1.本发明属于萝卜属作物育种
技术领域：
：，具体涉及一种高效繁殖萝卜自交不亲和系的方法。
背景技术：
：：2.萝卜(raphanussativusl.，2n＝2x＝18)又名莱菔、芦菔，十字花科萝卜属一、二年生根菜类作物。萝卜属于典型异花授粉植物，多具有自交不亲和性(self‑incompatibility，si)，杂种优势十分明显，利用自交不亲和系配制杂交种是杂种优势利用的重要途径之一，具有优势强、选育易、周期短等优点。在制备杂交种时，选用高度自交不亲和系作为亲本能提高杂交率及杂种纯度，但由于萝卜自交不亲和性的存在，会出现亲本自身自交结籽困难，难以完成大面积繁殖，制种成本高，不利于广泛应用等问题。这是长期以来限制自交不亲和系在萝卜杂种优势育种中广泛利用的一个重要因素，是蔬菜育种中亟需解决的难题。3.为了提高自交不和系的保存和繁殖效率，育种工作者已尝试多种方法：传统人工剥蕾授粉在萝卜育种实践中应用最为广泛，但该方法操作繁琐、效率低、成本高，大大降低了萝卜杂交种生产的经济效益；高温处理与电助授粉在芸薹属植物育种中应用较多，也逐渐应用到萝卜属作物上，但克服效果因植物种类和自交不亲和性强度而异；nacl盐溶液在应用上存在一定的可逆性，相隔时间越长，授粉的效果越差且不适宜浓度易造成作物盐害，大大降低繁殖效率；近年来也发现生长素(iaa、naa)、细胞分裂素(6‑ba)、赤霉素(ga3)、槲皮素等等生长调节物质可以克服大白菜、甘蓝等芸薹属植物的自交不亲和性，但生产上应用较少，广谱性未得到证实，克服萝卜自交不亲和性的作用尚未证明。因此，急需寻找一种高效且适用于萝卜作物，提高其自交不亲和系亲本繁殖效率的方法。4.褪黑素(n‑乙酰‑5‑甲氧基色胺，melatonin，mt)是一种被广泛研究的吲哚类色胺分子，目前已研究发现mt在植物中具有清除活性氧、促进植物种子萌发、提高植株抗逆性等多种生理功能，但mt是否具有克服植物自交不亲和性的功效尚未见报道。本发明选用适宜浓度mt溶液在萝卜自交不亲和系花期进行喷施，并在喷施试剂辅助壁蜂授粉，可以显著提高萝卜自交不亲和系的繁殖效率，且处理工作操作简便、成本低，能有效解决萝卜自交不亲和系亲本难以大面积繁殖问题，推动利用自交不和系进行萝卜f1代高效制种的应用，实用价值大且应用前景广阔。技术实现要素：5.针对上述自交不亲和亲本繁殖中存在的问题，本发明提供了一种高效繁殖萝卜自交不亲和系的方法，本发明的目的在于，有效克服萝卜自交不亲和性，简单高效的解决繁殖萝卜自交不亲和亲本时成本高、产量低的问题，简化萝卜自交不亲和材料的繁殖和保存，促进萝卜杂交制种的大面积应用。6.本发明目的可以通过以下技术方案实现：7.1.一种高效繁殖萝卜自交不亲和系的方法，其特征在于采用如下步骤：8.1)将萝卜自交不亲和系长势健壮一致的植株种植于棚内，待植株进入始花期，摘除已开放的花和种荚，随后不同材料分别加盖网罩，防止异花授粉；9.2)选择盛花期上午9～11点将褪黑素溶液喷施于萝卜花柱头上，喷施后及时加盖遮阳网，对材料进行遮光处理；10.3)在网罩内放置蜂箱，处理2h后收起遮阳网，打开蜂巢，每日傍晚待壁蜂回巢之后锁闭蜂巢；每隔1天喷施1次，至盛花期结束，取出蜂箱；11.4)花期结束后30～45d，角果黄熟时及时采收，晾晒后进行脱粒处理。12.2.作为一种优选的技术方案，步骤1中所述高效繁殖萝卜自交不亲和系的方法，其特征在于，所述的萝卜植株栽培及田间管理步骤如下：13.1)采用直播种植萝卜自交不亲和系材料，播种前整地施肥，播后盖细沙，灌足底水。14.2)苗期要观察叶型、叶柄和胚轴颜色，结合间苗严格去杂；同时膨大根据叶簇、叶型、叶色及肉质根形状、皮色等特征，再次去杂去劣。15.3)盛花期进行新型化学试剂褪黑素处理并结合壁蜂完成自花授粉，保证水肥供应；末花期停止追肥浇水，促使籽粒饱满与种荚成熟；角果黄熟时及时采收进行脱粒处理。16.3.作为一种优选的技术方案，步骤1中所述褪黑素溶液配制方法为：利用适量无水乙醇作为助溶剂溶解褪黑素，并用去离子水定容至1l，得到500μm褪黑素母液，放置于4℃冰箱避光保存。使用时用去离子水稀释为终浓度分别为50、100、200μm的褪黑素溶液。17.4.作为一种优选的技术方案，步骤1中所述喷施处理在盛花期上午9～11点进行，每隔1天喷施1次，2h后待柱头干燥后，打开蜂巢，每日傍晚待壁蜂回巢之后锁闭蜂巢。18.5.作为一种优选的技术方案，步骤1中将褪黑素溶液喷施于萝卜花柱头上，喷施后及时覆盖黑色遮阳网于棚膜顶部与四周，避免褪黑素溶液光解，处理2h后收起遮阳网。19.与现有技术相比，本发明具有如下突出效果：20.针对自交不亲和系亲本繁育困难的现状，本发明提出利用褪黑素喷施材料盛花期柱头，能有效克服萝卜自交不亲和性，实现萝卜自交不和性的人工调控；同时结合壁蜂授粉技术，显著提高萝卜自交不亲和系材料的繁殖效率，能够推动利用自交不和系进行萝卜f1代高效制种的广泛应用。附图说明21.图1为本发明提供的自交不亲和系‘nau‑yxyb’进行褪黑素处理后自交授粉的结荚情况；22.图2为本发明提供的自交不亲和系‘nau‑yxyb’进行褪黑素处理后自交授粉的种荚解剖结果；23.图3为本发明提供的自交不亲和系‘nau‑wxq’进行褪黑素处理后自交授粉的结荚情况；24.图4为本发明提供的自交不亲和系‘nau‑wxq’进行褪黑素处理后自交授粉的种荚解剖结果；具体实施方式25.为使本发明的目的和技术方法更清晰明了，下面结合具体实施例对本发明所述的一种高效繁殖萝卜自交不亲和系的方法进行详细说明。本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。26.实施例1一种高效繁殖萝卜自交不亲和系的方法27.(1)褪黑素溶液配制28.褪黑素溶液浓度分别为50、100、200μm。所述褪黑素溶液为利用适量无水乙醇作为助溶剂溶解褪黑素，并用去离子水定容至1l，得到500μm褪黑素母液，放置于4℃冰箱避光保存。使用时用去离子水稀释为终浓度分别为50、100、200μm的褪黑素溶液。配置好的溶液装入带喷头的100ml小喷壶，避光保存于4℃冰箱中。29.(2)植物材料30.本实施例选用2个萝卜高代自交不亲和系‘nau‑yxyb’和‘nau‑wxq’为供试材料，由南京农业大学园艺学院萝卜遗传育种研究室提供。31.(3)喷施处理32.共设3个对照，3个处理，分别为去离子水处理(ck)、花期授粉(fp)、蕾期授粉(bp)、50μm褪黑素溶液、100μm褪黑素溶液、200μm褪黑素溶液。选取长势一致的植株，每株选取3个以上花序，提前3d用硫酸纸袋套袋；选择晴朗天气上午9～11点进行处理。处理前摘除纸袋中未开放的蕾和非当天开放的花朵，将不同浓度褪黑素溶液喷施于萝卜花柱头上，每个柱头喷两下，处理后套上不透光的纸袋，柱头干燥后人工自花授粉，每个处理5次重复。授粉5d后拆袋，拆除纸袋30～45d后收取整个枝条装入透明网袋，统计结荚数及结籽数。研究结果发现活体喷施褪黑素溶液能显著提高萝卜的自交亲和指数(表1，2)。33.表1化学试剂处理对‘nau‑yxyb’结荚率和亲和指数的平均效应34.table1meaneffectofchemicaltreatmentonthefruitingrateandcompatibilityindex.[0035][0036]表2化学试剂处理对‘nau‑wxq’结荚率和亲和指数的平均效应[0037][0038]注：亲和指数＝结籽数/授粉花朵数；结荚率＝结荚数/授粉花朵数×100％；p＝0.05[0039]不同处理对亲和指数的处理效应中，去离子水处理(ck)和花期授粉(fp)后的亲和指数均低于0.5，证明供试材料均为强自交不亲和系。本研究中传统蕾期处理(bp)可以有效打破萝卜的自交不亲和性，但费时费工，成本较大。经不同浓度的褪黑素溶液处理后，克服自交不亲和性效果十分显著。综合两个萝卜自交系结果，100μm褪黑素溶液处理后的平均亲和指数最高，分别是2.93和2.51，可将自交不亲和植株变为亲和；200μm褪黑素溶液处理次之，亲和指数均为1.82，也部分打破自交不亲和性；50μm褪黑素溶液效果不甚显著，但也高于花期自交亲和指数，转变为弱自交不亲和系。褪黑素溶液可以打破萝卜自交不亲和性，但处理浓度不宜过高。[0040]各处理对结荚率的平均效应与亲和指数一致。100μm褪黑素处理能使‘nau‑yxyb’及‘nau‑wxq’两个材料的结荚率显著提高，接近蕾期处理效应，打破自交不亲和性。[0041]实施例2：[0042]一种高效繁殖萝卜自交不亲和系的方法[0043](1)褪黑素溶液配制[0044]褪黑素溶液浓度为100μm。所述褪黑素溶液为利用适量无水乙醇作为助溶剂溶解褪黑素，并用去离子水定容至1l，得到500μm褪黑素母液，放置于4℃冰箱避光保存。使用时用去离子水稀释为终浓度100μm的褪黑素溶液。配置好的溶液装入500ml喷壶中，避光保存于4℃冰箱中。[0045](2)植物材料[0046]本研究选用7个萝卜自交不亲和系‘nau‑lv791’、‘nau‑yxyb’、‘nau‑df3’、‘nau‑wxq’、‘nau‑yh’、‘nau‑xzh’、‘nau‑yb’为供试材料，由南京农业大学园艺学院萝卜遗传育种研究室提供。[0047](3)处理方法[0048]待植株进入始花期，不同材料分别加盖网罩，防止异花授粉，并设置遮阳网。选择盛花期上午9～11点将100μm褪黑素溶液喷施于萝卜花柱头上，初次处理前摘除非当天开放的花朵和荚，喷施后及时加盖遮阳网，对材料进行遮光处理。在网罩内放置蜂箱，处理2h后收起遮阳网，打开蜂巢，每日傍晚待壁蜂回巢之后锁闭蜂巢。每隔1天喷施1次，至盛花期结束，取出蜂箱。花期结束后30～45d，角果黄熟时及时采收。晾晒后进行脱粒处理。发现经过喷施100μm褪黑素溶液，各个实施材料的种子结籽量有大幅提升。[0049]所用的7个基因型包括‘nau‑lv791’、‘nau‑yxyb’、‘nau‑df3’、‘nau‑wxq’、‘nau‑yh’、‘nau‑xzh’、‘nau‑yb’种子产量较ck分别提高了438.57％、481.92％、127.12％、163.00％、682.60％、280.88％和448.57％。证明100μm褪黑素处理在大田生产中能够显著提高萝卜自交不亲和系亲本繁殖效率，且具有一定的普适性，对于萝卜自交不亲和系的高效繁殖有较大意义。[0050]以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出相应的修改与调整。因此，本发明将不会被限制于所示的这些实施例。当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：，具体涉及一种高效繁殖萝卜自交不亲和系的方法。
背景技术：
：：2.萝卜(raphanussativusl.，2n＝2x＝18)又名莱菔、芦菔，十字花科萝卜属一、二年生根菜类作物。萝卜属于典型异花授粉植物，多具有自交不亲和性(self‑incompatibility，si)，杂种优势十分明显，利用自交不亲和系配制杂交种是杂种优势利用的重要途径之一，具有优势强、选育易、周期短等优点。在制备杂交种时，选用高度自交不亲和系作为亲本能提高杂交率及杂种纯度，但由于萝卜自交不亲和性的存在，会出现亲本自身自交结籽困难，难以完成大面积繁殖，制种成本高，不利于广泛应用等问题。这是长期以来限制自交不亲和系在萝卜杂种优势育种中广泛利用的一个重要因素，是蔬菜育种中亟需解决的难题。3.为了提高自交不和系的保存和繁殖效率，育种工作者已尝试多种方法：传统人工剥蕾授粉在萝卜育种实践中应用最为广泛，但该方法操作繁琐、效率低、成本高，大大降低了萝卜杂交种生产的经济效益；高温处理与电助授粉在芸薹属植物育种中应用较多，也逐渐应用到萝卜属作物上，但克服效果因植物种类和自交不亲和性强度而异；nacl盐溶液在应用上存在一定的可逆性，相隔时间越长，授粉的效果越差且不适宜浓度易造成作物盐害，大大降低繁殖效率；近年来也发现生长素(iaa、naa)、细胞分裂素(6‑ba)、赤霉素(ga3)、槲皮素等等生长调节物质可以克服大白菜、甘蓝等芸薹属植物的自交不亲和性，但生产上应用较少，广谱性未得到证实，克服萝卜自交不亲和性的作用尚未证明。因此，急需寻找一种高效且适用于萝卜作物，提高其自交不亲和系亲本繁殖效率的方法。4.褪黑素(n‑乙酰‑5‑甲氧基色胺，melatonin，mt)是一种被广泛研究的吲哚类色胺分子，目前已研究发现mt在植物中具有清除活性氧、促进植物种子萌发、提高植株抗逆性等多种生理功能，但mt是否具有克服植物自交不亲和性的功效尚未见报道。本发明选用适宜浓度mt溶液在萝卜自交不亲和系花期进行喷施，并在喷施试剂辅助壁蜂授粉，可以显著提高萝卜自交不亲和系的繁殖效率，且处理工作操作简便、成本低，能有效解决萝卜自交不亲和系亲本难以大面积繁殖问题，推动利用自交不和系进行萝卜f1代高效制种的应用，实用价值大且应用前景广阔。技术实现要素：5.针对上述自交不亲和亲本繁殖中存在的问题，本发明提供了一种高效繁殖萝卜自交不亲和系的方法，本发明的目的在于，有效克服萝卜自交不亲和性，简单高效的解决繁殖萝卜自交不亲和亲本时成本高、产量低的问题，简化萝卜自交不亲和材料的繁殖和保存，促进萝卜杂交制种的大面积应用。6.本发明目的可以通过以下技术方案实现：7.1.一种高效繁殖萝卜自交不亲和系的方法，其特征在于采用如下步骤：8.1)将萝卜自交不亲和系长势健壮一致的植株种植于棚内，待植株进入始花期，摘除已开放的花和种荚，随后不同材料分别加盖网罩，防止异花授粉；9.2)选择盛花期上午9～11点将褪黑素溶液喷施于萝卜花柱头上，喷施后及时加盖遮阳网，对材料进行遮光处理；10.3)在网罩内放置蜂箱，处理2h后收起遮阳网，打开蜂巢，每日傍晚待壁蜂回巢之后锁闭蜂巢；每隔1天喷施1次，至盛花期结束，取出蜂箱；11.4)花期结束后30～45d，角果黄熟时及时采收，晾晒后进行脱粒处理。12.2.作为一种优选的技术方案，步骤1中所述高效繁殖萝卜自交不亲和系的方法，其特征在于，所述的萝卜植株栽培及田间管理步骤如下：13.1)采用直播种植萝卜自交不亲和系材料，播种前整地施肥，播后盖细沙，灌足底水。14.2)苗期要观察叶型、叶柄和胚轴颜色，结合间苗严格去杂；同时膨大根据叶簇、叶型、叶色及肉质根形状、皮色等特征，再次去杂去劣。15.3)盛花期进行新型化学试剂褪黑素处理并结合壁蜂完成自花授粉，保证水肥供应；末花期停止追肥浇水，促使籽粒饱满与种荚成熟；角果黄熟时及时采收进行脱粒处理。16.3.作为一种优选的技术方案，步骤1中所述褪黑素溶液配制方法为：利用适量无水乙醇作为助溶剂溶解褪黑素，并用去离子水定容至1l，得到500μm褪黑素母液，放置于4℃冰箱避光保存。使用时用去离子水稀释为终浓度分别为50、100、200μm的褪黑素溶液。17.4.作为一种优选的技术方案，步骤1中所述喷施处理在盛花期上午9～11点进行，每隔1天喷施1次，2h后待柱头干燥后，打开蜂巢，每日傍晚待壁蜂回巢之后锁闭蜂巢。18.5.作为一种优选的技术方案，步骤1中将褪黑素溶液喷施于萝卜花柱头上，喷施后及时覆盖黑色遮阳网于棚膜顶部与四周，避免褪黑素溶液光解，处理2h后收起遮阳网。19.与现有技术相比，本发明具有如下突出效果：20.针对自交不亲和系亲本繁育困难的现状，本发明提出利用褪黑素喷施材料盛花期柱头，能有效克服萝卜自交不亲和性，实现萝卜自交不和性的人工调控；同时结合壁蜂授粉技术，显著提高萝卜自交不亲和系材料的繁殖效率，能够推动利用自交不和系进行萝卜f1代高效制种的广泛应用。附图说明21.图1为本发明提供的自交不亲和系‘nau‑yxyb’进行褪黑素处理后自交授粉的结荚情况；22.图2为本发明提供的自交不亲和系‘nau‑yxyb’进行褪黑素处理后自交授粉的种荚解剖结果；23.图3为本发明提供的自交不亲和系‘nau‑wxq’进行褪黑素处理后自交授粉的结荚情况；24.图4为本发明提供的自交不亲和系‘nau‑wxq’进行褪黑素处理后自交授粉的种荚解剖结果；具体实施方式25.为使本发明的目的和技术方法更清晰明了，下面结合具体实施例对本发明所述的一种高效繁殖萝卜自交不亲和系的方法进行详细说明。本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。26.实施例1一种高效繁殖萝卜自交不亲和系的方法27.(1)褪黑素溶液配制28.褪黑素溶液浓度分别为50、100、200μm。所述褪黑素溶液为利用适量无水乙醇作为助溶剂溶解褪黑素，并用去离子水定容至1l，得到500μm褪黑素母液，放置于4℃冰箱避光保存。使用时用去离子水稀释为终浓度分别为50、100、200μm的褪黑素溶液。配置好的溶液装入带喷头的100ml小喷壶，避光保存于4℃冰箱中。29.(2)植物材料30.本实施例选用2个萝卜高代自交不亲和系‘nau‑yxyb’和‘nau‑wxq’为供试材料，由南京农业大学园艺学院萝卜遗传育种研究室提供。31.(3)喷施处理32.共设3个对照，3个处理，分别为去离子水处理(ck)、花期授粉(fp)、蕾期授粉(bp)、50μm褪黑素溶液、100μm褪黑素溶液、200μm褪黑素溶液。选取长势一致的植株，每株选取3个以上花序，提前3d用硫酸纸袋套袋；选择晴朗天气上午9～11点进行处理。处理前摘除纸袋中未开放的蕾和非当天开放的花朵，将不同浓度褪黑素溶液喷施于萝卜花柱头上，每个柱头喷两下，处理后套上不透光的纸袋，柱头干燥后人工自花授粉，每个处理5次重复。授粉5d后拆袋，拆除纸袋30～45d后收取整个枝条装入透明网袋，统计结荚数及结籽数。研究结果发现活体喷施褪黑素溶液能显著提高萝卜的自交亲和指数(表1，2)。33.表1化学试剂处理对‘nau‑yxyb’结荚率和亲和指数的平均效应34.table1meaneffectofchemicaltreatmentonthefruitingrateandcompatibilityindex.[0035][0036]表2化学试剂处理对‘nau‑wxq’结荚率和亲和指数的平均效应[0037][0038]注：亲和指数＝结籽数/授粉花朵数；结荚率＝结荚数/授粉花朵数×100％；p＝0.05[0039]不同处理对亲和指数的处理效应中，去离子水处理(ck)和花期授粉(fp)后的亲和指数均低于0.5，证明供试材料均为强自交不亲和系。本研究中传统蕾期处理(bp)可以有效打破萝卜的自交不亲和性，但费时费工，成本较大。经不同浓度的褪黑素溶液处理后，克服自交不亲和性效果十分显著。综合两个萝卜自交系结果，100μm褪黑素溶液处理后的平均亲和指数最高，分别是2.93和2.51，可将自交不亲和植株变为亲和；200μm褪黑素溶液处理次之，亲和指数均为1.82，也部分打破自交不亲和性；50μm褪黑素溶液效果不甚显著，但也高于花期自交亲和指数，转变为弱自交不亲和系。褪黑素溶液可以打破萝卜自交不亲和性，但处理浓度不宜过高。[0040]各处理对结荚率的平均效应与亲和指数一致。100μm褪黑素处理能使‘nau‑yxyb’及‘nau‑wxq’两个材料的结荚率显著提高，接近蕾期处理效应，打破自交不亲和性。[0041]实施例2：[0042]一种高效繁殖萝卜自交不亲和系的方法[0043](1)褪黑素溶液配制[0044]褪黑素溶液浓度为100μm。所述褪黑素溶液为利用适量无水乙醇作为助溶剂溶解褪黑素，并用去离子水定容至1l，得到500μm褪黑素母液，放置于4℃冰箱避光保存。使用时用去离子水稀释为终浓度100μm的褪黑素溶液。配置好的溶液装入500ml喷壶中，避光保存于4℃冰箱中。[0045](2)植物材料[0046]本研究选用7个萝卜自交不亲和系‘nau‑lv791’、‘nau‑yxyb’、‘nau‑df3’、‘nau‑wxq’、‘nau‑yh’、‘nau‑xzh’、‘nau‑yb’为供试材料，由南京农业大学园艺学院萝卜遗传育种研究室提供。[0047](3)处理方法[0048]待植株进入始花期，不同材料分别加盖网罩，防止异花授粉，并设置遮阳网。选择盛花期上午9～11点将100μm褪黑素溶液喷施于萝卜花柱头上，初次处理前摘除非当天开放的花朵和荚，喷施后及时加盖遮阳网，对材料进行遮光处理。在网罩内放置蜂箱，处理2h后收起遮阳网，打开蜂巢，每日傍晚待壁蜂回巢之后锁闭蜂巢。每隔1天喷施1次，至盛花期结束，取出蜂箱。花期结束后30～45d，角果黄熟时及时采收。晾晒后进行脱粒处理。发现经过喷施100μm褪黑素溶液，各个实施材料的种子结籽量有大幅提升。[0049]所用的7个基因型包括‘nau‑lv791’、‘nau‑yxyb’、‘nau‑df3’、‘nau‑wxq’、‘nau‑yh’、‘nau‑xzh’、‘nau‑yb’种子产量较ck分别提高了438.57％、481.92％、127.12％、163.00％、682.60％、280.88％和448.57％。证明100μm褪黑素处理在大田生产中能够显著提高萝卜自交不亲和系亲本繁殖效率，且具有一定的普适性，对于萝卜自交不亲和系的高效繁殖有较大意义。[0050]以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出相应的修改与调整。因此，本发明将不会被限制于所示的这些实施例。当前第1页12当前第1页12
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