含贝莱斯芽孢杆菌的发酵剂发酵食品工业下脚料的方法与流程

1.本发明涉及了贝莱斯芽孢杆菌的应用，尤其涉及含贝莱斯芽孢杆菌的发酵剂发酵食品工业下脚料的方法。


背景技术：

2.腐竹厂、酱油厂利用大豆来生产腐竹和酱油的过程会产生大量的废腐竹渣和废酱油渣(以下统称含蛋白下脚料)，这些含蛋白下脚料一直都是用来供给养鱼塘作为养鱼的辅助饵料，由于这些下脚料没有经过腐熟只能少量使用，其营养利用率很低，附加值很低；另一方面，由于这些下脚料在加工、运输和储存的过程中容易污染杂菌，没有经过灭菌和发酵腐熟处理直接用作饲料，很容易导致于鱼类发病；这类含蛋白下脚料还有很多，如各类榨油厂的饼泊、麸泊等。
3.陈皮厂利用柑橘生产陈皮过程中，只利用果皮，果肉(俗称陈皮渣)直接丢弃，仅广东新会市每年就有30-50万吨的果肉产生，一直以来，这些陈皮渣基本没有得到应用，大部分被直接倾倒入河流，污染地表和地下水体，近年来由于发现陈皮果肉里面的果核有利用价值，有厂家开始回收陈皮果肉，提取里面的果核进行销售，但果肉和果汁(以下统称含糖下脚料)依然是没有得到较好的利用，这类含糖下脚料还有很多，如药厂的药渣，茶饮料厂的茶叶渣等等。
4.在珠江三角洲等地区，农民们称鱼苗开口诱饵为“水蛛”，“水蛛”主要是轮虫和枝角类的统称。“水蛛”分为“细水蛛”和“大水蛛”，“细水蛛”主要是指大小在0.2mm-0.5mm之间的轮虫和小分枝角，它们能通过60目筛网，是刚孵化的小鱼苗(前5天)的主食。“大水蛛”主要是指枝角类，大小为0.5-1.0mm，是苗期食物转化前的主要食物，根据鱼类种类，以大水蛛为主要食物的时间约为6～15天。水产养殖特别是鱼苗养殖过程中，水蛛的需求量很大，但一直以来水蛛主要还是天然生长，人工养殖水蛛是近几年才开始有人开始尝试。
5.据了解当前水蛛需求量最大的是培养加州鲈鱼、桂花鱼、南美白对虾等高价值水产动物苗种，以及其他鱼类如四大家鱼鱼苗的鱼苗场，这些鱼苗场需要外购水蛛来给喂养鱼苗，这些水蛛，大部分是天然池塘里或者大海里捕捞的，捕捞后它们需要冰冻起来保藏，因此都是死水蛛，它们往往携带有多种病原微生物或其他环境中残留的杂质，因此这些鱼苗场的鱼苗养殖的成活率大部分都不高，一直都在20-50％，甚至更低。因此人工培养活水蛛来喂养鱼苗是提高鱼苗场养殖成功率的重要出路之一。
6.人工培养活水蛛需要专用饵料，目前培养水蛛主要采用普通的鸡粪等粪便类肥料，也有采用饲料原料来配制的例如水蛛乐等，这些饵料要么对水体污染较大，残留毒素多，要么原料成本较高，因此利用食品工业的下脚料来作为生产培养水蛛的专用饵料的原料成为开发水蛛专用饵料较好的选择。
7.要把含蛋白类下脚料和含糖下脚料发酵转化成培养水蛛的专用饵料，必须筛选出适合发酵腐熟这些下脚料的专用菌株，目前常用的发酵饲料的菌株如枯草芽孢杆菌、酿酒酵母等，用这些菌种用来发酵这些下脚料，往往发酵过头，把大部分粗蛋白发酵成为水溶性
的氨基酸或小肽，不适合用来喂养水蛛，因此必须筛选一种发酵程度恰到好处的菌株，来发酵上述下脚料，使其转化为水蛛的饵料原料。


技术实现要素：

8.本发明的目的是提供了含贝莱斯芽孢杆菌的发酵剂发酵食品工业下脚料的方法。
9.含贝莱斯芽孢杆菌的发酵剂发酵食品工业下脚料的方法，包括以下步骤：
10.(1)取贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)xdy021菌液接种至已灭菌的培养基中，摇瓶培养后转入种子罐培养得含贝莱斯芽孢杆菌的发酵剂，备用；
11.(2)取含蛋白下脚料和含糖下脚料构成的发酵底物，加水研磨成浆状；
12.(3)将浆状发酵底物置入发酵罐中，调整ph至4-8，加入含贝莱斯芽孢杆菌的发酵剂，发酵24-120小时，即得。
13.本发明步骤(1)中的培养基包含：蛋白胨1％-4％、酵母膏1％-4％、葡萄糖0.5％-3％、kh2po
4 0.1％-2％、氯化钠0.1％-1.5％、硫酸锰0.01％-0.2％、加纯净水至100％。
14.本发明步骤(1)中的摇瓶培养1-5天，种子罐培养1-5天，可为厌氧或低氧发酵。
15.本发明步骤(2)的含蛋白下脚料和含糖下脚料按照碳氮比10-35:1的比例换算后称重混合(本发明的碳氮比按有机质:粗蛋白计，下同)。当然，在选择原料的过程中，还需要根据原料性质进行选配和调整用量，例如酱油渣含盐量高，用量就不能太大，而且须和腐竹配合使用。
16.本发明中，含蛋白下脚料为腐竹厂的腐竹渣、酱油厂的酱油渣、各类榨油厂的饼泊等；含糖下脚料为陈皮厂的陈皮渣、淀粉厂的废淀粉渣、制药厂的药渣、茶叶饮料厂的茶叶渣、酵母厂的酵母渣等。
17.本发明步骤(2)中，发酵底物和水按质量比1:0.2-1.5。
18.本发明步骤(3)中的贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)xdy021按照常规的从0.1-50立方的发酵罐的发酵工艺及接种量培养，就可以实现本发明的目的。但是作为本发明优选地，所述的含贝莱斯芽孢杆菌的发酵剂在发酵罐的接种量占发酵底物总质量的0.1～10％范围内。
19.本发明步骤(3)中，发酵为低氧发酵或厌氧发酵，发酵温度为30-45度，通气量0-5m3/h。
20.贝莱斯芽孢杆菌的新菌株(bacillus velezensis)xdy021，其保藏号为gdmcc no:62146，该菌株在发酵中产生多种抑菌蛋白和抗菌肽等物质，能够抑制其他杂菌的生长，达到抑制或杀灭其他杂菌效果，适合用于有杂菌污染的发酵底物。在应用中，该菌株发酵的发酵底物的发酵程度，包括底物粒径和水不溶物含量等恰好符合培养水蛛的要求，而且不会出现发酵过度或发酵不足的现象。
21.本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)xdy021，已经于2021年12月18日送广东省微生物保藏中心保藏，并收到保藏登记号gdmcc no:62146。
22.本发明的优点：
23.1.本发明提供的含贝莱斯芽孢杆菌的发酵剂发酵食品工业下脚料的方法，用于发酵含蛋白下脚料和含糖下脚料，获得的发酵物料粒径大小、水不溶物含量等恰好符合培养水蛛的要求，有利于水蛛摄食，特别适合作为水蛛饵料培养水蛛。而且由于发酵产物中依然
存在贝莱斯芽孢杆菌xdy021，耐储藏，储藏过程中不会滋生其他杂菌，不会出现胀气、膨胀等现象。
24.2.本发明的发酵工艺简单，使用的贝莱斯芽孢杆菌xdy021在发酵中产生多种抑菌蛋白和抗菌肽等物质，能够抑制其他杂菌的生长，达到抑制或杀灭其他杂菌效果，适在发酵的过程中同步实现杀菌灭菌和发酵腐熟。
25.3.本发明以含蛋白下脚料和含糖下脚料为发酵底物，变废为宝，将腐竹厂、酱油厂和榨油厂等的含蛋白下脚料和陈皮厂、酵母厂、茶叶饮料厂等的含糖下脚料进行资源化、高值化利用，实现更高的经济价值。
附图说明
26.图1是贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)xdy021的测序结果。
27.图2是试验一中未经贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)xdy021发酵前的发酵底物的显微图。
28.图3是试验一中经贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)xdy021发酵后的发酵底物的显微图。
具体实施方式
29.实施例一
30.贝莱斯芽孢杆菌xdy021的筛选：从广东省微生物研究所菌种保藏中心购买了4株芽孢杆菌(xd05b-xd08b)，1株酵母(xd05j)，从广州百佳超市购买了2株酵母(xd06j-xd07j)，再从自然界分离筛选了4株芽孢杆菌(xdy020-xdy023)，3株酵母(xd05j-xd07j)，然后将它们分别经3代含蛋白下脚料和含糖下脚料构成的发酵底物的培养筛选，最后挑选出能将上述发酵底物发酵成符合培养水蛛原料的菌株。
31.上述含蛋白下脚料包括：来自广东江门鹤山市鹤城镇南腐竹厂的腐竹渣，来自广东江门鹤山市东古酱油厂的酱油渣，来自广东江门鹤山桃源花生油厂的花生麸等；含糖下脚料包括：来自广东江门新会浩田陈皮厂的陈皮渣，来自广东广州市东鹏食品饮料有限公司的茶叶渣，广西柳州安琪酵母厂的酵母渣等，将这些原料按碳氮比10-35:1的比例配制，作为用于筛选菌种的发酵底物，具体配方见表一、表五、表七、表九、表十一。
32.表一：发酵底物配方
[0033][0034]
上述贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)的筛选方法：第一阶段：按表一配制发酵底物加水研磨后分别装入112个500ml的三角瓶中，每瓶装入300g，分别接种上述的14种菌，每种菌接种8瓶，在35度的培养箱培养36小时后，分别进行细菌总数的计数，挑选出总菌数≥107的4个菌株，它们是xdy020、xdy021、xdy022、xdy023，证明这些菌株适合在这种底物上生长，继续做进一步的筛选。第二阶段：将按表一配制的发酵底物加水研磨后分别装入
32个500ml的三角瓶中，每瓶装入300g，分别接种挑选出来的4种菌，每种菌接种8瓶，在35度的培养箱培养36小时后，将发酵产物用于水蛛的培养实验。
[0035]
表二：不同菌株第七天的发酵产物检测结果记录
[0036][0037][0038]
从表二可以看出，xdy021菌株发酵产物中，1500-2200目粒径的发酵物数量最多，菌量适中。
[0039]
培养试验：
[0040]
将xdy020-023菌株发酵腐竹渣 酱油渣 陈皮渣的发酵产物用于培养水蛛实验：在鹤山市新的生物制品有限公司的水蛛养殖试验场，设12个100l的水蛛培养缸，分别加入80l水，并接种1l含有水蛛种源的水，分别将上述菌种筛选方法第二阶段筛选出来的4种菌种发酵腐竹渣 酱油渣 陈皮渣(表一)的发酵产物，添加时间为每天上午8：30，添加量为每个培养缸10ml，每个菌种的培养物添加3个培养缸，每天观察水蛛的丰度，观察方法是在160倍显微镜下计算每个视野水蛛的数量(每天的数量是三个培养缸的平均数取整数)，第七天收集水蛛，用100目筛网滤干水后称重，结果见表三所示。
[0041]
表三：不同菌种发酵产物培养水蛛的效果记录表
[0042]
组别第一天第二天第三天第四天第五天第六天第七天重量xdy0205818386788107221gxdy02158204890124179323gxdy02257163683113146240gxdy02356173778111155284g
[0043]
从表二和表三可以看出xdy021菌株培养的水蛛从丰度，到产量都是最高的。
[0044]
经连续5次的重复实验，最终选择水蛛丰度最高，水蛛产量最高的菌株为xdy021，将该菌株送华南农业大学分子遗传实验室进行dna测序(见图1)，结果证明该菌株是一株贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)的菌株。
[0045]
试验例一
[0046]
所筛选出来的贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)xdy021菌株(简称xdy021菌株)制成的水蛛饵料原料发酵剂：
[0047]
(1)制备xdy021菌液：接种贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)xdy021的新鲜培养物至装有培养基的16个500ml三角瓶中，在35℃的水浴摇床中培养48h，搅拌转速为20-50rpm。
[0048]
(2)培养基的制作：以葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、kh2po4、氯化钠、硫酸锰和水为主要原料配制培养基，它们的质量百分比为：
[0049]
蛋白胨2％、酵母膏3％、葡萄糖2％、kh2po
4 0.6％、氯化钠0.6％、硫酸锰0.02％，水
余量。
[0050]
将贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)xdy021菌株制成的含贝莱斯芽孢杆菌的发酵剂，在鹤山市新的生物制品有限公司位于鹤山市桃源镇中心村交通石场的实验基地进行发酵物的处理实验。按表一的比例配制500g腐竹渣 酱油渣 陈皮渣的混合料，加入400ml纯净水，充分混合均匀后，经过胶体磨研磨成浆料后，检测其菌群情况，发现有酵母、不同类型的芽孢杆菌、大肠杆菌、霉菌等15种菌种左右，没有一种菌处于优势菌种(图2)。
[0051]
各取300g置入三个500ml的三角瓶中，分别加入xdy021菌株制成的含贝莱斯芽孢杆菌的发酵剂30ml，在恒温摇床培养72小时后，搅拌转速为20-50rpm，再次检测菌群情况，发现三个三角瓶的发酵产物中95％以上的菌都是贝莱斯芽孢杆菌，其他杂菌不到5％(见表四)，基本看不到大肠杆菌，霉菌等存在，该实验证明，含贝莱斯芽孢杆菌的发酵剂能有效抑制其他杂菌的生长(图3)；经查证贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)在生长过程中会产生抗菌肽和抑菌蛋白等物质来抑制其他杂菌生长。
[0052]
表四：下脚料发酵前后不同菌类比例检测结果
[0053][0054]
实施例二
[0055]
1.含贝莱斯芽孢杆菌的发酵剂的制备：取xdy021菌种接种至经过高温灭菌的培养基中，在发酵罐中进行发酵培养，即得含贝莱斯芽孢杆菌的发酵剂，也就是贝莱斯芽孢杆菌制备的水蛛饵料原料发酵液，备用。
[0056]
具体地，制备步骤如下：
[0057]
(1)制备xdy021菌液：接种贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)xdy021的新鲜培养物至装有培养基的16个500ml三角瓶中，在35℃的水浴摇床中培养48h，搅拌转速为20-50rpm。此步骤中的培养基与步骤(2)的培养基相同。
[0058]
(2)培养基的制作：以葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、kh2po4、氯化钠、硫酸锰和水为主要原料配制培养基，它们的质量百分比为：
[0059]
蛋白胨2％、酵母膏3％、葡萄糖2％、kh2po
4 0.6％、氯化钠0.6％、硫酸锰0.02％，水余量。
[0060]
(3)取上述xdy021菌液接种至经过高温灭菌的上述培养基中，调整起始ph至6，在100l种子罐中进行厌氧发酵5天，至终点ph为4.5，即得含贝莱斯芽孢杆菌的发酵剂。
[0061]
2.发酵底物的制备
[0062]
取广东江门鹤山市鹤城镇南腐竹厂的腐竹渣和广东江门鹤山市东古酱油厂的酱油渣作为含蛋白下脚料；取广东江门新会浩田陈皮厂的陈皮渣作为含糖下脚料。将这些原料按碳氮比26:1的比例换算称取后混合，具体物料配方见表五。
[0063]
表五：发酵底物配方
[0064][0065]
将上述原料混合均匀，按混合料:水的重量比1:1比例加水后，经过胶体磨研磨成浆状，即制成发酵底物。
[0066]
3.将70l上述发酵底物至于100l发酵罐中，调整ph至6.5，加入含贝莱斯芽孢杆菌的发酵剂5l，发酵7天后至ph为5.1即达发酵终点，发酵过程中控制通气量为0.5m3/h，保持低氧发酵状态，取300克发酵产物进行检测，结果如表六。
[0067]
表六：发酵产物检测结果记录
[0068]
发酵物(g)发酵物水不溶物(g)1500-2200目水不溶物占比(％)发酵物种菌数30026.2270.567.1
×
107[0069]
实施例三
[0070]
1.含贝莱斯芽孢杆菌的发酵剂的制备：取xdy021菌种接种至经过高温灭菌的培养基中，在发酵罐中进行发酵培养，即得含贝莱斯芽孢杆菌的发酵剂，备用。
[0071]
具体地，制备步骤如下：
[0072]
(1)制备xdy021菌液：接种贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)xdy021的新鲜培养物至装有培养基的16个500ml三角瓶中，在38℃的生化培养箱培养48h。此步骤中的培养基与步骤(2)的培养基相同。
[0073]
(2)培养基的制作：以葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、kh2po4、氯化钠、硫酸锰和水为主要原料配制培养基，它们的质量百分比为：
[0074]
蛋白胨3％、酵母膏2.5％、葡萄糖2％、kh2po
4 0.5％、氯化钠0.4％、硫酸锰0.04％，水余量。
[0075]
(3)取上述xdy021菌液接种至经过高温灭菌的上述培养基中，调整起始ph至6，在100l种子罐中进行低氧发酵5天，通气量为0.3m3/h，至终点ph为4.5，即得含贝莱斯芽孢杆菌的发酵剂。
[0076]
2.发酵底物的制备
[0077]
取广东江门鹤山市鹤城镇南腐竹厂的腐竹渣和广东江门鹤山市东古酱油厂的酱油渣作为含蛋白下脚料；取广东广州市东鹏食品饮料有限公司的茶叶渣作为含糖下脚料。将这些原料按碳氮比24:1的比例换算称取后混合，具体物料配方见表七。
[0078]
表七：发酵底物配方
[0079][0080]
将上述原料混合均匀，按混合料﹕水的重量比1﹕0.8比例加水后，经过胶体磨研磨成浆状，即制成本发明的发酵底物。
[0081]
3.将70l上述发酵底物至于100l发酵罐中，调整ph至6.5，加入含贝莱斯芽孢杆菌的发酵剂5l，发酵7天后至ph为5.0即达发酵终点，发酵过程为厌氧发酵，取300克发酵产物进行检测，结果如表八。
[0082]
表八：发酵产物检测结果记录
[0083]
发酵物(g)发酵物水不溶物(g)1500-2200目水不溶物占比(％)发酵物种菌数30028.1269.316.8
×
107[0084]
实施例四
[0085]
1.含贝莱斯芽孢杆菌的发酵剂的制备：取xdy021菌种接种至经过高温灭菌的培养基中，在发酵罐中进行发酵培养，即得含贝莱斯芽孢杆菌的发酵剂，备用。
[0086]
具体地，制备步骤如下：
[0087]
(1)制备xdy021菌液：接种贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)xdy021的新鲜培养物至装有培养基的20个500ml三角瓶中，在38℃的生化培养箱培养48h。此步骤中的培养基与步骤(2)的培养基相同。
[0088]
(2)培养基的制作：以葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、kh2po4、氯化钠、硫酸锰和水为主要原料配制培养基，它们的质量百分比为：
[0089]
蛋白胨3.5％、酵母膏2.5％、葡萄糖3％、kh2po
4 0.5％、氯化钠0.1％、硫酸锰0.01％，水余量。
[0090]
(3)取上述xdy021菌液接种至经过高温灭菌的上述培养基中，调整起始ph至6，在100l种子罐中进行厌氧发酵5天，至终点ph为4.7，即得含贝莱斯芽孢杆菌的发酵剂。
[0091]
2.发酵底物的制备
[0092]
取广东江门鹤山桃源花生油厂的花生麸作为含蛋白下脚料；取广东广州市东鹏食品饮料有限公司的茶叶渣作为含糖下脚料；将这些原料按碳氮比15:1的比例换算称取后混合，具体物料配方见表九。
[0093]
表九：发酵底物配方
[0094]
[0095]
将上述原料混合均匀，按混合料:水的重量比1:1.2比例加水后，经过胶体磨研磨成浆状，即得发酵底物。
[0096]
4.将70l上述发酵底物至于100l发酵罐中，调整ph至6.5，加入含贝莱斯芽孢杆菌的发酵剂5l，发酵7天后至ph为4.8即达发酵终点，发酵过程为厌氧发酵，取300克发酵产物进行检测，结果如表十。
[0097]
表十：发酵产物检测结果记录
[0098]
发酵物(g)发酵物水不溶物(g)1500-2200目水不溶物占比(％)发酵物种菌数30026.3267.365.2
×
107[0099]
实施例五：
[0100]
1.含贝莱斯芽孢杆菌的发酵剂的制备：与实施例一同。
[0101]
2.发酵底物的制备
[0102]
取广东江门鹤山桃源花生油厂的花生麸作为含蛋白下脚料；取广西柳州安琪酵母厂的酵母渣作为含糖下脚料。将这些原料按碳氮比14:1的比例换算称取后混合，具体物料配方见表十一。
[0103]
表十一：发酵底物配方
[0104][0105]
将上述原料混合均匀，按混合料﹕水的重量比1﹕0.7比例加水后，经过胶体磨研磨成浆状，即得发酵底物。
[0106]
3.将70l上述发酵底物至于100l发酵罐中，调整ph至6.5，加入含贝莱斯芽孢杆菌的发酵剂5l，发酵7天后至ph为5.3即达发酵终点，发酵过程中控制通气量为0.8m3/h，保持低氧发酵状态，取300克发酵产物进行检测，结果如表十二。
[0107]
表十二：发酵产物检测结果记录
[0108]
取发酵物(g)发酵物水不溶物(g)1500-2200目水不溶物占比(％)发酵物种菌数30028.2566.572.4
×
107[0109]
试验例二
[0110]
在鹤山市新的生物制品有限公司的水蛛养殖试验场，设12个100升的水蛛培养缸，分别加入80升水，并接种1升含有水蛛种源的水后，分别添加上述实施例二至实施例五的发酵产物，添加时间为每天上午8：30，添加量为每个培养缸每天10毫升，每个实施例的培养物添加3个培养缸，每天观察水蛛的丰度，观察方法是在160倍显微镜下计算每个视野水蛛的数量(每天的个数是三个培养缸的平均数取整数)，第七天收集水蛛，用100目筛网滤干水后称重，结果见表十三所示。
[0111]
表十三：不同下脚料发酵产物培养水蛛的效果记录表
[0112]
组别第一天第二天第三天第四天第五天第六天第七天重量实施例二58183673118179323g
实施例三58163976121170315g实施例四57163680128183326g实施例五56173880131188334g
[0113]
从结果可以看出，采用不同下脚料发酵的发酵产物，培养水蛛的效果有所差异，但差异不会特别大，在实际生产中可根据原材料的来源情况确定使用哪种下脚料，还可以通过将发酵料添加不同营养元素来调整期使用效果。
[0114]
试验例三
[0115]
取实施例二至五的发酵产物各10公斤，用真空袋抽真空后封口包装，放置到40度的恒温烘箱中进行耐储存实验，储存15天后未见产品有胀气或膨胀现象，证明发酵产物中的xdy021菌种继续抑制其他产气杂菌的生长，发酵产物具有良好的耐储性和商品属性。
[0116]
试验例四
[0117]
取实施例二至四的水蛛饵料原料发酵剂各10kg，用真空袋抽真空后封口包装，放置到40度的恒温烘箱中进行耐储存实验，储存15天后未见产品有胀气或膨胀现象，证明该发酵剂中的xdy021菌继续抑制其他产气杂菌的生长，发酵剂具有良好的耐储性和商品属性。