野生型酿酒酵母单倍体子囊孢子的制备方法与流程

1.本发明涉及工业微生物技术领域，特别涉及一种野生型酿酒酵母单倍体子囊孢子的制备方法。


背景技术：

2.酵母是酿造食品中分布广泛的天然菌种，除了在发酵阶段产生醇类、酚类等成分为食品贡献特征风味外，其自溶后营养成分的释放与分解也进一步增强了食品的风味品质，其中核酸分解后可形成呈味核苷酸，为酿造食品贡献鲜味。因此高核酸含量的天然酵母有助于酿造食品风味品质提升，酿酒酵母因其安全特性，被认为是良好的风味来源。然而酿酒酵母中核酸含量一般为6％～8％，难以满足生产需要。因此，选育核酸含量高的酵母菌种就成为了食品生产工业的重要组成部分。
3.国内学者主要通过传统筛选方法进行高核酸含量菌株的筛选，并采用优化培养条件方式以提高菌株的核酸含量。该传统方式培养筛选菌株条件较苛刻，生产成本高，难以大规模生产应用。也有学者通过传统诱变育种的方法例如使用亚硝基胍(ntg)为诱变剂寻找对氯化钾敏感的变异菌株以提高菌体的核酸含量。然而由于野生型酿酒酵母的诱变菌种，往往耗时长，难以获得遗传稳定、性状优良的高核酸酿酒酵母安全菌株。
4.酿酒酵母存在双倍体和单倍体两种生命周期，酿酒酵母在两种生命周期条件下均可通过有丝分裂增殖。单倍体分为matα和mata两种配型，这两种配型的细胞在接触时会发生融合形成二倍体细胞，进而以二倍体形式通过有丝分裂增殖。但是当二倍体细胞遇到营养不良等环境压力时会发生减数分裂，形成子囊孢子，正常的野生型酿酒酵母体内的双倍体会形成4个单倍体子囊孢子，被细胞壁包被，在显微镜下呈现为菱形，称为四分孢子。酵母的孢子也是单倍体，是酵母对抗环境压力时的一种形态，单倍体子囊孢子处于休眠状态，遇丰富营养条件会复苏，形成单倍体细胞。然而野生型酵母的单倍体细胞很难稳定传代，因为体内含有ho内切酶，使得单倍体的配型在传代过程中能够自由转换。而同一培养体系中的单倍体细胞遇不同配型后极易融合形成二倍体，难以以稳定单倍体配型进行营养生长，造成野生型酵母分离获得的单倍体细胞在传代过程中极易回复为双倍体，导致诱变等育种方式获得目标菌种效率及几率大大降低。部分实验室菌株由于敲除了ho内切酶，配型变得稳定，能够获得稳定遗传的单倍体细胞，但是往往核酸含量较低，生物量不高，且经过基因改造的转基因菌株，不能安全、高效应用于食品工业产业化中。
5.李小坤、王旺等人在《常压室温等离子体(artp)诱变选育高核酸酿酒酵母》中通过诱导菌株产生单倍体子囊孢子，将孢子进一步分离培养获得单倍体细胞，以单倍体细胞为出发菌株进行诱变选育。但该研究中所用酵母产孢后多形成2个、3个孢子，标准的4个子囊孢子较少，这可能是由于细胞本身存在产孢和配型基因的缺陷，这种缺陷可能导致单倍体能够稳定存在，但存在产孢和配型基因缺陷的天然酵母并不常见。而针对4个子囊孢子较多的正常野生型酵母菌株进行单倍体分离是极为困难的，工作量大且具有偶然性，因此该方法对于筛选高核酸酿酒酵母不具备普适性。


技术实现要素：

6.为了解决营养细胞诱变效率低、野生酵母分离稳定单倍体困难的问题，本发明提供一种高效获得野生型酿酒酵母子囊孢子的方法，通过诱变子囊孢子，解决回复突变的问题，从而实现高核酸酿酒酵母菌株的快速选育。
7.为实现上述目的，本发明人进行了深入研究，并经重复多次研究论证而完成获得本发明方案，具体如下：
8.一种野生型酿酒酵母单倍体子囊孢子的制备方法，所述制备方法包括将野生型酿酒酵母经过液态培养基培养和固态培养基进行诱导的步骤；
9.所述液态培养基包含水以及8g/l～12g/l酵母粉、18g/l～22g/l蛋白胨和18g/l～22g/l葡萄糖；
10.所述固态培养基包含水以及18g/l～22g/l钾盐、0g/l～0.15g/l氨基酸和18g/l～22g/l琼脂，所述氨基酸包含甘氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、l
‑
组氨酸、l
‑
胱氨酸和天冬氨酸中的至少一种，所述钾盐包含醋酸钾和磷酸氢二钾中的至少一种。
11.在某些实施方案中，所述氨基酸包含甘氨酸、赖氨酸、蛋氨酸和丝氨酸中的至少一种。
12.在某些实施方案中，所述固态培养基包含水以及18g/l～22g/l醋酸钾和18g/l～22g/l琼脂。
13.在某些实施方案中，所述固态培养基包含水以及18g/l～22g/l醋酸钾、0.08g/l～0.15g/l甘氨酸和18g/l～22g/l琼脂。
14.在某些实施方案中，所述固态培养基包含水以及18g/l～22g/l醋酸钾、0.08g/l～0.15g/l赖氨酸和18g/l～22g/l琼脂。
15.在某些实施方案中，所述固态培养基包含水以及18g/l～22g/l醋酸钾、0.08g/l～0.15g/l蛋氨酸和18g/l～22g/l琼脂。
16.在某些实施方案中，所述固态培养基包含水以及18g/l～22g/l醋酸钾、0.08g/l～0.15g/l丝氨酸和18g/l～22g/l琼脂。
17.在某些实施方案中，所述固态培养基包含水以及8g/l～11g/l醋酸钾、8g/l～11g/l磷酸氢二钾和18g/l～22g/l琼脂。
18.在某些实施方案中，诱导的条件包括：温度为25℃～30℃，时长为48h～96h，静态。
19.在某些实施方案中，所述野生型酿酒酵母的保藏编号为gdmcc no.61173。
20.与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：
21.本发明提供了一种野生酿酒酵母单倍体子囊孢子培养体系，即先将野生酿酒酵母置于合适的液态培养基中培养再转移至合适的固态培养基中诱导，采用该培养体系，单倍体子囊孢子产孢率高，且主要为四分孢子。该方法简单易行，促进了微生物育种的发展。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
23.图1为本发明一个实施例的实验路线图；
24.图2为本发明一个实施例中酿酒酵母菌zb419 pcr分型结果图；
25.图3为本发明一个实施例的y2
‑
3四分孢子示意图。
26.本发明实施例涉及的酿酒酵母，命名为酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)zb419，该菌株已于2020年9月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no.61173，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510070。该菌株于2020年9月1日由保藏中心收到并登记入册，经保藏中心于2020年9月2日检测为存活菌株。
27.本发明实施例所涉酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb420已于2020年9月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no.61174，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510070。该菌株于2020年9月1日由保藏中心收到并登记入册，经保藏中心于2020年9月2日检测为存活菌株。
具体实施方式
28.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
29.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
30.本发明提供一种野生型酿酒酵母单倍体子囊孢子的制备方法，所述制备方法包括将野生型酿酒酵母经过液态培养基培养和固态培养基进行诱导的步骤；
31.所述液态培养基包含水以及8g/l～12g/l酵母粉、18g/l～22g/l蛋白胨和18g/l～22g/l葡萄糖；
32.所述固态培养基包含水以及18g/l～22g/l钾盐、0g/l～0.15g/l氨基酸和18g/l～22g/l琼脂，所述氨基酸包含甘氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、l
‑
组氨酸、l
‑
胱氨酸和天冬氨酸中的至少一种，所述钾盐包含醋酸钾和磷酸氢二钾中的至少一种。
33.在其中一个示例中，所述氨基酸包含甘氨酸、赖氨酸、蛋氨酸和丝氨酸中的至少一种。
34.在其中一个示例中，所述固态培养基包含水以及18g/l～22g/l醋酸钾和18g/l～22g/l琼脂。
35.在其中一个示例中，所述固态培养基包含水以及18g/l～22g/l醋酸钾、0.08g/l～0.15g/l甘氨酸和18g/l～22g/l琼脂。
36.在其中一个示例中，所述固态培养基包含水以及18g/l～22g/l醋酸钾、0.08g/l～0.15g/l赖氨酸和18g/l～22g/l琼脂。
37.在其中一个示例中，所述固态培养基包含水以及18g/l～22g/l醋酸钾、0.08g/l～0.15g/l蛋氨酸和18g/l～22g/l琼脂。
38.在其中一个示例中，所述固态培养基包含水以及18g/l～22g/l醋酸钾、0.08g/l～0.15g/l丝氨酸和18g/l～22g/l琼脂。
39.在其中一个示例中，所述固态培养基包含水以及8g/l～11g/l醋酸钾、8g/l～11g/l磷酸氢二钾和18g/l～22g/l琼脂。
40.在其中一个示例中，诱导的条件包括：温度为25℃～30℃(例如25℃、28℃、30℃、32℃、35℃)，时长为48h～96h(例如48h、55h、60h、65h、70h、75h、80h、85h、90h、95h)，静态。
41.可以理解的是，本发明所述野生型酿酒酵母包括但不限于保藏编号为gdmcc no.61173的野生型酿酒酵母。
42.本发明提供的上述方法，单倍体子囊孢子产孢率高，通过上述方法获得的大量的四分孢子，可用于酵母的诱变育种。为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。本发明的实验路线图参见图1：
43.(1)出发菌株的活化：将保藏的酿酒酵母菌种划线接种于ypd培养基上，置于培养箱30℃恒温培养72h。
44.(2)确定最佳产孢条件：将出发菌株分别接种到培养基中，通过调整培养基的固、液状态，确定将所述菌体接种至ypd液态培养基进行液态培养，然后再转移至醋酸钾固态培养基进行固态诱导为产生子囊孢子最佳产孢方式。
45.(3)单孢子菌悬液制备：收集产孢成熟的菌体，加入5ml无菌水后加入1ml lyticase buffer，20μl lyticase，37℃裂解2h～3h，镜检至子囊孢子完全分散，继续用超声破碎仪进行间歇式超声波裂解1h，通过缓冲液洗涤后制得浓度约为107cfu/ml单孢子悬浮液。
46.(4)artp诱变：用移液枪吸取10μl单倍体子囊孢子悬液滴加至载片中央，用无菌镊子将载片放于放在artp系统操作室旋转台上的对应孔位，并对其进行artp诱变处理，诱变时间30s～120s为所确定的最佳诱变时间。
47.(5)诱变单孢子培养：将制备好的单倍体子囊孢子悬液利用aptp在最佳诱变时间下诱变后，将诱变后孢子悬液用无菌生理盐水重悬后制成稀释液，然后将稀释液涂布在ypd固态培养基平板上，30℃培养48h后计数。
48.(6)氯化钾易感菌株初筛：将上述单菌落进行平板划线分离纯化后，分别接种在麦芽汁平板培养基和含氯化钾的麦芽汁平板培养基上，挑选出在麦芽汁平板培养基能够正常生长，而在含氯化钾的麦芽汁平板培养基上菌斑薄而透明的菌株进入下一轮筛选中。
49.(7)高核酸菌株高通量复筛：将上述初筛获得的氯化钾易感菌株采用24孔微孔板培养，然后采用高氯酸法测定每个菌株平台期的核酸含量，筛选出生长较好且核酸含量明显提升的菌株进行摇瓶验证。
50.(8)高核酸菌株摇瓶验证：对上述经微孔板高通量复筛获得的菌株通过平板划线纯化后，采用摇瓶培养6h～8h，通过高氯酸法来测定所筛选菌株产核酸能力，核酸含量高的菌株即为高产菌株。
51.(9)遗传稳定培养：将高产核酸菌株进行传代培养十代，再进行发酵培养。
52.采用以上方案，具有以下有益效果：1.本发明中的菌株属于酿酒酵母菌，通过提高其产孢效率、分离单倍体子囊孢子、对单倍体子囊孢子进行artp诱变、建立完整的氯化钾筛选体系以及高通量筛选方法选育出遗传性稳定的高核酸酿酒酵母菌株，安全性好，可直接应用在医药、食品、农业、化妆品等领域。2.本发明中提供了野生酿酒酵母单倍体子囊孢子分离、诱变及筛选体系，该方法简单易行，诱变效率高，大幅提升了酿酒酵母的最高致死时
间，正突变率由0％～0.81％提升至7％～30％，并且对其他微生物的诱变与筛选具有普适性，促进了微生物育种的发展。3.采用本发明方法获得的酿酒酵母菌菌株具有生长旺盛，遗传稳定性良好的特点，生产核酸的性能保持稳定，解决了目前酵母核酸含量低，工业化生产成本高的难题，将极大的推动核酸产业的发展。
53.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
54.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
55.下述实施例中，所述百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。
56.实施例1、野生型酿酒酵母获得、配型鉴定
57.本发明实施例采用的出发菌株为野生型酿酒酵母y2
‑
3，该菌株是从佛山海天(高明)调味食品有限公司的酒醅中分离获得，通过真核生物18s通用引物扩增并测序获得18s全长序列如下seq id no.1所示：
[0058]5’‑
atttatacagtgaaactgcgaatggctcattaaatcagttatcgtttatttgatagttcctttactacatggtataactgtggtaattctagagctaatacatgcttaaaatctcgaccctttggaagagatgtatttattagataaaaaatcaatgtcttcggactctttgatgattcataataacttttcgaatcgcatggccttgtgctggcgatggttcattcaaatttctgccctatcaactttcgatggtaggatagtggcctaccatggtttcaacgggtaacggggaataagggttcgattccggagagggagcctgagaaacggctaccacatccaaggaaggcagcaggcgcgcaaattacccaatcctaattcagggaggtagtgacaataaataacgatacagggcccattcgggtcttgtaattggaatgagtacaatgtaaataccttaacgaggaacaattggagggcaagtctggtgccagcagccgcggtaattccagctccaatagcgtatattaaagttgttgcagttaaaaagctcgtagttgaactttgggcccggttggccggtccgattttttcgtgtactggatttccaacggggcctttccttctggctaaccttgagtccttgtggctcttggcgaaccaggacttttactttgaaaaaattagagtgttcaaagcaggcgtattgctcgaatatattagcatggaataatagaataggacgtttggttctattttgttggtttctaggaccatcgtaatgattaatagggacggtcgggggcatcagtattcaattgtcagaggtgaaattcttggatttattgaagactaactactgcgaaagcatttgccaaggacgttttcattaatcaagaacgaaagttaggggatcgaagatgatcagataccgtcgtagtcttaaccataaactatgccgactagggatcgggtggtgtttttttaatgacccactcggcaccttacgagaaatcaaagtctttgggttctggggggagtatggtcgcaaggctgaaacttaaaggaattgacggaagggcaccaccaggagtggagcctgcggcttaatttgactcaacacggggaaactcaccaggtccagacacaataaggattgacagattgagagctctttcttgattttgtgggtggtggtgcatggccgttcttagttggtggagtgatttgtctgcttaattgcgataacgaacgagaccttaacctactaaatagtggtgctagcatttgctggttatccacttcttagagggactatcggtttcaagccgatggaagtttgaggcaataacaggtctgtgatgcccttagacgttctgggccgcacgcgcgctacactgacggagccagcgagtctaaccttggccgagaggtcttggtaatcttgtgaaactccgtcgtgctggggatagagcattgtaattattgctcttcaacgaggaattcctagtaagcgcaagtcatcagcttgcgttgattacgtccctgccctttgtacacaccgcccgtcgctagtaccgattgaatggcttagtgaggcctcaggatctgcttagagaagggggcaactccatctcagagcggagaatttggacaaa
‑3’
[0059]
将上述18s序列在ncbi数据库进行blast比对，其与数据库中已知酿酒酵母18s序列的相似度为100％，因此y2
‑
3菌株鉴定为酿酒酵母，命名为酿酒酵母菌zb419，所述酿酒酵母菌zb419已于2020年9月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no.61173，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
[0060]
酿酒酵母菌zb419经过pcr分型，为典型的二倍体细胞，见图2，所用引物见表1。经
过醋酸钾产孢培养基诱导后产生的子囊孢子呈现典型的四面体结构，90％以上含有4个子囊孢子，见图3。
[0061]
表1、引物信息
[0062][0063][0064]
实施例2、不同产孢方式的产孢率比较
[0065]
将酿酒酵母菌y2
‑
3作为出发菌株进行诱导产孢，本实施例主要采取以下三种方式：固态培养转固态诱导产孢(s
‑
s组)、液态培养转液态诱导产孢(l
‑
l组)、液态培养转固态诱导产孢(l
‑
s组)，比较不同产孢方式下的产孢率(％)。
[0066]
方式一、固态培养转固态诱导产孢(编号为s
‑
s组)
[0067]
将野生型酿酒酵母y2
‑
3接种到ypd固态培养基平板上，30℃静态培养20h后，至od
600
约为20，收集5ml菌体，水洗两次后，用0.2ml醋酸钾溶液(醋酸钾浓度为20g/l)重悬，将菌落转移至醋酸钾固态培养基平板上诱导产孢，诱导产孢条件为，30℃静态诱导培养72h。
[0068]
ypd固态培养基含有：酵母粉10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l，琼脂20g/l以及水。
[0069]
醋酸钾固态培养基含有：醋酸钾20g/l，琼脂20g/l，以及水。
[0070]
重复该步骤操作4次，分别记作“实验1”、“实验2”、“实验3”以及“实验4”，观察并统计产孢情况。
[0071]
方式二、液态培养转液态诱导产孢(编号为l
‑
l组)
[0072]
将野生型酿酒酵母y2
‑
3接种至ypd液态培养中培养20h，至od
600
约为20，收集5ml菌体，采用无菌蒸馏水水洗两次去除培养基后，用0.2ml醋酸钾溶液(醋酸钾浓度为20g/l)重悬，并转移至醋酸钾液态培养基中进行诱导产孢，诱导产孢条件为，30℃震荡培养72h。
[0073]
ypd液态培养基含有：酵母粉10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l，以及水。
[0074]
醋酸钾液态培养基含有：醋酸钾20g/l，以及水。
[0075]
重复该步骤操作4次，分别记作“实验1”、“实验2”、“实验3”以及“实验4”，观察并统计产孢情况。
[0076]
方式三、液态培养转固态诱导产孢(编号为l
‑
s组)
[0077]
将野生型酿酒酵母y2
‑
3菌株接种至ypd液态培养基中培养20h，至od
600
约为20，收集5ml菌体，采用无菌蒸馏水水洗两次后，用0.2ml醋酸钾溶液(醋酸钾浓度为20g/l)重悬，并将重悬后的菌液均匀铺至醋酸钾固态培养基平板上，30℃诱导培养72h。参照该操作，设置30℃诱导培养24h的l
‑
s组。
[0078]
重复该步骤操作4次，分别记作“实验1”、“实验2”、“实验3”以及“实验4”，观察并统计产孢情况。
[0079]
产孢率：酵母孢子细胞是指一个子囊壳中包含不少于一个孢子的细胞即为孢子细胞。产孢率是指在光学显微镜下观察统计孢子细胞的百分比，每个处理随机选择5个视野进行统计。
[0080]
产孢率(％)＝a/n
×
100％；
[0081]
其中，a：显微镜视野中孢子细胞总数，n为显微镜视野中酵母细胞总数。
[0082]
表2、不同产孢诱导方式对酵母产孢率影响
[0083][0084]
上述测试结果表明：l
‑
s组24小时产孢率在50％以上，72小时产孢率在70％以上，产孢率具有显著的优势，因此，本发明方案采用液态培养转固态诱导产孢，确保诱导前获得大量的单倍体子囊孢子。固态培养转固态诱导产孢(s
‑
s组)的产孢率较低，产孢率在40％以下。液态培养转液态诱导产孢(l
‑
l组)产孢率在40％～60％。
[0085]
实施例3、出发菌株二倍体营养细胞与单倍体子囊孢子artp诱变比较
[0086]
对酿酒酵母y2
‑
3菌株的二倍体营养细胞和酿酒酵母y2
‑
3的单倍体子囊孢子分别进行artp诱变，对比酿酒酵母y2
‑
3的二倍体营养细胞和酿酒酵母y2
‑
3的单倍体子囊孢子在artp诱变过程中的最高致死时间和正突变率。
[0087]
artp诱变包括如下步骤：
[0088]
(1)二倍体营养细胞的获得：
[0089]
将酿酒酵母y2
‑
3菌株接种至ypd液态培养基中于30℃恒温条件下进行过夜培养，收集菌体，用无菌水水洗两次后，采用无菌水稀释成浓度为107cfu/ml～108cfu/ml的二倍体营养细胞悬液，备用。
[0090]
ypd液态培养基含有：酵母粉10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l，以及水。
[0091]
(2)单倍体子囊孢子的获得：
[0092]
采用纯固态诱导产孢(s
‑
s组)的方式、纯液态诱导产孢(l
‑
l组)方式、液态转固态诱导产孢(l
‑
s组)方式，将酿酒酵母y2
‑
3菌株诱导产孢，收集已产孢菌体，采用无菌水水洗两次后加入1ml lyticase buffer，20μl lyticase，37℃裂解2h～3h，镜检至孢子完全分散，继续用超声破碎仪进行间歇式超声波裂解1h，超声波功率为162.5w，每隔5s进行超声波处理，每次超声波处理时间为70min。通过洗涤缓冲液洗涤4～6次后，采用诱变缓冲液稀释成浓度为107cfu/ml单倍体子囊孢子悬液，备用。
[0093]
洗涤缓冲液包含0.25％(v/v)吐温80和0.25％(v/v)tritonx
‑
100，能够进一步去除营养细胞，使孢子充分分散。
[0094]
诱变缓冲液包含0.3％(v/v)tritonx
‑
100、0.25％(v/v)甘油和150μm甜菜碱。
[0095]
(3)artp诱变：
[0096]
分别取10μl单倍体子囊孢子悬液和二倍体营养细胞悬液，在120w功率以及10m3/h
氦气通气量的条件下分别诱变0s、5s、10s、20s、30s、40s、50s、60s、90s、120s的时间，经过诱变后的菌液按照10倍梯度稀释法用无菌生理盐水进行重悬，制成菌体稀释液，然后将不同稀释梯度的菌体稀释液分别涂布于ypd固态培养基平板上，30℃培养2天后，选择菌落数目位于30～300之间的稀释梯度(n)，计数(a)。
[0097]
存活率(％)＝a
×
n/(a0
×
n0)
×
100％；
[0098]
其中：a为诱变菌液计数平板菌落数，n为诱变菌液计数平板稀释梯度，a0为未经诱变菌液计数平板菌落数，n0为未经诱变菌液计数平板稀释梯度。
[0099]
(4)kcl敏感突变体的筛分：
[0100]
根据核酸含量高的酵母菌对高浓度的kcl更为敏感，具有在含氯化钾的固态培养基上生长受限的特征，根据该特性筛选正突变酿酒酵母菌株。将诱变后菌株(计数为b)使用无菌生理盐水重悬后，分别滴在麦芽汁固态培养基平板和含氯化钾的麦芽汁固态培养基平板上进行筛分，对筛分得到的结果进行正突变率和致死率统计(表3、表4)。
[0101]
麦芽汁固态培养基含有：麦芽膏粉130g/l，氯霉素0.1g/l，琼脂20g/l，水，调ph为5.4～5.8。
[0102]
含氯化钾的麦芽汁固态培养基含有：麦芽膏粉130g/l，氯霉素0.1g/l，氯化钾100g/l，琼脂20g/l，水，调ph为5.4～5.8。
[0103]
36h后对比观察两种平板上菌体的生长情况，在麦芽汁固态培养基平板能够正常生长，但是在含氯化钾的麦芽汁固态培养基平板上生长不佳(表现为菌斑薄而透明)的菌株，即为l
‑
s组氯化钾敏感性菌株，称为正突变菌株，正突变菌株计数为m，筛选菌株总数计数为b。正突变率(％)＝m/b
×
100％；
[0104]
其中：m为正突变菌株计数，b为筛选菌株总数。
[0105]
表3、不同处理时间下二倍体营养细胞的正突变率、致死率
[0106][0107]
表4、不同产孢方式诱变后的致死率和正突变率
[0108][0109][0110]
由表3和表4结果可知，野生酿酒酵母y2
‑
3的单倍体子囊孢子的最高致死时间为120s，远高于其二倍体营养细胞的最高致死时间30s。致死率随artp诱变时间的增加而提高，对于单倍体子囊孢子来说，致死率越高，正突变率越高。而对于二倍体营养细胞来说，5s内，致死率及正突变率均较低，超过5s，致死率逐渐增加，但正突变率为0％。对野生酿酒酵母y2
‑
3单倍体子囊孢子进行诱变具有显著的正突变率优势。
[0111]
由表4可知，液态培养转固态诱导产孢(l
‑
s组)的产孢率提升后，其单倍体子囊孢子的诱变质量得到明显的提升。l
‑
s组的产孢率为78.9％的最高致死时间为120s，明显高于s
‑
s组产孢率为36.4％的最高致死时间90s。l
‑
s组的产孢率为78.9％的致死率随artp诱变时间的增加而提高，致死率越高，正突变率越高，正突变率可达30％，显著高于s
‑
s组的正突变率。这是由于单倍体子囊孢子单条染色体发生诱变后无互补染色体补救，更容易产生明显的性状改变。因此本实施例中提供的采用单倍体子囊孢子artp诱变效果明显高于采用二倍体营养细胞的诱变效果。
[0112]
实施例4、产孢培养基
[0113]
确定产孢方式和子囊孢子诱变优势后，在此基础上进一步优化产孢固态培养基，以提升产孢效率，获得最佳诱变效果。培养基及配方如下：
[0114]
配方一：2％(w/v)醋酸钾，0.01％(w/v)天冬氨酸，2％(w/v)琼脂；
[0115]
配方二：2％(w/v)醋酸钾，0.01％(w/v)l
‑
胱氨酸，2％(w/v)琼脂；
[0116]
配方三：2％(w/v)醋酸钾，0.01％(w/v)甘氨酸，2％(w/v)琼脂；
[0117]
配方四：2％(w/v)醋酸钾，0.01％(w/v)l
‑
组氨酸，2％(w/v)琼脂；
[0118]
配方五：2％(w/v)醋酸钾，0.01％(w/v)赖氨酸，2％(w/v)琼脂；
[0119]
配方六：2％(w/v)醋酸钾，0.01％(w/v)蛋氨酸，2％(w/v)琼脂；
[0120]
配方七：2％(w/v)醋酸钾，0.01％(w/v)丝氨酸，2％(w/v)琼脂；
[0121]
配方八：2％(w/v)醋酸钾，0.01％(w/v)酪氨酸，2％(w/v)琼脂；
[0122]
配方九：2％(w/v)草氨酸，2％(w/v)琼脂；
[0123]
配方十：1％(w/v)醋酸钾，1％(w/v)磷酸氢二钾，2％(w/v)琼脂；
[0124]
配方十一：双层平板，下层：2％(w/v)琼脂15ml；上层：2％(w/v)醋酸钾，2％(w/v)琼脂，15ml；
[0125]
配方十二：双层平板，下层：2％(w/v)醋酸钾，2％(w/v)琼脂，15ml。上层：2％(w/v)琼脂15ml；
[0126]
对照培养基一：0.1％(w/v)醋酸钾，0.05％(w/v)醋酸锌，0.01％(w/v)l
‑
组氨酸；
[0127]
对照培养基二：(mcclary培养基)：0.1％(w/v)葡萄糖，0.18％(w/v)氯化钾，0.82％醋酸钠，0.25％(w/v)酵母膏；
[0128]
依照实施例2中提供的产孢方法，将野生型酿酒酵母y2
‑
3在上述培养基上进行产孢实验，30℃诱导培养72h后，计算产孢率，计算方法同实施例2。
[0129]
表5、不同培养基产孢效率对比
[0130]
[0131][0132]
配方三、五、七和十相比实施例2均体现出产孢率提升，尤其是配方五和配方七，产孢率分别达到85.6％和83.23％，相比常用产孢培养基对照一和对照二，产孢率具有明显优势，为有效诱变提供大量孢子。
[0133]
实施例5、目标菌株筛选
[0134]
(1)诱导产孢培养：
[0135]
将野生型酿酒酵母y2
‑
3菌株采用实施例4所述最优方案进行产孢。
[0136]
(2)单倍体子囊孢子悬液制备：
[0137]
单倍体子囊孢子悬液制备采用最佳产孢方式进行。
[0138]
(3)artp诱变：
[0139]
取10μl单倍体子囊孢子悬液，在120w功率以及10m3/h氦气通气量的条件下分别诱变0s、5s、10s、20s、30s、40s、50s、60s、90s、120s的时间，经过诱变后的菌液按照10倍梯度稀释法用无菌生理盐水进行重悬，制成菌体稀释液，然后将不同稀释梯度的菌体稀释液分别涂布于ypd固态培养基平板上，30℃培养2天后，选择菌落数目位于30～300之间的稀释梯度(n)，计数(a)。
[0140]
(4)氯化钾敏感性菌株初筛
[0141]
将所有诱变后的菌株分别在麦芽汁固态培养基平板和含氯化钾的麦芽汁固态培养基平板上，每隔12h对比二者生长情况，前24h的含氯化钾的固态培养基平板菌落生长缓慢，无明显生长差异性，36h后生长差异性开始显现，可以通过两种平板上的生长差异判断菌株是否为氯化钾敏感性菌株。在麦芽汁固态培养基平板能够正常生长，但是在含氯化钾的麦芽汁固态培养基平板上生长不佳(表现为菌斑薄而透明)的菌株，即为氯化钾敏感性菌株，通过该方法共初筛出170株氯化钾敏感性菌株。
[0142]
(5)目标菌株微孔板通量复筛
[0143]
将上述初筛获得的170株氯化钾敏感性菌株，采用24孔微孔板培养，然后采用高氯酸法测定每个菌株平台期的核酸含量，每个样品培养两份，一份用于检测核酸含量，另一份用于称重。
[0144]
高氯酸法测定核酸含量方法为：收集转接培养6h～8h酵母发酵液，吸取6份1ml的
菌液，其中3份测核酸含量，另外3份烘干测干重；将1ml菌液于8000rpm离心2min离心收集菌体，并用无菌水洗涤2次，用枪头吸干水分。菌体加1ml 0.5m高氯酸，充分重悬后，72℃水浴加热15min，期间每隔2min颠倒混匀一次，加热后1000rpm离心10min，取0.5ml上清加入4.5ml无菌水中稀释后，用分光光度计在260nm处测定核酸浓度，并用无菌水做空白，得到吸光值后计算rna含量。
[0145]
rna含量＝(a
×
660)/(m
×
800)
×
100％；
[0146]
其中：a为rna浓度，m为菌体细胞干重。
[0147]
通过该方法筛选出生长较好且核酸含量明显提升的31个菌株进行摇瓶测试。
[0148]
(6)摇瓶检测的高核酸含量菌株筛选
[0149]
对上述经微孔板通量复筛获得的31株菌株，采用摇瓶培养并用高氯酸法测定培养6h～8h酵母发酵液的菌液浓度与核酸含量，最终筛选出核酸含量提升显著的七株菌，编号分别为a11、a12、f6、3、6、19、26。这些菌生长较好且核酸含量提升20％以上，其中a11(保藏命名为酿酒酵母菌zb420)生长最好且核酸含量提高25％以上。
[0150]
表6、复筛菌株核酸含量
[0151]
样品名核酸含量(％)核酸含量占原来百分比(％)y2
‑
319.16100％a1124.87129.80％a1223.67123.53％f623.87124.58％323.36121.94％623.47122.51％1923.32121.73％2622.99120.01％
[0152]
酿酒酵母菌zb420保藏信息如下：
[0153]
所述酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb420已于2020年9月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no.61174，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
[0154]
酿酒酵母菌zb420的形态特征包括：在ypd培养基上单个菌落形态为圆形，边缘整齐，有明显突出，菌落为乳白色，表面有光泽，透明度较差，质地光滑湿润；该菌在显微镜下细胞形态较大，呈椭球形，芽殖，且分散均匀。
[0155]
实施例6、传代稳定性测试
[0156]
将酿酒酵母菌zb420接种在ypd平板上，连续传代10代，传代培养条件为：30℃培养24小时，观察并记录各代菌株的生长情况，并将第1代、第5代和第10代传代菌株按照高氯酸法进行核酸含量测试，得到各代菌株的核酸含量的数据如下表：
[0157]
表7、连续传10代后菌株的生产核酸性能
[0158]
传代数1代5代10代核酸含量(％)24.8725.1624.92
[0159]
表中结果显示，各代菌种接种于ypd培养基，第1代、5代、10代之间的核酸含量误差在10％误差范围内，表明酿酒酵母zb420产核酸能力保持稳定，具有良好的传代稳定性，适
合工业化应用。
[0160]
实施例7、酿酒酵母zb420菌株的发酵应用
[0161]
将酿酒酵母zb420和野生型酿酒酵母y2
‑
3(出发菌株)应用于酱油发酵体系，对比二者对于原油风味品质的贡献。
[0162]
在酱油发酵中期分别以106cfu/ml浓度将两种菌株添加至发酵体系，分别为y2
‑
3组、zb420组。对照组为酱油发酵中期不进行接种处理。
[0163]
选择10名具有丰富经验的鉴评人员对发酵所得原油进行感官鉴评，结果如表8所示。
[0164]
结果表明：添加zb420和原始菌株y2
‑
3后原油的鲜度和综合口感均有提升，且zb420回添原油相比y2
‑
3回添原油鲜味和综合口感更佳。
[0165]
表8、添加酿酒酵母zb420和野生型酿酒酵母y2
‑
3的原油感官分析
[0166][0167][0168]
注：每项评定满分5分，每0.5分为间隔，评分越高代表该项指标越好，0～2.5分代表不可接受，2.5～5分代表可接受。表8中显示数值为10位鉴评员打分的平均值。
[0169]
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0170]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0171]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。