一种黄芪不定根的诱导与培养方法与流程

1.本发明公开了一种黄芪不定根的诱导与培养方法，属于中药黄芪组织培养领域。


背景技术：

2.黄芪是豆科黄芪属多年生草本植物，主根入药。黄芪为中药上品，药用历史悠久，临床应用十分广泛。现代药理研究表明，黄芪具有补气固表，利尿脱毒，敛疮生肌，益气补中之功效，可促进机体的体液免疫和细胞免疫。目前随着保健药日益畅销，黄芪的用药量越来越大，天然资源甚感缺乏,加之黄芪用种子繁殖从播种到收获一般要4
‑
5年，而且出苗率很低(30％
‑
40％)，病虫害影响严重，使品质和产量均有所下降。利用组织培养方法生产黄芪的活性成分具有很大的发展前景，可以解决国内外市场之需求。目前已有移栽、扦插、愈伤诱导等研究，但上述方法植株生长周期较长或活性成分含量较低且目前，尚未有较为完整详细的黄芪不定根诱导及培养方法的报道。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种快速可行，均一的培养物，可以工业化生产、黄芪甲苷等含量高的黄芪不定根的诱导与培养方法，为黄芪活性成分提取提供充足原料。
4.本发明的技术方案概述如下：
5.一种黄芪不定根的诱导与培养方法，包括如下步骤：
6.1)黄芪无菌苗的培养；
7.将灭菌的黄芪种子接种于无菌苗培养基上，在20
‑
30℃，每天12
‑
16小时光照，光照强度1000
‑
2000lux，8
‑
12小时黑暗，培养10
‑
20天，得黄芪无菌苗；
8.2)愈伤的诱导：将黄芪无菌苗的下胚轴切下接种于愈伤诱导培养基上，并在20
‑
30℃，黑暗中培养，长出愈伤组织；
9.3)不定根的诱导：将步骤2)获得的愈伤组织转接到不定根诱导培养基中，20
‑
30℃暗培养30
‑
40天长出不定根；
10.4)不定根的培养：将步骤3)获得的不定根切下接到生长培养基中，生长30
‑
40天为第一次不定根培养，再将第一次不定根培养获得的不定根转接到新的生长培养基中继续培养，收获；
11.所述无菌苗培养基用下述方法制成：
12.在ms培养基中加入6
‑
苄氨基嘌呤使终浓度为1.0
‑
2.0mg/l、加入吲哚丁酸使终浓度为0.15
‑
0.3mg/l、加入蔗糖使终浓度为20
‑
30g/l，加入琼脂使终浓度为6
‑
10g/l；调节ph为5.8
‑
6.0；
13.所述愈伤诱导培养基用下述方法制成：
14.在ms培养基中加入2,4
‑
二氯苯氧乙酸使终浓度为0.1
‑
2.0mg/l，加入6
‑
苄氨基嘌呤使终浓度为0.1
‑
1.0mg/l，加入蔗糖使终浓度为20
‑
30g/l，加入琼脂使终浓度为6
‑
10g/l；
调节ph为5.8
‑
6.0；
15.所述不定根诱导培养基用下述方法制成：
16.在ms培养基中加入吲哚丁酸使终浓度为0.5
‑
2.0mg/l，加入蔗糖使终浓度为20
‑
30g/l，加入琼脂使终浓度为6
‑
10g/l；调节ph为5.8
‑
6.0；
17.所述生长培养基用下述方法制成：
18.在ms培养基中加入吲哚丁酸使终浓度为2.0
‑
6.0mg/l，加入激动素使终浓度为0.2
‑
0.6mg/l，加入蔗糖使终浓度为20
‑
30g/l；调节ph为5.5
‑
5.8。
19.本发明的优点：
20.本发明的方法得到黄芪不定根具有过程简单，诱导率高，不定根增殖快、产量大、生产周期短、耗能少的特点且能够实现大规模生产，有效的解决了黄芪工业化提取有效成分对原料的需求与野生资源保护之间的矛盾。
具体实施方式
21.下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
22.各实施例使用的黄芪种子为购自内蒙古黄芪生产基地的内蒙黄芪的种子，但对本发明不进行限定。
23.实施例1
24.无菌苗培养基用下述方法制成：
25.在ms培养基中加入6
‑
苄氨基嘌呤使终浓度为1.0mg/l、加入吲哚丁酸使终浓度为0.15mg/l、加入蔗糖使终浓度为20g/l，加入琼脂使终浓度为6g/l；调节ph为5.8；
26.实施例2
27.无菌苗培养基用下述方法制成：
28.在ms培养基中加入6
‑
苄氨基嘌呤使终浓度为2.0mg/l、加入吲哚丁酸使终浓度为0.3mg/l、加入蔗糖使终浓度为30g/l，加入琼脂使终浓度为10g/l；调节ph为6.0；
29.实施例3
30.无菌苗培养基用下述方法制成：
31.在ms培养基中加入6
‑
苄氨基嘌呤使终浓度为1.5mg/l、加入吲哚丁酸使终浓度为0.2mg/l、加入蔗糖使终浓度为30g/l，加入琼脂使终浓度为7g/l；调节ph为6.0；
32.实施例4
33.愈伤诱导培养基用下述方法制成：
34.在ms培养基中加入2,4
‑
二氯苯氧乙酸使终浓度为0.5mg/l，加入6
‑
苄氨基嘌呤使终浓度为0.1mg/l，加入蔗糖使终浓度为20g/l，加入琼脂使终浓度为6g/l；调节ph为5.8；
35.实施例5
36.愈伤诱导培养基用下述方法制成：
37.在ms培养基中加入2,4
‑
二氯苯氧乙酸使终浓度为2.0mg/l，加入6
‑
苄氨基嘌呤使终浓度为1.0mg/l，加入蔗糖使终浓度为30g/l，加入琼脂使终浓度为8g/l；调节ph为6.0；
38.实施例6
39.愈伤诱导培养基用下述方法制成：
40.在ms培养基中加入2,4
‑
二氯苯氧乙酸使终浓度为1.0mg/l，加入6
‑
苄氨基嘌呤使
终浓度为0.5mg/l，加入蔗糖使终浓度为30g/l，加入琼脂使终浓度为10g/l；调节ph为6.0；
41.实施例7
42.不定根诱导培养基用下述方法制成：
43.在ms培养基中加入吲哚丁酸使终浓度为0.5mg/l，加入蔗糖使终浓度为20g/l，加入琼脂使终浓度为6g/l；调节ph为5.8；
44.实施例8
45.不定根诱导培养基用下述方法制成：
46.在ms培养基中加入吲哚丁酸使终浓度为2.0mg/l，加入蔗糖使终浓度为30g/l，加入琼脂使终浓度为8g/l；调节ph为6.0；
47.实施例9
48.不定根诱导培养基用下述方法制成：
49.在ms培养基中加入吲哚丁酸使终浓度为1.0mg/l，加入蔗糖使终浓度为30g/l，加入琼脂使终浓度为10g/l；调节ph为6.0；
50.实施例10
51.生长培养基用下述方法制成：
52.在ms培养基中加入吲哚丁酸使终浓度为2.0mg/l，加入激动素使终浓度为0.2mg/l，加入蔗糖使终浓度为20g/l；调节ph为5.5。
53.实施例11
54.生长培养基用下述方法制成：
55.在ms培养基中加入吲哚丁酸使终浓度为6.0mg/l，加入激动素使终浓度为0.6mg/l，加入蔗糖使终浓度为30g/l；调节ph为5.8。
56.实施例12
57.生长培养基用下述方法制成：
58.在ms培养基中加入吲哚丁酸使终浓度为4.0mg/l，加入激动素使终浓度为0.5mg/l，加入蔗糖使终浓度为30g/l；调节ph为5.8。
59.实施例13
60.一种黄芪不定根的诱导与培养方法，包括如下步骤：
61.1)黄芪无菌苗的培养；
62.黄芪种子灭菌：将黄芪种子用自来水冲洗干净后，选择饱满的黄芪种子于30℃的温水中浸泡4h，采用体积分数为75％的乙醇水溶液冲洗20s、体积分数为4％次氯酸钠水溶液浸泡5min以消毒灭菌，无菌水冲洗3次；
63.将灭菌的黄芪种子接种于无菌苗培养基(实施例1制备)上，在20℃，每天16小时光照，光照强度1000lux，8小时黑暗，培养20天，得黄芪无菌苗；
64.2)愈伤组织的诱导：将黄芪无菌苗的下胚轴切下接种于愈伤诱导培养基(实施例4制备)上，并在20℃，黑暗中培养，长出愈伤组织；
65.3)不定根的诱导：将步骤2)获得的愈伤组织转接到不定根诱导培养基(实施例7制备)上，20℃暗培养(促进不定根增殖)约40天长出不定根；
66.4)不定根的培养：将步骤(3)获得的不定根切成0.5cm的小段，接到生长培养基(实施例10制备)中按照质量体积比0.7％(g/ml)进行接种，生长40天为第一次不定根培养，再
将第一次不定根培养获得的不定根按照质量体积比0.7％(g/ml)转接到新的生长培养基(实施例10制备)中继续培养40天，收获；
67.黄芪不定根生物量与接种量相比提高13.8倍。60℃烘干至恒重后储存在塑封袋中，取适量进行含量测定。
68.实施例14
69.一种黄芪不定根的诱导与培养方法，包括如下步骤：
70.1)黄芪无菌苗的培养；
71.黄芪种子灭菌：同实施例13的黄芪种子灭菌；
72.将灭菌的黄芪种子接种于无菌苗培养基(实施例2制备)上，在30℃，每天12小时光照，光照强度1500lux，12小时黑暗，培养20天，得黄芪无菌苗；
73.2)愈伤组织的诱导：将黄芪无菌苗的下胚轴切下接种于愈伤诱导培养基(实施例5制备)上，并在25℃，黑暗中培养，长出愈伤组织；
74.3)不定根的诱导：将步骤2)获得的愈伤组织转接到不定根诱导培养基(实施例8制备)上，30℃暗培养(促进不定根增殖)约35天后长出不定根；
75.4)不定根的培养：将步骤(3)获得的不定根切成1.0cm的小段，接到生长培养基(实施例11制备)中，按照质量体积比1.0％进行接种((g/ml))，生长30天为第一次不定根培养，再将第一次不定根培养获得的不定根按照质量体积比1.0％((g/ml))转接到新的生长培养基(实施例11制备)中继续培养40天，收获；
76.黄芪不定根生物量与接种量相比提高15倍。60℃烘干至恒重后储存在塑封袋中，取适量进行含量测定。
77.实施例15
78.一种黄芪不定根的诱导与培养方法，包括如下步骤：
79.1)黄芪无菌苗的培养；
80.黄芪种子灭菌：同实施例13的黄芪种子灭菌；
81.将灭菌的黄芪种子接种于无菌苗培养基(实施例3制备)上，在25℃，每天14小时光照，光照强度2000lux，10小时黑暗，培养10天，得黄芪无菌苗；
82.2)愈伤组织的诱导：将黄芪无菌苗的下胚轴切下接种于愈伤诱导培养基(实施例6制备)上，并在30℃，黑暗中培养，长出愈伤组织；
83.3)不定根的诱导：将步骤2)获得的愈伤组织转接到不定根诱导培养基(实施例9制备)上，20℃暗培养(促进不定根增殖)约30天后长出不定根；
84.4)不定根的培养：将步骤(3)获得的不定根切成1.0cm的小段，接到生长培养基(实施例12制备)中按照质量体积比1.5％(g/ml)进行接种，生长35天为第一次不定根培养，再将第一次不定根培养获得的不定根按照质量体积比1.5％(g/ml)转接到新的生长培养基(实施例12制备)中继续培养40天，收获；
85.黄芪不定根生物量与接种量相比提高20倍。60℃烘干至恒重后储存在塑封袋中，取适量进行含量测定。
86.本发明获得的黄芪不定根中黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷的提取及含量测定依据2020版中国《药典》进行：
87.黄芪甲苷
88.(1)色谱条件
89.色谱柱为kromasil c
18
(4.6mm
×
250mm,5μm)；以乙腈
‑
水(32：68)为流动相；蒸发光散射检测器检测。
90.(2)标准品溶液的制备
91.取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加80％甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，即得。对照品储备液用0.22μm微孔滤膜过滤后密封，置冰箱中保存备用。
92.(3)样品溶液的制备
93.取实施例13、14、15得到的干燥黄芪不定根分别粉碎，过四号筛，各取1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入含4％浓氨试液的80％甲醇溶液(取浓氨试液4ml，加80％甲醇至100ml，摇匀)50ml，密塞，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用含4％浓氨试液的80％甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，蒸干，残渣用80％甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加80％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。样品溶液用0.22μm微孔滤膜过滤后密封，置冰箱中保存备用。
94.实验结果：实施例13
‑
15获得的产物中的黄芪甲苷含量依次为0.08
±
0.002％、0.15
±
0.005％、0.14
±
0.010％。均可以达到2020版中国《药典》对黄芪中黄芪甲苷含量的要求(不得少于0.080％)。
95.毛蕊异黄酮葡萄糖苷
96.(1)色谱条件
97.色谱柱为kromasil c
18
(4.6mm
×
250mm,5μm)；以乙腈为流动相a，以0.2％甲酸溶液为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为260nm。
[0098][0099]
(2)标准品溶液的制备
[0100]
取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含50μg的溶液，即得。对照品储备液用0.22μm微孔滤膜过滤后密封，置冰箱中保存备用。
[0101]
(3)样品溶液的制备
[0102]
取实施例13、14、15得到的干燥黄芪不定根分别粉碎，过四号筛，各取1g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，加热回流4小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。样品溶液用0.22μm微孔滤膜过滤后密封，置冰箱中保存备用。
[0103]
实验结果：实施例13
‑
15获得的产物中的毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量依次为0.11
±
0.001％、0.06
±
0.002％、0.06
±
0.001％。均可以达到2020版中国《药典》对黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的要求(不得少于0.020％)。