一种无菌冬虫夏草寄主幼虫的产业化饲养方法与流程

1.本发明涉及冬虫夏草人工培植领域，具体涉及一种无菌冬虫夏草寄主幼虫的产业化饲养方法。


背景技术：

2.冬虫夏草，中药名，为麦角菌科植物冬虫夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫的尸体的复合体。冬虫夏草具有调节免疫系统功能、抗肿瘤、抗疲劳、补肺益肾、止血化痰、秘精益气等多种功效。冬虫夏草人工培育产业化中，病原微生物较多，导致冬虫夏草寄主幼虫死亡率较高，其他微生物的竞争也导致冬虫夏草寄主幼虫侵染率有所限制，无法实现人工培育冬虫夏草的高产，因此，无菌冬虫夏草寄主幼虫的产业化饲养尤为重要。


技术实现要素：

3.针对上述现有技术中的不足之处，本发明提供一种无菌冬虫夏草寄主幼虫的产业化饲养方法，其通过培养无菌虫避免了杂菌感染，提高了冬虫夏草的纯度。
4.为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
5.一种无菌冬虫夏草寄主幼虫的产业化饲养方法，其特征在于：包括以下步骤，
6.s1、虫卵的无菌处理，将蝙蝠蛾科昆虫交尾卵放置在无菌卵消毒装置内，用浓度为100
‑
300ppm的含氯消毒液浸没消毒5
‑
20分钟，取出，无菌水冲洗尽虫卵表面的消毒剂，得无菌虫卵；
7.s2、侵染装置的制备，取透明玻璃容器作为侵染盒，侵染盒上设置可密封连接的上盖，上盖上开设透气孔，在透气孔位置设置有无菌滤膜，将侵染盒及上盖进行灭菌处理；
8.s3、添加无菌饲料，定量称取植物块茎粉、珠芽蓼粉、琼脂、水混合，加热溶解，倾倒入步骤s2制备的侵染盒中，高压蒸汽灭菌，待冷却凝固得到含固体培养基的侵染盒；
9.s4、制备无菌幼虫饲养瓶，按照步骤s3的方式制备含固体培养基的无菌幼虫饲养瓶；
10.s5、将步骤s1中得到的无菌卵在无菌室内放置在步骤s3中的侵染盒中，每个侵染盒放入500粒无菌虫卵，待卵孵化幼虫1
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3个月内可连接菌种发酵装置将冬虫夏草菌的发酵液通过总管道直接输入到侵染盒中，采用雾状喷洒的方式均匀散布侵染盒中，使得菌种发酵液接触到无菌幼虫体表和幼虫取食的无菌饲料，充分侵染；
11.s6、把步骤s5中侵染1
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3个月后的幼虫按单只分别转移至步骤s4中制得的无菌饲养瓶中，所述无菌饲养瓶中盛装有15
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30毫升无菌饲料，每2
‑
4个月转移一次新的无菌饲养瓶直到幼虫发育为僵虫。
12.进一步地，步骤s1中所述的无菌卵消毒装置包括盛放消毒液的液体槽(1)、盛放虫卵的双层滤膜网(2)、无菌水喷洒装置(3)，所述双层滤膜网(2)通过竖直升降支架设置在所述液体槽(1)上方，所述无菌水喷洒装置(3)设置在所述双层滤膜网(2)上方，所述双层滤膜网向下滑动可完全浸没在所述液体槽(1)内的消毒液中。
13.进一步地，步骤s3中的植物块茎粉为胡萝卜粉、蕨麻粉一种或两种组合。
14.进一步地，步骤s3中的无菌饲料成分配比为每100毫升水中添加琼脂1
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1.5克、胡萝卜粉3
‑
5克、蕨麻粉2.5
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3.5克、珠芽蓼粉1.5
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2.5克，调节ph6.0
‑
6.5。
15.进一步地，步骤s3中的无菌饲料成分配比为每100毫升水中添加琼脂1
‑
1.5克、胡萝卜粉3
‑
5克、蕨麻粉2.5
‑
3.5克，调节ph6.0
‑
6.5。
16.进一步地，步骤s3中的无菌饲料成分配比为每100毫升水中添加琼脂1
‑
1.5克、胡萝卜粉3
‑
5克、珠芽蓼粉1.5
‑
2.5克，调节ph6.0
‑
6.5。
17.进一步地，步骤s3和s4中采用的高蒸汽灭菌工艺为将侵染盒或幼虫饲养瓶放入高压蒸汽灭菌锅中，在103kpa，121摄氏度条件下灭菌45分钟。
18.进一步地，步骤s6中所述无菌饲养瓶包括可密封扣合的瓶身和瓶盖，所述瓶身为直径为5cm、高度为5cm的透明瓶，所述瓶盖上设置有直径为1cm的透气孔，所述透气孔处设置微生物过滤透气膜。
19.进一步地，步骤s5中的冬虫夏草菌的发酵液配方为：100毫升水中添加葡萄糖1.5
‑
3.5克、牛奶10
‑
15毫升、硫酸镁0.005
‑
0.01克、磷酸二氢钾0.005
‑
0.01克、磷酸氢二钾0.005
‑
0.01克。
20.本发明的有益效果包括：饲养无菌虫，外界无任何病原微生物进入，可提高成活率，其次，无菌虫因缺乏水平传播微生物，免疫能力相对较弱，侵染时也无其他微生物竞争，可利于冬虫夏草菌的侵染，无菌幼虫饲养，可为研究微生物与冬虫夏草寄主幼虫之间健康关系提供专业的平台，包括某些疾病的病原研究，微生物间的拮抗作用，病毒病的研究，细菌学研究，真菌感染研究，原虫感染研究。在免疫学研究中的应用，包括无菌动物中无特异性抗体，适合各种免疫现象的研究，在营养代谢研究中的研究，在胆固醇代谢中的研究，毒理学、肿瘤、寄生虫等。辅助解决冬虫夏草人工培育开发中冬虫夏草寄主幼虫抗病能力弱导致产量低的问题。
附图说明
21.图1是本发明中无菌卵消毒装置的结构示意图；
22.图2是本发明中无菌卵侵染装置的结构示意图；
23.图3是本发明中幼虫饲养装置的结构示意图；
24.图4是本发明中验证无菌幼虫及环境无菌的细菌培养基结果；
25.图5是本发明中验证无菌幼虫及环境无菌的真菌培养基结果。
具体实施方式
26.下面结合具体实施例及附图来进一步详细说明本发明。
27.实施例一
28.一种无菌冬虫夏草寄主幼虫的产业化饲养方法，将预先制备的无菌卵、无菌饲料、无菌饲养装置准备好后，放置在无菌室内，并检测无污染后，打开无菌室内的风机，打开无菌饲养装置，用无菌工具转移调配好无菌饲料到无菌装置中，在放置无菌卵在无菌饲料上，扣紧无菌装置的顶盖，放置在无菌生产厂区内。
29.上述无菌卵的制备包括把预计三天要孵化的交尾卵放置在无菌卵消毒装置内，用
浓度为100
‑
300ppm的含氯消毒液浸没消毒5
‑
20分钟，取出，无菌水冲洗尽虫卵表面的消毒剂，得无菌虫卵；
30.如图1所示本实施例中的无菌卵消毒装置分为三部分，底部是盛放消毒液的液体槽，中部是盛放卵的双层滤膜网，上层是连接无菌水喷洒装置，装置工作原理下层盛放消毒液，中层把盛放滤网膜内的卵，通过上下滑槽浸入消毒液消毒，消毒时间结束后，还原到滤网膜的原位置，取出消毒液槽，换干净水槽进去，打开无菌水喷洒装置开关，无菌水清洗卵表皮的消毒液。
31.无菌卵消毒方式：全程消毒操作在专用无菌室内操作，无菌室内安装臭氧装置，先取定量数量的卵，放到无菌卵消毒装置的中层滤网膜上，上下滑动滤网膜，全部浸入底部盛放含氯消毒液体槽中，时长5
‑
20分钟，时间到后上下滑动滤网膜，远离消毒液，打开上层连接无菌水喷洒装置的开关，用流动无菌水从上部冲洗氯消毒液，消毒完后把滤网膜中的卵倒置在提前高温高压灭菌的吸水无纺布上，并打开无菌室内的臭氧装置，臭氧消毒半小时，全程打开无菌室的风机。
32.如图2所示的侵染装置：侵染盒尺寸长、宽、高为30*20*10cm，分为上下两部分，材质为透明玻璃，上部分是耐高温高压的塑料顶盖，两者螺旋衔接，可保证顶盖和瓶身衔接处无空气进入，顶盖有5*5的无菌滤膜，可供幼虫通气，无菌滤膜可保证空气中的微生物无法进入侵染装置内，也可保证幼虫所需的空气量。
33.在侵染装置内设置无菌饲料作为培养基，侵染时期无菌饲料制备配方：琼脂1
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1.5克/100毫升水，胡萝卜粉3
‑
5克/100毫升水，蕨麻粉2.5
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3.5克/100毫升水，珠芽蓼粉1.5
‑
2.5克/100毫升水，调节ph6.0
‑
6.5。定量称取混合倒入到无菌侵染托盘和无菌饲养瓶中，高温高压灭菌，冷却，将无菌卵按每盘500粒转移到侵染托盘中，卵两到三天孵化后，生长1
‑
3个月后，通过发酵菌种总管道输送到侵染盒中，对无菌幼虫进行侵染。
34.此处的发酵菌种制备包括按照冬虫夏草菌的发酵液配方制作菌种培养基，配方为100毫升水中添加葡萄糖1.5
‑
3.5克、牛奶10
‑
15毫升、硫酸镁0.005
‑
0.01克、磷酸二氢钾0.005
‑
0.01克、磷酸氢二钾0.005
‑
0.01克。通过菌种输入管道分装到发酵瓶中，设置总装置对培养基进行灭菌处理，待冷却后将液体母菌种通过输入总管道分别接种到发酵瓶中，并设置震荡模式，进行菌种发酵培养。
35.侵染冬虫夏草菌的的幼虫饲养方式：把侵染后的幼虫按单条分别转移到如图3所示的装有无菌饲料的无菌饲养瓶中，此处的无菌饲料量是每瓶25毫升，让其生长3个月后，重新转移到新的装有无菌饲料的无菌装置中生长3个月，单瓶饲养每阶段以3个月为期限，直到幼虫生长发育转变为僵虫。
36.上述无菌饲养瓶中的无菌冬虫夏草幼虫的无菌饲料主要配料：
37.配方一：琼脂1
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1.5克/100毫升水，胡萝卜粉3
‑
5克/100毫升水，蕨麻粉2.5
‑
3.5克/100毫升水，珠芽蓼粉1.5
‑
2.5克/100毫升水，ph6.0
‑
6.5。
38.无菌饲料制作方法：各成分按比例配置，倒入到无菌侵染托盘和无菌饲养瓶中，高压103kpa蒸汽灭菌45分钟，灭菌温度121摄氏度，放置在无菌室内冷却。
39.无菌冬虫夏草寄主幼虫的饲养装置：由两部分组成，瓶身和瓶盖，瓶盖有隔绝微生物的透气膜，直径1cm，可透气可隔绝外界微生物。瓶身透明可清除观察瓶中现象，材质可隔绝污染，锁住瓶内水分，可高温高压灭菌，不宜变形。高度5cm,直径5cm，体型小，节省厂区空
间，瓶身和瓶盖吻合部位是螺旋设计，可保证接触部位，无空间流通现象，微生物无法从结合处进入。
40.实施例二
41.其余方法步骤与实施例一相同仅在无菌饲养瓶中添加如下配方的无菌饲料，配方二：琼脂1
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1.5克/100毫升水，胡萝卜粉3
‑
5克/100毫升水，蕨麻粉2.5
‑
3.5克/100毫升水，ph6.0
‑
6.5。经过多个周期的喂养，观察幼虫的生长情况。
42.实施例三
43.其余方法步骤与实施例一相同仅在无菌饲养瓶中添加如下配方的无菌饲料，配方三：琼脂1
‑
1.5克/100毫升水，胡萝卜粉3
‑
5克/100毫升水，珠芽蓼粉1.5
‑
2.5克/100毫升水，ph6.0
‑
6.5。经过多个周期的喂养，观察幼虫的生长情况。
44.将按照本发明方法饲养的幼虫进行全虫研磨后在培养基上培养，再进行多种配方的高营养细菌和真菌培养基检测无菌幼虫的无菌情况，其结果如图4
‑
5所示，从结果中可以看出培养基中未长出真菌和细菌，由此可得无菌虫培养结果符合预期。
45.细菌培养基配方对照组一：1、琼脂1.5克/100毫升水 冬虫夏草蝙蝠蛾幼虫虫粉5克/100毫升，胰蛋白胨0.5克/100毫升，葡萄糖0.1克/100毫升，酵母浸粉0.25克/毫升，ph调制:5.0、6.5、8.0、9.5、11；放置温度16℃、28℃、35℃。
46.细菌培养基配方对照组二：琼脂1.5克/100毫升水，胰蛋白胨0.5克/100毫升，葡萄糖0.1克/100毫升，酵母浸粉0.25克/毫升，ph调制:5.0、6.5、8.0、9.5、11；放置温度16℃、28℃、35℃。
47.真菌培养基配方对照组一：1、琼脂1.5克/100毫升水 冬虫夏草蝙蝠蛾幼虫虫粉5克/100毫升，马铃薯浸出粉1克/100毫升，葡萄糖2克/100毫升，氯霉素0.01克/100毫升，ph调制:5.0、6.5、8.0、9.5、11，放置温度16℃、25℃真菌培养基配方配方对照组二：1、琼脂1.5克/100毫升水，马铃薯浸出粉1克/100毫升，葡萄糖2克/100毫升，氯霉素0.01克/100毫升，ph调制:5.0、6.5、8.0、9.5、11；放置温度16℃、25℃。
48.以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。