1.本发明涉及酶活性传感器(enzymeactivitysensor)对照。
背景技术：
：：2.诊断和监测疾病(如癌症)通常涉及侵入性和痛苦的过程(如组织活检)。生物标志物可以提供用于跟踪内部现象的非侵入性的途径，但其范围受到自然发生的现象相关分子的要求和我们对该联系的理解的限制。发现新的天然生物标志物是麻烦的过程。最近的发展包括合成生物标志物，该生物标志物被工程化以响应于体内的各种条件释放可检测的分子。然而，确认报告物数据的来源、排除靶特异性报告物故障以及消除样本间的变异性都呈现了对使用合成生物标志物进行准确报告的障碍。3.此类生物标志物在肿瘤免疫疗法或免疫肿瘤学(i-o)领域具有有前景的应用。免疫肿瘤学是最近发展的领域，其在治疗各种形式的癌症方面已经显示出前景。i-o是指利用患者自身的免疫系统来攻击他们的癌症。i-o是广泛的类别，并且包括被动技术以及主动技术。被动技术涉及通过例如免疫检查点抑制剂(例如，ctla-4阻滞剂、pd-1抑制剂或pd-l1抑制剂)增强患者现有的抗肿瘤免疫应答，这些免疫检查点抑制剂可以破坏肿瘤抵抗免疫系统攻击的防御。主动技术包括靶向的免疫疗法，如编程为靶向肿瘤特异性抗原的工程化的car-t细胞。不幸的是，在没有侵入性活检或潜在地误导性成像的情况下洞察肿瘤环境是困难的，因此合成生物标志物的应用有利。也就是说，在现有的非侵入性诊断和监测测定中可能难以消除假阴性。此外，在癌症免疫疗法的情况下，可能需要区分定位的抗肿瘤免疫应答和全身免疫系统活性，这可能证明是困难的，即使使用来自合成生物标志物的信息。技术实现要素：4.本发明提供了可用于疾病和治疗功效的非侵入性检测和监测的报告物。根据本发明，活性传感器用于验证结果，并校准诊断和治疗测定。在一个实施方案中，本发明包括归一化值(normalizer)和对照报告物用于检测癌症进展的酶活性特征、定位的免疫系统活性和免疫治疗应答的用途。如本文所述，活性传感器提供合成生物标志物，该合成生物标志物可以施用于患者并定位于靶组织以释放指示靶标处酶活性的可检测的报告物分子。此类靶向肿瘤组织并被工程化以报告指示免疫应答或肿瘤进展的酶活性的活性传感器可用于评估患者对免疫肿瘤学疗法的应答和监测疾病状态。然而，i-o疗法中报告物水平的分析通常是比较性的，因此，依赖于对基线酶活性的理解，并且需要监测该活性随时间的变化。来自跨过不同时间点获取的样本的测量值涉及样本间的变异性，其必须被考虑。来自本发明的对照报告物的值作为归一化值，可以帮助消除该变异性，以提供对疾病进展和治疗应答的更准确的评估。此外，免疫系统活性不一定是抗肿瘤活性，因此，评估i-o疗法需要区分抗肿瘤和一般免疫应答。本发明的对照和归一化值报告物可以通过提供靶组织中活性传感器定位的确认和通过提供用于肿瘤特异性免疫系统活性的比较分析的脱靶免疫系统活性的水平来提供这种区分。5.对照可以包括一般的靶特异性报告物(例如，无论疾病状态如何，对靶组织中差异表达的酶有应答)。样本中此类报告物的存在提供了活性传感器到达靶组织以及组织状态报告物水平(例如，癌症进展相关或免疫学酶报告物水平)可以归因于靶组织。例如，在肺癌的i-o分析应用中，免疫学酶敏感的活性传感器可以与肺特异性酶敏感的活性传感器共同施用。患者样本中肺特异性报告物的存在表明活性传感器到达了靶组织，并且样本中发现的免疫学酶敏感的报告物水平可能归因于抗肿瘤应答，而不是脱靶免疫应答。另一方面，在没有相应肺特异性报告物的患者样本中存在免疫学酶敏感的报告物，可能表明由脱靶免疫系统应答导致的假阳性结果。6.对照报告物还可以通过提供指示成功测定的基线信号来防止假阴性结果。在上述示例中，在患者样本中缺少一般肺特异性报告物和免疫学酶敏感的报告物两者可以指示测定已经失败，并且不应当得出关于缺乏抗肿瘤应答的临床结论。在某些实施方案中，对照报告物可以被分期以沿着施用途径的各个阶段被酶切割，使得随后的分析可以帮助排除测定故障，其中存在于患者样本中的报告物的踪迹指示沿着施用途径哪里可能发生问题。7.对照报告物的水平也可以作为归一化值。归一化的主要目的是通过校正除了报告物靶标以外的因素的数据来消除样本间的变异性。归一化可以通过将目标报告物水平除以第二对照值来实现。免疫学酶或癌症特异性酶报告物水平可以除以上述对照报告物水平中的任何一种，以使i-o应答数据归一化。例如，如下所述，免疫学酶敏感的活性传感器可以靶向肿瘤组织，以提供对肿瘤组织特异性的免疫应答信息。在某些实施方案中，可以共同施用非靶向免疫学酶敏感的活性传感器，以提供一般免疫系统活性的比较水平。靶特异性水平可以除以非靶特异性水平，以使一般免疫应答归一化，并提供抗肿瘤免疫应答的更准确的图片。8.在某些实施方案中，测试酶敏感的报告物水平(例如，报告免疫学酶或其它条件指示酶活性)针对对与疾病无关的普遍存在的或靶特异性酶敏感的对照报告物的水平进行归一化。此类对照水平表明了一般的测定功能，并且使用它们进行的归一化可以有助于平滑样本间的差异，这在依赖于报告物测量的样本间比较的i-o疗法监测技术中可能是尤其有用的。如本文所述，活性传感器充当合成生物标志物，该合成生物标志物可以被编程以通过工程化活性传感器中的酶特异性切割位点来提供特异性靶组织中任何酶水平的非侵入性报告。在某些实施方案中，归一化值报告物和实验报告物可以包含在单独的载体上。在优选的实施方案中，活性传感器可以包含可以被相同或不同的酶切割的多个可切割的报告物分子。因此，对照或归一化值报告物可以与实验报告物(例如，免疫学酶敏感的报告物)一起包含在单个载体上。例如，活性传感器可以是多臂聚乙二醇(peg)骨架，其连接至作为可切割的分析物的四个或更多个多肽报告物。可切割的接头对不同的酶是特异性的，所述酶的活性是待监测的病况(例如，癌性组织中的某个阶段或进展或免疫应答)的特征。当施用于患者时，活性传感器定位于靶组织，在靶组织中它们被酶切割以释放可检测的分析物。在患者样本(如尿液)中检测分析物。检测到的分析物可以用作组织中哪些酶具有活性的报告，从而作物作为相关病况或活性的报告。9.在各种实施方案中，实验活性传感器可以包括具有对免疫学酶敏感的可切割的报告物的肿瘤定位的活性传感器，其可用于i-o治疗应答的预测以及癌症进展和演变的详细监测。通过对照和归一化值数据进行情境化，i-o报告物水平可以有助于预测治疗应答、分期疾病进展并监测治疗功效。实验活性传感器可以包含对在包括炎症和细胞凋亡的免疫应答中差异表达的蛋白酶敏感的可切割的接头。还可以包括对与自然肿瘤进展相关的坏死细胞死亡相关的蛋白酶敏感的活性传感器，以提供关于癌症进展的额外信息。炎症/细胞凋亡相关蛋白酶水平与坏死相关蛋白酶水平的比较可以提供癌症进展和i-o治疗应答的更详细的视图。10.半胱天冬酶(半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸天冬氨酸酶或半胱氨酸依赖性天冬氨酸定向蛋白酶)与程序性细胞死亡(例如，细胞凋亡)和炎症相关，因此，如本文所述用半胱天冬酶可切割报告物工程化的活性传感器可以提供指示免疫应答的合成生物标志物。指示免疫应答的其他蛋白酶包括丝氨酸蛋白酶，如颗粒酶、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶g、蛋白酶3、胃促胰酶(chymase)和类胰蛋白酶。如下文所述，那些合成生物标志物可以包含调节结构域以将活性传感器定位于肿瘤，以便提供可用于将i-o治疗功效与全身性或脱靶免疫应答区分开的肿瘤特异性的免疫应答情况。11.活性传感器可以包含经由可切割的接头与一种或多种可检测的分析物连接的分子载体结构。如通过活性传感器报告物水平在患者样本中测量并通过对照和/或归一化值数据情境化的免疫学酶的存在和量可以用于确定患者的先天、人工或增强的免疫肿瘤学应答。例如，如通过与非靶向免疫学酶敏感的活性传感器对照的比较/对其归一化所验证的来自肿瘤定位的活性传感器的半胱天冬酶和丝氨酸蛋白酶报告物的基线信号可以指示当在治疗后测量时的非应答性肿瘤或当在治疗前测量时的免疫学上的冷肿瘤。免疫学上的冷肿瘤的指征可以指示患者对检查点抑制剂不太可能有应答。治疗前测量的来自肿瘤定位的活性传感器的半胱天冬酶和丝氨酸蛋白酶报告物的轻微升高的信号可以指示免疫学上的热肿瘤，其中患者可能是检查点抑制剂的良好候选者。在治疗期间或之后测量的来自肿瘤定位的活性传感器的半胱天冬酶和丝氨酸蛋白酶报告物的高信号可以指示期望的免疫肿瘤学应答。在上述情况中的任何一种下，靶特异性免疫学酶的基线、轻微升高或高度升高的水平的确定可以包括与对照报告物如非靶向免疫学酶的水平进行比较。12.报道的坏死相关蛋白酶如钙蛋白酶和组织蛋白酶的水平可以提供关于坏死性细胞死亡的信息，以补充免疫肿瘤学信息，并有助于区分肿瘤进展和假性进展。对照水平(例如，非靶向的坏死相关蛋白酶)可以有助于提供肿瘤特异性坏死的清晰情况。13.使用本发明的活性传感器提供的信息可以用于区分热肿瘤和冷肿瘤。免疫学上的冷肿瘤是指具有较少的浸润性t细胞的肿瘤，这些肿瘤不引起免疫系统的强烈应答。相比之下，热肿瘤含有高水平的浸润性t细胞和更多抗原，并且更可能引发强烈的免疫应答。因此，已经被患者的免疫系统识别为靶标的热肿瘤可能是被动治疗(如简单地增强患者的现有免疫应答的检查点抑制剂)的良好候选者。肿瘤特异性免疫应答与指示一般免疫系统活性的对照值的比较可以有助于识别免疫学上的热肿瘤。14.在某些实施方案中，周期性地施用和测量充当合成生物标志物、核酸、蛋白质、染料等的i-o活性传感器，以提供各种酶水平的按时间顺序的映射。除了时间点信息外，还可以检查各种酶水平测量值的变化率，以提供速度信息。此类图可用于提供健康指征，其甚至可应用于健康个体，并且提供了疾病进展和治疗应答的传统纵向监测以外的另一个数据点。在此类速度分析中，跨样本的归一化对于抑制样本变异性的任何影响非常重要。15.在各种实施方案中，活性传感器可以采取天然抗脱靶降解的环肽形式。靶环境可以是特异性的酶或一组酶在其中差异表达的肿瘤微环境。可以用对肿瘤中的酶(例如，在肿瘤中优先表达的独特酶)或对用于归一化的对照酶特异的切割位点对环肽进行工程化。以其环状形式存在的工程化的肽可以行进穿过血液和其他潜在的恶劣环境，受保护以免于被常见的非特异性蛋白酶降解，并且不以有意义的方式与脱靶组织相互作用。只有当到达特异性靶组织内并暴露于所需的酶或酶的组合时，环肽才被切割以产生能够清除和样本观察的线性分子。出于本技术的目的，并且如考虑到其详细描述将是显而易见的，线性肽是任何非环状的肽。因此，例如，线性化的肽可以具有各种支链。16.环肽可以用其他可切割的连接(linkage)进行工程化，如以环状酯肽(depsipeptide)形式存在的酯键，其中酯键的降解释放出准备与其靶环境反应的线性化的肽。在环肽中可以包含硫酯和其他可调键，以在血浆或其他环境中产生定时释放。参见lin和anseth,2013biomaterialsscience(第三版),第716-728页，其通过引用并入本文。17.大环肽可能含有两个或更多个蛋白酶特异性切割序列，并且可能需要两个或更多个蛋白酶依赖性水解事件以释放报告物肽或生物活性化合物。在各种实施方案中，蛋白酶特异性序列可以不同。在其中需要切割多个位点以释放线性化的肽的情况下，不同的蛋白酶特异性序列可以增加释放的特异性，因为将需要存在至少两种不同的靶特异性酶。特异性和非特异性蛋白水解敏感性和速率可以通过操纵肽序列内容、长度和环化化学来调节。18.活性传感器可以包含额外的分子结构，以影响肽在体内的转运，或颗粒的酶促切割或其他代谢降解的定时。为了用作对照和归一化，将实验活性传感器靶向一个位置而将对照活性传感器靶向另一个位置可能是有利的。该任务可以由起调节结构域作用的分子结构、额外的分子亚基或接头来执行，它们被身体作用以在受控的定时下将活性传感器定位于靶组织。例如，调节结构域可以将颗粒靶向特定组织或细胞类型。可以通过在载体聚合物中添加分子结构来影响转运，例如，通过增加peg骨架的大小来减缓体内的降解。附图说明19.图1图示了用于监测癌症进展的方法的步骤。20.图2显示了活性传感器。21.图3显示了工程化的大环肽。具体实施方式22.本发明通过使用定位的活性传感器报告免疫学上相关酶的差异表达，以及使用对照或归一化报告物来将该数据上下文化，提供了癌症相关免疫应答的详细信息。此类活性传感器可以包含多种报告物分子，所述报告物分子在体液样本(如尿液)中是可检测的，但仅在接触到与定位的免疫应答、癌症进展或对照指标相关联的切割酶时从体内释放。因此，样本中实验报告物的检测指示靶组织中酶的差异表达和相关免疫活性(例如，免疫治疗应答或免疫学上的热肿瘤)的存在。患者样本中对照报告物的检测和水平可用于验证结果、排除测定问题故障以及使样本或患者之间的数据归一化。通过优先靶向癌性组织和工程化对在各种条件下差异表达的酶特异的切割位点，本发明的活性传感器可以提供对癌症进展和预测的或实际的免疫-治疗应答的洞察，这在现有的成像或全身性监测技术中是不可能的，并且可以用指示测定功能性和背景或脱靶活性的对照水平将该数据情境化。23.图1示出了用于监测癌症进展的方法100的步骤。在步骤105，将活性传感器施用于患者。患者可能被怀疑患有癌症、已知患有癌症(活动期或缓解期)、处于发展癌症的风险和/或正在经历癌症治疗，包括免疫肿瘤学(i-o)疗法。活性传感器包含通过可切割的接头与载体连接的报告物(例如，如图2和3所示)。实验性可切割的接头对其水平指示肿瘤环境中的特征的酶(例如，在扩展的肿瘤或消退的肿瘤中上调的酶，或指示活性或抑制的免疫应答的酶)敏感。还包含对照可切割的接头。它们可以与实验性可切割的接头位于同一载体上，或者位于单独的载体上。如本文所讨论的，取决于活性传感器被工程化以报告的酶活性和患者的疾病和治疗状态，从患者样本中的报告物水平获得的信息可以用于诊断和/或分期疾病、监测进展、预测对给定疗法的应答性、和监测治疗有效性，包括区分抗肿瘤免疫应答、一般免疫应答和肿瘤进展。对照报告物用于将使用实验报告物获得的数据置于上下文中理解或归一化。可以通过任何合适的方法施用活性传感器。在优选的实施方案中，活性传感器被静脉内递送或雾化并例如经由雾化器被递送至肺。在其他示例中，活性传感器可以经皮、皮内、动脉内、病变内、瘤内、颅内、关节内、瘤内、肌内、皮下、口服、局部、定位、吸入、注射、输注或通过本领域已知的其他方法或任何组合(参见，例如，remington’spharmaceuticalsciences(1990)，通过引用并入)施用于对象。24.在步骤110，在施用活性传感器并在靶组织中定位活性传感器之后，在存在特征指示酶的情况下，在接头的切割时选择性地释放报告物。定位可以通过使用包含优先集中在靶组织(例如，怀疑含有癌细胞或通常集中在肿瘤中的特定组织)中的部分的调节结构域来实现。在释放报告物时，它可以在转运到血流和肾清除之后被身体清除到能够非侵入性收集的流体如尿液中。在各种实施方案中，对照报告物可以被靶组织中差异表达的酶切割，而与疾病状态无关。样本中此类报告物的存在提供了活性传感器到达靶组织以及组织状态报告物水平(例如，癌症进展相关或免疫学酶报告物水平)可以归因于靶组织。在某些实施方案中，对照报告物可以存在于非靶向的活性传感器上，即不定位于靶组织的传感器上。此类对照报告物可以被与实验报告物相同的酶切割，以提供用于靶特异性报告物信息的归一化的脱靶酶水平。例如，免疫学酶或癌症特异性酶报告物水平可以除以上述对照报告物水平中的任何一种，以使i-o应答数据归一化。例如，免疫学酶敏感的活性传感器可以靶向肿瘤组织，以提供对肿瘤组织特异性的免疫学应答信息。在某些实施方案中，在步骤105可以共同施用非靶向免疫学酶敏感的活性传感器，以在步骤120提供一般免疫系统活性的比较水平。靶特异性水平可以除以非靶特异性水平，以使一般免疫应答归一化，并提供抗肿瘤免疫应答的更准确的情况。25.在步骤115，可以收集样本(如尿液样本)以用于分析。在步骤120，可以分析样本，并且可以检测样本中报告物的存在和/或水平。26.在步骤125，可以使用对照报告物水平使实验报告物水平归一化。在某些实施方案中，对照报告物的水平也可以用作归一化值。归一化可以通过用目标报告物水平除以对照报告物值来消除样本间的变异性。因此，可以过滤掉在不同测定中的步骤105-120期间可能发生的任何测定变异性，以提供跨过测定的实验酶水平的更精确的跟踪。归一化可以用于控制患者与患者或单个患者在不同时间进行的测定的差异。27.免疫学酶可以是作为免疫应答的一部分产生的酶。例如，免疫学酶可以包括由免疫细胞产生的酶。28.在某些实施方案中，测试酶敏感的报告物水平(例如，报告免疫学酶或其它条件指示性酶活性)可以针对对与疾病无关的普遍存在的或靶特异性酶敏感的对照报告物的水平进行归一化。此类对照水平表明了一般的测定功能，并且使用它们进行的归一化可以有助于抹平样本间的差异，这在依赖于报告物测量的样本间比较的i-o疗法监测技术中可能是尤其有用的。29.在步骤127，由报告物的存在指示的酶水平可以用于确定与观察到的差异表达相关的特征。如上所述，取决于工程化到所用的活性传感器中的酶敏感性，报告物水平可以用于监测疾病进展和i-o疗法应答或预测对各种治疗的应答性(例如，确定肿瘤的热或冷状态)。可以在分析中使用对照报告物的水平来确定特征。例如，在用于肺癌的i-o分析应用中，在步骤105，免疫学酶敏感的活性传感器可以与肺特异性酶敏感的活性传感器共同施用。然后，在步骤120检测患者样本中的肺特异性对照报告物，表明活性传感器到达靶组织，并且在样本中发现的免疫学酶敏感的报告物水平可能归因于抗肿瘤应答而不是脱靶免疫应答。另一方面，在没有相应肺特异性报告物的患者样本中存在免疫学酶敏感的报告物，可能表明由脱靶免疫系统应答导致的假阳性结果。对照报告物还可以通过提供指示成功测定的基线信号来防止假阴性结果。在步骤120，检测患者样本中的靶特异性或非靶向的对照报告物的失败可以指示测定已经失败，并且不应当得出临床结论或者应当重复该过程。30.在某些实施方案中，对照报告物可以被分期以沿着施用途径的各个阶段被酶切割，使得随后的分析可以帮助排除测定故障，其中存在于患者样本中的报告物的踪迹指示沿着施用途径哪里可能发生问题。例如，可摄取的肺靶向活性传感器可以包含对胃肠道、肝脏、血液和肺组织特异性的酶敏感的可切割的报告物。单独存在胃肠道和肝脏报告物可能表明在报告物从肝脏转移到血流中存在问题，这可以有助于排除测定故障。在某些实施方案中，活性传感器可以包含对于不是预期施用途径的一部分的组织可被脱靶组织特异性酶切割并且可以提供关于脱靶摄取的信息的报告物。31.已知几种蛋白酶与炎症和程序性细胞死亡(例如，包括细胞凋亡、细胞焦亡和坏死性凋亡)有关。这些蛋白酶的定位水平相应地指示免疫系统活性。类似地，如由对照报告物所示，这些蛋白酶的脱靶或全身性水平指示一般免疫系统活性，并且可以与肿瘤组织活性进行比较以使该数据归一化。半胱天冬酶(半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸天冬氨酸酶或半胱氨酸依赖性天冬氨酸定向蛋白酶)是这样的蛋白酶家族，在其活性位点中包含半胱氨酸，其仅在天冬氨酸残基后亲核切割靶蛋白。半胱天冬酶-1、半胱天冬酶-4、半胱天冬酶-5和半胱天冬酶-11与炎症有关。丝氨酸蛋白酶也在细胞凋亡和炎症中起作用，因此它们的差异表达也指示免疫应答。免疫细胞表达丝氨酸蛋白酶，如颗粒酶、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶g、蛋白酶3、胃促胰酶和类胰蛋白酶。32.在各种实施方案中，区分指示免疫应答的程序性细胞死亡和在肿瘤进展期间自然发现的坏死可能是有用的。与其中半胱天冬酶和丝氨酸蛋白酶是主要蛋白酶的程序性细胞死亡相反，钙蛋白酶和溶酶体蛋白酶(例如，组织蛋白酶b和d)是坏死中的关键蛋白酶。因此，由活性传感器报告物测量值指示的钙蛋白酶和组织蛋白酶水平可以提供关于坏死性细胞死亡的信息，以补充免疫肿瘤学信息。33.本发明的活性传感器和方法可以应用于i-o治疗以观察患者的i-o药物应答。例如，可以在i-o治疗期间或之后施用具有对半胱天冬酶、丝氨酸蛋白酶、钙蛋白酶和组织蛋白酶敏感的切割位点的活性传感器，并且患者样本中的报告物水平可以用于监测治疗应答。患者样本中半胱天冬酶或丝氨酸蛋白酶的基线信号指示非应答性的肿瘤。基线水平可以通过例如使用非靶向的对照活性传感器来确定。基线水平还可以通过从患者群体中收集的数据或从经历治疗的患者中收集的治疗前数据通过实验确定。在治疗期间或之后半胱天冬酶和丝氨酸蛋白酶的信号相对于基线水平的增加可以指示期望的免疫肿瘤学应答。跟踪钙蛋白酶或组织蛋白酶信号的水平可以提供关于可能与肿瘤进展相关的非免疫学细胞死亡的额外信息。对照报告物的水平可用于归一化跨样本的数据，以说明测定变异性。34.活性传感器充当合成生物标志物，所述生物标志物可以被编程以通过工程化活性传感器中的酶特异性切割位点来提供特异性靶组织中任何酶水平的非侵入性报告。当施用于患者时，活性传感器使用例如靶特异性调节结构域定位于靶组织。一旦定位，它们就会被酶切割，以释放可检测的分析物。在患者样本(如尿液样本)中检测分析物。检测到的分析物用作组织中哪些酶是活性的报告，从而用作相关病况或活性的报告。定位允许活性传感器报告靶组织的状况，而不污染脱靶信息。该能力可用于区分指示成功的i-o治疗的抗肿瘤免疫应答与例如可能响应于病毒感染发生的脱靶免疫应答。全身性分布或定位的能力也可用于提供包含靶报告物的全身性水平或对照酶的靶特异性水平的对照数据。例如，免疫学酶(如半胱天冬酶或丝氨酸蛋白酶)的普遍增加可能是由全身性或脱靶免疫应答(如病毒感染)引起的。本发明提供关于免疫系统活性的肿瘤特异性信息以及关于背景免疫活性的对照数据的能力避免了将一般免疫应答误解为期望的抗肿瘤应答。35.本发明的活性传感器和方法还可以用于评估患者对i-o疗法的适用性。例如，活性传感器可以报告在患者对癌性组织的自然免疫识别和应答中差异表达的酶。此类活性传感器可以在任何i-o治疗前施用，以便区分热肿瘤和冷肿瘤。若患者具有含有高水平的浸润性t细胞和更多抗原的肿瘤，则他们可能是被动治疗(如检查点抑制剂，以增强患者现有的免疫应答)的良好候选者。检查点蛋白包括ctla-4(细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4)、pd-1(程序性细胞死亡蛋白1)和pd-l1(程序性死亡配体1)，已知这些蛋白使肿瘤免受免疫检测或应答的影响，并且已知每种蛋白的各种抑制剂。在对免疫系统识别敏感的活性传感器指示热肿瘤的情况下，可以指示此类检查点抑制剂疗法。与来自对照报告者的全身免疫学酶水平进行比较可以为建立基线水平提供必要的数据。例如，使用如本文所述的活性传感器可以观察到治疗前肿瘤中半胱天冬酶或丝氨酸蛋白酶活性水平升高的高于基线的水平，并且将指示肿瘤部位的一些免疫系统识别和活性。先天性免疫识别和应答的存在支持了这样的结论，即癌症进展依赖于检查点蛋白操作，并且检查点抑制剂的施用可能被证明对该患者有效。36.酶特异性报告物(包括实验报告物和对照报告物)可以在单个活性传感器上或在同时施用和分析的许多不同活性传感器中进行多重化。报告物分子可以对每种酶是特异性的，使得可以在多重分析中区分它们。在某些实施方案中，可以周期性地施用和测量充当合成生物标志物的i-o活性传感器，以提供各种酶水平的按时间顺序的映射。研究已经发现，生物标志物速度(生物标志物水平随时间变化的速率)可能是比任何单一阈值更好的疾病进展(或消退)指标。相同的原理可以应用于充当合成生物标志物的本发明的活性传感器。使用对照数据对来自不同测定的数据进行归一化的能力在此类速度分析中特别有用。37.活性传感器可以包含载体、与载体连接的至少一种报告物和至少一个调节结构域，当施用于对象时，所述调节结构域改变活性传感器在对象体内的分布或停留时间。活性传感器可以被设计成检测和报告体内的酶促活性，例如在免疫应答期间或在肿瘤进展或消退期间差异表达的酶。调节异常的蛋白酶在疾病如癌症的进展中具有重要的后果，因为它们可以改变细胞信号传导，帮助驱动癌细胞增殖、侵袭、血管生成、避免细胞凋亡和转移。38.可以以多种方式经由调节结构域来调节活性传感器，以便于检测体内特定细胞或特定组织中的酶促活性。例如，可以调节活性传感器以促进活性传感器向特定组织的分布或改善活性传感器在对象或特定组织中的停留时间。调节结构域可以包含，例如，定位于快速复制细胞中以更好地靶向肿瘤组织的分子。39.当施用于对象时，活性传感器被转运通过身体，并且可以从体循环扩散至特定组织，在特定组织中，报告物可以经由指示癌症进展或免疫应答的酶被切割。可检测的分析物然后可以扩散回到循环中，在循环中它可以通过肾过滤并被排泄到尿液中，由此尿液样本中可检测的分析物的检测指示靶组织中的酶促活性。40.当施用于对象时，载体可以是用于通过对象的身体转运报告物的任何合适的平台。载体可以是适合用作载体或平台的任何材料或尺寸。优选地，所述载体是生物相容性的、无毒的和无免疫原性的，并且不在施用所述载体的对象体内引发免疫应答。载体还可以用作靶向手段，以将活性传感器靶向组织、细胞或分子。在一些实施方案中，载体结构域是颗粒，如聚合物骨架。例如，载体可能通过循环导致被动靶向肿瘤或其他特定组织。其他类型的载体包含，例如，促进活性靶向组织、细胞或分子的化合物。载体的示例包括但不限于，纳米颗粒(如氧化铁或金纳米颗粒)、适体、肽、蛋白质、核酸、多糖、聚合物、抗体或抗体片段和小分子。41.载体可以包含各种材料，如铁、陶瓷、金属、天然聚合物材料如透明质酸，合成聚合物材料如聚癸二酸甘油酯，和非聚合物材料，或其组合。载体可以全部或部分包括聚合物或非聚合物材料，如氧化铝、碳酸钙、硫酸钙、磷硅酸钙、磷酸钠、铝酸钙和硅酸盐。聚合物包括但不限于：聚酰胺、聚碳酸酯、聚亚烷基、聚亚烷基二醇、聚环氧烷、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、丙烯酸和甲基丙烯酸酯的聚合物、甲基纤维素、乙基纤维素和羟丙基纤维素。不可生物降解的聚合物的示例包括乙烯乙酸乙烯酯、聚(甲基)丙烯酸、聚酰胺、共聚物及其混合物。42.生物可降解的聚合物的示例包括合成聚合物如乳酸和乙醇酸的聚合物、聚酸酐、聚氨酯和天然聚合物如藻酸盐和其他多糖(包括葡聚糖和纤维素)、胶原、白蛋白和其他蛋白质、共聚物及其混合物。一般而言，这些可生物降解的聚合物通过酶促水解或体内暴露于水、通过表面或本体侵蚀而降解。这些可生物降解的聚合物可以单独使用，作为物理混合物(共混物)，或作为共聚物使用。43.在优选的实施方案中，载体包括可生物降解的聚合物，使得无论报告物是否从载体上切割，载体都将在体内降解。通过提供可生物降解的载体，体内剩余的完整活性传感器的累积和任何相关的免疫应答或意外影响可以被最小化。44.其他生物相容性聚合物包括peg、pva和pvp，它们都是市售的。pvp是一种平均分子量在约10,000至700,000范围内的非离子型亲水性聚合物并且具有化学式(c6h9no)[n]。pvp也被称为聚[1(2-氧代-1-吡咯烷基)乙烯]。pvp是无毒的、吸湿性强的，并且易溶于水或有机溶剂。氨基酸、合成元件或合成化合物。报告物可以是质量编码的报告物，例如，具有已知且可单独识别的质量的报告物，如具有已知质量或同位素的多肽。[0054]酶可以是在活细胞中产生的加速或催化生物体的代谢过程的各种蛋白质中的任何一种。酶作用于底物。在由酶催化的反应发生之前，底物在称为活性位点的位置处与酶结合。通常，酶包括但不限于蛋白酶、糖苷酶、脂肪酶、肝素酶和磷酸酶。与对象的疾病相关的酶的示例包括但不限于mmp、mmp-2、mmp-7、mmp-9、激肽释放酶、组织蛋白酶、丝氨酸膜蛋白酶(seprase)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(g6pd)、葡糖脑苷脂酶、丙酮酸激酶、组织纤溶酶原激活物(tpa)、崩解剂和金属蛋白酶(adam)、adam9、adam15和基质蛋白酶。检测到的酶促活性可以是任何类型的酶的活性，例如蛋白酶、激酶、酯酶、肽酶、酰胺酶、氧化还原酶、转移酶、水解酶、切割酶、异构酶或连接酶。[0055]用于疾病相关酶的底物的示例包括但不限于白细胞介素1β、igfbp-3、tgf-β、tnf、fasl、hb-egf、fgfr1、核心蛋白聚糖、vegf、egf、il2、il6、pdgf、成纤维细胞生长因子(fgf)和mmp组织抑制剂(timp)。指示免疫应答的酶可以包括，例如，组织重塑酶。[0056]调节结构域可以包含任何合适的材料，当将所述活性传感器施用于对象时，所述材料改变所述活性传感器在对象体内的分布或停留时间。例如，调节结构域可以包含peg、pva或pvp。在另一实施方案中，调节结构域可以包含多肽、肽、核酸、多糖、挥发性有机化合物、疏水链或小分子。[0057]图2显示了具有载体205、报告物207和调节结构域215的活性传感器200。如所示出的，载体205是生物相容性骨架，其包含共价连接的聚乙二醇马来酰亚胺(peg-mal)的多个亚基。载体205是分子量在约20kda和80kda之间的8臂peg-mal骨架。报告物207是包含对鉴定的蛋白酶敏感的区域的多肽。鉴定的蛋白酶切割报告物的活性表明疾病。报告物207包含与可检测的分析物210连接的可切割的底物221。当在可切割的底物221上发生被所鉴定的蛋白酶切割时，可检测的分析物210从活性传感器200释放，并且可以从组织中排出，从体内排泄并被检测。[0058]在各种实施方案中，活性传感器可以包含在结构上耐受体内非特异性蛋白水解和降解的环肽。环肽可以包含蛋白酶特异性底物或ph敏感键，其允许否则非反应性的环肽响应于本文所讨论的酶的存在而释放反应性报告物分子。环肽可能需要在多个切割位点处进行切割，以提高特异性。多个位点可以对相同或不同的蛋白酶具有特异性。可以使用包含2、3、4或更多个环肽结构的多环肽，所述环肽结构具有线性化或释放功能性肽或其他分子所需的酶或环境条件的各种组合。环肽可以包括酯肽，其中一个或多个酯键的水解释放线性化的肽。此类实施方案可以用于调节如血浆的环境中肽释放的定时。[0059]图3显示了具有蛋白酶特异性底物309和稳定的环化接头303的示例性环肽301。蛋白酶特异性底物309可以以任何顺序包含任何数量的氨基酸。例如，x1可以是甘氨酸。x2可以是丝氨酸。x3可以是天冬氨酸。x4可以是苯丙氨酸。x5可以是谷氨酸。x6可以是异亮氨酸。与环化接头303偶联的n-末端和c-末端包含环化残基305。可以对肽进行工程化，以解决如蛋白酶稳定性、切割位点周围的空间位阻、大环结构和肽链的刚性/柔性的问题。可以选择间隔子残基307的类型和数量，以通过改变环肽的各种功能位点之间的间隔来解决和改变许多这些性质。环化接头以及环化残基的定位和选择也可以影响上述考虑事项。调节结构域如peg和/或报告物如fam可以被包含在环肽中。[0060]生物样本可以是来自对象的其中可以检测到报告物的任何样本。例如，样本可以是组织样本(如血液样本、硬组织样本、软组织样本等)，尿液样本、唾液样本、粘液样本、粪便样本、精液样本或脑脊液样本。报告物检测[0061]从本发明的活性传感器释放的报告物分子可以通过能够直接或间接检测可检测的分析物中大量分子的存在的任何合适的检测方法来检测。例如，可以经由配体结合测定来检测报告物，该配体结合测定是涉及捕获配体与亲和药剂的结合的测试。在捕获之后，可以通过光密度、放射性发射或非辐射能量转移直接检测报告物。可替代地，可以用抗体缀合物、亲和柱、链霉亲和素-生物素缀合物、pcr分析、dna微阵列或荧光分析间接检测报告物。[0062]配体结合测定通常涉及检测步骤，如elisa(包括荧光、比色、生物发光和化学发光elisa)、纸测试条或侧向流动测定或基于珠的荧光测定。[0063]在一个示例中，基于纸的elisa测试可以用于检测尿液中释放的报告物。基于纸的elisa可以廉价地产生，如通过回流从商业固体油墨打印机沉积的蜡以在单张纸上产生测试点的阵列。当固体油墨被加热到液态或半液态时，打印的蜡渗透到纸张中，产生疏水性屏障。疏水性屏障之间的空间然后可以用作单独的反应孔。可以通过干燥单独的反应孔上的检测抗体，在纸上构成测试点，然后进行封闭和洗涤步骤来进行elisa测定。然后可以将从对象获取的尿液样本中的尿液加入到测试点中，然后可以将链霉亲和素碱性磷酸(alp)缀合物加入到测试点中，作为检测抗体。结合的alp然后可以暴露于颜色反应药剂，如bcip/nbt(5-溴-4-氯-3’‑吲哚多磷酸盐对甲苯胺盐/氯化硝基四氮唑蓝(nitro-bluetetrazoliumchloride))，其导致紫色沉淀物，表明报告物的存在。[0064]在另一示例中，挥发性有机化合物可以通过分析平台如气相色谱仪、呼吸分析仪、质谱仪，或者使用光学或声学传感器来检测。[0065]气相色谱法可以用于检测可以蒸发而不分解的化合物(例如，挥发性有机化合物)。气相色谱仪包含流动相(或移动相)和固定相，流动相是载气，例如惰性气体如氦气或非反应性的气体如氮气，固定相是惰性固体载体上的液体或聚合物的微观层，位于一片玻璃或金属管(被称为柱)内。该柱被涂覆有固定相，并且被分析的气态化合物与柱的壁相互作用，导致它们在不同时间洗脱(即，在柱中具有不同的保留时间)。化合物可以通过它们的保留时间来区分。[0066]改良的呼吸分析仪也可以用于检测挥发性有机化合物。在用于检测血液中酒精水平的传统呼吸分析仪中，对象向仪器中呼气，并且在对象的呼吸中存在的任何乙醇在阳极处被氧化成乙酸。在阴极处，大气中的氧气被还原。总体反应是乙醇氧化成乙酸和水，其产生可以被微控制器检测和量化的电流。利用其他反应的改良的呼吸分析仪可以用于检测各种挥发性有机化合物。[0067]质谱法可以用于基于质量的差异来检测和区分报告物。在质谱法中，样本被电离，例如通过用电子轰击它被电离。样本可以是固体、液体或气体。通过电离样本，一些样本的分子被分解成带电的碎片。这些离子然后可以根据它们的质荷比被分离。这通常通过加速离子并使它们经受电场或磁场中来实现，其中具有相同质荷比的离子将经历相同量的偏转。当偏转时，离子可以被能够检测带电粒子的机构(例如电子倍增器)检测到。检测到的结果可以被显示为作为质荷比的函数的检测离子的相对丰度的光谱。然后，可以通过将已知质量(如整个分子的质量)与所鉴定的质量相关联，或者通过特征性碎裂模式，来鉴定样本中的分子。[0068]当报告物包含核酸时，可以通过本领域中已知的各种测序方法(例如，传统的桑格测序方法)或通过下一代测序(ngs)来检测报告物。ngs通常是指非基于桑格的高通量核酸测序技术，其中许多(即，数千、数百万或数十亿)核酸链可以被并行测序。此类ngs测序的示例包括illumina生产的平台(例如，hiseq、miseq、nextseq、miniseq和iseq100)、pacificbiosciences生产的平台(例如，sequel和rsii)和thermofisher生产的iontorrent平台(例如，ions5、ionproton、ionpgm和ionchef系统)。应当理解，任何合适的ngs测序平台可以用于ngs以检测如本文所述的可检测的分析物的核酸。[0069]可以直接对生物样本进行分析，或者可以首先对可检测的分析物进行一定程度的纯化。例如，纯化步骤可以涉及将可检测分析物与生物样本中的其他组分分离。纯化可以包括如亲和色谱法的方法。在分析前，分离或纯化的可检测的分析物不需要100％纯的，或者甚至基本上纯的。[0070]对可检测的分析物进行检测可以提供定性评估(例如，是否存在可检测的分析物)或定量评估(例如，存在的可检测的分析物的量)，以指示酶的比较活性水平。可以通过任何手段来计算定量值，例如，通过确定样本中存在的每种级分的相对量百分比。用于进行这些类型的计算的方法是本领域已知的。[0071]可检测的分析物可以被标记。例如，当分离的可检测的分析物经受pcr时，可以将标记直接添加到核酸中。例如，使用标记的引物或标记的核苷酸进行的pcr反应将产生标记的产物。标记的核苷酸，如荧光素标记的ctp是市售的。用于将标记附着至核酸的方法是本领域普通技术人员熟知的，并且除了pcr方法之外，还包括例如缺口翻译和末端标记。[0072]适用于报告物的标记包括可通过标准方法(包括光谱方法、光化学方法、生物化学方法、电学方法、光学方法或化学方法)检测的任何类型的标记。标记可以是荧光标记。荧光标记是包含至少一个荧光团的化合物。市售的荧光标记包括，例如，荧光素亚磷酰胺、若丹明、聚甲基苯胺染料衍生物、磷光体、德克萨斯红、绿色荧光蛋白、cy3和cys。[0073]其他已知技术，如化学发光或比色法(酶促显色反应)，也可以用于检测报告物。也可以使用猝灭剂组合物，其中“供体”荧光团通过作为酶的结合位点的短桥与“受体”发色团连接。供体荧光团的信号通过被认为涉及共振能量转移(ret)的过程(如荧光共振能量转移(fret))被受体发色团猝灭。肽的切割导致发色团和荧光团的分离，淬灭剂的去除，以及从供体荧光团测量的后续信号的产生。fret对的示例包括5-羧基荧光素(5-fam)和cpq2、fam和dabcyl、cy5和qsy21、cy3和qsy7。[0074]在各种实施方案中，活性传感器可以包含配体以帮助它靶向特定组织或器官。当施用于对象时，活性传感器根据其进入身体的方式通过各种途径在体内传输。例如，如果通过静脉内施用活性传感器，则该传感器将从注射部位进入体循环，并且可能被动地通过身体进行传输。[0075]为了使活性传感器响应于特定细胞内的酶活性，在其在体内的停留时间期间的某个点，活性传感器必须进入酶的存在中并且有机会被酶切割和线性化以释放线性化的报告物或治疗分子。从靶向的角度来看，有利的是向活性传感器提供靶向其中可能存在此类感兴趣的酶的特定细胞或特定组织类型的手段。为了实现这一点，特定细胞或特定组织类型的受体的配体可以作为调节结构域提供并且与多肽连接。[0076]细胞表面受体是结合细胞的外表面上的配体的膜锚定蛋白。在一个示例中，配体可以结合配体门控的离子通道，所述离子通道是响应于配体的结合而开放的离子通道。配体门控的离子通道横跨细胞的膜，并且在中间具有亲水性通道。响应于与通道的细胞外区域结合的配体，蛋白质的结构以使得某些颗粒或离子可以通过的方式变化。通过向活性传感器提供包含在细胞表面上存在的蛋白质的配体的调节结构域，活性传感器具有更大的机会到达并进入特定细胞以检测这些细胞内的酶促活性。[0077]通过提供具有调节结构域的活性传感器，可以改变活性传感器的分布，因为配体可以经由配体与靶向的细胞上的细胞表面蛋白的结合将活性传感器靶向对象中的特定细胞或特定组织。调节结构域的配体可以选自小分子、肽、抗体、抗体的片段、核酸和适体。[0078]一旦活性传感器到达特定组织，配体也可以促进活性传感器在特定组织类型中的积累。使活性传感器在特定组织中积累增加了活性传感器的停留时间，并且为活性传感器被组织中的蛋白酶酶促切割提供了更大的机会，如果存在此类蛋白酶的话。[0079]当将活性传感器施用于对象时，它可能被免疫系统识别为外来物质并经受免疫清除，从而从未到达其中特异性酶促活性可以释放治疗化合物或报告物分子的特定细胞或特定组织。此外，免疫应答的产生可能会破坏免疫应答敏感的活性传感器的目的。为了抑制免疫检测，优选的使用生物相容性载体，使得其不引发免疫应答，例如，生物相容性载体可以包含聚乙二醇马来酰亚胺的一个或多个亚基。此外，可以改变聚乙二醇马来酰亚胺载体的分子量，以促进体内的转运并防止活性传感器被网状内皮系统清除。通过此类修改，可以改善活性传感器在体内或特定组织中的分布和停留时间。[0080]在各种实施方案中，活性传感器可以被工程化以促进跨过细胞膜的扩散。如上所述，活性传感器的细胞摄取已经被很好地记录。参见gang。还可以提供疏水链作为调节结构域以促进活性传感器跨过细胞膜的扩散，所述疏水链可以与活性传感器连接。[0081]调节结构域可以包含任何合适的促进扩散的疏水链，例如脂肪酸链，包括中性的、饱和的、(聚/单)不饱和脂肪和油(甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯)、磷脂、甾醇(类固醇醇)、动物甾醇(胆固醇)、蜡和脂溶性维生素(维生素a、维生素d、维生素e和维生素k)。[0082]在一些实施方案中，调节结构域包含细胞穿透肽。细胞穿透肽(cpp)是促进本公开的活性传感器的细胞摄入/摄取的短肽。cpp优选地具有这样的氨基酸组成，其含有高相对丰度的带正电荷的氨基酸如赖氨酸或精氨酸，或具有含有极性/带电荷的氨基酸和非极性的疏水性氨基酸的交替模式的序列。参见milletti,2012,cell-penetratingpeptides:classes,origin,andcurrentlandscape,drugdiscovtoday17:850-860，通过引用并入。合适的cpp包括文献中已知的cpp，如tat、r6、r8、r9、穿膜肽(penetratin)、pvec、rrl螺旋、shuffle和penetramax。参见kristensen,2016,cell-penetratingpeptidesastoolstoenhancenon-injectabledeliveryofbiopharmaceuticals,tissuebarriers4(2):e1178369，通过引用并入。[0083]在某些实施方案中，活性传感器可以包含生物相容性聚合物作为调节结构域以保护活性传感器免于免疫检测或抑制巨噬细胞对活性传感器的细胞摄取。[0084]当外来物质被识别为抗原时，抗体应答可能会被免疫系统触发。通常，抗体然后会附着至外来物质，形成抗原-抗体复合物，其然后被巨噬细胞和其他吞噬细胞摄取，以将这些外来物质从体内清除。因此，当活性传感器进入体内时，其可以被识别为抗原并经受免疫清除，防止活性传感器到达特定组织以检测酶促活性。为了抑制活性传感器的免疫检测，例如，可以将peg调节结构域与活性传感器连接。peg充当屏蔽，抑制通过免疫系统将活性传感器识别为外来物质。通过抑制免疫检测，调节结构域改善了活性传感器在体内或特定组织中的停留时间。[0085]通过结合具有互补形状、电荷和底物的亲水/疏水特性的口袋，酶对特异性底物具有高度特异性。因此，酶可以将非常相似的底物分子区分为化学选择性的(即，偏好化学反应的结局而不是替代反应)、区域选择性的(即，偏好化学键形成或断裂的一个方向而不是所有其他可能的方向)和立体特异性的(即，仅在立体异构体中的一个或子集上反应)。[0086]空间效应是影响离子和分子的形状(即构象)和反应性的非键相互作用，其导致空间位阻。空间位阻是由于空间体积而导致的化学反应变慢，影响分子间反应。可以对分子的各种基团进行修饰，以控制基团间的空间位阻，例如控制选择性，如用于抑制不希望的副反应。通过向活性传感器提供调节结构域，如载体和切割位点之间的间隔子残基和/或任何生物缀合残基，可以使活性传感器的组分之间的空间位阻最小化，以增加切割位点对特异性蛋白酶的可及性。可替代地，可以如上所述使用空间位阻来防止接近切割位点，直到不稳定的环化接头(例如，环状酯肽的酯键)已经被降解。此类不稳定的环化接头可以是在限定的条件(例如，ph或存在某种分析物)下水解的其他已知的化学部分，可以选择这些条件以响应于靶标环境的特定特征。[0087]在各种实施方案中，活性传感器可以包含除靶切割位点之外的d-氨基酸，以进一步防止非特异性蛋白酶活性。其他非天然氨基酸也可以被并入到肽中，包括合成的非天然氨基酸、取代的氨基酸或一种或多种d-氨基酸。[0088]在一些实施方案中，调节结构域可以包含合成聚合物，如乳酸和乙醇酸的聚合物、聚酐、聚氨酯，以及天然聚合物如藻酸盐和其他多糖(包括葡聚糖和纤维素)、胶原、白蛋白和其他亲水性蛋白质、玉米醇溶蛋白(zein)和其他醇溶蛋白和疏水性蛋白质、共聚物及其混合物。[0089]本领域技术人员将知晓在本公开的活性传感器中包含哪些肽片段作为蛋白酶切割位点。可以使用在线工具或出版物来识别切割位点。例如，在song,2012,prosper:anintegratedfeature-basedtoolforpredictingproteasesubstratecleavagesites,plosone7(11):e50300(通过引用并入)中所述的在线数据库prosper中预测了切割位点。本文所讨论的组合物、结构、方法或活性传感器中的任何一种可以包含，例如，任何合适的切割位点，以及获得任何所需分子量的任何另外的任意多肽片段。为了防止脱靶切割，切割位点外的一个或任何数量的氨基酸可以以任何量处于d和/或l形式的混合物中。援引并入[0090]在整个本公开中，对其他文件，如专利、专利申请、专利出版物、期刊、书籍、论文、网络内容进行了参考和引用。出于所有目的，所有此类文件据此通过引用以其整体并入本文。等同物[0091]除了在本文示出和描述的那些之外，本发明的各种修改及其许多另外的实施方案对于本领域技术人员来说，从本文件的全部内容(包括参考在本文中引用的科学和专利文献)将变得显而易见。本文中的主题含有重要的信息、例证和指导，这些信息、例证和指导可以适用于本发明在其各种实施方案及其等同物中的实践。当前第1页12当前第1页12
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：：2.诊断和监测疾病(如癌症)通常涉及侵入性和痛苦的过程(如组织活检)。生物标志物可以提供用于跟踪内部现象的非侵入性的途径，但其范围受到自然发生的现象相关分子的要求和我们对该联系的理解的限制。发现新的天然生物标志物是麻烦的过程。最近的发展包括合成生物标志物，该生物标志物被工程化以响应于体内的各种条件释放可检测的分子。然而，确认报告物数据的来源、排除靶特异性报告物故障以及消除样本间的变异性都呈现了对使用合成生物标志物进行准确报告的障碍。3.此类生物标志物在肿瘤免疫疗法或免疫肿瘤学(i-o)领域具有有前景的应用。免疫肿瘤学是最近发展的领域，其在治疗各种形式的癌症方面已经显示出前景。i-o是指利用患者自身的免疫系统来攻击他们的癌症。i-o是广泛的类别，并且包括被动技术以及主动技术。被动技术涉及通过例如免疫检查点抑制剂(例如，ctla-4阻滞剂、pd-1抑制剂或pd-l1抑制剂)增强患者现有的抗肿瘤免疫应答，这些免疫检查点抑制剂可以破坏肿瘤抵抗免疫系统攻击的防御。主动技术包括靶向的免疫疗法，如编程为靶向肿瘤特异性抗原的工程化的car-t细胞。不幸的是，在没有侵入性活检或潜在地误导性成像的情况下洞察肿瘤环境是困难的，因此合成生物标志物的应用有利。也就是说，在现有的非侵入性诊断和监测测定中可能难以消除假阴性。此外，在癌症免疫疗法的情况下，可能需要区分定位的抗肿瘤免疫应答和全身免疫系统活性，这可能证明是困难的，即使使用来自合成生物标志物的信息。技术实现要素：4.本发明提供了可用于疾病和治疗功效的非侵入性检测和监测的报告物。根据本发明，活性传感器用于验证结果，并校准诊断和治疗测定。在一个实施方案中，本发明包括归一化值(normalizer)和对照报告物用于检测癌症进展的酶活性特征、定位的免疫系统活性和免疫治疗应答的用途。如本文所述，活性传感器提供合成生物标志物，该合成生物标志物可以施用于患者并定位于靶组织以释放指示靶标处酶活性的可检测的报告物分子。此类靶向肿瘤组织并被工程化以报告指示免疫应答或肿瘤进展的酶活性的活性传感器可用于评估患者对免疫肿瘤学疗法的应答和监测疾病状态。然而，i-o疗法中报告物水平的分析通常是比较性的，因此，依赖于对基线酶活性的理解，并且需要监测该活性随时间的变化。来自跨过不同时间点获取的样本的测量值涉及样本间的变异性，其必须被考虑。来自本发明的对照报告物的值作为归一化值，可以帮助消除该变异性，以提供对疾病进展和治疗应答的更准确的评估。此外，免疫系统活性不一定是抗肿瘤活性，因此，评估i-o疗法需要区分抗肿瘤和一般免疫应答。本发明的对照和归一化值报告物可以通过提供靶组织中活性传感器定位的确认和通过提供用于肿瘤特异性免疫系统活性的比较分析的脱靶免疫系统活性的水平来提供这种区分。5.对照可以包括一般的靶特异性报告物(例如，无论疾病状态如何，对靶组织中差异表达的酶有应答)。样本中此类报告物的存在提供了活性传感器到达靶组织以及组织状态报告物水平(例如，癌症进展相关或免疫学酶报告物水平)可以归因于靶组织。例如，在肺癌的i-o分析应用中，免疫学酶敏感的活性传感器可以与肺特异性酶敏感的活性传感器共同施用。患者样本中肺特异性报告物的存在表明活性传感器到达了靶组织，并且样本中发现的免疫学酶敏感的报告物水平可能归因于抗肿瘤应答，而不是脱靶免疫应答。另一方面，在没有相应肺特异性报告物的患者样本中存在免疫学酶敏感的报告物，可能表明由脱靶免疫系统应答导致的假阳性结果。6.对照报告物还可以通过提供指示成功测定的基线信号来防止假阴性结果。在上述示例中，在患者样本中缺少一般肺特异性报告物和免疫学酶敏感的报告物两者可以指示测定已经失败，并且不应当得出关于缺乏抗肿瘤应答的临床结论。在某些实施方案中，对照报告物可以被分期以沿着施用途径的各个阶段被酶切割，使得随后的分析可以帮助排除测定故障，其中存在于患者样本中的报告物的踪迹指示沿着施用途径哪里可能发生问题。7.对照报告物的水平也可以作为归一化值。归一化的主要目的是通过校正除了报告物靶标以外的因素的数据来消除样本间的变异性。归一化可以通过将目标报告物水平除以第二对照值来实现。免疫学酶或癌症特异性酶报告物水平可以除以上述对照报告物水平中的任何一种，以使i-o应答数据归一化。例如，如下所述，免疫学酶敏感的活性传感器可以靶向肿瘤组织，以提供对肿瘤组织特异性的免疫应答信息。在某些实施方案中，可以共同施用非靶向免疫学酶敏感的活性传感器，以提供一般免疫系统活性的比较水平。靶特异性水平可以除以非靶特异性水平，以使一般免疫应答归一化，并提供抗肿瘤免疫应答的更准确的图片。8.在某些实施方案中，测试酶敏感的报告物水平(例如，报告免疫学酶或其它条件指示酶活性)针对对与疾病无关的普遍存在的或靶特异性酶敏感的对照报告物的水平进行归一化。此类对照水平表明了一般的测定功能，并且使用它们进行的归一化可以有助于平滑样本间的差异，这在依赖于报告物测量的样本间比较的i-o疗法监测技术中可能是尤其有用的。如本文所述，活性传感器充当合成生物标志物，该合成生物标志物可以被编程以通过工程化活性传感器中的酶特异性切割位点来提供特异性靶组织中任何酶水平的非侵入性报告。在某些实施方案中，归一化值报告物和实验报告物可以包含在单独的载体上。在优选的实施方案中，活性传感器可以包含可以被相同或不同的酶切割的多个可切割的报告物分子。因此，对照或归一化值报告物可以与实验报告物(例如，免疫学酶敏感的报告物)一起包含在单个载体上。例如，活性传感器可以是多臂聚乙二醇(peg)骨架，其连接至作为可切割的分析物的四个或更多个多肽报告物。可切割的接头对不同的酶是特异性的，所述酶的活性是待监测的病况(例如，癌性组织中的某个阶段或进展或免疫应答)的特征。当施用于患者时，活性传感器定位于靶组织，在靶组织中它们被酶切割以释放可检测的分析物。在患者样本(如尿液)中检测分析物。检测到的分析物可以用作组织中哪些酶具有活性的报告，从而作物作为相关病况或活性的报告。9.在各种实施方案中，实验活性传感器可以包括具有对免疫学酶敏感的可切割的报告物的肿瘤定位的活性传感器，其可用于i-o治疗应答的预测以及癌症进展和演变的详细监测。通过对照和归一化值数据进行情境化，i-o报告物水平可以有助于预测治疗应答、分期疾病进展并监测治疗功效。实验活性传感器可以包含对在包括炎症和细胞凋亡的免疫应答中差异表达的蛋白酶敏感的可切割的接头。还可以包括对与自然肿瘤进展相关的坏死细胞死亡相关的蛋白酶敏感的活性传感器，以提供关于癌症进展的额外信息。炎症/细胞凋亡相关蛋白酶水平与坏死相关蛋白酶水平的比较可以提供癌症进展和i-o治疗应答的更详细的视图。10.半胱天冬酶(半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸天冬氨酸酶或半胱氨酸依赖性天冬氨酸定向蛋白酶)与程序性细胞死亡(例如，细胞凋亡)和炎症相关，因此，如本文所述用半胱天冬酶可切割报告物工程化的活性传感器可以提供指示免疫应答的合成生物标志物。指示免疫应答的其他蛋白酶包括丝氨酸蛋白酶，如颗粒酶、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶g、蛋白酶3、胃促胰酶(chymase)和类胰蛋白酶。如下文所述，那些合成生物标志物可以包含调节结构域以将活性传感器定位于肿瘤，以便提供可用于将i-o治疗功效与全身性或脱靶免疫应答区分开的肿瘤特异性的免疫应答情况。11.活性传感器可以包含经由可切割的接头与一种或多种可检测的分析物连接的分子载体结构。如通过活性传感器报告物水平在患者样本中测量并通过对照和/或归一化值数据情境化的免疫学酶的存在和量可以用于确定患者的先天、人工或增强的免疫肿瘤学应答。例如，如通过与非靶向免疫学酶敏感的活性传感器对照的比较/对其归一化所验证的来自肿瘤定位的活性传感器的半胱天冬酶和丝氨酸蛋白酶报告物的基线信号可以指示当在治疗后测量时的非应答性肿瘤或当在治疗前测量时的免疫学上的冷肿瘤。免疫学上的冷肿瘤的指征可以指示患者对检查点抑制剂不太可能有应答。治疗前测量的来自肿瘤定位的活性传感器的半胱天冬酶和丝氨酸蛋白酶报告物的轻微升高的信号可以指示免疫学上的热肿瘤，其中患者可能是检查点抑制剂的良好候选者。在治疗期间或之后测量的来自肿瘤定位的活性传感器的半胱天冬酶和丝氨酸蛋白酶报告物的高信号可以指示期望的免疫肿瘤学应答。在上述情况中的任何一种下，靶特异性免疫学酶的基线、轻微升高或高度升高的水平的确定可以包括与对照报告物如非靶向免疫学酶的水平进行比较。12.报道的坏死相关蛋白酶如钙蛋白酶和组织蛋白酶的水平可以提供关于坏死性细胞死亡的信息，以补充免疫肿瘤学信息，并有助于区分肿瘤进展和假性进展。对照水平(例如，非靶向的坏死相关蛋白酶)可以有助于提供肿瘤特异性坏死的清晰情况。13.使用本发明的活性传感器提供的信息可以用于区分热肿瘤和冷肿瘤。免疫学上的冷肿瘤是指具有较少的浸润性t细胞的肿瘤，这些肿瘤不引起免疫系统的强烈应答。相比之下，热肿瘤含有高水平的浸润性t细胞和更多抗原，并且更可能引发强烈的免疫应答。因此，已经被患者的免疫系统识别为靶标的热肿瘤可能是被动治疗(如简单地增强患者的现有免疫应答的检查点抑制剂)的良好候选者。肿瘤特异性免疫应答与指示一般免疫系统活性的对照值的比较可以有助于识别免疫学上的热肿瘤。14.在某些实施方案中，周期性地施用和测量充当合成生物标志物、核酸、蛋白质、染料等的i-o活性传感器，以提供各种酶水平的按时间顺序的映射。除了时间点信息外，还可以检查各种酶水平测量值的变化率，以提供速度信息。此类图可用于提供健康指征，其甚至可应用于健康个体，并且提供了疾病进展和治疗应答的传统纵向监测以外的另一个数据点。在此类速度分析中，跨样本的归一化对于抑制样本变异性的任何影响非常重要。15.在各种实施方案中，活性传感器可以采取天然抗脱靶降解的环肽形式。靶环境可以是特异性的酶或一组酶在其中差异表达的肿瘤微环境。可以用对肿瘤中的酶(例如，在肿瘤中优先表达的独特酶)或对用于归一化的对照酶特异的切割位点对环肽进行工程化。以其环状形式存在的工程化的肽可以行进穿过血液和其他潜在的恶劣环境，受保护以免于被常见的非特异性蛋白酶降解，并且不以有意义的方式与脱靶组织相互作用。只有当到达特异性靶组织内并暴露于所需的酶或酶的组合时，环肽才被切割以产生能够清除和样本观察的线性分子。出于本技术的目的，并且如考虑到其详细描述将是显而易见的，线性肽是任何非环状的肽。因此，例如，线性化的肽可以具有各种支链。16.环肽可以用其他可切割的连接(linkage)进行工程化，如以环状酯肽(depsipeptide)形式存在的酯键，其中酯键的降解释放出准备与其靶环境反应的线性化的肽。在环肽中可以包含硫酯和其他可调键，以在血浆或其他环境中产生定时释放。参见lin和anseth,2013biomaterialsscience(第三版),第716-728页，其通过引用并入本文。17.大环肽可能含有两个或更多个蛋白酶特异性切割序列，并且可能需要两个或更多个蛋白酶依赖性水解事件以释放报告物肽或生物活性化合物。在各种实施方案中，蛋白酶特异性序列可以不同。在其中需要切割多个位点以释放线性化的肽的情况下，不同的蛋白酶特异性序列可以增加释放的特异性，因为将需要存在至少两种不同的靶特异性酶。特异性和非特异性蛋白水解敏感性和速率可以通过操纵肽序列内容、长度和环化化学来调节。18.活性传感器可以包含额外的分子结构，以影响肽在体内的转运，或颗粒的酶促切割或其他代谢降解的定时。为了用作对照和归一化，将实验活性传感器靶向一个位置而将对照活性传感器靶向另一个位置可能是有利的。该任务可以由起调节结构域作用的分子结构、额外的分子亚基或接头来执行，它们被身体作用以在受控的定时下将活性传感器定位于靶组织。例如，调节结构域可以将颗粒靶向特定组织或细胞类型。可以通过在载体聚合物中添加分子结构来影响转运，例如，通过增加peg骨架的大小来减缓体内的降解。附图说明19.图1图示了用于监测癌症进展的方法的步骤。20.图2显示了活性传感器。21.图3显示了工程化的大环肽。具体实施方式22.本发明通过使用定位的活性传感器报告免疫学上相关酶的差异表达，以及使用对照或归一化报告物来将该数据上下文化，提供了癌症相关免疫应答的详细信息。此类活性传感器可以包含多种报告物分子，所述报告物分子在体液样本(如尿液)中是可检测的，但仅在接触到与定位的免疫应答、癌症进展或对照指标相关联的切割酶时从体内释放。因此，样本中实验报告物的检测指示靶组织中酶的差异表达和相关免疫活性(例如，免疫治疗应答或免疫学上的热肿瘤)的存在。患者样本中对照报告物的检测和水平可用于验证结果、排除测定问题故障以及使样本或患者之间的数据归一化。通过优先靶向癌性组织和工程化对在各种条件下差异表达的酶特异的切割位点，本发明的活性传感器可以提供对癌症进展和预测的或实际的免疫-治疗应答的洞察，这在现有的成像或全身性监测技术中是不可能的，并且可以用指示测定功能性和背景或脱靶活性的对照水平将该数据情境化。23.图1示出了用于监测癌症进展的方法100的步骤。在步骤105，将活性传感器施用于患者。患者可能被怀疑患有癌症、已知患有癌症(活动期或缓解期)、处于发展癌症的风险和/或正在经历癌症治疗，包括免疫肿瘤学(i-o)疗法。活性传感器包含通过可切割的接头与载体连接的报告物(例如，如图2和3所示)。实验性可切割的接头对其水平指示肿瘤环境中的特征的酶(例如，在扩展的肿瘤或消退的肿瘤中上调的酶，或指示活性或抑制的免疫应答的酶)敏感。还包含对照可切割的接头。它们可以与实验性可切割的接头位于同一载体上，或者位于单独的载体上。如本文所讨论的，取决于活性传感器被工程化以报告的酶活性和患者的疾病和治疗状态，从患者样本中的报告物水平获得的信息可以用于诊断和/或分期疾病、监测进展、预测对给定疗法的应答性、和监测治疗有效性，包括区分抗肿瘤免疫应答、一般免疫应答和肿瘤进展。对照报告物用于将使用实验报告物获得的数据置于上下文中理解或归一化。可以通过任何合适的方法施用活性传感器。在优选的实施方案中，活性传感器被静脉内递送或雾化并例如经由雾化器被递送至肺。在其他示例中，活性传感器可以经皮、皮内、动脉内、病变内、瘤内、颅内、关节内、瘤内、肌内、皮下、口服、局部、定位、吸入、注射、输注或通过本领域已知的其他方法或任何组合(参见，例如，remington’spharmaceuticalsciences(1990)，通过引用并入)施用于对象。24.在步骤110，在施用活性传感器并在靶组织中定位活性传感器之后，在存在特征指示酶的情况下，在接头的切割时选择性地释放报告物。定位可以通过使用包含优先集中在靶组织(例如，怀疑含有癌细胞或通常集中在肿瘤中的特定组织)中的部分的调节结构域来实现。在释放报告物时，它可以在转运到血流和肾清除之后被身体清除到能够非侵入性收集的流体如尿液中。在各种实施方案中，对照报告物可以被靶组织中差异表达的酶切割，而与疾病状态无关。样本中此类报告物的存在提供了活性传感器到达靶组织以及组织状态报告物水平(例如，癌症进展相关或免疫学酶报告物水平)可以归因于靶组织。在某些实施方案中，对照报告物可以存在于非靶向的活性传感器上，即不定位于靶组织的传感器上。此类对照报告物可以被与实验报告物相同的酶切割，以提供用于靶特异性报告物信息的归一化的脱靶酶水平。例如，免疫学酶或癌症特异性酶报告物水平可以除以上述对照报告物水平中的任何一种，以使i-o应答数据归一化。例如，免疫学酶敏感的活性传感器可以靶向肿瘤组织，以提供对肿瘤组织特异性的免疫学应答信息。在某些实施方案中，在步骤105可以共同施用非靶向免疫学酶敏感的活性传感器，以在步骤120提供一般免疫系统活性的比较水平。靶特异性水平可以除以非靶特异性水平，以使一般免疫应答归一化，并提供抗肿瘤免疫应答的更准确的情况。25.在步骤115，可以收集样本(如尿液样本)以用于分析。在步骤120，可以分析样本，并且可以检测样本中报告物的存在和/或水平。26.在步骤125，可以使用对照报告物水平使实验报告物水平归一化。在某些实施方案中，对照报告物的水平也可以用作归一化值。归一化可以通过用目标报告物水平除以对照报告物值来消除样本间的变异性。因此，可以过滤掉在不同测定中的步骤105-120期间可能发生的任何测定变异性，以提供跨过测定的实验酶水平的更精确的跟踪。归一化可以用于控制患者与患者或单个患者在不同时间进行的测定的差异。27.免疫学酶可以是作为免疫应答的一部分产生的酶。例如，免疫学酶可以包括由免疫细胞产生的酶。28.在某些实施方案中，测试酶敏感的报告物水平(例如，报告免疫学酶或其它条件指示性酶活性)可以针对对与疾病无关的普遍存在的或靶特异性酶敏感的对照报告物的水平进行归一化。此类对照水平表明了一般的测定功能，并且使用它们进行的归一化可以有助于抹平样本间的差异，这在依赖于报告物测量的样本间比较的i-o疗法监测技术中可能是尤其有用的。29.在步骤127，由报告物的存在指示的酶水平可以用于确定与观察到的差异表达相关的特征。如上所述，取决于工程化到所用的活性传感器中的酶敏感性，报告物水平可以用于监测疾病进展和i-o疗法应答或预测对各种治疗的应答性(例如，确定肿瘤的热或冷状态)。可以在分析中使用对照报告物的水平来确定特征。例如，在用于肺癌的i-o分析应用中，在步骤105，免疫学酶敏感的活性传感器可以与肺特异性酶敏感的活性传感器共同施用。然后，在步骤120检测患者样本中的肺特异性对照报告物，表明活性传感器到达靶组织，并且在样本中发现的免疫学酶敏感的报告物水平可能归因于抗肿瘤应答而不是脱靶免疫应答。另一方面，在没有相应肺特异性报告物的患者样本中存在免疫学酶敏感的报告物，可能表明由脱靶免疫系统应答导致的假阳性结果。对照报告物还可以通过提供指示成功测定的基线信号来防止假阴性结果。在步骤120，检测患者样本中的靶特异性或非靶向的对照报告物的失败可以指示测定已经失败，并且不应当得出临床结论或者应当重复该过程。30.在某些实施方案中，对照报告物可以被分期以沿着施用途径的各个阶段被酶切割，使得随后的分析可以帮助排除测定故障，其中存在于患者样本中的报告物的踪迹指示沿着施用途径哪里可能发生问题。例如，可摄取的肺靶向活性传感器可以包含对胃肠道、肝脏、血液和肺组织特异性的酶敏感的可切割的报告物。单独存在胃肠道和肝脏报告物可能表明在报告物从肝脏转移到血流中存在问题，这可以有助于排除测定故障。在某些实施方案中，活性传感器可以包含对于不是预期施用途径的一部分的组织可被脱靶组织特异性酶切割并且可以提供关于脱靶摄取的信息的报告物。31.已知几种蛋白酶与炎症和程序性细胞死亡(例如，包括细胞凋亡、细胞焦亡和坏死性凋亡)有关。这些蛋白酶的定位水平相应地指示免疫系统活性。类似地，如由对照报告物所示，这些蛋白酶的脱靶或全身性水平指示一般免疫系统活性，并且可以与肿瘤组织活性进行比较以使该数据归一化。半胱天冬酶(半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸天冬氨酸酶或半胱氨酸依赖性天冬氨酸定向蛋白酶)是这样的蛋白酶家族，在其活性位点中包含半胱氨酸，其仅在天冬氨酸残基后亲核切割靶蛋白。半胱天冬酶-1、半胱天冬酶-4、半胱天冬酶-5和半胱天冬酶-11与炎症有关。丝氨酸蛋白酶也在细胞凋亡和炎症中起作用，因此它们的差异表达也指示免疫应答。免疫细胞表达丝氨酸蛋白酶，如颗粒酶、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶g、蛋白酶3、胃促胰酶和类胰蛋白酶。32.在各种实施方案中，区分指示免疫应答的程序性细胞死亡和在肿瘤进展期间自然发现的坏死可能是有用的。与其中半胱天冬酶和丝氨酸蛋白酶是主要蛋白酶的程序性细胞死亡相反，钙蛋白酶和溶酶体蛋白酶(例如，组织蛋白酶b和d)是坏死中的关键蛋白酶。因此，由活性传感器报告物测量值指示的钙蛋白酶和组织蛋白酶水平可以提供关于坏死性细胞死亡的信息，以补充免疫肿瘤学信息。33.本发明的活性传感器和方法可以应用于i-o治疗以观察患者的i-o药物应答。例如，可以在i-o治疗期间或之后施用具有对半胱天冬酶、丝氨酸蛋白酶、钙蛋白酶和组织蛋白酶敏感的切割位点的活性传感器，并且患者样本中的报告物水平可以用于监测治疗应答。患者样本中半胱天冬酶或丝氨酸蛋白酶的基线信号指示非应答性的肿瘤。基线水平可以通过例如使用非靶向的对照活性传感器来确定。基线水平还可以通过从患者群体中收集的数据或从经历治疗的患者中收集的治疗前数据通过实验确定。在治疗期间或之后半胱天冬酶和丝氨酸蛋白酶的信号相对于基线水平的增加可以指示期望的免疫肿瘤学应答。跟踪钙蛋白酶或组织蛋白酶信号的水平可以提供关于可能与肿瘤进展相关的非免疫学细胞死亡的额外信息。对照报告物的水平可用于归一化跨样本的数据，以说明测定变异性。34.活性传感器充当合成生物标志物，所述生物标志物可以被编程以通过工程化活性传感器中的酶特异性切割位点来提供特异性靶组织中任何酶水平的非侵入性报告。当施用于患者时，活性传感器使用例如靶特异性调节结构域定位于靶组织。一旦定位，它们就会被酶切割，以释放可检测的分析物。在患者样本(如尿液样本)中检测分析物。检测到的分析物用作组织中哪些酶是活性的报告，从而用作相关病况或活性的报告。定位允许活性传感器报告靶组织的状况，而不污染脱靶信息。该能力可用于区分指示成功的i-o治疗的抗肿瘤免疫应答与例如可能响应于病毒感染发生的脱靶免疫应答。全身性分布或定位的能力也可用于提供包含靶报告物的全身性水平或对照酶的靶特异性水平的对照数据。例如，免疫学酶(如半胱天冬酶或丝氨酸蛋白酶)的普遍增加可能是由全身性或脱靶免疫应答(如病毒感染)引起的。本发明提供关于免疫系统活性的肿瘤特异性信息以及关于背景免疫活性的对照数据的能力避免了将一般免疫应答误解为期望的抗肿瘤应答。35.本发明的活性传感器和方法还可以用于评估患者对i-o疗法的适用性。例如，活性传感器可以报告在患者对癌性组织的自然免疫识别和应答中差异表达的酶。此类活性传感器可以在任何i-o治疗前施用，以便区分热肿瘤和冷肿瘤。若患者具有含有高水平的浸润性t细胞和更多抗原的肿瘤，则他们可能是被动治疗(如检查点抑制剂，以增强患者现有的免疫应答)的良好候选者。检查点蛋白包括ctla-4(细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4)、pd-1(程序性细胞死亡蛋白1)和pd-l1(程序性死亡配体1)，已知这些蛋白使肿瘤免受免疫检测或应答的影响，并且已知每种蛋白的各种抑制剂。在对免疫系统识别敏感的活性传感器指示热肿瘤的情况下，可以指示此类检查点抑制剂疗法。与来自对照报告者的全身免疫学酶水平进行比较可以为建立基线水平提供必要的数据。例如，使用如本文所述的活性传感器可以观察到治疗前肿瘤中半胱天冬酶或丝氨酸蛋白酶活性水平升高的高于基线的水平，并且将指示肿瘤部位的一些免疫系统识别和活性。先天性免疫识别和应答的存在支持了这样的结论，即癌症进展依赖于检查点蛋白操作，并且检查点抑制剂的施用可能被证明对该患者有效。36.酶特异性报告物(包括实验报告物和对照报告物)可以在单个活性传感器上或在同时施用和分析的许多不同活性传感器中进行多重化。报告物分子可以对每种酶是特异性的，使得可以在多重分析中区分它们。在某些实施方案中，可以周期性地施用和测量充当合成生物标志物的i-o活性传感器，以提供各种酶水平的按时间顺序的映射。研究已经发现，生物标志物速度(生物标志物水平随时间变化的速率)可能是比任何单一阈值更好的疾病进展(或消退)指标。相同的原理可以应用于充当合成生物标志物的本发明的活性传感器。使用对照数据对来自不同测定的数据进行归一化的能力在此类速度分析中特别有用。37.活性传感器可以包含载体、与载体连接的至少一种报告物和至少一个调节结构域，当施用于对象时，所述调节结构域改变活性传感器在对象体内的分布或停留时间。活性传感器可以被设计成检测和报告体内的酶促活性，例如在免疫应答期间或在肿瘤进展或消退期间差异表达的酶。调节异常的蛋白酶在疾病如癌症的进展中具有重要的后果，因为它们可以改变细胞信号传导，帮助驱动癌细胞增殖、侵袭、血管生成、避免细胞凋亡和转移。38.可以以多种方式经由调节结构域来调节活性传感器，以便于检测体内特定细胞或特定组织中的酶促活性。例如，可以调节活性传感器以促进活性传感器向特定组织的分布或改善活性传感器在对象或特定组织中的停留时间。调节结构域可以包含，例如，定位于快速复制细胞中以更好地靶向肿瘤组织的分子。39.当施用于对象时，活性传感器被转运通过身体，并且可以从体循环扩散至特定组织，在特定组织中，报告物可以经由指示癌症进展或免疫应答的酶被切割。可检测的分析物然后可以扩散回到循环中，在循环中它可以通过肾过滤并被排泄到尿液中，由此尿液样本中可检测的分析物的检测指示靶组织中的酶促活性。40.当施用于对象时，载体可以是用于通过对象的身体转运报告物的任何合适的平台。载体可以是适合用作载体或平台的任何材料或尺寸。优选地，所述载体是生物相容性的、无毒的和无免疫原性的，并且不在施用所述载体的对象体内引发免疫应答。载体还可以用作靶向手段，以将活性传感器靶向组织、细胞或分子。在一些实施方案中，载体结构域是颗粒，如聚合物骨架。例如，载体可能通过循环导致被动靶向肿瘤或其他特定组织。其他类型的载体包含，例如，促进活性靶向组织、细胞或分子的化合物。载体的示例包括但不限于，纳米颗粒(如氧化铁或金纳米颗粒)、适体、肽、蛋白质、核酸、多糖、聚合物、抗体或抗体片段和小分子。41.载体可以包含各种材料，如铁、陶瓷、金属、天然聚合物材料如透明质酸，合成聚合物材料如聚癸二酸甘油酯，和非聚合物材料，或其组合。载体可以全部或部分包括聚合物或非聚合物材料，如氧化铝、碳酸钙、硫酸钙、磷硅酸钙、磷酸钠、铝酸钙和硅酸盐。聚合物包括但不限于：聚酰胺、聚碳酸酯、聚亚烷基、聚亚烷基二醇、聚环氧烷、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、丙烯酸和甲基丙烯酸酯的聚合物、甲基纤维素、乙基纤维素和羟丙基纤维素。不可生物降解的聚合物的示例包括乙烯乙酸乙烯酯、聚(甲基)丙烯酸、聚酰胺、共聚物及其混合物。42.生物可降解的聚合物的示例包括合成聚合物如乳酸和乙醇酸的聚合物、聚酸酐、聚氨酯和天然聚合物如藻酸盐和其他多糖(包括葡聚糖和纤维素)、胶原、白蛋白和其他蛋白质、共聚物及其混合物。一般而言，这些可生物降解的聚合物通过酶促水解或体内暴露于水、通过表面或本体侵蚀而降解。这些可生物降解的聚合物可以单独使用，作为物理混合物(共混物)，或作为共聚物使用。43.在优选的实施方案中，载体包括可生物降解的聚合物，使得无论报告物是否从载体上切割，载体都将在体内降解。通过提供可生物降解的载体，体内剩余的完整活性传感器的累积和任何相关的免疫应答或意外影响可以被最小化。44.其他生物相容性聚合物包括peg、pva和pvp，它们都是市售的。pvp是一种平均分子量在约10,000至700,000范围内的非离子型亲水性聚合物并且具有化学式(c6h9no)[n]。pvp也被称为聚[1(2-氧代-1-吡咯烷基)乙烯]。pvp是无毒的、吸湿性强的，并且易溶于水或有机溶剂。氨基酸、合成元件或合成化合物。报告物可以是质量编码的报告物，例如，具有已知且可单独识别的质量的报告物，如具有已知质量或同位素的多肽。[0054]酶可以是在活细胞中产生的加速或催化生物体的代谢过程的各种蛋白质中的任何一种。酶作用于底物。在由酶催化的反应发生之前，底物在称为活性位点的位置处与酶结合。通常，酶包括但不限于蛋白酶、糖苷酶、脂肪酶、肝素酶和磷酸酶。与对象的疾病相关的酶的示例包括但不限于mmp、mmp-2、mmp-7、mmp-9、激肽释放酶、组织蛋白酶、丝氨酸膜蛋白酶(seprase)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(g6pd)、葡糖脑苷脂酶、丙酮酸激酶、组织纤溶酶原激活物(tpa)、崩解剂和金属蛋白酶(adam)、adam9、adam15和基质蛋白酶。检测到的酶促活性可以是任何类型的酶的活性，例如蛋白酶、激酶、酯酶、肽酶、酰胺酶、氧化还原酶、转移酶、水解酶、切割酶、异构酶或连接酶。[0055]用于疾病相关酶的底物的示例包括但不限于白细胞介素1β、igfbp-3、tgf-β、tnf、fasl、hb-egf、fgfr1、核心蛋白聚糖、vegf、egf、il2、il6、pdgf、成纤维细胞生长因子(fgf)和mmp组织抑制剂(timp)。指示免疫应答的酶可以包括，例如，组织重塑酶。[0056]调节结构域可以包含任何合适的材料，当将所述活性传感器施用于对象时，所述材料改变所述活性传感器在对象体内的分布或停留时间。例如，调节结构域可以包含peg、pva或pvp。在另一实施方案中，调节结构域可以包含多肽、肽、核酸、多糖、挥发性有机化合物、疏水链或小分子。[0057]图2显示了具有载体205、报告物207和调节结构域215的活性传感器200。如所示出的，载体205是生物相容性骨架，其包含共价连接的聚乙二醇马来酰亚胺(peg-mal)的多个亚基。载体205是分子量在约20kda和80kda之间的8臂peg-mal骨架。报告物207是包含对鉴定的蛋白酶敏感的区域的多肽。鉴定的蛋白酶切割报告物的活性表明疾病。报告物207包含与可检测的分析物210连接的可切割的底物221。当在可切割的底物221上发生被所鉴定的蛋白酶切割时，可检测的分析物210从活性传感器200释放，并且可以从组织中排出，从体内排泄并被检测。[0058]在各种实施方案中，活性传感器可以包含在结构上耐受体内非特异性蛋白水解和降解的环肽。环肽可以包含蛋白酶特异性底物或ph敏感键，其允许否则非反应性的环肽响应于本文所讨论的酶的存在而释放反应性报告物分子。环肽可能需要在多个切割位点处进行切割，以提高特异性。多个位点可以对相同或不同的蛋白酶具有特异性。可以使用包含2、3、4或更多个环肽结构的多环肽，所述环肽结构具有线性化或释放功能性肽或其他分子所需的酶或环境条件的各种组合。环肽可以包括酯肽，其中一个或多个酯键的水解释放线性化的肽。此类实施方案可以用于调节如血浆的环境中肽释放的定时。[0059]图3显示了具有蛋白酶特异性底物309和稳定的环化接头303的示例性环肽301。蛋白酶特异性底物309可以以任何顺序包含任何数量的氨基酸。例如，x1可以是甘氨酸。x2可以是丝氨酸。x3可以是天冬氨酸。x4可以是苯丙氨酸。x5可以是谷氨酸。x6可以是异亮氨酸。与环化接头303偶联的n-末端和c-末端包含环化残基305。可以对肽进行工程化，以解决如蛋白酶稳定性、切割位点周围的空间位阻、大环结构和肽链的刚性/柔性的问题。可以选择间隔子残基307的类型和数量，以通过改变环肽的各种功能位点之间的间隔来解决和改变许多这些性质。环化接头以及环化残基的定位和选择也可以影响上述考虑事项。调节结构域如peg和/或报告物如fam可以被包含在环肽中。[0060]生物样本可以是来自对象的其中可以检测到报告物的任何样本。例如，样本可以是组织样本(如血液样本、硬组织样本、软组织样本等)，尿液样本、唾液样本、粘液样本、粪便样本、精液样本或脑脊液样本。报告物检测[0061]从本发明的活性传感器释放的报告物分子可以通过能够直接或间接检测可检测的分析物中大量分子的存在的任何合适的检测方法来检测。例如，可以经由配体结合测定来检测报告物，该配体结合测定是涉及捕获配体与亲和药剂的结合的测试。在捕获之后，可以通过光密度、放射性发射或非辐射能量转移直接检测报告物。可替代地，可以用抗体缀合物、亲和柱、链霉亲和素-生物素缀合物、pcr分析、dna微阵列或荧光分析间接检测报告物。[0062]配体结合测定通常涉及检测步骤，如elisa(包括荧光、比色、生物发光和化学发光elisa)、纸测试条或侧向流动测定或基于珠的荧光测定。[0063]在一个示例中，基于纸的elisa测试可以用于检测尿液中释放的报告物。基于纸的elisa可以廉价地产生，如通过回流从商业固体油墨打印机沉积的蜡以在单张纸上产生测试点的阵列。当固体油墨被加热到液态或半液态时，打印的蜡渗透到纸张中，产生疏水性屏障。疏水性屏障之间的空间然后可以用作单独的反应孔。可以通过干燥单独的反应孔上的检测抗体，在纸上构成测试点，然后进行封闭和洗涤步骤来进行elisa测定。然后可以将从对象获取的尿液样本中的尿液加入到测试点中，然后可以将链霉亲和素碱性磷酸(alp)缀合物加入到测试点中，作为检测抗体。结合的alp然后可以暴露于颜色反应药剂，如bcip/nbt(5-溴-4-氯-3’‑吲哚多磷酸盐对甲苯胺盐/氯化硝基四氮唑蓝(nitro-bluetetrazoliumchloride))，其导致紫色沉淀物，表明报告物的存在。[0064]在另一示例中，挥发性有机化合物可以通过分析平台如气相色谱仪、呼吸分析仪、质谱仪，或者使用光学或声学传感器来检测。[0065]气相色谱法可以用于检测可以蒸发而不分解的化合物(例如，挥发性有机化合物)。气相色谱仪包含流动相(或移动相)和固定相，流动相是载气，例如惰性气体如氦气或非反应性的气体如氮气，固定相是惰性固体载体上的液体或聚合物的微观层，位于一片玻璃或金属管(被称为柱)内。该柱被涂覆有固定相，并且被分析的气态化合物与柱的壁相互作用，导致它们在不同时间洗脱(即，在柱中具有不同的保留时间)。化合物可以通过它们的保留时间来区分。[0066]改良的呼吸分析仪也可以用于检测挥发性有机化合物。在用于检测血液中酒精水平的传统呼吸分析仪中，对象向仪器中呼气，并且在对象的呼吸中存在的任何乙醇在阳极处被氧化成乙酸。在阴极处，大气中的氧气被还原。总体反应是乙醇氧化成乙酸和水，其产生可以被微控制器检测和量化的电流。利用其他反应的改良的呼吸分析仪可以用于检测各种挥发性有机化合物。[0067]质谱法可以用于基于质量的差异来检测和区分报告物。在质谱法中，样本被电离，例如通过用电子轰击它被电离。样本可以是固体、液体或气体。通过电离样本，一些样本的分子被分解成带电的碎片。这些离子然后可以根据它们的质荷比被分离。这通常通过加速离子并使它们经受电场或磁场中来实现，其中具有相同质荷比的离子将经历相同量的偏转。当偏转时，离子可以被能够检测带电粒子的机构(例如电子倍增器)检测到。检测到的结果可以被显示为作为质荷比的函数的检测离子的相对丰度的光谱。然后，可以通过将已知质量(如整个分子的质量)与所鉴定的质量相关联，或者通过特征性碎裂模式，来鉴定样本中的分子。[0068]当报告物包含核酸时，可以通过本领域中已知的各种测序方法(例如，传统的桑格测序方法)或通过下一代测序(ngs)来检测报告物。ngs通常是指非基于桑格的高通量核酸测序技术，其中许多(即，数千、数百万或数十亿)核酸链可以被并行测序。此类ngs测序的示例包括illumina生产的平台(例如，hiseq、miseq、nextseq、miniseq和iseq100)、pacificbiosciences生产的平台(例如，sequel和rsii)和thermofisher生产的iontorrent平台(例如，ions5、ionproton、ionpgm和ionchef系统)。应当理解，任何合适的ngs测序平台可以用于ngs以检测如本文所述的可检测的分析物的核酸。[0069]可以直接对生物样本进行分析，或者可以首先对可检测的分析物进行一定程度的纯化。例如，纯化步骤可以涉及将可检测分析物与生物样本中的其他组分分离。纯化可以包括如亲和色谱法的方法。在分析前，分离或纯化的可检测的分析物不需要100％纯的，或者甚至基本上纯的。[0070]对可检测的分析物进行检测可以提供定性评估(例如，是否存在可检测的分析物)或定量评估(例如，存在的可检测的分析物的量)，以指示酶的比较活性水平。可以通过任何手段来计算定量值，例如，通过确定样本中存在的每种级分的相对量百分比。用于进行这些类型的计算的方法是本领域已知的。[0071]可检测的分析物可以被标记。例如，当分离的可检测的分析物经受pcr时，可以将标记直接添加到核酸中。例如，使用标记的引物或标记的核苷酸进行的pcr反应将产生标记的产物。标记的核苷酸，如荧光素标记的ctp是市售的。用于将标记附着至核酸的方法是本领域普通技术人员熟知的，并且除了pcr方法之外，还包括例如缺口翻译和末端标记。[0072]适用于报告物的标记包括可通过标准方法(包括光谱方法、光化学方法、生物化学方法、电学方法、光学方法或化学方法)检测的任何类型的标记。标记可以是荧光标记。荧光标记是包含至少一个荧光团的化合物。市售的荧光标记包括，例如，荧光素亚磷酰胺、若丹明、聚甲基苯胺染料衍生物、磷光体、德克萨斯红、绿色荧光蛋白、cy3和cys。[0073]其他已知技术，如化学发光或比色法(酶促显色反应)，也可以用于检测报告物。也可以使用猝灭剂组合物，其中“供体”荧光团通过作为酶的结合位点的短桥与“受体”发色团连接。供体荧光团的信号通过被认为涉及共振能量转移(ret)的过程(如荧光共振能量转移(fret))被受体发色团猝灭。肽的切割导致发色团和荧光团的分离，淬灭剂的去除，以及从供体荧光团测量的后续信号的产生。fret对的示例包括5-羧基荧光素(5-fam)和cpq2、fam和dabcyl、cy5和qsy21、cy3和qsy7。[0074]在各种实施方案中，活性传感器可以包含配体以帮助它靶向特定组织或器官。当施用于对象时，活性传感器根据其进入身体的方式通过各种途径在体内传输。例如，如果通过静脉内施用活性传感器，则该传感器将从注射部位进入体循环，并且可能被动地通过身体进行传输。[0075]为了使活性传感器响应于特定细胞内的酶活性，在其在体内的停留时间期间的某个点，活性传感器必须进入酶的存在中并且有机会被酶切割和线性化以释放线性化的报告物或治疗分子。从靶向的角度来看，有利的是向活性传感器提供靶向其中可能存在此类感兴趣的酶的特定细胞或特定组织类型的手段。为了实现这一点，特定细胞或特定组织类型的受体的配体可以作为调节结构域提供并且与多肽连接。[0076]细胞表面受体是结合细胞的外表面上的配体的膜锚定蛋白。在一个示例中，配体可以结合配体门控的离子通道，所述离子通道是响应于配体的结合而开放的离子通道。配体门控的离子通道横跨细胞的膜，并且在中间具有亲水性通道。响应于与通道的细胞外区域结合的配体，蛋白质的结构以使得某些颗粒或离子可以通过的方式变化。通过向活性传感器提供包含在细胞表面上存在的蛋白质的配体的调节结构域，活性传感器具有更大的机会到达并进入特定细胞以检测这些细胞内的酶促活性。[0077]通过提供具有调节结构域的活性传感器，可以改变活性传感器的分布，因为配体可以经由配体与靶向的细胞上的细胞表面蛋白的结合将活性传感器靶向对象中的特定细胞或特定组织。调节结构域的配体可以选自小分子、肽、抗体、抗体的片段、核酸和适体。[0078]一旦活性传感器到达特定组织，配体也可以促进活性传感器在特定组织类型中的积累。使活性传感器在特定组织中积累增加了活性传感器的停留时间，并且为活性传感器被组织中的蛋白酶酶促切割提供了更大的机会，如果存在此类蛋白酶的话。[0079]当将活性传感器施用于对象时，它可能被免疫系统识别为外来物质并经受免疫清除，从而从未到达其中特异性酶促活性可以释放治疗化合物或报告物分子的特定细胞或特定组织。此外，免疫应答的产生可能会破坏免疫应答敏感的活性传感器的目的。为了抑制免疫检测，优选的使用生物相容性载体，使得其不引发免疫应答，例如，生物相容性载体可以包含聚乙二醇马来酰亚胺的一个或多个亚基。此外，可以改变聚乙二醇马来酰亚胺载体的分子量，以促进体内的转运并防止活性传感器被网状内皮系统清除。通过此类修改，可以改善活性传感器在体内或特定组织中的分布和停留时间。[0080]在各种实施方案中，活性传感器可以被工程化以促进跨过细胞膜的扩散。如上所述，活性传感器的细胞摄取已经被很好地记录。参见gang。还可以提供疏水链作为调节结构域以促进活性传感器跨过细胞膜的扩散，所述疏水链可以与活性传感器连接。[0081]调节结构域可以包含任何合适的促进扩散的疏水链，例如脂肪酸链，包括中性的、饱和的、(聚/单)不饱和脂肪和油(甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯)、磷脂、甾醇(类固醇醇)、动物甾醇(胆固醇)、蜡和脂溶性维生素(维生素a、维生素d、维生素e和维生素k)。[0082]在一些实施方案中，调节结构域包含细胞穿透肽。细胞穿透肽(cpp)是促进本公开的活性传感器的细胞摄入/摄取的短肽。cpp优选地具有这样的氨基酸组成，其含有高相对丰度的带正电荷的氨基酸如赖氨酸或精氨酸，或具有含有极性/带电荷的氨基酸和非极性的疏水性氨基酸的交替模式的序列。参见milletti,2012,cell-penetratingpeptides:classes,origin,andcurrentlandscape,drugdiscovtoday17:850-860，通过引用并入。合适的cpp包括文献中已知的cpp，如tat、r6、r8、r9、穿膜肽(penetratin)、pvec、rrl螺旋、shuffle和penetramax。参见kristensen,2016,cell-penetratingpeptidesastoolstoenhancenon-injectabledeliveryofbiopharmaceuticals,tissuebarriers4(2):e1178369，通过引用并入。[0083]在某些实施方案中，活性传感器可以包含生物相容性聚合物作为调节结构域以保护活性传感器免于免疫检测或抑制巨噬细胞对活性传感器的细胞摄取。[0084]当外来物质被识别为抗原时，抗体应答可能会被免疫系统触发。通常，抗体然后会附着至外来物质，形成抗原-抗体复合物，其然后被巨噬细胞和其他吞噬细胞摄取，以将这些外来物质从体内清除。因此，当活性传感器进入体内时，其可以被识别为抗原并经受免疫清除，防止活性传感器到达特定组织以检测酶促活性。为了抑制活性传感器的免疫检测，例如，可以将peg调节结构域与活性传感器连接。peg充当屏蔽，抑制通过免疫系统将活性传感器识别为外来物质。通过抑制免疫检测，调节结构域改善了活性传感器在体内或特定组织中的停留时间。[0085]通过结合具有互补形状、电荷和底物的亲水/疏水特性的口袋，酶对特异性底物具有高度特异性。因此，酶可以将非常相似的底物分子区分为化学选择性的(即，偏好化学反应的结局而不是替代反应)、区域选择性的(即，偏好化学键形成或断裂的一个方向而不是所有其他可能的方向)和立体特异性的(即，仅在立体异构体中的一个或子集上反应)。[0086]空间效应是影响离子和分子的形状(即构象)和反应性的非键相互作用，其导致空间位阻。空间位阻是由于空间体积而导致的化学反应变慢，影响分子间反应。可以对分子的各种基团进行修饰，以控制基团间的空间位阻，例如控制选择性，如用于抑制不希望的副反应。通过向活性传感器提供调节结构域，如载体和切割位点之间的间隔子残基和/或任何生物缀合残基，可以使活性传感器的组分之间的空间位阻最小化，以增加切割位点对特异性蛋白酶的可及性。可替代地，可以如上所述使用空间位阻来防止接近切割位点，直到不稳定的环化接头(例如，环状酯肽的酯键)已经被降解。此类不稳定的环化接头可以是在限定的条件(例如，ph或存在某种分析物)下水解的其他已知的化学部分，可以选择这些条件以响应于靶标环境的特定特征。[0087]在各种实施方案中，活性传感器可以包含除靶切割位点之外的d-氨基酸，以进一步防止非特异性蛋白酶活性。其他非天然氨基酸也可以被并入到肽中，包括合成的非天然氨基酸、取代的氨基酸或一种或多种d-氨基酸。[0088]在一些实施方案中，调节结构域可以包含合成聚合物，如乳酸和乙醇酸的聚合物、聚酐、聚氨酯，以及天然聚合物如藻酸盐和其他多糖(包括葡聚糖和纤维素)、胶原、白蛋白和其他亲水性蛋白质、玉米醇溶蛋白(zein)和其他醇溶蛋白和疏水性蛋白质、共聚物及其混合物。[0089]本领域技术人员将知晓在本公开的活性传感器中包含哪些肽片段作为蛋白酶切割位点。可以使用在线工具或出版物来识别切割位点。例如，在song,2012,prosper:anintegratedfeature-basedtoolforpredictingproteasesubstratecleavagesites,plosone7(11):e50300(通过引用并入)中所述的在线数据库prosper中预测了切割位点。本文所讨论的组合物、结构、方法或活性传感器中的任何一种可以包含，例如，任何合适的切割位点，以及获得任何所需分子量的任何另外的任意多肽片段。为了防止脱靶切割，切割位点外的一个或任何数量的氨基酸可以以任何量处于d和/或l形式的混合物中。援引并入[0090]在整个本公开中，对其他文件，如专利、专利申请、专利出版物、期刊、书籍、论文、网络内容进行了参考和引用。出于所有目的，所有此类文件据此通过引用以其整体并入本文。等同物[0091]除了在本文示出和描述的那些之外，本发明的各种修改及其许多另外的实施方案对于本领域技术人员来说，从本文件的全部内容(包括参考在本文中引用的科学和专利文献)将变得显而易见。本文中的主题含有重要的信息、例证和指导，这些信息、例证和指导可以适用于本发明在其各种实施方案及其等同物中的实践。当前第1页12当前第1页12
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