一种同时提取和检测头发中甲状腺激素和类固醇激素的方法

1.本发明涉及化合物的提取和检测方法，特别涉及一种同时提取和检测头发中甲状腺激素和类固醇激素的方法。


背景技术：

2.甲状腺激素是人体重要的内分泌激素，甲状腺激素的主要功能是控制机体的整体代谢、免疫调节、蛋白质合成、碳水化合物和脂肪代谢、神经发育、骨骼的正常生长和成熟，以及心血管和肾脏功能。甲状腺激素的合成由下丘脑-垂体-甲状腺(hpt)轴调节，甲状腺素(t4)和3，3
′
，5-三碘甲状腺原氨酸(t3)是两种最主要的碘甲状腺激素，但它们很容易通过多种代谢途径被快速降解为活性和非活性代谢物。其中，脱碘化是主要途径。t4通过不同的碘甲状腺素脱碘酶形成多种代谢物，包括3，3
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，5
′‑
三碘甲状腺原氨酸(rt3)、3，3
′‑
二碘甲状腺原氨酸(3，3
′‑
t2)和l-甲状腺原氨酸(t0)。检测甲状腺激素及其代谢物的含量有助于更全面、准确地评估hpt轴的功能活性。
3.皮质醇是人体内重要的糖皮质激素，负责调节情绪、维持免疫细胞和炎症、血管和血压等生理功能。皮质醇是下丘脑-垂体-肾上腺(hpa)轴的终端产物，但是当血液中皮质醇的含量过高时，又会通过负反馈作用抑制下丘脑和垂体，以此降低皮质醇的水平。此外，皮质醇在2型11β-羟化类固醇脱氢酶(11β-hsd2)的作用下可以转化成可的松(e)。因此，皮质醇和可的松的含量可以作为评价hpa功能活性的生物标志物。
4.皮质醇能够抑制急性应激诱导的免疫反应，发挥其抗炎特性。然而，当人体长期处于慢性压力时，hpa轴被持续激活，导致压力反应通路的失调，加剧炎症反应。有研究表明，皮质醇可以在下丘脑和垂体层面抑制hpt轴，降低促甲状腺激素释放激素(trh)和促甲状腺激素(tsh)释放，从而抑制甲状腺激素的分泌。此外，皮质醇也会抑制负责将t4转化为t3的2型脱碘酶的活性，导致甲状腺功能减退。由此可见，hpa轴与hpt轴之间有着密切的相互作用。开发同时检测人体内的甲状腺激素和皮质醇含量的方法非常有必要，这有助于进一步探索hpt与hpa轴的作用机制，以及它们之间相互作用的病理生理学机制，从而应用于临床疾病的辅助诊断和健康管理。
5.在实际应用中，广泛地采用血浆、血清、唾液或尿液作为生物基质进行甲状腺激素、皮质醇和可的松的检测，但这些基质也有一定的局限性。第一，传统生物基质都有较强的即时性，只能反映某个时间点或短期内的激素总量。如果希望通过此类基质反映长期状况，就需要对受试者进行长期的连续重复采样，过程繁琐、操作复杂。第二，血液中的激素含量波动大，容易受到环境因素干扰，且采集血样的过程有可能引起受试者应激，使结果不可靠。第三，传统生物基质的保存要求较高，从采集到最终检测期间，样本都必须保存在低温环境中。第四，目前的临床实践是以游离激素的浓度为导向，但血清或唾液中的游离态的甲状腺激素含量较低，为pg/ml水平。例如，甲状腺中游离激素的含量保持不变，而激素总量随着载体蛋白的浓度而变化。若采用传统生物基质，游离组分的定量检测需要在质谱分析之前进行样品预处理，以除去与蛋白质结合的激素。
6.相比之下，头发基质具有很多优势。第一，头发中的激素浓度具有累积性和可回溯性，人脑后枕部头发平均生长速度约为1cm/月，可以反映最近一个月中体内激素水平的累积情况，适用于长期激素水平分析。第二，头发样本的采集无创伤性，被试更易于接受，且头发本身结构比较稳定，保存要求低，常温下置于锡箔纸或信封中可长期保存。第三，头发中的内源性物质主要来源于血液中游离物质的被动扩散，所反映的是血液中游离的内源性物质的长期水平。
7.传统的检测方法包括免疫法、气相色谱串联质谱法和高效液相色谱串联质谱法。免疫法虽然灵敏度高且经济便捷，但可能发生交叉反应影响结果，而且不能同时检测多种物质。
8.高效气相色谱法要求待测物拥有良好的热稳定性和易挥发性，否则就需要先进行衍生化，再经提纯、富集后进行检测，操作复杂。此外，待测物的衍生化会造成待测物的损失，这对原本在头发中含量较低的ths的检测极为不利。
9.为实现上述目标物的定量检测，研究者在不断改进现有的方法。已有研究通过高效液相色谱串联质谱法分别建立了检测血清中的甲状腺激素、皮质醇和可的松的定量分析方法，这些方法无法同时检测五种甲状腺激素和两种类固醇激素，而且头发前处理和提取过程操作繁琐，头发样本用量高，不适合于头发样本分析的大规模应用。因此，本发明旨在建立一种同时提取和检测头发中甲状腺素、3，3
′
，5-三碘甲状腺原氨酸、3，3
′
，5
′‑
三碘甲状腺原氨酸、3，3
′‑
二碘甲状腺原氨酸、l-甲状腺原氨酸、皮质醇和可的松的高效液相色谱串联质谱法。
10.至今，尚未有研究报道同时检测头发基质中五种甲状腺激素和两种类固醇激素的高效液相色谱串联质谱法。大多数研究集中于对两类激素的单独检测，这主要因为现有检测方法存在以下问题。第一，两类激素的溶解度存在较大差异。甲状腺激素微溶于甲醇等有机溶剂，而溶于含有无机酸或碱的甲醇；皮质醇和可的松溶于甲醇，但在碱性条件下不稳定。第二，两类激素的极性有一定的差异，对检测条件的要求各不相同。皮质醇和可的松的极性较弱，流动相多采用高有机相；甲状腺激素及其代谢物的极性较强，且随着代谢途径的延伸，流动相对水相的比例要求逐渐上升。这两方面的差异就对溶剂和流动相的选择提出了挑战。第三，由于头发中游离甲状腺激素含量较少，头发样本前处理和两类激素的同时提取是检测技术的关键。


技术实现要素：

11.发明目的：本发明提供一种基于高效液相色谱串联电喷雾离子化源质谱的同时提取和检测头发中甲状腺激素和类固醇激素的方法，灵敏度高、特异性好。
12.技术方案：本发明所述的同时提取和检测头发中甲状腺激素和类固醇激素的方法，包括以下步骤：
13.(1)采集人体头发样本并预处理；
14.(2)孵育、萃取样本以提取样本中的目标物；
15.(3)使用高效液相色谱串联质谱法实现目标物含量的检测。
16.作为优选方案：
17.(1)采集人体头发样本并预处理；
18.将采集得到的头发样本，在室温下加入2ml甲醇、异丙醇、丙酮或它们的混合溶液等小分子有机溶剂进行清洗，共振摇清洗2次，每次2min，清洗后发样在50℃下风干，再用洁净的剪刀剪为1mm左右的碎段；
19.(2)孵育、萃取样本以提取样本中的目标物；
20.向头发碎段中加入孵育溶剂孵育12-36h，再将孵化后的溶液用离心机以12000转/分钟的速度离心5min，取上清液，取得的上清液在氮气流下蒸发后，再重新用50μl的甲醇/纯氨水溶液溶解，其中孵育温度为40℃，氮气流蒸发温度为50℃，孵育溶剂由50μl的含50ng内标物的内标溶液和950μl的含有氨水的高有机相的甲醇/纯氨水(75/25～99/1，v/v)的混合溶液构成，内标物为甲状腺素-[
13
c6]、3，3
′
，5-三碘甲状腺原氨酸-[
13
c6]、3，3
′
，5
′‑
三碘甲状腺原氨酸-[
13
c6]、3，3
′‑
二碘甲状腺原氨酸-[
13
c6]、二氘代皮质醇和八氘代可的松，定溶溶剂为50μl的含有氨水的高有机相的甲醇/纯氨水(55/45～99/1，v/v)的混合溶液；
[0021]
(3)使用高效液相色谱串联质谱法实现目标物的含量检测；
[0022]
步骤(2)中的重溶液经高效液相色谱分离后，通过质谱仪进行检测，并由内标法对头发中甲状腺素、3，3
′
，5-三碘甲状腺原氨酸、3，3
′
，5
′‑
三碘甲状腺原氨酸、3，3
′‑
二碘甲状腺原氨酸、l-甲状腺原氨酸、皮质醇和可的松进行定量；
[0023]
高效液相色谱串联质谱仪的色谱分离条件包括如下：
[0024]
(1)色谱柱：c18色谱柱；
[0025]
(2)流动相：含高有机相的甲醇/水(70/30～99/1，v/v)的混合溶液，其中每100ml流动相中含约0.00154g乙酸铵，溶液配制后用0.22μm微孔滤膜过滤，并进行15min的超声脱气处理；
[0026]
(3)流速：200μl/min；
[0027]
(4)进样量：10μl。
[0028]
高效液相色谱串联质谱仪的质谱检测条件包括如下：
[0029]
(1)离子化方法：电喷雾；
[0030]
(2)离子模式：正离子模式；
[0031]
(3)离子化参数：电喷雾电压，5500伏特；离子源温度，500℃；雾化气压，20psi；卷帘气压，20psi；碰撞气压，medium；驻留时间，100ms；
[0032]
(4)监测模式：多反应监测模式。
[0033]
所述步骤(3)中质谱质荷比和质谱条件如表1所示：
[0034]
表1七种激素及其对应内标的离子对和优化质谱参数
[0035][0036][0037]
本发明基于高效液相色谱串联质谱技术，建立了一种操作简便、能够同时提取和检测人体头发中甲状腺素、3，3
′
，5-三碘甲状腺原氨酸、3，3
′
，5
′‑
三碘甲状腺原氨酸、3，3
′‑
二碘甲状腺原氨酸、l-甲状腺原氨酸、皮质醇和可的松的新方法。先利用高效液相色谱分离待测物质，后通过qtrap四级线性质谱进行检测，使用内标法对物质含量定量。内标法建立时所用的头发空白基质为远离头皮12厘米的发梢，或连续在上述孵育溶剂中浸泡7天以上的发根，其中的甲状腺素、3，3
′
，5-三碘甲状腺原氨酸、3，3
′
，5
′‑
三碘甲状腺原氨酸、3，3
′‑
二碘甲状腺原氨酸、l-甲状腺原氨酸、皮质醇和可的松含量低于本方法的检测限。高效液相色谱测得的图谱显示，各待测物的出峰时间依次是：t0(13.7min)，rt3(17.4min)，t4(20.6min)，3，3
′‑
t2(21.4min)，t3(21.7min)，e(25.1min)和f(29.0min)。空白基质和真实头发样本中，各待测物及其内标均实现良好的色谱峰分离，峰型尖锐对称，背景噪声信号较低，在出峰时间内无干扰峰出现。
[0038]
有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优势：本发明方法实现了头发中甲状腺素、3，3
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，5-三碘甲状腺原氨酸、3，3
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，5
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三碘甲状腺原氨酸、3，3
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二碘甲状腺原氨酸、l-甲状腺原氨酸、皮质醇和可的松的分离和同时检测。七种激素的检测限在0.3～1.9pg/mg之间，定量限在1.1～6.5pg/mg，线性范围宽，上限为1000pg/mg；日内变异系数在0.7～8.3％之间，日间变异系数在1.7～8.0％之间，回收率在89.4～109.1％之间；台式稳定性、自动进样器稳定性、储备液稳定性、长期稳定性、高温稳定性和冻融稳定性良好。这证明本发明的检测方法灵敏度高、特异性好、准确可靠。
附图说明
[0039]
图1为加标空白基质中七种激素的色谱质谱图，在头发空白基质中加入1000pg/mg外标标准品后检测得到，其中，a：t0，l-甲状腺原氨酸；b：t3，3，3
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，5-三碘甲状腺原氨酸和rt3，3，3
′
，5
′‑
三碘甲状腺原氨酸；c：t4，甲状腺素；d：3，3
′‑
t2，3，3
′‑
二碘甲状腺原氨酸；e：可的松；f：皮质醇；
[0040]
图2为加标空白基质中六种内标物质的色谱质谱图，在头发空白基质中加入50ng/ml内标标准品后检测得到，其中，a：t3，3，3
′
，5-三碘甲状腺原氨酸和rt3，3，3
′
，5
′‑
三碘甲状腺原氨酸；b：t4，甲状腺素；c：3，3
′‑
t2，3，3
′‑
二碘甲状腺原氨酸；d：可的松；e：皮质醇；
[0041]
图3为真实毛发样本中七种激素的色谱质谱图，其中，a：t0，l-甲状腺原氨酸；b：t3，3，3
′
，5-三碘甲状腺原氨酸和rt3，3，3
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，5
′‑
三碘甲状腺原氨酸；c：t4，甲状腺素；d：3，3
′‑
t2，3，3
′‑
二碘甲状腺原氨酸；e：可的松；f：皮质醇。
具体实施方式
[0042]
本实施例对100名人类免疫缺陷病毒(hiv)感染阳性患者以及40名健康人群头发中的t0、rt3、t3、t4、3，3
’‑
t2、e和f的含量进行了检测
[0043]
包括如下步骤：
[0044]
(1)采集人体毛发样本并预处理：
[0045]
尽可能地贴近头皮剪取受试者脑后枕部贴近发根的头发，长度需大于1cm，剪取的发样保存于室温下干燥洁净的离心管中，取20mg发样在室温下用2ml甲醇清洗2次，每次2min，洗净后在50℃下风干，再用甲醇洁净过的剪刀将发样剪为1mm左右的碎段；
[0046]
(2)孵育、萃取样本以提取样本中的目标物：
[0047]
向20mg头发中加入50μl含50ng内标物的混合内标溶液和950μl的甲醇/氨水(95/5，v/v)混匀，在40℃下孵育24h，然后将孵育液用离心机以12000转/分钟的速度离心5min，取上清液，在50℃氮气流下吹干后，重新用50μl的甲醇/氨水(95/5，v/v)溶液溶解；
[0048]
(3)使用高效液相色谱串联质谱法实现目标物的含量检测：
[0049]
使用dikma c18色谱柱，80/20(v/v)的甲醇/水作为流动相，其中每100ml流动相溶液含有0.00154g乙酸铵，流动相配制完成后用0.22μm微孔滤膜过滤并超声脱气15min，流速为200μl/min，进样量为10μl；质谱的检测参数如表1所示。在得到的标准品色谱质谱图中，t0色谱峰约在13.7分钟出现，rt3色谱峰约在17.4分钟出现，t4色谱峰约在20.6分钟出现，3，3
′‑
t2色谱峰约在21.4分钟出现，t3色谱峰约在21.7分钟出现，可的松色谱峰约在25.1分钟出现，皮质醇色谱峰约在29.0分钟出现，见附图1。
[0050]
取标准储备液用甲醇按比例稀释，配成系列浓度梯度的标准溶液(400、200、80、40、20、8、4、2、0.8、0.4、0.2、0.08、0.04、0.02、0.008、0.004、0.002ng/ml)，取剪碎的头发空白基质20mg，分别加入各种浓度的标准溶液，混匀，室温下孵育24h，得到的孵育处理和检测过程与步骤(2)、(3)一致。
[0051]
在浓度梯度范围内，以待测物质的浓度为横坐标(换算浓度单位ng/ml为pg/mg)、质谱峰面积比为纵坐标进行线性回归分析，得到各待测物的回归方程，其中t4的回归方程为y＝0.0016x-0.0035(线性范围6.5-1000pg/mg)，rt3的回归方程为y＝0.0063x-0.0111(线性范围3.9-1000pg/mg)，t3的回归方程为y＝0.0047x-0.0078(线性范围4.3-1000pg/
mg)，3，3
′‑
t2的回归方程为y＝0.0020x-0.0036(线性范围5.4-1000pg/mg)，t0的回归方程为y＝0.0021x-0.0037(线性范围3.9-1000pg/mg)，f的回归方程为y＝0.0167x-0.0098(线性范围1.8-1000pg/mg)，e的回归方程为y＝0.0623x-0.0373(线性范围1.1-1000pg/mg)。
[0052]
头发中t4的检测限和定量限为1.9和6.5pg/mg，rt3的检测限和定量限为1.2和3.9pg/mg，t3的检测限和定量限为1.3和4.3pg/mg，3，3
′‑
t2的检测限和定量限为1.6和5.4pg/mg，t0的检测限和定量限为1.2和3.9pg/mg，f的检测限和定量限为0.6和1.8pg/mg，e的检测限和定量限均为0.3和1.1pg/mg。日内变异系数在0.7～8.3％之间，日间变异系数在1.7～8.0％之间，回收率在89.4～109.1％之间。
[0053]
经回归方程换算得到，t0、f和e在所有样本中均可以被检测。t0在hiv感染组和健康对照组中的含量分别为35.1
±
51.2和45.0
±
54.2pg/mg；f分别为8.4
±
8.3和5.1
±
3.4pg/mg；e分别为11.4
±
4.3和9.0
±
4.7pg/mg。而t4、t3、rt3和3，3
′‑
t2的头发含量非常低，且其均在定量限附近，仅在少量被试中被检出。t4只在1个hiv患者和1个健康被试中被检出，含量分别为11.2和16.0pg/mg。t3在32个hiv感染者中检出，浓度范围为9.2～12.3pg/mg；在15个健康对照组被试中检出，浓度范围为9.7～11.2pg/mg。rt3在7个hiv感染者中检出，浓度范围为6.7～8.1pg/mg，而在健康对照组中未检出。3，3
′‑
t2在3个hiv患者中被检出，浓度范围为12.9～13.7pg/mg；在2个健康对照被试中被检出，含量为13.1和14.0pg/mg。
[0054]
本实施例中所使用的水均为三蒸去离子水，色谱纯级甲醇购自美国sigma aldrich公司，色谱纯级乙酸铵购自美国tedia公司，甲状腺素、3，3
′
，5-三碘甲状腺原氨酸、3，3
′
，5
′‑
三碘甲状腺原氨酸、3，3
′‑
二碘甲状腺原氨酸、l-甲状腺原氨酸标准品及其对应内标购自上海甄准生物科技有限公司，皮质醇和可的松及对应氘代物购自美国sigma aldrich公司。
[0055]
高效液相色谱系统为agilent 1200系列液相色谱仪。质谱为applied biosystems公司的qtrap 3200四级线性质谱系统。数据分析使用analyst 1.6.2软件。色谱柱为dikma的platisil ods-c18色谱柱(5μm，150
×
4.6mm)，并由c18预柱(5μm，10
×
4.6mm)进行保护。流动相为80/20(v/v)的甲醇/水，其中水中含有0.2mm乙酸铵，流动相配制完成后用0.22μm微孔滤膜过滤并超声脱气15min，流速为200μl/min，进样量为10μl。