸钠具有0.5％至6％范围内的浓度。根据特定示例性实施方案，所述次氯酸钠具有约1.5％的浓度。根据某些实施方案，所述整个绒毛膜层基本上被除去。
112.根据某些实施方案，所述通透化组合物包含通透化化合物的组合。
113.根据某些实施方案，所述通透化化合物的组合包含至少一种环萜烯和/或包含它们的精油和至少一种有机溶剂。
114.萜烯是包括至少一个异戊二烯单元(具有化学式c5h8)的有机化合物。除了异戊二烯取代基之外，环萜烯还包括饱和或不饱和的6元碳环。根据某些示例性实施方案，所述环萜烯源自于天然来源，例如柠檬烯包括d-柠檬烯(源自于柑橘)、桉树脑(源自于桉树)、芳樟醇(源自于多种不同的香味植物)、香芹酮(源自于各种不同的植物，但主要来自于香菜、留兰香和莳萝的种子)、蒎烯(主要源自于针叶树，但也存在于大麻中)、石竹烯(主要源自于丁香、大麻(cannabis sativa)、迷迭香和啤酒花)和其他大麻衍生的环萜烯。环萜烯可以以分离的形式存在于组合物中或可以形成相应精油的一部分。
115.根据某些示例性实施方案，所述环萜烯选自柠檬烯、蒎烯、大麻衍生的环萜烯及其任何组合。每种可能性代表本发明的独立实施方案。
116.根据某些实施方案，所述环萜烯是柠檬烯。根据某些示例性实施方案，所述柠檬烯是d-柠檬烯。
117.根据某些实施方案，所述无毒环萜烯是蒎烯。
118.根据某些实施方案，所述无毒环萜烯源自于大麻。
119.用于从植物和动物组织提取脂质的有机溶剂通常是基于石油的有机溶剂，其中使用最广泛的是烷烃，包括己烷、庚烷和辛烷。然而，这些有机溶剂与游离污染物反应以形成臭氧、光化学物质，例如据说己烷在被人类吸入时影响神经系统。因此，正在进行研究，旨在用经济可行的、可替代的环保有机溶剂替代石油化学溶剂(clark j h等，2015.int.j.mol.sci.16:17101-17159；doi:10.3390/ijms160817101；ravi h k等，2019.journal of cleaner production 238:117861)。由于这些可选物通常从生物质生产，因此它们在本文中被称为“基于生物质的有机溶剂”。
120.根据某些实施方案，所述基于生物质的有机溶剂选自2-甲基四氢呋喃(2-methf)、环戊基甲基醚(cpme)、二甲醚、碳酸二甲酯、乳酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯及其任何组合。每种可能性代表本发明的独立实施方案。
121.根据某些实施方案，所述基于石油的有机溶剂是烷烃。根据某些实施方案，所述烷烃选自己烷、庚烷和辛烷。每种可能性代表本发明的独立实施方案。
122.以前已报道烷烃作为有效的通透化试剂，能够使冷冻保存剂渗透到昆虫胚胎中；然而，当以有效的浓度和温育时间使用时，烷烃对胚胎活力、孵化率和孵化后发育的能力有负面影响。根据本发明的教导，天然来源的环萜烯与烷烃的组合降低烷烃的毒性，同时保持有效的通透化能力。烷烃与萜烯之间的比例在1:3至3:1之间的范围内，相应地烷烃/环萜烯中的每一者的浓度在30％至66％v/v之间。
123.根据某些示例性实施方案，所述通透化组合物包含浓度为50％的至少一种无毒性环萜烯或包含它们的精油，和浓度约为50％的烷烃。在寻找烷烃的环保替代品的过程中，本发明的发明人发现2-methf不仅在等同的通透化活性方面可以代替烷烃，而且当与至少一
种环萜烯组合时对胚胎健康和正常发育显示出甚至更轻的负面影响。
124.根据某些示例性实施方案，所述通透化组合物由环萜烯和/或包含它们的精油与2-methf的组合组成。根据这些实施方案，所述组合包含环萜烯浓度为相对于所述组合物体积约70％至约95％v/v的至少一种环萜烯或包含它们的精油，和浓度为所述组合物总体积的约5％至约30％v/v的2-methf。根据某些示例性实施方案，所述组合包含环萜烯浓度为相对于所述组合物体积约80％至约90％v/v的至少一种环萜烯或包含它们的精油，和浓度为所述组合物总体积的约10％至约20％v/v的2-methf。根据某些当前示例性的实施方案，所述组合包含d-柠檬烯和2-methf。
125.根据某些实施方案，所述通透化化合物的组合包含至少一种环萜烯和/或包含它们的精油与至少一种表面活性剂。
126.所述至少一种环萜烯如上文中所述。
127.表面活性剂(表面作用剂)通常是有机两亲性化合物(即同时含有疏水基团和亲水基团)，因此可溶于有机溶剂和水这两者中。表面活性剂可用于溶解仅微溶于或不完全溶于水或有机溶剂的化合物。表面活性剂通过吸附在液-气界面处来降低水的表面张力。它们还通过吸附在液-液界面处来降低油与水之间的界面张力。表面活性剂可以是化学合成的，或者可以是天然存在的或者是化学改性的天然存在的化合物。此类去污剂的实例包括在《mccutcheon乳化剂和去污剂》(mccutcheon's emulsifiers&detergents)，北美版(2008)，mccutcheon division of mc publishing co.出版，(usa))的第295-298页上指定的那些。去污剂通常是表面活性剂。表面活性剂通常根据它们的电荷来分组，例如阴离子型(例如基于硫酸根、磺酸根或羧酸根阴离子)、阳离子型(基于季铵阳离子)、两性离子型(两性)和非离子型(例如烷基聚(环氧乙烷)如乙氧基化蓖麻油(cas#61791-12-6)和乙氧基化椰子醇(cas#68131-39-5)；聚(环氧乙烷)和聚(环氧丙烷)的共聚物；烷基多糖苷；脂肪醇；椰油酰胺mea、椰油酰胺dea；和聚山梨醇酯)。表面活性剂也可以根据它们的分子量、它们的临界胶束浓度(cmc)和胶束分子量(mmw)来分组。
128.非离子型表面活性剂包括但不限于乙氧基化脂肪醇醚和月桂基醚、乙氧基化烷基酚、辛基苯氧基聚乙氧基乙醇化合物、改性的氧乙基化和/或氧丙基化直链醇、聚乙二醇单油酸酯化合物、聚山梨醇酯化合物和酚类脂肪醇醚。非离子型去污剂包括醇乙氧基化物，例如c
9-11
链长、c
8-12
链长、c
9-12
链长，和二乙醇酰亚胺或二乙醇胺，特别是源自于天然来源例如椰子的。
129.根据某些示例性实施方案，所述至少一种表面活性剂是乙氧基化醇。根据其他示例性实施方案，所述至少一种表面活性剂是椰油酰胺dea。
130.根据某些实施方案，所述通透化组合物包含浓度为约0.2％至约10％的至少一种无毒环萜烯或包含它们的精油与浓度为约0.1％至约3％的至少一种表面活性剂。根据某些实施方案，所述至少一种表面活性剂的浓度为约0.1％至约2％或约0.1％至约1％或约0.1％至约0.5％。根据某些示例性实施方案，所述通透化组合物包含浓度为3％的至少一种无毒环萜烯或包含它们的精油与浓度为约0.33％的至少一种无毒表面活性剂。
131.根据某些实施方案，所述通透化组合物包含单一通透化化合物。
132.根据某些实施方案，所述单一通透化试剂是烷烃。
133.如上文中所述，尽管烷烃在使蜡质层通透化方面有效，但其对胚胎具有有害影响。
因此，根据本发明的教导，在有效温育时间内在使用高达100％的极高浓度的烷烃的同时维持胚胎的活力并不容易，尤其是当在敏感胚胎上和以较大规模进行时。
134.根据某些实施方案，所述包含烷烃作为单一通透化化合物的通透化组合物包含浓度为约50％至约100％(以组合物的总体积计的v/v)的烷烃。根据某些实施方案，所述烷烃的浓度为约75％至约100％烷烃。根据某些实施方案，所述组合物包含大于90％的烷烃、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的烷烃。根据某些示例性实施方案，所述组合物包含100％的烷烃。根据某些实施方案，所述烷烃选自己烷、庚烷、辛烷及其任何组合。每种可能性代表本发明的独立实施方案。
135.根据某些实施方案，所述组合物包含己烷作为唯一通透化化合物。根据某些实施方案，所述组合物包含大于90％的己烷、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的己烷。根据某些示例性实施方案，所述组合物包含100％的己烷。根据某些示例性实施方案，所述组合物包含庚烷作为唯一通透化化合物。根据某些实施方案，所述组合物包含大于90％的庚烷、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的庚烷。每种可能性代表本发明的独立实施方案。根据某些示例性实施方案，所述组合物包含100％的庚烷。
136.所述浓度、烷烃类型和温育时间将取决于待冷冻保存的蝇种。
137.根据可选实施方案，所述通透化组合物包含至少一种无毒环萜烯和/或包含它们的精油作为唯一通透化活性化合物。根据某些实施方案，所述至少一种环萜烯或包含它们的精油的浓度为约2％至约40％v/v。
138.根据某些实施方案，所述至少一种环萜烯或包含它们的精油的浓度为约2％至约30％v/v。
139.根据某些实施方案，所述至少一种环萜烯或包含它们的精油的浓度为约2％至约20％v/v。
140.根据某些实施方案，所述至少一种环萜烯或包含它们的精油的浓度为约2％至约10％v/v。
141.根据某些实施方案，所述至少一种环萜烯或包含它们的精油的浓度为约2％至约5％v/v。
142.根据某些示例性实施方案，所述至少一种环萜烯或包含它们的精油的浓度为约3％v/v。
143.根据某些实施方案，将所述至少一种环萜烯或包含它们的精油在水性缓冲液中稀释。适合的水性缓冲液的非限制性实例包括磷酸盐缓冲盐水(pbs)或林格氏溶液。根据这些实施方案，所述方法还包括就在将所述通透化组合物与具有至少一部分暴露的蜡质层的胚胎接触之前形成悬液。
144.根据某些实施方案，所述通透化组合物由至少一种无毒环萜烯或包含它们的精油组成。
145.根据某些实施方案，所述为冷冻保存而获取的胚胎处于头部内卷开始至空气渗入气管树结束之间的发育阶段，被称为阶段13-17。根据某些示例性实施方案，获取处于发育阶段14-16的bsf胚胎用于冷冻保存。
146.根据某些实施方案，所述方法还包括清洗所述至少一部分蜡质层被通透化的胚胎
以便除去所述通透化组合物。根据某些实施方案，将所述胚胎用等渗溶液清洗至少一次。正如本领域中已知的，可以使用相同或不同的等渗溶液进行重复清洗。
147.根据某些实施方案，将所述清洗过的胚胎的表面干燥，通常通过将所述清洗过的胚胎在异丙醇或包含它的组合物中温育来进行。
148.向至少一部分蜡质层被通透化的胚胎装载cpa的方法是本领域中已知的。根据某些示例性实施方案，所述cpa是能够穿透胚胎组织的化合物，其选自乙二醇、甘油、dmso、丙二醇、乙酰胺、甲醇、甘油及其任何组合。每种可能性代表本发明的独立实施方案。
149.根据某些示例性实施方案，所述cpa是乙二醇。
150.根据某些实施方案，所述cpa通过将所述通透化的胚胎与包含所述cpa的组合物温育来装载。根据某些示例性实施方案，装载通过使用随后的温育期来进行。根据这些实施方案，在每个随后另外的温育期中将cpa浓度升高。不希望受到任何理论或作用机制限制，cpa浓度的逐渐升高降低了由cpa替换胚胎的水引起的胚胎脱水的有害效应。
151.根据某些实施方案，所述cpa通过将所述通透化的胚胎与包含所述cpa的组合物温育至少2个、至少3个或至少4个温育期来装载。根据某些示例性实施方案，使用4个连续的温育期，每个温育期为约1min至约20min。
152.根据某些实施方案，在第一温育期中所述cpa的浓度为约5％至约20％(v/v)。根据某些示例性实施方案，在第一温育期中所述cpa的浓度为约10％至约15％(v/v)。根据这些实施方案，所述温育时间为约5min至约10min。
153.根据某些实施方案，在第二温育期中所述cpa的浓度为约15％至约30％(v/v)。根据某些示例性实施方案，在第二温育期中所述cpa的浓度为约20％至约25％(v/v)。根据这些实施方案，所述温育时间为约5min至约10min。
154.根据某些实施方案，在第三温育期中所述cpa的浓度为约35％至约55％(v/v)。根据某些示例性实施方案，在第三温育期中所述cpa的浓度为约40％至约50％(v/v)。根据这些实施方案，所述温育时间为约5min至约10min。
155.根据某些实施方案，在第四温育期中所述cpa的浓度为约45％至约65％(v/v)。根据某些示例性实施方案，在第四温育期中所述cpa的浓度为约50％至约55％(v/v)。根据这些实施方案，所述温育时间为约5min至约10min。
156.根据某些实施方案，所述包含cpa的组合物是昆虫生长培养基，其还包含至少一种对组合物的高渗透压有贡献的非渗透化合物、至少一种抗菌剂、胎牛血清(fcs)及其任何组合。
157.根据某些示例性实施方案，所述非渗透化合物选自海藻糖、聚乙二醇(peg)、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)及其组合。每种可能性代表本发明的独立实施方案。
158.根据本发明的教导，可以使用本领域已知的用于将多个胚胎统一、通常为同时暴露于某个统一的冷冻保存温度的任何方法。
159.根据某些实施方案，冷冻保存温度通过将所述多个胚胎置于具有-196℃的温度的液氮中来进行。
160.根据某些实施方案，所述统一的冷冻保存温度由预冷的水平表面提供。使用预冷的水平表面能够将所述装载cpa的胚胎暴露于-70℃至-150℃范围内的相对高的低温。在将所述冷冻保存的胚胎解冻后可以获得的存活胚胎的百分率方面，本发明的这种任选方法优
于迄今为止的方法。这种方法允许相对均匀地冷冻所有胚胎，提高冷冻胚胎的均匀性，从而提高胚胎的存活率，并且使本发明能够用于大规模生产。
161.根据某些实施方案，将所述包含至少一种cpa的胚胎暴露于低温包括将所述胚胎放置在预冷的水平表面上，所述表面处于-70℃或-80℃或-90℃或-100℃或-110℃或-120℃或-130℃或-135℃或-140℃或-150℃的温度下。
162.根据另外的实施方案，所述统一冷冻保存温度由预冷液体提供。根据某些实施方案，所述预冷液体选自乙醇、异丙醇、硅油、乙烷、具有适合的冻结温度的其他液体，或其任何组合。每种可能性代表本发明的独立实施方案。使用预冷液体能够使所述装载cpa的胚胎暴露于-80℃至-150℃之间的相对高的低温。根据某些实施方案，当所述蝇是bsf时，将所述装载cpa的bsf胚胎暴露于-110℃至-135℃之间的低温。
163.根据某些实施方案，在将所述包含至少一种cpa的胚胎暴露于低温后，将所述胚胎转移到或维持在-196℃或-80℃的温度下进行储存。
164.正如本领域技术人员已知的，玻璃化/冷冻保存温度和实现它的方法(使用预冷表面或液体)将根据蝇种来决定。
165.根据某些实施方案，所述方法还包括冷冻保存的胚胎的复活。根据某些实施方案，所述复活包括下述步骤：
166.(1)将所述冷冻保存的胚胎转移到复活溶液；
167.(2)将所述胚胎在所述复活溶液中在约20℃至约35℃的温度下温育；任选地
168.(3)更换所述复活溶液至少一次；和
169.(4)将所述复活的胚胎在孵化条件下温育以获得幼虫。
170.根据某些实施方案，所述复活方法还包括将所述幼虫在生长条件下温育以获得成蝇。
171.正如本领域技术人员已知的，所述孵化条件将根据蝇种来确定。
172.根据某些实施方案，所述胚胎的复活还包括在步骤(1)之前将所述冷冻保存的胚胎暴露于-70℃至-150℃范围内的温度。
173.根据某些示例性实施方案，将所述冷冻保存的胚胎在复活溶液中温育包括连续的温育期，其中在每个后续的温育期中所述复活组合物中的cpa浓度降低。根据某些实施方案，将所述冷冻保存的胚胎在复活溶液中温育至少两个、至少三个或至少四个约0.5min至约2min的时间段。
174.根据某些示例性实施方案，对于约1min的第一温育时间来说，将所述冷冻保存的胚胎在包含约35％至约45％cpa的复活溶液中温育。
175.根据某些示例性实施方案，对于约1min的第二温育时间来说，将所述冷冻保存的胚胎在包含约15％至约25％cpa的复活溶液中温育。
176.根据某些示例性实施方案，对于约1min的至少一个另外的温育时间来说，将所述冷冻保存的胚胎在不含cpa的复活溶液中温育。
177.根据某些实施方案，所述复活溶液还包含至少一种对组合物的高渗透压有贡献的非渗透化合物。所述非渗透化合物如上文中所述。
178.根据某些示例性实施方案，所述孵化条件包括将胚胎放置在选自林格氏培养基、pbs、schneider培养基的培养基中的熔化琼脂中，或直接放置在培养基的薄层中(使得能够
获得足够的氧气)或富含氧气的培养基中。
179.然后正如本领域中已知的，根据蝇种将孵化的幼虫在正常饮食和生长条件下生长。
180.根据另一方面，本发明提供了多个冷冻保存的蝇胚胎，其特征在于孵化的幼虫达到成蝇形式的数目为相应的从未冷冻保存的胚胎孵化的幼虫的成蝇形式数目的至少1％。根据某些实施方案，所述数目为从未冷冻保存的胚胎获得的成蝇形式数目的至少2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或更多。根据某些实施方案，所述数目在1-10％之间。
181.根据另一方面，本发明提供了高度冷敏感的蝇种的多个冷冻保存的蝇胚胎，其特征在于孵化的幼虫达到成蝇形式的数目为相应的从未冷冻保存的胚胎孵化的幼虫的成蝇形式数目的至少1％。根据某些实施方案，所述数目为从未冷冻保存的胚胎获得的成蝇形式数目的至少2％、3％、4％、5％、10％、20％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或更多。根据某些实施方案，所述数目在1-10％之间。
182.根据某些示例性实施方案，所述冷敏感的蝇种是bsf。
183.根据另一方面，本发明提供了多个冷冻保存的蝇胚胎，其特征在于孵化的幼虫达到成蝇形式的数目为相应的从未冷冻保存的胚胎孵化的幼虫的成蝇形式数目的至少1％，其中所述胚胎是具有大卵的蝇种的胚胎。根据某些实施方案，所述数目为从未冷冻保存的胚胎获得的成蝇形式数目的至少2％、3％、4％、5％、10％、20％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或更多。根据某些实施方案，所述数目在1-10％之间。
184.根据另一方面，本发明提供了一种制备冷冻保存用蝇胚胎的试剂盒，所述试剂盒包含：包含次氯酸钠的组合物；通透化组合物；至少一种冷冻保护剂；任选的复活溶液；和任选的使用所述试剂盒组分冷冻保存蝇胚胎的说明书。
185.根据某些实施方案，所述试剂盒还包含清洗溶液。
186.提供下述实施例是为了更全面地说明本发明的一些实施方案。然而，它们决不应被解释为限制本发明的广泛范围。在不背离本发明范围的情况下，本领域技术人员可以容易地设计出本文公开的原理的许多变化和修改。
实施例
187.实施例1：黑水虻胚胎发育阶段
188.为了绘制黑水虻(bsf)的胚胎发育图，在高分辨率共聚焦显微镜下对bsf胚胎进行了延时成像，并将关键发育事件与黑腹果蝇(drosophila melanogaster)的特征阶段进行比较。
189.黑水虻胚胎在30℃的温度和90％相对湿度下生长并每30分钟成像，直至幼虫孵化。黑水虻胚胎发生阶段的鉴定通过将来自于影片的快照与campos-ortega和hartenstein所定义的黑腹果蝇胚胎发生阶段的已知标志(1985，《黑腹果蝇的胚胎发育》(the embryonic development of drosophila melanogaster)，springer-verlag,berlin heidelberg，第9-84页)比较来进行。胚胎姿态旋转是在所有成像的胚胎(n＝5)中观察到的独特特征，并且以前从未在其他蝇种的胚胎发育中报道过。图1描绘了黑水虻的胚胎发育阶段。
190.实施例2：bsf胚胎的冷冻保存和复活
191.方案1
192.通透化组合物：
193.组合物包含14％的2-甲基四氢呋喃(2-methf)和86％的d-柠檬烯。
194.培养基：
195.schneider培养基(biological industries，01-150-1a)，10％胎牛血清和1％抗生素抗真菌剂溶液(biological industries,03-033-1b)。
196.在产卵后(ael)0-2h小时收集黑水虻的卵，然后在30℃和高湿度下温育直至38-48h ael，这是发育阶段14-16。
197.通透化如下所述来进行：
198.a.将卵与次氯酸钠(naclo)(1.5％)温育60秒；
199.b.用ddw清洗1分钟；
200.c.将干燥的卵与异丙醇温育3-10sec；
201.d.将清洗过的卵在纸上干燥；
202.e.将干燥的卵在通透化溶液中温育30-90sec.；
203.f.将卵在纸上干燥，然后空气干燥30-90sec.；
204.g.在pbs中快速清洗5次；
205.h.在naoh(10％)中温育30-90sec.；
206.i.在pbs中快速清洗2次。
207.冷冻保存剂(cpa)的装载通过下述步骤进行：
208.a.将通透化的卵在包含10％乙二醇、0.25m海藻糖、5％fcs和1％抗生素的schneider培养基中在rt温育10min；
209.b.将步骤(a)的通透化的卵在包含20％乙二醇、0.25m海藻糖、5％fcs和1％抗生素的schneider培养基中在rt温育10min；
210.c.将步骤(b)的通透化的卵在包含40％乙二醇、0.5m海藻糖、10％fcs和1％抗生素的schneider培养基中在rt温育10min；和
211.d.将步骤(c)的通透化的卵在包含50％乙二醇、0.5m海藻糖、10％fcs和1％抗生素的schneider培养基中在rt温育10min.
212.所述装载有cpa的卵准备好用于冷冻保存。
213.玻璃化
214.将胚胎置于薄铜网(具有40-110um的孔眼)或聚碳酸酯nucleopore whatman纸(lifegene,110414)上。除去过量液体，并使用镊子将胚胎直接在液氮(-196℃)中冷冻。
215.解冻如下所述进行：
216.a.将卵在置于包含40％乙二醇、0.75m海藻糖和1％抗生素的schneider培养基中的过滤器中解冻1min.；然后
217.b.在包含20％乙二醇、0.5m海藻糖和1％抗生素的schneider培养基中温育1min.；然后
218.c.在包含10％乙二醇、0.5m海藻糖和1％抗生素的schneider培养基中温育1min.；然后
219.d.在包含0.5m海藻糖和1％抗生素的schneider培养基中温育1min.；然后
220.e.在包含0.25m海藻糖和1％抗生素的schneider培养基中温育1min.；然后
221.f.两次10分钟清洗，每次在包含10％fcs的schneider培养基中进行；然后
222.g.在包含10％fcs的schneider培养基中温育，直至孵化。
223.方案2
224.卵的通透化如上面方案1中所述来进行。
225.冷冻保存剂(cpa)的装载通过下述步骤来进行：
226.a.将通透化的卵在包含10％乙二醇、0.125m海藻糖、5％pvp和1％抗生素的schneider培养基中温育10min.；
227.b.将通透化的卵在包含20％乙二醇、0.125m海藻糖、5％pvp和1％抗生素的schneider培养基中在室温(rt)温育10min.；
228.c.将通透化的卵在包含40％乙二醇、0.25m海藻糖、10％pvp和1％抗生素的schneider培养基中在rt温育10min；
229.d.将通透化的卵在包含53％乙二醇、0.25m海藻糖、10％pvp和1％抗生素的schneider培养基中在rt温育5min。
230.所述装载有cpa的卵准备好用于冷冻保存。
231.快速冷冻：
232.将胚胎置于薄的聚碳酸酯nucleopore whatman纸(lifegene,110414)或薄铜网(具有40-110um的孔眼)上。除去过量液体，并使用镊子将胚胎直接在液氮中冷冻。
233.解冻通过下述步骤进行：
234.a.将卵在置于包含0.75m海藻糖、2％pvp和1％抗生素的schneider培养基中的过滤器中解冻1-2min.；
235.b.在包含0.5m海藻糖、2％pvp和1％抗生素的schneider培养基中温育1-2min.；
236.c.在包含0.5m海藻糖和1％抗生素的schneider培养基中温育1-2min.；
237.d.在包含0.25m海藻糖和1％抗生素的schneider培养基中温育1-2min.；
238.e.两次2-3分钟清洗，每次在schneider培养基中进行；
239.f.一次2-3分钟清洗，在包含10％fcs的schneider培养基中进行；
240.g.在包含10％fcs的schneider培养基中温育，直至孵化。
241.图2示出了未处理的胚胎与剥离方案后的胚胎相比的h&e染色。在剥离处理后大多数卵层被除去。
242.图3示出了在所描述的剥离和cpa装载方案后或未处理时液氮中的nucleopore whatman纸上的玻璃化的胚胎。未处理的胚胎的白色表示它们内部的冰晶，这在大多数处理过的胚胎中不存在。
243.图4显示，冷冻保存和复活方案两者产生超过1％孵化的孵化率。孵化的幼虫显示出等同的向成虫的发育率(超过90％)，并且生育力被验证了两代。
244.上述特定实施方案的描述如此充分地揭示了本发明的一般性质，以至于其他人可以通过应用当前知识容易地修改和/或改编这些特定实施方案以适用于各种不同应用，而无需过度实验并且不背离一般概念，并且因此，这样的改编和修改应该并且旨在被理解为在所公开的实施方案的等同物的含义和范围之内。应当理解，本文中使用的短语或术语是
为了描述而非限制的目的。用于执行各种公开的功能的手段、材料和步骤可以采用各种不同的替代形式，而不背离本发明。