一种乳剂型器官保存液及其制备方法与流程

1.本发明属于医学材料领域，具体涉及一种乳剂型器官保存液及其制备方法。


背景技术：

2.随着目前器官移植技术的发展，器官的保存技术越发受到重视，高质量的供体器官是器官移植手术成功的前提条件，器官保存技术是器官移植学的基石。器官移植必需移植活的器官，供移植用的器官从切离供者体内之时起直到其主要血管与患者血管接通期间，需要始终保持完整的解剖结构和活性。但是，任何器官一旦失去血液供应，细胞得不到所必需的氧和养料，在常温下于短期内即会死亡。因此，必需设法使得离体器官的活性能够长时间维持。
3.使用器官保存液对切除后的供体器官进行灌洗并进行静态低温保存是已知最常见的器官保存方式。目前常用器官保存液有uw液、htk液、euro
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collins液和celsior液等，其保存机制是维持离子浓度和渗透压。例如，uw液可保存肾脏12小时或肝脏8小时，是较为公认的肝胰肾标准保存液，在国内外广泛使用，但是uw液粘度高，不适于配合灌注设备。htk液缓冲性能好，在抑制组织酸化方面性能突出，且黏度低，易于扩散，其临床效果与uw液相当。
4.值得注意的是，目前的器官保存液均无氧气支持功能，这限制了器官的有效保存时间。无论是静态低温保存还是常温灌注保存，器官中的代谢并没有完全停止。即使在4℃，移植器官仍然具有正常体温时代谢水平的5％～15％。所以，理想的器官保存液应能为组织提供足够的氧供。因此，开发一种能够高效维持所保存器官氧供的器官保存液对于延长器官保存时间和提高保存质量具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种乳剂型器官保存液，能够延长器官保存时间和提高保存质量。
6.本发明还提出一种具有上述乳剂型器官保存液的制备方法。
7.根据本发明的一个方面，提出了一种乳剂型器官保存液，包含油相成分和水相成分，所述油相成分包含氟碳烷烃类携氧剂、乳化剂和乳酸，所述水相成分包含渗透压调节剂、缓冲盐、电解质和碳酸盐，所述油相成分与水相成分的体积比为1：(3～20)。
8.根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：本发明的乳剂型器官保存液中的氟碳烷烃类携氧剂作为油相分散在水相中，油相供氧，水相中的多种溶质维持离子浓度和渗透压，该乳液剂型解决了水不溶性氟碳烷烃在水性环境中的稳定分散难题；该乳剂型器官保存液利用乳酸与碳酸盐的产气反应，为乳剂形成提供足够的能量，获得更小、更均匀的乳滴粒径分布的乳液；该乳剂型器官保存液携氧含量高，能够延长器官保存时间和提高保存质量。
9.在本发明的一些实施方式中，所述氟碳烷烃类携氧剂选自全氟溴辛烷、全氟溴癸
烷、全氟萘烷、全氟三丙胺、全氟甲基环己哌啶，全氟三丁基胺、全氟二氯辛烷和全氟丁基乙烯中的至少一种；和/或所述乳化剂选自大豆卵磷脂和蛋黄卵磷脂中的至少一种；和/或所述渗透压调节剂选自甘露醇和甘油中的至少一种；和/或所述缓冲盐选自组氨酸、组氨酸盐酸盐、色氨酸和2
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酮戊二酸氢钾中的至少一种；和/或所述电解质选自氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙和硫酸镁中的至少一种；和/或所述碳酸盐选自碳酸氢钠和碳酸钠中的至少一种。
10.在本发明中，所述氟碳烷烃类携氧剂采用氟碳化合物，采用生物安全性良好的磷脂类乳化剂，保证携氧剂以纳米尺度液滴形式稳定分散。
11.在本发明的一些优选的实施方式中，所述油相成分由质量比为(100～200)：(1～10)：(10～30)：1的全氟溴辛烷、全氟溴癸烷、乳化剂和乳酸组成；更优选地，所述油相成分由质量比为155:3:20:1的全氟溴辛烷、全氟溴癸烷、乳化剂和乳酸组成
12.在本发明的一些实施方式中，所述碳酸盐与乳酸的摩尔比为(0.5～3)：1。
13.在本发明的一些优选的实施方式中，所述碳酸盐在水相中的浓度为0.01～0.03mol/l。
14.在本发明的一些优选的实施方式中，当所述碳酸盐为碳酸氢钠时，碳酸氢钠在水相中的浓度为0.01～0.03mol/l碳酸氢钠与乳酸的摩尔比为(1.5～3):1；更优选地，所述碳酸氢钠在水相中的浓度为0.015mol/l碳酸氢钠与乳酸的摩尔比为2:1。
15.在本发明的一些优选的实施方式中，当所述碳酸盐为碳酸钠时，碳酸钠在水相中的浓度为0.01～0.02mol/l碳酸钠与乳酸的摩尔比为(1.5～3):2。
16.在本发明的一些实施方式中，所述乳剂型器官保存液的平均粒径为50～200nm。
17.在本发明的一些实施方式中，所述乳剂型器官保存液的渗透压为290～320mosm/kg h2o，ph值为6.8～7.4，37℃时的粘度为100～230s
‑1。
18.在本发明的一些实施方式中，含钠离子浓度范围0.01～0.03mol/l，含钾离子浓度范围0.005～0.015mol/l，含镁离子浓度范围0.001～0.003mol/l，含钙离子浓度范围0.000005～0.000015mol/l，组氨酸及组氨酸盐酸盐总浓度范围0.05～0.15mol/l，色氨酸浓度范围0.0005～0.002mol/l，甘露醇浓度范围0.01～0.03mol/l，甘油浓度范围0.01～0.15mol/l，卵磷脂浓度范围0.04～0.08mol/l。
19.在本发明的一些优选的实施方式中，含钾离子浓度0.009mol/l，含镁离子浓度0.002mol/l，含钙离子浓度0.000008mol/l，含组氨酸浓度0.09mol/l，含组氨酸盐酸盐浓度0.009mol/l，色氨酸浓度0.001mol/l，甘露醇浓度0.015mol/l，甘油浓度0.152mol/l。
20.根据本发明的再一个方面，提出了乳剂型器官保存液的制备方法，包括以下步骤：制备油相：将氟碳烷烃类携氧剂、乳化剂和乳酸混合均匀；制备水相：将电解质、缓冲盐、渗透压调节剂和碳酸盐制备成水溶液；将所述油相和所述水相通过微流控法或微射流高压均质法混合均匀，得到所述乳剂型器官保存液。
21.根据本发明的一种优选的实施方式的制备方法，至少具有以下有益效果：本发明的制备方法通过微流控混合或微射流高压均质技术将氟碳烷烃类携氧剂分散在含有适宜电解质、渗透压调节剂和缓冲盐的水溶液中得到乳剂型器官保存液，解决了水不溶性氟碳烷烃在水性环境中的稳定分散难题，有利于维持所保存器官氧及养分供应，可用于肝脏等器官移植中的器官保存。
22.在本发明的一些实施方式中，所述微流控法包括通过微流控系统控制所述油相和所述水相分别流入微通道，总流速为3～8ml/min，所述油相和所述水相的流速比为1:(3～20)。
23.在本发明的一些优选的实施方式中，所述微流控混合的条件为总流速为4～6ml/min，所述油相和水相的流速比为1:(8～12)；更优选地，所述微流控混合的条件为总流速约为5ml/min，所述油相和水相的流速比约为1:10。
24.在本发明的一些优选的实施方式中，所述微流控系统为nanoassemblr
tm
平台。nanoassemblr
tm
平台为一种微流控纳米微粒制造系统，通过该系统的微流控技术进行油相和水相混合，能够制备得到粒径合适、乳液性质稳定的纳米乳液。
25.在本发明的一些优选的实施方式中，所述微流控系统的反应体系温度为15～30℃；更优选地，所述反应体系温度约为25℃。
26.在本发明的一些实施方式中，所述微射流高压均质法使用的压力为1000～2000bar，循环为3～8次。
27.在本发明的一些优选的实施方式中，所述微射流高压均质法具体包括以下步骤：按体积比1:10将油相与水相混合，10000rpm剪切10min，获得初乳，随后以微射流高压均质机进行均质，压力1500bar，循环5次，温度控制在25℃，得到氟碳乳，以动态光散射测定纳米乳粒径分布，平均粒径103.0nm，多分散系数为0.106，ph为7.2，渗透压为300mmol/l。
附图说明
28.下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
29.图1为本发明实施例1中的氟碳乳的乳剂粒径分布图；
30.图2为本发明实施例2中的氟碳乳的乳剂粒径分布图；
31.图3为本发明实施例1中的氟碳乳和对照样品和对比例1制备的对照氟碳乳的氧含量测试图；
32.图4为本发明实施例1中的氟碳乳载氧后保存大鼠肝脏48小时(4℃)后肝脏中的atp含量；
33.图5为本发明实施例1中的氟碳乳载氧后保存大鼠肝脏48小时(4℃)后肝脏中的天冬氨酸转氨酶(ast)水平；
34.图6为本发明实施例1中的氟碳乳载氧后保存大鼠肝脏48小时(4℃)后肝脏中的过氧化脂质(lpo)水平。
具体实施方式
35.以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
36.在本发明中，制备的乳剂型器官保存液，是主要成分为氟碳烷烃类携氧剂的乳液，
因此在下述实施例或对比例中或以氟碳乳命名。
37.实施例1
38.本实施例制备了一种乳剂型器官保存液，具体过程为：
39.(1)分别配制油相和水相：
40.油相配制方法为：称取186g全氟溴辛烷、3.5g全氟溴癸烷、2g乳酸和44g卵磷脂，超声振荡使其充分混合溶解。
41.水相配制方法为：以纯水为溶剂，溶质包括0.02mol/l碳酸氢钠、0.009mol/l氯化钾、0.002mol/l氯化镁、0.000008mol/l氯化钙、0.009mol/l盐酸组氨酸盐、0.0022mol/l 2
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酮戊二酸氢钾、0.09mol/l组氨酸、0.001mol/l色氨酸、0.015mol/l甘露醇和0.14mol/l甘油，充分溶解。
42.(2)微流控法制备氟碳乳：以nanoassemblr
tm
平台控制油相与水相分别流入微通道，油相和水相的流速比1:10，总流速5ml/min，控制反应体系温度为25℃，在微通道出口收集产物，得到氟碳乳。该氟碳乳作为乳剂型器官保存液，用于保存器官。
43.实施例2
44.本实施例制备了一种乳剂型器官保存液，具体过程为：
45.(1)分别配制油相和水相：
46.油相配制方法为：称取186g全氟溴辛烷、3.5g全氟溴癸烷、2g乳酸和44g卵磷脂，超声振荡使其充分混合溶解。
47.水相配制方法为：以纯水为溶剂，溶质包括0.02mol/l碳酸氢钠,0.009mol/l氯化钾，0.002mol/l氯化镁，0.000008mol/l氯化钙，0.009mol/l盐酸组氨酸盐，0.0022mol/l 2
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酮戊二酸氢钾，0.09mol/l组氨酸，0.001mol/l色氨酸，0.015mol/l甘露醇，0.14mol/l甘油。
48.(2)微射流高压均质法制备氟碳乳：按体积比1:10将油相与水相混合，10000rpm剪切10min，获得初乳，随后以微射流高压均质机进行均质，压力1500bar，循环5次，温度控制在25℃，得到氟碳乳。该氟碳乳作为乳剂型器官保存液，用于保存器官。
49.对比例
50.本实施例制备了一种乳剂型器官保存液，与实施例1的区别在于油相中不添加乳酸且水相中不添加碳酸盐，其它具体过程和制备工艺与实施例1完全一致。制备得到一种对照氟碳乳。
51.试验例
52.本试验例测试了实施例1～2和对比例1制备的氟碳乳的性能。其中：
53.一、粒径和乳液性质测试：
54.实施例1的氟碳乳以动态光散射测定氟碳乳的粒径分布，如图1所示，平均粒径88.5nm，多分散系数0.268，稳定性良好(热压灭菌后平均粒径98.5nm，pdi 0.323)。该氟碳乳ph约为7.2，渗透压约为300mmol/l。
55.对照例的对照氟碳乳液滴过大，平均粒径520.5nm，多分散系数0.10，稳定性差，室温后粒径超过1微米，且出现分层、破乳。因此，如不采用碳酸氢钠与乳酸的组合，无法得到粒径合适和性质稳定的乳液。利用乳酸与碳酸盐的产气反应，为乳剂形成提供足够的能量，获得更小、更均匀的乳滴粒径分布的乳液。
56.实施例2的氟碳乳以动态光散射测定纳米乳粒径分布，平均粒径103.0nm，多分散
系数0.106，测试结果如图2所示。经测定，ph约为7.2，渗透压约为300mmol/l。
57.二、氧含量测试：
58.将连接氧气罐的管口分别置于实施例1的氟碳乳、对比例的对照氟碳乳、纯水或htk液的液面下2cm处，在保证气泡连续不断的情况下充气15分钟。用inpro 6860i光学氧传感器检测各样本的含氧量，以亚硫酸氢钠饱和溶液调零点，以新鲜配置的饱和溶解氧纯水调100％，测试得到的氧含量数据如图3所示。结果表明，实施例1的氟碳乳具有良好的载氧能力，氧含量为1421.7
±
100.2mg/l显著高于对照氟碳乳或htk液。
59.三、器官保存效果测试：
60.实施例1的氟碳乳以220nm滤膜过滤除菌后按上述条件载氧，将所需保存的模型器官(来自健康大鼠的肝脏)浸没于其中，于4℃保存48小时，以htk液作为对照进行相同实验操作，然后分别检测肝脏中的atp含量(结果如图4所示)、天冬氨酸转氨酶(ast)水平(结果如图5所示)和过氧化脂质(lpo)水平(结果如图6所示)。结果表明，与htk液保存相比，实施例1的氟碳乳保存的肝脏，可显著改善保存后的器官质量，具体表现为atp含量较高，天冬氨酸转氨酶和过氧化脂质含量较低。
61.本发明通过微流控法或微射流高压均质法将氟碳烷烃类携氧剂分散在含有适宜电解质、渗透压调节剂和缓冲盐的水溶液中得到氟碳乳，制备得到粒径大小合适、稳定性高和携氧量高的乳剂型器官保存液。
62.上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。