将cart细胞重新定向到感兴趣的抗原的衔接分子1.相关申请的交叉引用2.本技术要求2020年5月27日提交的美国临时申请号63/030,653的优先权，其全部内容通过引用纳入本文。3.对序列列表的引用4.本技术包含序列表，其以ascii格式通过efs-web提交并通过引用全部内容纳入本文。该ascii副本创建于20215月26日，命名为anbop0005wo_st25.txt，并且其大小为16.4千字节。
背景技术：
：：1.
技术领域：
：5.本公开总体涉及免疫学、病毒学和医学领域。更具体地说，它涉及将表达car的免疫效应细胞重新导向任何感兴趣的抗原的桥接蛋白，以及利用其治疗疾病的方法。6.2.相关领域的描述7.最近，经工程改造的免疫效应细胞已成为治疗病毒性疾病和癌症的一种有吸引力的疗法。例如，t细胞可以经工程改造为表达嵌合抗原受体(car)，其靶向任何感兴趣的具体抗原。这种细胞能够有靶向性地杀死表达癌症标志物的细胞或任何感染病原体的细胞。尽管这些新疗法很有前景，但仍存在脱靶毒性和工程改造的细胞在治疗对象中缺乏持久性的问题。例如，肿瘤异质性和标靶抗原表达的丧失是开发有效的嵌合抗原受体(car)t细胞疗法的显著挑战。存在非常少的肿瘤特异性抗原(即仅在肿瘤细胞上表达的抗原)，而大多数是与肿瘤相关(即在肿瘤细胞上过度表达，但在健康细胞上表达程度较低)。肿瘤也有失去car靶向抗原表达的倾向，因此许多研究小组正在开发双特异性和三特异性cart细胞，以捕获更多样化的肿瘤细胞。这在b细胞恶性肿瘤的背景下得到了很好的描述，其中针对cd19、cd20和cd22的多特异性cart细胞正在临床开发中。实体瘤和实体瘤微环境是一个更大的挑战，需要克服更多的肿瘤异质性。因此，非常需要新的，更先进的靶向免疫效应细胞的方法。技术实现要素：8.本文提供了嵌合抗原受体(car)桥接蛋白，其将单特异性car-t细胞重新导向替代性或多个标靶抗原。例如，提供了融合蛋白和抗体偶联物，它们一方面与car结合，另一方面与选择的标靶抗原结合。因此，与创建多特异性car相比，本文提供的桥接蛋白通过多特异性桥接蛋白将单变体car-t细胞重新导向多种抗原。单个或多个桥蛋白可以依序或作为一个部分一起输注，以实现同时的多靶向方法。9.在一些实施方式中，本公开提供了嵌合抗原受体(car)桥接蛋白，其包含(1)抗原结合域和(2)car结合域，其包含hiv-1gp120蛋白的至少部分。在一些方面中，car结合域与抗原结合域化学偶联。在一些方面中，car桥接蛋白进一步包含抗体fc结构域。在一些方面中，fc结构域位于car结合域和抗原结合域之间。在一些方面中，car结合域位于抗原结合域和fc结构域之间。在一些方面中，car桥接蛋白进一步包含抗原结合域和car结合域之间的接头序列。在一些方面中，car结合域包含seqidno:6中提供的序列。在一些方面中，fc结构域包含人类fc结构域序列。在其他方面中，fc结构域包含人类重链fc结构域序列。在另一些方面中，fc结构域包含人类重链fc结构域序列的ch2和ch3区。在另一方面中，fc结构域相对于野生型人类重链fc结构域序列包含取代，这些取代阻止与fcgr受体结合。在其他方面，该fc结构域包含与seqidno:4提供的序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％相同性的序列。10.在一些方面中，该抗原结合域结合于肿瘤抗原或病毒抗原。在一些方面中，抗原结合域包含与感兴趣的抗原相互作用的肽。在一些方面中，抗原结合域包含识别感兴趣抗原的抗体的抗原结合部分。在一些方面中，抗原结合域包含配体的至少部分,其与感兴趣的抗原相互作用。在一些方面中，抗原结合域能够与cd19、cd20或cd22结合。在其他方面，抗原结合域能够与冠状病毒刺突蛋白结合。在另一方面中，冠状病毒刺突蛋白是sars-cov-1或sars-cov-2刺突蛋白。在一些方面中，该抗原结合域包含ace2胞外结构域的至少部分。在另一方面中，ace2胞外结构域的所述部分是ace2t结构域。在另一方面中，该ace2t结构域包含与seqidno:2的序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％相同性的序列。11.在一些方面中，car桥接蛋白进一步包含car结合域、fc域和/或抗原结合域之间的至少一个接头序列。在一些方面中，car桥接蛋白包含car结合域、fc结构域和/或抗原结合域各自之间的接头序列。在一些方面中，接头序列包含gggs的序列(seqidno:7)。在一些方面中，接头序列包含由seqidno:8提供的序列。在一些方面中，car桥接蛋白形成同二聚体。12.在其他实施方式中，本公开提供了包含car结合域和抗原结合域的嵌合抗原受体(car)桥接蛋白。在一些方面中，car结合域与抗原结合域化学偶联。在一些方面中，car桥接蛋白进一步包含抗体fc结构域。在一些方面中，fc结构域位于car结合域和抗原结合域之间。在其他方面中，car结合域位于抗原结合域和fc结构域之间。在一些方面中，car结合域包含与car胞外部分相互作用的肽。在一些方面中，car结合域包含识别car的胞外部分的抗体的抗原结合部分。在一些方面中，car结合域包含配体的至少部分,其与car胞外部分相互作用。在一些方面中，car结合域包含hiv-1gp120蛋白的至少部分。在一些方面中，car结合域包含seqidno:6中提供的序列。在某些方面中，car结合域基本上由seqidno:6中提供的序列组成。在某些方面中，car结合域由seqidno:6中提供的序列组成。13.在一些方面中，fc结构域包含人类fc结构域序列。在一些方面中，fc结构域包含人类重链fc结构域序列。在一些方面中，fc结构域包含人重链fc结构域序列的ch2和ch3区。在一些方面中，fc结构域相对于野生型人类重链fc结构域序列包含取代，这些取代阻止与fcgr受体结合。在一些方面中，该fc结构域包含与seqidno:4提供的序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％相同性的序列。在一些方面中，该抗原结合域结合于肿瘤抗原或病毒抗原。在一些方面中，抗原结合域包含与感兴趣的抗原相互作用的肽。在一些方面中，抗原结合域包含识别感兴趣抗原的抗体的抗原结合部分。在一些方面中，抗原结合域包含配体的至少部分,其与感兴趣的抗原相互作用。在一些方面中，抗原结合域能够与cd19、cd20或cd22结合。在一些方面中，抗原结合域能够与冠状病毒刺突蛋白结合。在另一些方面中，冠状病毒刺突蛋白是sars-cov-1或sars-cov-2刺突蛋白。14.在一些方面中，该抗原结合域包含ace2胞外结构域的至少部分。在一些方面中，部分ace2胞外结构域是ace2t结构域。在另一方面中，该ace2t结构域包含与seqidno:2的序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％相同性的序列。在一些方面中，car桥接蛋白进一步包含car结合域、fc结构域和/或抗原结合域之间的至少一个接头序列。在一些方面中，car桥接蛋白包含car结合域和抗原结合域，以及可选地，fc结构域之间的接头序列。在一些方面中，接头序列包含gggs的序列(seqidno:7)。在一些方面中，接头序列包含由seqidno:8提供的序列。在一些方面中，car桥接蛋白形成同二聚体。15.在其他实施方式中，本公开提供了编码本公开的car桥接蛋白的核酸分子。在一些方面中，编码car桥接蛋白的序列操作性地连接至表达控制序列。在一些方面中，核酸分子被进一步定义为表达载体。在一些方面中，表达载体是附加型载体。在一些实施方式中，表达载体是病毒载体。在另一些方面中，该病毒载体是腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒或慢病毒载体。16.在其他实施方式中，本公开提供了药物组合物，其在药学上可接受的运载体中包含本公开的car桥接蛋白。在一些方面中，药物组合物进一步包含免疫效应细胞群，所述免疫效应细胞群体包含car桥接蛋白的car结合域所结合的car多肽。17.在进一步的实施方式中，本公开提供了治疗有需要的对象的方法，该方法包括向对象施用有效量的本公开的car桥接蛋白。在一些方面中，对象先前已被施用免疫效应细胞群，所述免疫效应细胞群体包含car桥接蛋白的car结合域所结合的car多肽。在一些方面中，该方法进一步包括向对象施用有效量包含car多肽的免疫效应细胞群，car桥接蛋白的car结合域结合该car多肽。在一些方面中，细胞与对象同种异体。在一些方面中，细胞与对象自体同源。在一些方面，细胞hla匹配于对象。在一些方面中，对象具有冠状病毒感染。在一些方面中，对象具有sar-cov感染。在一些方面中，对象具有sar-cov-2感染。在一些方面中，对象患有covid-19。在一些方面中，car桥接蛋白包含(i)与seqidno:2的序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％相同性的抗原结合域；以及(ii)car结合域，其包含seqidno:6中提供的序列，并且其中car多肽包含cd4结构域作为其抗原结合域。在一些方面中，对象患有癌症。在一些方面中，car桥接蛋白包含能够与cd19、cd20或cd22结合的抗原结合域。18.在另一实施方式中，本公开提供了包含car结合域和抗原结合域的嵌合抗原受体(car)桥接蛋白。在一些方面中，抗原结合域与car结合域化学偶联。在一些方面中，抗原结合域和car结合域包含在融合蛋白中。在一些方面中，car桥接蛋白进一步包含抗体fc结构域。在一些方面中，fc结构域位于car结合域和抗原结合域之间。在其他方面中，car结合域位于抗原结合域和fc结构域之间。在一些方面中，car结合域包含与car胞外部分相互作用的肽。在一些方面中，car结合域包含识别car的胞外部分的抗体的抗原结合部分。在一些方面中，car结合域包含配体的至少部分，其与car胞外部分相互作用。在一些方面中，car结合域结合到对car的标靶具有特异性的部分car。在一些方面中，car包括scfv，并且其中car结合域结合于scfv的可变区。在一些方面中，car结合域包含抗体或其抗原结合片段。在一些方面中，car结合域包括scfv。19.在一些方面中，car结合域包含hiv-1gp120蛋白的至少部分。在一些方面中，car结合域包含seqidno:6中提供的序列。在一些方面中，car是cd19特异性car，并且car结合域结合于cd19特异性car。在一些方面中，car结合域包含抗体或其抗原结合片段。在一些方面中，car结合域包含scfv。在一些方面中，car结合域包含cd19蛋白的至少部分。在一些方面中，fc结构域包含人类fc结构域序列。在一些方面中，fc结构域包含人类重链fc结构域序列。在一些方面中，fc结构域包含人重链fc结构域序列的ch2和ch3区。在一些方面中，fc结构域相对于野生型人类重链fc结构域序列包含取代，这些取代阻止与fcgr受体结合。在一些方面中，fc结构域包含与seqidno:4提供的序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％相同性的序列。在一些方面中，该抗原结合域结合于肿瘤抗原或病毒抗原。20.在一些方面中，抗原结合域包含与感兴趣的抗原相互作用的肽。在一些方面中，抗原结合域包含识别感兴趣抗原的抗体的抗原结合部分。在一些方面中，抗原结合域包含配体的至少部分，其与感兴趣的抗原相互作用。在一些方面中，抗原结合域结合cd19、cd20或cd22。在一些方面中，抗原结合域能够与冠状病毒刺突蛋白结合。在一些方面中，冠状病毒刺突蛋白是sars-cov-1或sars-cov-2刺突蛋白。在一些方面中，抗原结合域包含ace2胞外结构域的至少部分。在一些方面中，ace2胞外结构域的所述部分是ace2t结构域。在另一方面中，该ace2t结构域包含与seqidno:2的序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％相同性的序列。在一些方面中，car桥接蛋白进一步包含car结合域、fc结构域和/或抗原结合域之间的至少一个接头序列。在一些方面中，car桥接蛋白包含car结合域和抗原结合域，以及可选地，fc结构域之间的接头序列。在一些方面中，接头序列包含gggs的序列(seqidno:7)。在一些方面中，接头序列包含由seqidno:8提供的序列。在一些方面中，car桥接蛋白形成同二聚体。21.在其他实施方式中，本公开提供了编码本公开的car桥接蛋白的核酸分子。在一些方面中，编码car桥接蛋白的序列被操作性地连接至表达控制序列。在其他方面中，car桥接蛋白被进一步定义为表达载体。在一些方面中，表达载体是附加型载体。在一些实施方式中，表达载体是病毒载体。在一些方面中，该病毒载体是腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒或慢病毒载体。22.在其他实施方式中，本公开提供了药物组合物，其在药学上可接受的运载体中包含本公开的car桥接蛋白。在一些方面中，药物组合物进一步包含免疫效应细胞群，所述免疫效应细胞群体包含car桥接蛋白的car结合域所结合的car多肽。23.在另一些实施方式中，本公开提供了治疗有需要的对象的方法，该方法包括向对象施用有效量的本公开的car桥接蛋白。在一些方面中，对象先前已被施用有效量包含car多肽的免疫效应细胞群，car桥接蛋白的car结合域结合该car多肽。在一些方面中，该方法进一步包括向对象施用有效量包含car多肽的免疫效应细胞群，car桥接蛋白的car结合域结合该car多肽。在一些方面中，细胞与对象同种异体。在一些方面中，细胞与对象自体同源。在一些方面，细胞hla匹配于对象。在一些方面中，对象具有冠状病毒感染。在一些方面中，对象具有sar-cov感染。在其他方面中，对象具有sar-cov-2感染。在另一些方面中，对象患有covid-19。在一些方面中，car桥接蛋白包含(i)与seqidno:2的序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％相同性的抗原结合域；以及(ii)car结合域，其包含seqidno:6中提供的序列，并且其中car多肽包含cd4结构域作为其抗原结合域。在某些方面中，car结合域基本上由seqidno:6中提供的序列组成。在某些方面中，car结合域由seqidno:6中提供的序列组成。在一些方面中，对象患有癌症。在一些方面中，car桥接蛋白包含能够与cd19、cd20或cd22结合的抗原结合域。在一些方面中，car桥接蛋白的car结合域包含cd19蛋白的至少部分。24.通过以下详细说明，本发明的其他目的、特征和优点将显而易见。然而，应当理解，在指示本发明的优选实施方式的同时，详细描述和具体实施例仅是示例说明，因为本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员而言将由该详细描述变得显而易见。25.附图简述26.以下所述附图属于本说明书的一部分，包括于此用以进一步说明本文某些方面的内容。以下一幅或多幅附图与具体实施方式的详细描述有助于更好地理解本发明。27.图1a-1e.重新定向cart细胞的桥接蛋白的示意图。图1a说明了使用桥接蛋白将cd4cart细胞重定向到标靶细胞的一般概念。图1b说明了cd4cart细胞直接作用和通过桥接蛋白作用的特点。图1c说明了将cd4cart细胞重定向到冠状病毒感染细胞的桥接蛋白。图1d说明了同时或依次靶向肿瘤，其可用于靶向多种恶性细胞或克服肿瘤细胞为逃避靶向治疗而利用的抗原丢失。图1e说明了使用桥接蛋白将cd19特异性cart细胞重定向到标靶细胞的一般概念。28.图2a-2c.示例性桥接蛋白的示意图。图2a说明了具有抗原结合域、fc区和car结合域的二聚体桥接蛋白。图2b说明了将car结合域(如gp120t所代表的)偶联至igg抗体的方法。图2c说明了具有car结合域(如gp120t所代表的)、fc区和抗原结合域的桥接蛋白的各种实施方式。29.图3.cd4特异性cart细胞的示意图。30.图4a-4c.示例性桥接蛋白的进一步示意图。图4a显示了一种有代表性的重新定向cd19特异性car细胞的方法。图4b说明了具有抗原结合域、fc区和cd-19car结合域的二聚体桥接蛋白，例如cd19、截短的cd19(与car结合)或对cd19car具有特异性的抗体结构域。图4c说明了将car结合域(如cd19t所代表的)偶联至igg抗体的方法。31.图5.抗hiv的car构建体，显示了用于生产靶向hivenv的car-t细胞的car构建体的所有元件。32.图6.gp120的cd4结合环与igg抗体的化学偶联。gp120cd4结合环(ssggdpeivth)的序列在seqidno:6中提供。33.图7a-7d.桥接蛋白概念的开发和测试。图7a显示了与gp120的cd4结合环(gp120t)偶联的igg，以及facs等值线图，显示了桥接蛋白与原代t细胞上cd4受体的结合。图7b提供car4结合的桥接蛋白的facs直方图和中值荧光强度(mfi)。图7c提供了car4t细胞通过igg和双抗体偶联抗体重新导向肿瘤细胞的实验的示意图。图7d说明了与单独的car4t细胞、car4t细胞与igg、car4t细胞与igg-gp120t偶联物以及car4t细胞与双抗体-gp120t偶联物共培养24小时后存活肿瘤细胞的百分比。具体实施方式34.本文提供了可用于重定向car-t细胞的桥接蛋白，例如，被设计为识别和杀死hiv感染细胞的治疗性cd4特异性car-t细胞。在该示例中，桥接蛋白可包含截短的gp120胞外结构域，该结构域融合到能与感兴趣的标靶抗原结合的蛋白结构域(图1a和1b)。例如，蛋白质结构域可以是ace2胞外结构域(cov用于感染人体细胞的天然受体)。当cov感染细胞时，病毒刺突蛋白会在细胞表面表达。因此，在gp120-ace2桥接蛋白存在的情况下，cd4特异性car-t细胞将结合至存在于cov感染细胞表面的病毒刺突蛋白(图1c)。35.桥接蛋白可包含截短的gp120肽，该肽融合或偶联于结合感兴趣的标靶抗原的蛋白结构域。在一个示例中，桥接蛋白可包含截短的gp120肽、人类fc区、与感兴趣的标靶抗原结合的蛋白结构域，以及一个或多个接头序列。在一个示例性的实施方式中，桥接蛋白可包含从n端到c端或从c端或n端的ace2的ace2t部分，该部分是包含cov结合所需的所有三个结构域的ace2胞外结构域部分，人类fc结构域和截短的gp120肽，每个结构域由接头分开(图2a)。在另一个示例性的实施方式中，桥接蛋白可包含从n端到c端或从c端或n端的ace2的ace2t部分，该部分是包含cov结合所需的所有三个结构域的ace2胞外结构域部分，截短的gp120肽和人类fc结构域，每个结构域由接头分开(图2a)。由于fc结构域之间的相互作用，桥接蛋白将作为同二聚体存在。36.桥接蛋白将重新引导cd4-cart细胞识别和杀死表达感兴趣抗原(例如cov刺突蛋白)的细胞，(图1c)。cd4-cart细胞可使其内源性tcr和/或mhc基因沉默以防止同种异体反应性(图3)。cd4-cart细胞可进一步具有一种或多种抑制性受体(例如pd1和/或tim3)，其被沉默以使t细胞能够持续存在并提供更持久的治疗效果(图3)。这些t细胞可以从健康的供体细胞中制备，使其成为一种“现成的”方案，其(a)可以快速提供给患者，(b)不受潜在疾病的影响(来自cov感染患者的t细胞被严重耗竭)和(c)具有成本效益(》100剂由单个供体单位制备)(图3)。37.在另外的方面中，实施方式的桥接蛋白可用于重新靶向其他类型的表达car的效应细胞，例如cd19cart细胞。接受抗cd19cart细胞治疗的患者经常遇到cd19抗原丢失，导致疾病复发。同时或依次施用桥接蛋白可以允许将抗cd19cart细胞重新导向恶性细胞上的其他抗原的方法。因此，此类方法允许治疗其他难治性疾病。38.i.定义39.如本文所用，就特定成分而言，“基本上不含”在本文中用于表示该特定成分未被有意配制入组合物和/或仅作为污染物存在或以痕量存在。因此，由组合物的任何非计划污染产生的该指定成分的总量远低于0.05％，优选低于0.01％。最优选的是使用标准分析方法无法检测到指定成分的量的组合物。40.如本说明书中所用，“一”或“一个/种”可指一个/种或多个/种。如本文权利要求中所用，当与词语“包括/包含”结合使用时，词语“一”或“一个/种”可指一个或多于一个。41.在权利要求中使用的术语“或”表示“和/或”，除非特别指出仅指替代方式，或替代方式互相排除，但公开内容支持仅指替代方式和“和/或”的定义。如本文所用，“另一”可指至少第二个/种或更多个/种。42.在本技术全文中，术语“约”用于表示数值包括装置误差的固有变化,方法中的固有变化被用于确认数值、研究对象之间存在的差异，或在规定数值10％范围内的值。43.本文所用“核酸”、“核酸序列”、“寡核苷酸”、“多核苷酸”或其他语法等同形式表示共价接合在一起的至少两个核苷酸，其为脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸是任何长度的聚合物，包括，例如，20、50、100、200、300、500、1000、2000、3000、5000、7000、10000等。本文所述的多核苷酸通常包含磷酸二酯键，但在某些情况下，包含可具有至少一个不同键的核酸类似物，例如磷酰胺，硫代磷酸、二硫代磷酸或o-甲基磷酰亚胺键，以及肽核酸骨架和键。可以制备天然多核苷酸和类似物的混合物；或者，可以制备不同的多核苷酸类似物的混合物，以及天然产生的多核苷酸和类似物的混合物。以下是多核苷酸的非限制性例子：基因或基因片段、外显子、内含子、信使rna(mrna)、转移rna、核糖体rna、核酶、cdna、crna、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任意序列的分离dna、任意序列的分离rna、核酸探针和引物。多核苷酸可包括修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，对核苷酸结构的修饰可在聚合物的组装之前或之后赋予。核苷酸序列可间插有非核苷酸成分。多核苷酸聚合后可被进一步修饰，如通过与标记性成分偶联。该术语也包括双链和单链分子。除非另有说明或要求，术语多核苷酸包括双链形式和已知或预测构成双链形式的两种互补单链形式中的每一种。多核苷酸由4种核苷酸碱基的具体序列组成：腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)，并且当多核苷酸是rna时，尿嘧啶(u)替代胸腺嘧啶(t)。因此，术语“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母表示。除非另有说明，否则具体多核苷酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列以及明确指出的序列。具体而言，可通过产生一个或多个选定(或所有)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来获得简并密码子取代。44.术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中指氨基酸残基的聚合物。这些术语也适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然产生氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然产生的氨基酸聚合物、包含修饰残基的那些和非天然产生的氨基酸聚合物。在本情况中，术语“多肽”包含抗体或其片段。45.如本文使用，"安全港"概况是指将外源遗传物质在一些位点处插入工程改造细胞基因组中，此情况下转基因表达持续(即不被沉默)且不破坏内源基因的表达。例如，“遗传安全港概况”可以指位于内源基因的编码和表达控制区之外的转基因事件。在一些方面中，鉴定工程改造的细胞是否具有安全港概况可包括进行全基因组测序或整合位点分析。46.ii.桥接蛋白47.桥接蛋白包含car结合域和与感兴趣的标靶抗原结合的蛋白结构域。在一些情况下，car结合域和与感兴趣的目标抗原结合的蛋白结构域可以是两个结构域的化学融合体。该排列可以是多聚体，例如双抗体或多聚体。多聚体很可能是通过将轻链和重链的可变部分交叉配对成双抗体形成的。48.在一些实施方式中，桥接蛋白包含car结合域、抗原结合域，以及，可选地，一种或多种接头序列。在一些情况下，接头位于car结合域和抗原结合域之间。在一些情况下，car结合域直接融合于抗原结合域。49.在一些实施方式中，桥接蛋白包含car结合域、人类fc区，抗原结合域，以及，可选地，一种或多种接头序列。在一个实施方式中，桥接蛋白可包含从n端到c端或从c端或n端的抗原结合域、人类fc结构域和car结合域，每个结构域或被接头分开或直接融合(图2a-2c)。在另一个实施方式中，桥接蛋白可包含从n端到c端或从c端或n端的抗原结合域、car结合域和人类fc结构域，每个结构域或被接头分开或直接融合(图2a-2c)。由于fc结构域之间形成的二硫键的存在，桥接蛋白可以同二聚体存在。然而，在任何提供的实施方式中，桥接蛋白可以是单体。50.car结合域51.桥接蛋白包含car结合域。car结合域是足以与car-t细胞表达的car相互作用的蛋白结构域，其效应功能被寻求重新定向。car结合域可位于fc结构域和抗原结合域之间，或者car结合域可位于桥接蛋白的任一末端。car结合域可包含特异性识别car的抗体或抗体片段的抗原结合部分。在car包含配体作为其标靶结构域的情况下，桥接蛋白的car结合域可包含结合配体的受体的部分。在car包含受体作为其标靶结构域的情况下，桥接蛋白的car结合域可包含结合受体的配体的部分。例如，如果car包含cd4结构域作为其标靶结构域，则桥接蛋白的car结合域可包含gp120结构域。例如，gp120结构域可以是如seqidno:6所示的截短的gp120结构域，它是gp120胞外结构域的11个氨基酸片段，能有效地与cd4结合。作为另一个示例，如果car包含一个抗cd19结构域作为其标靶结构域，桥接蛋白的car结合域可包含cd19的至少部分，足以被car的抗cd19结构域结合(图1e)。52.b.fc结构域53.桥接蛋白可包含fc结构域。fc结构域可位于car结合域和抗原结合域之间，或者fc结构域可位于桥接蛋白的任一末端。在一些实施方式中，fc结构域可包含人类fc结构域序列。fc结构域可以是人类重链fc结构域序列。fc结构域可只包含人类重链fc结构域的ch2和ch3区。fc结构域可含有防止fc与fcgr受体结合的取代，以减少cart细胞效应功能的非特异性靶向风险。例如，fc结构域可包含d265a和/或n297a的取代，它们分别对应seqidno:4中的第46和78位。在一些方面中，fc结构域的序列与由seqidno:4提供的序列有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。在一些方面中，fc结构域的序列与由seqidno:4提供的序列有大约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。在一些方面中，fc结构域具有与由seqidno:4提供的序列相同的序列。在一些方面中，fc结构域由密码子优化的核酸编码。在一些方面中，fc结构域由序列编码，该序列具有与由seqidno:3中提供的序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。在一些方面中，fc结构域由序列编码，该序列具有与由seqidno:3中提供的序列大约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。在一些方面中，fc结构域由序列编码，该序列与由seqidno:3中提供的序列相同。54.c.抗原结合域55.桥接蛋白包含能够结合任何感兴趣抗原的抗原结合域。抗原结合域可位于car结合域和fc域之间，或者抗原结合域可位于桥接蛋白的任一末端。抗原结合域可包含特异性识别抗原的抗体或抗体片段的抗原结合部分。56.抗体的抗原结合片段是指蛋白质的一部分，该蛋白质能够与抗原特异性结合。在某些实施方式中，抗原结合片段来自于包含一个或多个cdr的抗体，或与抗原结合但不包含完整的天然抗体结构的任何其他抗体片段。在某些实施方式中，抗原结合片段不是来自抗体，而是来自受体。抗原结合片段的实例包括但不限于双抗体、fab、fab'、f(ab')2、fv片段、二硫化物稳定的fv片段(dsfv)、(dsfv)2、双特异性dsfv(dsfv-dsfv')、二硫化物稳定的双抗体(dsdiabody)、单链抗体分子(scfv)、scfv二聚体(二价双抗体)、多特异性抗体、单域抗体(sdab)，骆驼科动物抗体或纳米抗体、结构域抗体，和二价结构域抗体。57.在抗原是配体的情况下，桥接蛋白的抗原结合域可包含能与配体结合的受体的部分(图2c)。在抗原是受体的情况下，桥接蛋白的抗原结合域可包含能与受体结合的配体的部分。例如，如果抗原是cov刺突蛋白，桥接蛋白的抗原结合域可包含ace2的胞外结构域。在一些方面中，ace2的胞外结构域可以是ace2胞外结构域的截短部分(ace2t)。ace2胞外结构域的ace2t部分可不包含天然ace2胞外结构域的近端，该结构域包含adam17、tmprss11d和tmprss2裂解位点，其用于产生可溶形式的ace2并促进cov感染。排除蛋白酶的裂解位点防止桥接蛋白的意外裂解。58.在某些实施方式中，抗原结合结构域可以包含与受体(例如冠状病毒刺突蛋白)结合的肽(例如ace2的胞外结构域)。标靶结合域可包含ace2胞外结构域的ace2t部分。ace2t部分包含cov结合所需的所有三个结构域。ace2胞外结构域的ace2t部分不包含天然ace2胞外结构域的近端，其包含对产生可溶形式的ace2和促进cov感染很重要的两个切割位点。59.在一些方面中，ace2胞外结构域的ace2t部分的序列与由seqidno:2提供的序列有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。在一些方面中，ace2胞外结构域的ace2t部分的序列与由seqidno:2提供的序列有大约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。在一些方面中，ace2胞外结构域的ace2t部分具有与由seqidno:2提供的序列相同的序列。60.在一些方面中，ace2胞外结构域的ace2t部分由密码子优化的核酸编码。在一些方面中，ace2胞外结构域的ace2t部分是由与seqidno:1提供的序列有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的序列所编码的。在一些方面中，ace2胞外结构域的ace2t部分是由与seqidno:1提供的序列有大约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的序列所编码的。在一些方面中，ace2胞外结构域的ace2t部分是由与seqidno:1提供的序列相同的序列所编码的。61.其他示例性抗原包括癌细胞上的表面抗原(图1d)和感染细胞上的表面抗原。癌细胞上的表面抗原可以是肿瘤特异性抗原，即仅在肿瘤细胞上表达的抗原。癌细胞上的表面抗原可是肿瘤相关抗原，即在健康细胞上表达但在肿瘤细胞上过表达的抗原。癌细胞表面抗原的实例包括her-3、her1/her-3融合；cd19；cd123；cd22；cd30；cd171；cs-1(也称为cd2子集1、cracc、slamf7、cd319和19a24)；c型凝集素样分子-1(cll-1或clecl1)；cd33；表皮生长因子受体变体iii(egfrviii)；神经节苷脂g2(gd2)；神经节苷脂gd3(aneu5ac(2-8)aneu5ac(2-3)bdgalp(1-4)bdglcp(1-1)cer)；tnf受体家族成员b细胞成熟(bcma)；tn抗原((tnag)或(galnacα-ser/thr))；前列腺特异性膜抗原(psma)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)；fms样酪氨酸激酶3(flt3)；肿瘤相关糖蛋白72(tag72)；cd38；cd44v6；癌胚抗原(cea)；上皮细胞粘附分子(epcam)；b7h3(cd276)；套件(cd117)；白细胞介素13受体亚基α-2(il-13ra2或cd213a2)；间皮素；白细胞介素11受体α(il-11ra)；前列腺干细胞抗原(psca)；蛋白酶丝氨酸21(testisin或prss21)；血管内皮生长因子受体2(vegfr2)；路易斯(y)抗原；cd24；血小板衍生生长因子受体β(pdgfr-β)；阶段特异性胚胎抗原4(ssea-4)；cd20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶erbb2(her2/neu)；粘蛋白1，细胞表面相关(muc1)；表皮生长因子受体(egfr)；神经细胞粘附分子(ncam)；前列腺；前列腺酸性磷酸酶(pap)；延伸因子2突变(elf2m)；埃弗林b2；成纤维细胞活化蛋白α(fap)；胰岛素样生长因子1受体(igf-i受体)、碳酸酐酶ix(caix)；蛋白酶体(前体，巨蛋白因子)亚基，β型，9(lmp2)；糖蛋白100(gp100)；由断点簇区(bcr)和abelson鼠白血病病毒癌基因同源物1(abl)(bcr-abl)组成的癌基因融合蛋白；酪氨酸酶；肝配蛋白a型受体2(epha2)；岩藻糖基gm1；唾液酸路易斯粘附分子(sle)；神经节苷脂gm3(aneu5ac(2-3)bdgalp(1-4)bdglcp(1-1)cer)；转谷氨酰胺酶5(tgs5)；高分子量黑色素瘤相关抗原(hmwmaa)；邻乙酰基-gd2神经节苷脂(oacgd2)；叶酸受体β；肿瘤内皮标志物1(tem1/cd248)；肿瘤内皮标志物7相关(tem7r)；密蛋白6(cldn6)；促甲状腺激素受体(tshr)；g蛋白偶联受体c类第5组，成员d(gprc5d)；x染色体开放阅读框61(cxorf61)；cd97；cd179a；间变性淋巴瘤激酶(alk)；聚唾液酸；胎盘特异性1(plac1)；globoh糖神经酰胺(globoh)的六糖部分；乳腺分化抗原(ny-br-1)；重组人尿斑蛋白2(upk2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(havcr1)；肾上腺素受体3(adrb3)；泛连接蛋白3(panx3)；g蛋白偶联受体20(gpr20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座k9(ly6k)；嗅觉受体51e2(or51e2)；tcrγ替代阅读框蛋白(tarp)；肾母细胞瘤蛋白(wt1)；癌症/睾丸抗原1(ny-eso-1)；癌症/睾丸抗原2(lage-1a)；黑色素瘤相关抗原1(mage-a1)；ets易位变异基因6，位于染色体12p(etv6-aml)；精子蛋白17(spa17)；x抗原家族，成员1a(xage1)；血管生成素结合细胞表面受体2(tie2)；黑色素瘤癌睾丸抗原-1(mad-ct-1)；黑色素瘤癌睾丸抗原-2(mad-ct-2)；fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；前列腺素；幸存下来；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1(pcta-1或半乳凝素8)，t细胞识别的黑色素瘤抗原1(黑色素a或marti)；大鼠肉瘤(ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(htert)；肉瘤易位断点；黑色素瘤细胞凋亡抑制剂(ml-iap)；erg(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(tmprss2)ets融合基因)；n-乙酰氨基葡萄糖转移酶v(na17)；配对盒蛋白pax-3(pax3)；雄激素受体；细胞周期蛋白b1；v-myc禽骨髓细胞瘤病病毒癌基因神经母细胞瘤衍生同源物(mycn)；ras同源家族成员c(rhoc)；酪氨酸酶相关蛋白2(trp-2)；细胞色素p4501b1(cyp1b1)；ccctc-结合因子(锌指蛋白)-样(boris或印迹位点调节剂的兄弟)，t细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(sart3)；配对盒蛋白pax-5(pax5)；顶体结合蛋白sp32(oy-tes1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(lck)；激酶锚定蛋白4(akap-4)；滑膜肉瘤，x断点2(ssx2)；高级糖基化终产物受体(rage-1)；肾遍在蛋白1(ru1)；肾遍在蛋白2(ru2)；豆荚蛋白；人乳头瘤病毒e6(hpve6)；人乳头瘤病毒e7(hpve7)；肠羧基酯酶；热休克蛋白70-2突变(muthsp70-2)；cd79a；cd79b；cd72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(lair1)；iga受体的fc片段(fcar或cd89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族a成员2(lilra2)；cd300分子样家族成员f(cd300lf)；c型凝集素结构域家族12成员a(clec12a)；骨髓基质细胞抗原2(bst2)；含有egf样模块的粘蛋白样激素受体样2(emr2)；淋巴细胞抗原75(ly75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(gpc3)；fc受体样5(fcrl5)；和免疫球蛋白λ样多肽1(igll1)。受感染细胞表面抗原的实例包括病毒刺突蛋白或包膜蛋白(例如hiv-1gp120、hiv-1gp41、hiv-1gp160、sars-covs蛋白、sars-cov-2s蛋白、merss蛋白、埃博拉病毒糖蛋白、流感血凝素、流感神经氨酸酶、丙型肝炎e1、丙型肝炎e2、登革热病毒e二聚体、基孔肯雅病毒e1、基孔肯雅病毒e1、巨细胞病毒糖蛋白、单纯疱疹病毒gb、单纯疱疹病毒gh、单纯疱疹病毒gl、单纯疱疹病毒gm、爱泼斯坦-巴尔病毒gp350和爱泼斯坦-巴尔病毒gp42)。62.d.接头63.桥接蛋白可包含位于融合多肽序列之间的至少一个肽接头(或间隔子)，以允许正确折叠和/或防止融合结构域的空间位阻。肽接头可为柔性接头。在一些方面中，接头的长度在2至20个肽之间，2至18个肽之间，2至16个肽之间，2至14个肽之间，2至12个肽之间，2至10个肽之间，4至20个肽之间，4至18个肽之间，4至16个肽之间，4至14个肽之间，4至12个肽之间，或4至10个肽之间。在一些方面中，接头序列包含gggs的序列(seqidno:7)。在一些方面中，接头包含序列ssggggsggggggss(seqidno:9)或序列ssggggsggggggssrss(seqidno:10)。优选地，接头包含序列ssggggs(seqidno:8).在桥接蛋白包含多于一个接头的情况下，桥接蛋白中的每个接头可具有相同的序列或每个接头可以具有不同的序列。64.或者，桥接蛋白的car结合域和抗原结合域可为化学偶联的。例如，抗原结合结构域的半胱氨酸残基可与硫醇反应性试剂进行位点特异性和有效的耦合。硫醇反应性试剂可为，例如，马来酰亚胺、碘乙酰胺、吡啶基二硫化物或其他硫醇反应性偶联伴侣。因此，桥接蛋白的car结合域部分可包含，例如，马来酰亚胺环。然后可以用二硫苏糖醇(dtt)还原和添加car结合域-马来酰亚胺开始化学偶联。65.iii.嵌合抗原受体66.嵌合抗原受体(car)分子是重组融合蛋白，其特征在于它们能够结合标靶(例如冠状病毒刺突蛋白)，并通过存在于其胞质尾部的免疫受体活化基序(itam)传递活化信号，从而活化基因修饰的免疫效应细胞，用于杀伤、增殖和细胞因子产生。67.根据本实施方式的嵌合抗原受体可通过本领域已知的任何方法制备，但优选使用重组dna技术制备。通过分子克隆的标准技术(基因组文库筛选、pcr、引物辅助连接、定点突变等)，可以制备编码嵌合抗原受体多个区域的核酸序列，并将其组装成完整的编码序列。由此产生的编码区可以插入到表达载体中，并用于转化合适的宿主同种异体或自体同源免疫效应细胞。68.本文所述的car的实施方式包含编码标靶特异性嵌合抗原受体(car)多肽的核酸，该多肽包含胞内信号传导结构域、跨膜结构域和包含标靶结合结构域的胞外结构域。可选地，car可以包含位于跨膜结构域和靶结合域之间的铰链结构域。在某些方面中，实施方式的car进一步包含将car的表达指引到细胞表面的信号肽。例如，在一些方面中，car可包含来自gm-csf的信号肽。69.在某些实施方式中，当存在少量标靶时，car还可以与膜结合细胞因子共同表达以改善持久性。例如，car可以与膜结合il-15共表达。70.根据car结构域的排列和结构域中使用的具体序列，表达car的免疫效应细胞可对标靶细胞具有不同水平的活性。在某些方面中，不同的car序列可被引入免疫效应细胞以生成经工程改造的细胞，选择具有提高的src的工程改造细胞，并测试所选细胞活性，以鉴定预测具有最大治疗功效的car构建物。71.嵌合构建体可作为裸dna或在合适的载体中被引入免疫效应细胞。本领域已知使用裸dna通过电穿孔稳定转染细胞的方法。参见例如美国专利号6,410,319。裸dna通常是指编码嵌合受体的dna，该嵌合受体以适当表达方向包含在质粒表达载体中。或者，可使用病毒载体(例如，逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或慢病毒载体)将嵌合构建体引入免疫效应细胞。根据本发明方法使用的合适载体在免疫效应细胞中不复制。已知大量基于病毒的载体，其中病毒在细胞中的拷贝数低到足以维持细胞生存，例如，基于hiv、sv40、ebv、hsv或bpv的载体。72.a.抗原结合域73.在某些实施方式中，抗原结合结构域可包含单克隆抗体的互补决定区、单克隆抗体的可变区和/或其抗原结合片段。例如，抗原结合域可以包含结合cd19的抗体的互补决定区。互补决定区(“cdr)”是在抗原受体(例如免疫球蛋白和t细胞受体)蛋白质的可变结构域中发现的一个短氨基酸序列，它与抗原互补，从而为受体提供对该具体抗原的特异性。抗原受体的每条多肽链包含三个cdr(cdr1、cdr2和cdr3)。由于抗原受体通常由两条多肽链组成，因此每个与抗原接触的抗原受体有六个cdr—每条重链和轻链包含三个cdr。由于大多数与免疫球蛋白和t细胞受体相关的序列变异在cdr中发现，这些区域有时被称为高变结构域。其中，cdr3表现出最大的可变性，因为它是通过vj(重链和tcrαβ链中的vdj)区域重组编码的。在另一个实施方式中，该特异性源自与受体结合的肽(例如，细胞因子)。在另一个实施方式中，该特异性源自与病毒糖蛋白结合的受体(例如cd4的胞外结构域，例如cd4的d1和d2结构域)。在抗原结合域源自cd4的方面，形成抗原结合域的cd4部分可被突变以限制与mhcii类的结合。74.设想car核酸，具体地，scfv序列是人类基因，用于增强人类患者细胞免疫疗法。在具体的实施方式中，提供全长carcdna或编码区。抗原结合区或结构域可包含源自具体小鼠或人或人源化单克隆抗体的单链可变片段(scfv)的vh和vl链片段。该片段也可以是抗原特异性抗体的任意数量的不同抗原结合域。在更具体的实施方式中，该片段是针对人密码子用途进行优化以在人类细胞中表达的序列编码的抗原特异性scfv。在某些方面中，car的vh和vl结构域由接头序列(例如whitlow接头)分隔。通过引用纳入本文的国际(pct)专利公开号wo2015/123642中还提供了可根据实施方式修改或使用的car构建物。75.如前所述，原型car编码包含源自一种单克隆抗体(mab)的vh和vl结构域的scfv，其与跨膜结构域和一个或多个胞质信号传导结构域(例如，共刺激结构域和信号传导结构域)耦合。因此，car可包含与感兴趣的抗原(例如肿瘤相关抗原)结合的抗体的lcdr1-3序列和hcdr1-3序列。然而，在另一方面中，识别了与感兴趣的抗原结合的多种抗体中的两种，并且构建了一种car，其包含：(1)与抗原结合的第一抗体的hcdr1-3序列；和(2)与抗原结合的第二抗体的lcdr1-3序列。这种包含来自两种不同抗原结合性抗体的hcdr和lcdr序列的car可具有优先结合抗原的特定构型(例如，与正常组织相比优先与癌细胞结合的构象)的优势。76.或者，可以使用从不同mab衍生的vh和vl链来工程改造car，以生成一组car t细胞。car的抗原结合域可包含第一抗体的lcdr1-3序列和第二抗体的hcdr1-3序列的任意组合。77.b.铰链结构域78.在某些方面中，实施方式的car多肽可包含位于抗原结合域和跨膜结构域之间的铰链结构域。在某些情况下，铰链结构域可包含在car多肽中，以在标靶结合域和细胞表面之间提供足够的距离，或减轻可对car修饰的t细胞的标靶结合或效应功能产生不利影响的空间位阻。铰链结构域包含与fc受体(例如fcγr2a或fcγr1a)结合的序列。例如，铰链序列可包含来自与fc受体结合的人免疫球蛋白(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1、iga2、igm、igd或ige)的fc结构域。79.在一些情况下，car铰链结构域可以源自人免疫球蛋白(ig)恒定区或其部分，包含ig铰链，或来自人cd8a跨膜结构域(facdiyiwaplagtcgvlllslvitlycnhrn；seqidno:11)和cd8a铰链区(kptttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgld；seqidno:12)。在一个方面，car铰链结构域可以包含一个铰链-ch2-ch3区域的抗体同种型igg4(eskygppcppcpapeflggpsvflfppkdtlmisrtpevtcvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnlpssiektiskakgqprepqvytlppqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslgkm；seqidno:13)。在某些方面中，可以在抗体重链ch2结构域中引入点突变，以减少car-修饰的免疫效应细胞的糖基化和非特异性fcγ受体结合。80.在某些方面中，实施方式的car铰链结构域包含igfc结构域，其包含相对于野生型igfc结构域减少fc受体结合的至少一个突变。例如，car铰链结构域可包含igg4-fc结构域，该结构域包含相对于野生型igg4-fc结构域减少fc-受体结合的至少一个突变。在一些方面中，car铰链结构域包含在相对于野生型igg4-fc序列对应于l235和/或n297的位置处具有突变(例如氨基酸缺失或取代)的igg4-fc结构域。例如，car铰链结构域可包含具有相对于野生型igg4-fc序列的l235e和/或n297q突变的igg4-fc结构域。在其它方面中，car铰链结构域可包含igg4-fc结构域，该结构域在l235位置处具有氨基酸取代，以取代亲水性氨基酸，例如r、h、k、d、e、s、t、n或q，或具有与“e”类似的性质的氨基酸，例如d。在某些方面，car铰链结构域可包含在位置n297处具有氨基酸取代的igg4-fc结构域，该氨基酸具有类似于“q”的性质，例如s或t。81.c.跨膜结构域82.标靶特异性胞外结构域和胞内信号传导结构域可通过跨膜结构域连接。可作为跨膜结构域一部分的多肽序列包括但不限于人类cd4跨膜结构域、人类cd28跨膜结构域、人类cd3ζ跨膜结构域或半胱氨酸突变的人类cd3ζ结构域，或来自其他人类跨膜信号蛋白的其他跨膜结构域，如cd16、cd8和红细胞生成素受体。在一些方面中，例如，跨膜结构域可包含与美国专利公开号2014/0274909(例如cd8和/或cd28跨膜结构区)或美国专利号8906682(例如cd8a跨膜结构体)之一中提供的序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的序列，两者均通过引用全文的方式纳入本文。在某些具体的方面，跨膜区可源自(即至少包括)t细胞受体的α、β或ζ链，cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154。在某些特定的方面中，跨膜结构域可以与cd8a跨膜结构或cd28跨膜结构域有85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性。83.d.胞内信号传导结构域84.实施方式的嵌合抗原受体的胞内信号传导结构域负责活化经工程改造以表达car的免疫细胞的至少一种正常效应功能。术语“效应功能”是指分化的细胞的专门功能。例如，t细胞的效应功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。原初、记忆或记忆型t细胞中的效应功能包括抗原依赖性增殖。因此，术语“胞内信号传导结构域”是指蛋白质中传导效应功能信号并指导细胞执行特定功能的部分。在一些方面中，细胞内信号传导结构域衍生自天然受体的胞内信号传导结构域。此类天然受体的例子包括t细胞受体的ζ链或其任何同系物(例如，η、δ、γ或ε)、mb1链、b29、fcriii、fcri以及信号传导分子的组合，例如cd3ζ和cd28、cd27、4-1bb/cd137、icos/cd278、il-2rβ/cd122、il-2rα/cd132、dap10、dap12、cd40、ox40/cd134及其组合，以及其他类似分子和片段。可以使用活化蛋白家族其他成员的细胞内信号传导部分，例如fcγriii和fcεri。85.虽然通常使用整个胞内信号传导结构域，但在许多情况下，不需要使用完整胞内多肽。在可使用胞内信号传导结构域的截短部分的范围内，只要该截短部分仍能传递效应功能信号，则可使用该截短部分代替完整链。因此，术语“胞内信号传导结构域”指包含胞内信号传导结构域的截短部分，其足以在car结合到标靶时传导效应功能信号。可使用一个或多个胞质结构域，因为所谓的第三代car具有至少两个或三个融合在一起的信号传导结构域以产生叠加或协同效应，例如，cd28和4-1bb可以组合在car构建物中。在某些具体方面，胞内信号传导结构域包含与cd3ζ胞内结构域(rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr；seqidno:14)、cd28胞内结构域、cd137胞内结构域或包含融合到4-1bb胞内结构域的cd28胞内结构域的结构域具有85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的序列。在优选实施方式中，人类cd3ζ胞内结构域用作实施方式的car的胞内信号传导结构域。86.在具体实施方式中，car中的胞内受体信号转导结构域包含t细胞抗原受体复合物的结构域，例如cd3的ζ链，也包含fcγriii共刺激信号转导结构域、cd28、cd27、dap10、cd137、ox40、cd2，单独或例如与ζcd3串联。在具体实施方式中，胞内结构域(可称为胞质结构域)包含一个或多个tcrζ链、cd28、cd27、ox40/cd134、4-1bb/cd137、fcεriγ、icos/cd278、il-2rβ/cd122、il-2rα/cd132、dap10、dap12和cd40的部分或全部。在一些实施方式中，在胞内结构域中使用内源性t细胞受体复合物的任何部分。例如，可使用一个或多个胞质结构域，因为所谓的第三代car具有至少两个或三个信号结构域融合在一起以产生加和或协同效应。87.在一些实施方式中，car还包含其他共刺激结构域。其他共刺激结构域可包括但不限于cd28、cd27、ox-40(cd134)、dap10和4-1bb(cd137)中的一个或多个。除了cd3ζ引发的主要信号之外，插入人car中的人共刺激受体提供的附加信号对于t细胞的充分活化非常重要，并且有助于提高过继免疫疗法的体内持久性和治疗成功率。88.iv.内源基因表达的修饰89.在一些方面中，工程改造的免疫效应细胞被修饰以降低或消除一种或多种内源基因的表达。例如，工程改造的免疫效应细胞可被修饰以敲低或敲除至少一种免疫检查点蛋白。所述至少一种免疫检查点蛋白可选自以下组：pd1、ctla4、lag3、tim3、tigit、cd96、btla、kirs、腺苷a2a受体、vista、ido、fas、sirpα、cish、shp-1、foxp3、lair1、pvrig、ppp2ca、ppp2cb、ptpn6、ptpn22、cd160、crtam、siglec7、siglec9、cd244、tnfrsf10b、tnfrsf10a、casp8、casp10、casp3、casp6、casp7、fadd、tgfbrii、tgfrbri、smad2、smad3、smad4、smad10、ski、skil、tgif1、il10ra、il10rb、hmox2、il6r、il6st、eif2ak4、csk、pag1、sit1、prdm1、batf、gucy1a2、gucy1a3、gucy1b2，和gucy1b3。在一些方面中，工程改造的免疫效应细胞被修饰以降低或消除一种或多种hiv共同受体的表达。例如，工程改造的免疫效应细胞被修饰，使得ccr5表达被沉默。90.作为另一个示例，工程改造的免疫效应细胞中的hla基因可以各种方式进行修饰。例如，工程改造的免疫效应细胞可被工程改造，使得它们不在其表面上表达功能性hla-a、hla-b和/或hla-c。hla-a阴性工程改造的免疫效应细胞可源自于hla-纯合个体。或者，经工程改造的免疫效应细胞可为hla-a纯合。进一步的，工程改造的免疫效应细胞，无论它们是hla-a阴性还是hla-a纯合，在hla-b、hla-c和/或hla-drb1等位基因上可以是hla纯合子。91.在一些方面中，工程改造的免疫效应细胞可被修饰以敲低或敲除一种或多种t细胞受体成分的表达。例如，在一些方面中，细胞缺乏或已降低tcrα、tcrβ、tcrα和tcrβ、tcrγ、tcrδ、tcrγ和tcrδ或前述的任何组合的表达。这可以通过任何合适的方式发生，包括通过引入锌指核酸酶(zfn)，例如，靶向一种或多种tcr受体成分的恒定区。92.敲除内源基因可包括向细胞中引入特异性靶向内源基因位点的人工核酸酶。在各个方面中，人工核酸酶可以是锌指核酸酶、talen或crispr/cas9在各个方面中，将人工核酸酶引入细胞中可包括将编码人工核酸酶的mrna引入细胞中。93.例如，在一些方面中，标靶内源基因包括由锌指核酸酶、talen或crispr/cas9系统产生的使基因或基因产物无功能的缺失或突变。这种缺失或突变可发生在标靶内源基因的两个等位基因中。94.敲低内源基因的表达可包括将抑制性核酸引入细胞，例如编码mirna的构建体。抑制性核酸可抑制基因的转录或阻止细胞中基因转录物的翻译。抑制性核酸可以是16到1000个核苷酸长，并且在某些实施方式中是18到100个核苷酸长。在某些实施方式中，抑制性核酸是分离的核酸，与感兴趣的基因结合或杂交。抑制性核酸可使标靶基因的表达沉默至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％，并且优选至少75％。95.抑制性核酸在本领域中是众所周知的。例如，美国专利6,506,559和6,573,099，以及美国专利公开号2003/0051263、2003/0055020、2004/0265839、2002/0168707、2003/0159161和2004/0064842中描述了sirna、shrna、mirna和双链rna，所有这些在此通过引用全文的方式纳入本文。在多个方面中，敲低内源性基因的表达可包括使用mirna表达构建体、多个mirna及其应用以敲低目标基因表达。在一些方面中，表达构建体包括启动子元件、间隔序列和mirna编码序列。此类mirna表达构建体的示例可见于wo2019/186274和美国专利号9,556,433，其每一个都以引用全文的方式纳入本文。96.在某些方面中，表达载体用于表达感兴趣的核酸，例如抑制具体基因表达的核酸。表达需要在载体中提供适当的信号，其中包括各种调节元件，例如来自病毒和哺乳动物来源的增强子/启动子，它们驱动感兴趣的基因在宿主细胞中的表达。还定义了被设计以优化宿主细胞中rna稳定性的元件。还提供了用于使用许多主要药物选择标志物来建立表达产物的永久、稳定的细胞克隆的条件，如同将药物选择标志物的表达与多肽的表达连接起来的元件一样。97.a.调控元件98.在本技术中，术语“表达构建体”或“表达载体”意在包括任何类型的基因构建体，其包含编码基因产物的核酸，其中部分或全部核酸编码序列能够被转录。转录物可以翻译成蛋白质，但不一定如此。在某些实施方式中，表达包括基因转录和将mrna翻译成基因产物。在其他实施方式中，表达仅包括编码感兴趣基因的核酸的转录，即，如同实施方式的rna分子的情况一样。99.在某些实施方式中，编码基因产物的核酸处于启动子的转录控制之下。“启动子”是指由细胞的合成机制识别或引入合成机制的dna序列，需要其以起始基因的特异性转录。短语"在转录控制下"指启动子相对于核酸处于正确的位置和取向，以控制rna聚合酶启动和基因表达。100.此处将使用术语启动子来指代聚集在真核rna聚合酶(pol)i、ii或iii的起始位点周围的一组转录控制模块。对启动子如何组织的思考大多来自对几个病毒polii启动子的分析，包括hsv胸苷激酶(tk)和sv40早期转录单元的启动子。这些研究，再加上最近的工作，表明启动子包括不连续的功能模块，每个模块由大约7-20bp的dna组成，并含有供于转录活化剂或抑制剂蛋白的一个或多个识别位点。101.每个启动子中有至少一个模块用于定位rna合成的起始位点。最著名的例子是tata盒，但在一些缺乏tata盒的启动子中，例如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和sv40晚期基因的启动子，覆盖起始位点本身的离散元件有助于确定起始位置。102.其它启动子元件调控转录起始的频率。通常，这些位于起始位点上游30-110bp的区域，尽管最近已被证明许多启动子在起始位点下游也含有功能元件。启动子元件之间的间隙通常是柔性的，使得当元件翻转或相对于彼此移动时保留启动子功能。在tk启动子中，在活性开始下降之前，启动子元件之间的间距可以增加到50bp。取决于启动子，个体元件似乎可协同或单独发挥作用以活化转录。103.在一些实施方式中，该启动子包括延长因子1短(ef1)启动子。在其他实施方式中，可以使用人类巨细胞病毒(cmv)立即早期基因启动子、sv40早期启动子、rous肉瘤病毒长末端重复、大鼠胰岛素启动子和甘油醛-3-磷酸脱氢酶来获得感兴趣的编码序列的高水平表达。也可以考虑使用本领域众所周知的其他病毒或哺乳动物细胞或细菌噬菌体启动子来实现感兴趣的编码序列的表达，只要表达水平足以满足给定的目的。104.通过使用具有熟知的特性的启动子，可以优化转染或转化后感兴趣的蛋白质的表达水平和模式。此外，选择响应于具体生理信号而受到调节的启动子可以允许基因产物的可诱导表达。表1和表2列出了在本发明的上下文中可用于调节感兴趣的基因表达的几种调节元件。该列表并非旨在穷举促进基因表达所涉及的所有可能元件，而是仅作为其示例。在一些方面中，根据本实施方式使用的启动子是非组织特异性启动子，例如组成型启动子。105.增强子是增加来自位于同一dna分子上远端位置的启动子的转录的遗传元件。增强子的组成方式很像启动子。也就是说，它们由许多单独的元件组成，每个元件都与一种或多种转录蛋白结合。106.增强子和启动子之间的基本区别是操作性的。增强子区域作为一个整体必须能够在远端刺激转录；对于启动子区域或其组成元件而言，这不一定是正确的。另一方面，启动子必须有一个或多个元件，在具体的位置和具体的方向上指导rna合成的起始，而增强子则缺乏这些特点。启动子和增强子通常是重叠和连续的，通常看起来具有非常相似的模块化组织。107.下面是病毒启动子、细胞启动子/增强子和诱导型启动子/增强子的列表，它们可以在表达构建体中与编码感兴趣的基因或mirna的核酸组合使用(表1和表2)。此外，任何启动子/增强子组合(根据真核启动子数据库epdb)也可用于驱动感兴趣的基因或mirna的表达。截短的启动子可也被用于驱动表达。如果提供适当的细菌聚合酶，真核细胞可以支持某些细菌启动子的细胞质转录，无论是作为递送复合物的一部分或是作为附加的基因表达构建体。108.109.110.[0111][0112][0113][0114][0115]在使用任何cdna插入物的情况下，通常会包括多聚腺苷酸化信号以影响基因转录物的适当多聚腺苷酸化。多腺苷酸化信号的性质被认为并不是本发明成功实施的关键，可采用任何这样的序列，如人类生长激素和sv40多腺苷酸化信号。然而，在一些方面中，多腺苷酸化信号序列不包括在本实施方式的载体中。例如，在慢病毒载体中加入这样的信号序列(在3'ltr之前)可以降低所产生的慢病毒滴度。[0116]在核酸构建体中可包括一个间隔序列。间隔子的存在似乎可以提高mirna的敲低效率(stegmeier等，2005)。间隔子可以是任任何核苷酸序列。在一些方面中，间隔子是gfp。[0117]作为表达盒的一个元件，还可以考虑使用终止子。这些元件可以起到提高信息水平的作用，并减少从盒读到其他序列的情况。[0118]b.可选择标志物[0119]在本发明的某些实施方式中，细胞含有本发明的核酸构建体，细胞可通过在表达构建体中包括一个标志物而在体外、体内或体内被识别。这样的标志物会给细胞带来可识别的变化，使含有表达构建体的细胞易于识别。通常，加入药物选择标志物有助于克隆和转化体的选择，例如，赋予新霉素(neomycin)、嘌呤霉素(puromycin)、透明霉素(hygromycin)、dhfr、gpt、博来霉素(zeocin)和组氨酸醇(histidinol)抗性的基因是有用的可选择标志物。或者，可使用酶，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(cat)。免疫学标志物也可以被使用。所用的可选择标志物并不被认为是重要的，只要它能够与编码基因产物的核酸同时表达即可。可选择标志物进一步的示例是本领域技术人员所熟知的。[0120]v.核酸分子和表达载体的递送[0121]在某些方面中，可以构建用于递送本实施方式的核酸的载体，以在细胞中表达这些因子。在具体方面中，以下系统和方法可用于向所需的细胞类型输送核酸。[0122]a.同源重组[0123]在本实施方式的某些方面中，编码本实施方式核酸分子的载体可以具体方式引入细胞，例如，通过同源重组。目前在干细胞中表达基因的方法涉及使用病毒载体(例如，慢病毒载体)或随机整合到基因组中的转基因。这些方法尚未成功，部分原因是随机整合的载体可以活化或抑制内源基因表达，和/或沉默转基因表达。与随机整合相关的问题可以通过与标靶基因组中具体基因座的同源重组来部分克服。[0124]同源重组(hr)，也称为一般重组，是一种用于所有生命形式的基因重组，其中核苷酸序列在两条相似或相同的dna链之间交换。自20世纪80代中期以来，该技术一直是哺乳动物细胞基因组工程的标准方法。该过程涉及物理破坏和dna最终重连的几个步骤。该过程在自然界中被最广泛使用于修复可致死的dna双链断裂。此外，同源重组在减数分裂过程中产生新的dna序列组合，减数分裂是真核生物产生生殖细胞如精子和卵子的过程。这些新的dna组合代表了后代的遗传变异，使种群能够随着时间的推移演化适应变化的环境条件。同源重组也用于水平基因转移，以在不同菌株和物种的细菌与病毒之间交换遗传物质。同源重组也被用作分子生物学中的一种技术，用于将遗传变化引入标靶生物体。[0125]同源重组可用作靶向基因组修饰。标准hr在哺乳动物细胞中的效率仅为经处理细胞的10-6至10-9(capecchi,1990)。兆核酸酶或归巢核酸内切核酸酶，例如i-scei的使用已被用于提高hr的效率。天然兆核酸酶以及具有修饰靶向特异性的工程改造兆核酸酶已被用于提高hr效率(pingoud和silva，2007；chevalier等，2002)。提高hr效率的另一条途径是工程改造具有可编程dna特异性结构域的嵌合核酸内切酶(silva等,2011)。锌指核酸酶(zfn)是此类嵌合分子的一个示例，其中锌指dna结合域与iis型限制性核酸内切酶(如foki)的催化结构域融合(如durai等，2005；wo2005028630所述)).另一类此类特异性分子包括与iis型限制性核酸内切酶如foki的催化结构域融合的转录激活子样效应物(tale)dna结合结构域(miller等，2011：wo2010079430)。[0126]b.核酸递送系统[0127]本领域技术人员将能够通过标准重组技术构建载体(例如，参见sambrook等，2001和ausubel等，1996，两者均通过引用纳入本文)。载体包括但不限于质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(如yac)，例如逆转录病毒载体(如来源于moloney小鼠白血病病毒载体(momlv)、mscv、sffv、mpsv、snv等)，慢病毒载体(例如，衍生自hiv-1、hiv-2、siv、biv、fiv等)、腺病毒(ad)载体，包括其复制感受态、复制缺陷型及其无病毒形式、腺相关病毒(aav)载体、猿猴病毒40(sv-40)载体、牛乳头瘤病毒载体、爱泼斯坦-巴尔病毒载体、疱疹病毒载体，痘苗病毒载体、哈维鼠肉瘤病毒载体、鼠乳癌病毒载体、rous肉瘤病毒载体。[0128]1.附加型载体[0129]在本发明的某些方面也可提供基于质粒或脂质体的染色体外(即附加型)载体的用途，例如，用于体细胞的重编程。此类附加型载体可包括例如基于orip的载体和/或编码ebv蛋白ebna-1衍生物的载体。这些载体可允许将大的dna片段引入细胞并在染色体外保持，每个细胞周期复制一次，高效地分配给子代细胞，并且基本上不引起免疫反应。[0130]具体地，基于orip的表达载体复制所需的唯一病毒蛋白ebna-1不会引发细胞免疫反应，因为它已经开发出一种高效的机制来绕过在mhci类分子上呈递其抗原所需的处理过程(levitskaya等,1997)。此外，ebna-1可以反式作用以增强克隆基因的表达，在一些细胞系中诱导克隆基因的表达高达100倍(langle-rouault等，1998；evans等，1997)。最后，这种基于orip的表达载体的制造成本很低。[0131]其他染色体外载体包括其他基于嗜淋巴疱疹病毒的载体。嗜淋巴疱疹病毒是一种疱疹病毒，它在淋巴母细胞(例如，人b淋巴母细胞)中复制，并在其自然生命周期的一部分中成为质粒。单纯疱疹病毒(hsv)不是“淋巴营养性”疱疹病毒。示例性的嗜淋巴疱疹病毒包括但不限于ebv、卡波西氏肉瘤疱疹病毒(kshv)；松鼠猴疱疹病毒(herpesvirussaimiri,hs)和马立克氏病病毒(mdv)。还考虑了其他来源的基于附加体的载体，例如酵母ars、腺病毒、sv40或bpv。[0132]本领域技术人员将能够通过标准重组技术构建载体(例如，参见maniatis等，1988和ausubel等，1994，两者均通过引用纳入本文)。[0133]载体还可以包含进一步调节基因递送和/或基因表达，或以其他方式为标靶细胞提供有益特性的其他成分或功能。此类其他成分包括，例如，影响结合或靶向细胞的成分(包括介导细胞类型或组织特异性结合的成分)；影响细胞摄取载体核酸的成分；影响多核苷酸摄取后在细胞内定位的成分(例如介导核定位的试剂)；和影响多核苷酸表达的成分。[0134]此类成分还可包括标志物，例如可检测和/或选择性标志物，其可用于检测或选择已经摄入并表达由载体递送的核酸的细胞。此类成分可以作为载体的天然特征提供(例如使用具有介导结合和摄取的成分或功能的某些病毒载体)，或者可以修饰载体以提供此类功能。大量此类载体在本领域中是已知的并且通常是可用的。当载体维持在宿主细胞中时，载体可以在有丝分裂期间作为自主结构由细胞稳定复制，纳入宿主细胞的基因组内，或维持在宿主细胞的细胞核或细胞质中。[0135]2.基于转座子的系统[0136]根据一个具体的实施方式，核酸的引入可使用转座子-转座酶系统。使用的转座子-转座酶系统可以是众所周知的睡美人、青蛙王子转座子-转座酶系统(有关后者的描述，请参见例如ep1507865)或ttaa特异性的转座子搭载系统。[0137]转座子是可以移动到单个细胞基因组内的不同位置的dna序列，这一过程称为转座。在这个过程中，它们可以引起突变并改变基因组中的dna数量。转座子也曾被称为跳跃基因，是移动遗传元件的示例。[0138]有多种移动遗传元件，它们可以基于其转座机制进行分组。i类移动遗传元件，或逆转录转座子，首先转录为rna，然后通过逆转录酶逆转录回dna，接着插入基因组中的另一个位置来复制自身。ii类移动遗传元件使用转座酶直接从一个位置移动到另一个位置，以在基因组中进行“剪切和粘贴”。[0139]3.病毒载体[0140]在产生重组病毒载体时，非必需基因通常被异源(或非天然)蛋白质或核酸的基因或编码序列取代。病毒载体是一种表达构建体，它利用病毒序列将核酸，且可能将蛋白质引入细胞。某些病毒通过ph依赖性或ph非依赖性机制感染细胞或进入细胞，将其遗传载物整合到宿主细胞基因组中并稳定有效地表达病毒基因的能力使它们成为外源核酸转移进入细胞(例如，哺乳动物细胞)的有吸引力的候选者。下文描述了可用于递送本发明某些方面核酸的病毒载体的非限制示例。[0141]由于逆转录病毒能够将其基因整合到宿主基因组中，转移大量外来遗传物质，感染广泛的物种和细胞类型以及被包装在具体的细胞系中，因此有望成为基因递送载体(miller，1992)。[0142]为了构建逆转录病毒载体，将核酸插入病毒基因组中某些病毒序列的位置，以产生复制缺陷型病毒。为了生产病毒粒子，构建了包含gag、pol和env基因但不含ltr和包装成分的包装细胞系(mann等，1983)。当含有cdna的重组质粒与逆转录病毒ltr和包装序列一起被引入具体的细胞系时(例如，通过磷酸钙沉淀)，包装序列允许重组质粒的rna转录物(即载体基因组)被包装成病毒颗粒，然后分泌到培养基中(nicolas和rubenstein，1988；temin，1986；mann等，1983)。然后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选对其进行浓集，并用于基因转移。根据用于覆盖载体颗粒表面的包膜蛋白的趋向性，逆转录病毒载体能够感染多种细胞类型。然而，整合和稳定表达需要宿主细胞的分裂(paskind等，1975)。[0143]慢病毒是复杂的逆转录病毒，除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env外，还包含其他具有调节或结构功能的基因。慢病毒载体是本领域众所周知的(参见，例如，naldini等，1996；zufferey等，1997；blomer等，1997；giry-laterriere等，2011；美国专利6,013,516和5,994,136)。[0144]重组慢病毒载体能够感染非分裂细胞，并且可用于体内和体外基因转移以及核酸序列的表达。例如，能够感染非分裂细胞的重组慢病毒，其中合适的宿主细胞被两个或多个携带包装功能的载体转染，名为gag、pol和env，以及rev，在美国专利5,994,136中有所描述，通过引用纳入本文。[0145]c.核酸递送[0146]将核酸(例如dna或rna)引入要用本发明编程的细胞中，可使用如本文所述或本领域普通技术人员已知的任何合适的方法进行核酸递送以转化细胞。此类方法包括但不限于直接递送dna，例如通过离体转染(wilson等，1989；nabel等，1989)，通过注射(美国专利号5,994,624、5,981,274、5,945,100、5,780,448、5,736,524、5,702,932、5,656,610、5,589,466和5,580,859，均通过引用纳入本文)，包括显微注射(harland和weintraub，1985；美国专利号5,789,215，通过引用纳入本文)；通过电穿孔法(美国专利号5,384,253，通过引用纳入本文；tur-kaspa等，1986；potter等，1984)；通过磷酸钙沉淀法(graham和vandereb，1973；chen和okayama，1987；rippe等，1990)；使用deae葡聚糖，然后使用聚乙二醇(gopal，1985)；通过直接声波加载(fechheimer等，1987)；通过脂质体介导的转染(nicolau和sene，1982；fraley等，1979；nicolau等，1987；wong等，1980；kaneda等，1989；kato等，1991)和受体介导的转染(wu和wu，1987；wu和wu，1988)；通过微粒轰击(pct申请号wo94/09699和95/06128；美国专利号5,610,042；5,322,783、5,563,055、5,550,318、5,538,877和5,538,880，每一个都通过引用纳入本文)；通过与碳化硅纤维搅拌(kaeppler等，1990；美国专利号5,302,523和5,464,765，均通过引用纳入本文)；通过农杆菌介导的转化(美国专利号5,591,616和5,563,055，均通过引用纳入本文)；通过干燥/抑制介导的dna摄取(potrykus等，1985)，以及这些方法的任何组合。通过应用诸如这些的技术，细胞器、细胞、组织或生物体可被稳定地或瞬时地转化。[0147]2.脂质体介导的转染[0148]在本发明的某个实施方式中，核酸可被包裹在脂质复合物中，例如脂质体。脂质体是以磷脂双层膜和内部水性介质为表征的囊泡结构。多层脂质体具有水性介质隔开的多重脂质层。当磷脂悬浮在过量水溶液中时其自动形成。脂质组分在形成闭合结构之前经历自我重排，并且在脂质双层之间捕获水和溶解的溶质(ghosh和bachhawat,1991)。还考虑了与lipofectamine(gibcobrl)或superfect(qiagen)复合的核酸。使用的脂质体的量可根据脂质体的性质以及使用的细胞而变化，例如，可考虑每1至1000万个细胞约5至约20μg载体dna。[0149]脂质体介导的核酸递送和外源dna的体外表达非常成功(nicolau和sene，1982；fraley等，1979；nicolau等，1987)。脂质体介导的外源dna在培养的鸡胚胎、hela和肝癌细胞中的递送和表达的可行性也已得到证实(wong等，1980)。[0150]在本发明的某些实施方式中，脂质体可与凝血性病毒(hemagglutinatingvirus,hvj)复合。这已被证明有助于与细胞膜融合并促进脂质体包裹的dna进入细胞(kaneda等，1989)。在其他实施方式中，脂质体可与核非组蛋白染色体蛋白(hmg1)复合或结合使用(kato等，1991)。在另外的实施方式中，脂质体可与hvj和hmg-1复合或结合使用。在其他实施方式中，递送载剂可包含配体和脂质体。[0151]3.电穿孔[0152]在本发明的某些实施方式中，通过电穿孔将核酸引入细胞器、细胞、组织或生物体。电穿孔涉及将细胞和dna悬浮液暴露于高压放电。受体细胞可以通过机械创伤使其更容易发生转化。使用的载体的量可根据使用的细胞性质而变化，例如，可考虑每1至1000万个细胞约5至约20μg载体dna。-[0153]使用电穿孔对真核细胞进行转染已经相当成功。小鼠前b淋巴细胞已被人κ免疫球蛋白基因转染(potter等，1984)，大鼠肝细胞已用这种方式被氯霉素乙酰基转移酶基因转染(turkaspa等，1986)。[0154]4.磷酸钙[0155]在本发明的其他实施方式中，使用磷酸钙沉淀将核酸引入细胞。人类kb细胞已使用该技术转染了腺病毒5dna(graham和vandereb，1973)。同样以这种方式，用新霉素标志物基因转染小鼠l(a9)、小鼠c127、cho、cv1、bhk、nih3t3和hela细胞(chen和okayama，1987)，并用多种标志物基因转染大鼠肝细胞基因(rippe等,1990)。[0156]5.deae葡聚糖[0157]在另一个实施方式中，使用deae葡聚糖随后使用聚乙二醇将核酸递送到细胞中。以这种方式，报告质粒被引入小鼠骨髓瘤和红白血病细胞(gopal，1985)。[0158]d.细胞培养[0159]通常，本发明的细胞在培养基中培养，培养基是能够维持细胞生长富含营养的缓冲溶液。[0160]适用于根据本文所述方法分离、扩增和分化干细胞的培养基包括但不限于高葡萄糖达氏改良伊氏培养基(dmem)、dmem/f-12、l-15培养基(liebovitzl-15)、rpmi1640、iscove改良杜氏培养基(imdm)和opti-memsfm(英杰有限公司(invitrogeninc.))。化学成分确定的培养基包含最低必需培养基，例如iscove改良杜氏培养基(imdm)(gibco)，辅以人血清白蛋白、人excyte脂蛋白、运铁蛋白、胰岛素、维生素、必需和非必需氨基酸、丙酮酸钠、谷氨酰胺和丝裂原也是合适的。如本文所用，有丝分裂原是指刺激细胞分裂的试剂。试剂可以是化学物质，通常是某种形式的蛋白质，它会促使细胞开始细胞分裂，从而引发有丝分裂。在一个实施方式中，无血清培养基例如美国专利号5,908,782和wo96/39487所述，以及美国专利号5,486,359中所述“完全培养基”，被考虑用于本文所述的方法。在一些实施方式中，培养基补充有10％胎牛血清(fbs)、人自体血清、人ab血清或补充有肝素(2u/ml)的富含血小板的血浆。细胞培养物可维持在co2气氛中，例如5％至12％，以维持培养液的ph值，在潮湿气氛中于37℃孵育并传代以维持融合度低于85％。[0161]vi.免疫效应细胞[0162]免疫效应细胞可以是t细胞(例如调节性t细胞、cd4 t细胞，cd8 t细胞，或γδt细胞)；自然杀伤(nk)细胞；不变nk细胞；或nkt细胞。本文还提供了产生和工程改造免疫效应细胞的方法以及使用和给予细胞用于过继细胞治疗的方法，在这种情况下，细胞可以是自体或同种异体的。因此，免疫效应细胞可用于免疫治疗，例如靶向癌细胞。[0163]免疫效应细胞可分离自对象、具体是人对象。免疫效应细胞可从感兴趣的对象获得，例如怀疑患有具体的疾病或病症的对象、怀疑患有具体疾病或病症倾向的对象、正在接受特定疾病或疾病治疗的对象、健康志愿者或健康捐献者的对象，或从血库获得。免疫效应细胞可从其存在的对象体内的任何组织或器官中收集、富集和/或纯化，包括但不限于血液、脐带血、脾脏、胸腺、淋巴结、骨髓、手术过程中移除和/或暴露的组织，以及通过活检手术获得的组织。分离的免疫效应细胞可直接使用，也可以例如通过冷冻储存一段时间。[0164]富集、分离和/或纯化免疫效应细胞的组织/器官可从活体和非活体对象中分离，其中非活体对象为器官供体。从脐带血中分离的免疫效应细胞可具有增强的免疫调节能力，例如通过cd4或cd8阳性t细胞抑制来测量。为了增强免疫调节能力，免疫效应细胞可从合并的血液，具体是合并的脐带血中分离出来。合并的血液可来自2个或更多来源，例如3、4、5、6、7、8、9、10或更多来源(例如，供体对象)。[0165]免疫细胞群可从需要治疗或患有与免疫效应细胞活性降低相关疾病的对象获得。因此，这些细胞将是需要治疗的受试者的自体细胞。或者，免疫效应细胞群可从供体获得，优选同种异体供体。同种异体供体细胞可与人白细胞抗原(hla)相容，也可不相容。为了使对象相容，可以对同种异体细胞进行处理以降低免疫原性。[0166]免疫效应细胞的来源包括同种异体和自体来源。在一些情况下，免疫效应细胞可从干细胞或诱导型多能干细胞(ipsc)分化而来。因此，可以从脐带血、外周血、人胚胎干细胞或ipscs中分离出用于根据实施方式进行工程改造的细胞。例如，同种异体t细胞可以被修饰成包括嵌合抗原受体(并且可选地，以缺乏功能性tcr和/或mhc)。在一些方面中，免疫效应细胞是原代人t细胞，例如源自人外周血单个核细胞(pbmc)的t细胞、在用g-csf刺激后收集的pbmc、骨髓或脐带血。在转染或转导(例如，使用car表达构建体)后，细胞可被立即输注或储存。在某些方面中，在转染后，细胞可在基因转移进细胞后约1、2、3、4、5天或更长时间作为批量群体在离体繁殖数天、数周或数月。在另外的方面中，在转染之后，克隆转染子并且克隆证明存在单个整合的或游离型维持的表达盒或质粒，并且离体扩增嵌合抗原受体的表达。选择用于扩增的克隆展示了特异性识别和裂解抗原表达的标靶细胞的能力。可通过用il-2或结合共同γ链的其他细胞因子(例如il-7、il-12、il-15、il-21等)刺激来扩增重组t细胞。重组t细胞可通过人工抗原呈递细胞的刺激进行扩增。重组t细胞可在人工抗原呈递细胞上扩增，或用一种抗体，如okt3，在t细胞表面交联cd3。重组t细胞的亚群可在人工抗原呈递细胞上或用一种抗体(如campath)来删除，该抗体能结合t细胞表面的cd52。在另外的方面中，基因修饰的细胞可被冷冻保存。[0167]在另一方面中，该实施方式的免疫效应细胞已被选择用于高线粒体呼吸潜力(src)。如本文所用，“具有高线粒体src的免疫效应细胞”是指具有比相应的平均免疫效应细胞(例如，t细胞)更高的线粒体活性或线粒体数量的免疫效应细胞(例如，t细胞)。因此，在一些方面中，实施方式的细胞组合物包含具有高线粒体src的免疫效应细胞群，例如具有高线粒体src的car表达t细胞群。[0168]具有高线粒体src的免疫效应细胞(例如cd8 t细胞)在应激条件下(例如高肿瘤负荷、缺氧、糖酵解营养缺乏或抑制性细胞因子环境)可表现出相对于具有较低src的细胞更高的存活率。此外，被选择用于高线粒体src的免疫效应细胞可保留细胞毒活性，即使在应激条件下也是如此。因此，通过选择具有高线粒体src的免疫效应细胞，可以产生用于治疗和car构建体测试的改进细胞组成。[0169]在一方面中，提供了转基因免疫效应细胞，其包含可用于确定转基因效应细胞的线粒体src的报告基因。例如，转基因细胞可包含与线粒体定位信号连接的报告多肽。例如，报告基因可以是荧光多肽，例如增强型黄色荧光蛋白(yfp)或增强型绿色荧光蛋白(egfp)，以及线粒体定位信号可以来自谷氧还蛋白(grx2)。在这种情况下，荧光报告基因识别出具有高线粒体src的car t细胞。例如，可以根据荧光强度对表达报告基因的转基因细胞进行分类，并注入体内进行肿瘤杀伤。同样，可以进行转基因细胞对标靶细胞的离体杀伤测试，以确定例如候选car多肽的治疗效果。[0170]在一些方面中，根据实施方式使用的线粒体报告基因可以是内源基因。在进一步的方面中，线粒体报告基因可以是外源基因，例如编码荧光报告蛋白的基因。在一些方面中，荧光报告蛋白可包含线粒体定位序列。在某些方面中，用于选择具有高src的免疫效应细胞的方法可包括流式细胞术或facs。[0171]在某些方面中，用于鉴定具有src的免疫效应细胞的报告基因的表达可处于核启动子(例如，hef1a)的控制下。在某些方面中，报告基因的表达可处于线粒体启动子的控制下。在某些方面中，表达的报告蛋白可包含线粒体定位序列。在某些方面中，表达的报告蛋白可被导向细胞表面。在某些方面中，报告基因的表达可处于线粒体启动子的控制下并且表达的报告蛋白可被导向细胞表面。在一些方面中，外源报告基因可以侧接转座子重复序列或病毒ltr。在一些方面中，外源报告基因可包含在染色体外核酸中，例如mrna或附加型载体。[0172]vii.增殖免疫效应细胞的方法[0173]在一些情况下，实施方式的免疫效应细胞(例如，t细胞)与活化和增殖细胞(aapc)共培养，以帮助细胞扩增。例如，抗原呈递细胞(apc)在制备本实施方式的治疗组合物和细胞治疗产品中是有用的。有关抗原呈递系统的制备和使用的一般指南，请参见例如，美国专利号6,225,042、6,355,479、6,362,001及6,790,662；美国专利申请公开号2009/0017000和2009/0004142；以及国际公开号wo2007/103009，每一个都通过引用的形式纳入本文。[0174]在一些情况下，aapcs表达感兴趣的抗原(例如cov刺突蛋白)。此外，在一些情况下，apc可以表达结合具体car多肽或一般car多肽(例如，通用活化和繁殖细胞(uapc))的抗体。此类方法公开于国际(pct)专利公开号wo/2014/190273，其通过引用纳入本文。除了感兴趣的抗原外，aapc系统还可包括至少一个外源辅助分子。可使用任何合适数量和组合的辅助分子。辅助分子可选自例如共刺激分子和粘附分子等辅助分子。示例性的共刺激分子包括cd70和b7.1(b7.1先前被称为b7，也被称为cd80)，它们与t细胞表面的cd28和/或ctla-4分子结合，从而例如，影响t细胞扩增、th1分化、短期t细胞存活，和细胞因子分泌，例如白细胞介素(il)-2(参见kim等，2004)。粘附分子可包括碳水化合物结合性糖蛋白(如选择素)、跨膜结合糖蛋白(如整合素)、钙依赖性蛋白(如钙粘蛋白)和单次跨膜免疫球蛋白(ig)超家族蛋白(如胞间粘附分子(icam))，其促进例如细胞对细胞或细胞对基质的接触。示例性粘附分子包括lfa-3和icam，例如icam-1。例如，美国专利号6,225,042，6,355,479和6,362,001中举例说明了用于筛选、克隆、制备和表达示例性辅助分子(包括共刺激分子和粘附分子)的技术、方法和试剂，通过引用纳入本文。[0175]选择成为aapc的细胞，优选在细胞内抗原加工、细胞内肽运输和/或细胞内mhci类或ii类分子肽加载方面存在缺陷，或者是变温的(即，对温度挑战的敏感性低于哺乳动物细胞系)，或同时具有缺陷和变温特性。优选地，被选择成为aapc的细胞也缺乏表达外源性mhci类或ii类分子的至少一种内源对应物(例如，如上所述的内源性mhci类或ii类分子和/或内源辅助分子)的能力，和被引入细胞的辅助分子成分。此外，aapc优选保留细胞在被修饰以生成aapc之前所具有的缺陷和变温特性。示例性的aapc构成或来自与抗原加工(tap)缺陷细胞系相关的转运体，如昆虫细胞系。示例性变温昆虫细胞系是果蝇属细胞系，例如schneider2细胞系(参见，例如，schneider1972)。用于制备、生长和培养schneider2细胞的说明性方法提供于美国专利号6,225,042、6,355,479和6,362,001。[0176]在一个实施方式中，aapc也经历冻融循环。在示例性冻融循环中，可通过使含有aapc的合适容器与适量液氮、固体二氧化碳(即干冰)，或类似低温材料接触来冷冻aapc，从而迅速冷冻。然后将冷冻的apc解冻，方法是从低温材料中取出aapc并暴露在环境室温条件下，或者通过使用温水浴或暖手以促进更短解冻时间来促进解冻过程.此外，aapc可在解冻前被冷冻和储存较长时间。冷冻的aapc也可被解冻，然后在进一步使用前冻干。优选地，可对冻融程序产生不利影响的防腐剂，例如二甲亚砜(dmso)、聚乙二醇(peg)和其他防腐剂，不存在于包含经过冻融循环的aapc的培养基中，或者基本上被去除，例如通过将aapc转移到基本上不含此类防腐剂的培养基中。[0177]在进一步的实施方式中，aapc的异种核酸和内源性核酸可通过交联失活，使得在失活后基本上没有细胞生长、复制或核酸表达发生。在一个实施方式中，aapc在外源mhc和辅助分子表达，此类分子在aapc表面呈递以及向呈递的mhc分子加载所选肽或肽后的某个点失活。因此，这种失活的和选择的肽负载aapc，虽然基本上不能增殖或复制，但保留了选择的肽呈递功能。优选地，交联还产生基本上不含污染微生物如细菌和病毒的aapc，而基本上不降低aapc的抗原呈递细胞功能。因此，交联保持了重要的aapc功能，同时有助于减轻对使用aapc开发的细胞治疗产品的安全性的担忧。对于与交联和aapc相关的方法，参见例如美国专利申请公开号20090017000，其通过引用纳入本文。[0178]viii.治疗性应用[0179]在一些方面中，实施方式的car桥接蛋白和嵌合抗原受体构建体和细胞在患有或怀疑患有冠状病毒感染的对象中具有应用。可以使用的合适的免疫效应细胞包括细胞毒性淋巴细胞(ctl)。正如本领域技术人员所熟知的那样，从对象身上分离这些细胞的各种方法都是容易获得的。例如，使用细胞表面标志物的表达或使用市面上的试剂盒(如皮尔斯,伊利诺伊州罗克福德的isocelltm)。[0180]一旦确定转染或转导的免疫效应细胞(例如，t细胞)能够以所需的调节和所需的水平将嵌合抗原受体表达为表面膜蛋白，就可以确定嵌合抗原受体是否在宿主细胞中具有功能以提供所需的信号诱导。随后，将转导的免疫效应细胞重新引入或给药于对象以活化受试者的抗肿瘤反应。为了便于给药，可以将根据实施方式将转导的t细胞与适当的运载体或稀释剂一起制成适合体内给药的药物组合物或植入物，其还可以是药学上可接受的。制造这种组合物或植入物的方法在本领域中已有描述(参见，例如，《雷明顿药物科学》(remington'spharmaceuticalsciences)，第16版，马克编，1980)。在适当的情况下，转导的t细胞可以按照其各自给药途径的常用方式配制成半固体或液体形式的制剂，例如胶囊、溶液、注射、吸入剂或气雾剂。可以使用本领域已知的方法来防止或最小化组合物的释放和吸收，直到它到达目标组织或器官，或确保组合物的定时释放。然而，理想的采用一种药学上可接受的形式，其不会对表达嵌合抗原受体的细胞产生影响。因此，最好是将转导的t细胞制成含有平衡盐溶液，优选是汉克氏平衡盐溶液，或正常盐水的药物组合物。[0181]在某些实施方式中，将实施方式的car表达细胞递送给有需要的个体，例如患有癌症或感染的个体。然后，这些细胞会增强个体的免疫系统，以攻击相应的癌症或病原体感染的细胞。在某些情况下，向个体提供一个或多个剂量的抗原特异性car细胞。在向个体提供两个或更多剂量的抗原特异性car细胞的情况下，两次给药之间的持续时间应足以允许在个体中增殖的时间，并且在具体实施方式中，两次给药之间的持续时间为l、2、3、4、5、6、7或更多天。例如，用于治疗效果的合适剂量是每次至少105个或约105至约1010个细胞之间，优选地在一系列的给药周期中。一个示例性的给药方案包括四个为期一周的剂量升级周期，从第0天至少约105个细胞开始，例如在启动患者内部剂量递增方案的几周内逐步增加到约1010个细胞的目标剂量。合适的给药方式包括静脉注射、皮下注射、腔内注射(例如通过储存器接入装置)、腹膜内注射和直接注射到肿瘤块中。[0182]在某些实施方式中，在递送桥接蛋白之前将表达car的细胞递送给有需要的个体。在一些情况下，car表达细胞和桥接蛋白之间给药的持续时间可以是1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、2周、3周、4周、5周、6周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月或更长时间。在一些情况下，向个体提供一个或多个剂量的car表达细胞和/或桥接蛋白。在向个体提供两个或多个剂量的car表达细胞和/或桥接蛋白的情况下，各剂量之间的给药时间可为l、2、3、4、5、6、7或更多天。[0183]在某些实施方式中，在递送桥接蛋白之后将car表达的细胞递送给有需要的个体。在一些情况下，桥接蛋白和car表达细胞之间给药的持续时间可以是1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、2周、3周、4周、5周、6周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月或更长时间。在一些情况下，向个体提供一个或多个剂量的car表达细胞和/或桥接蛋白。在向个体提供两个或多个剂量的car表达细胞和/或桥接蛋白的情况下，各剂量之间的给药时间可为l、2、3、4、5、6、7或更多天。[0184]在某些实施方式中，car表达细胞被递送给需要的个体，同时递送桥接蛋白。在一些情况下，向个体提供一个或多个剂量的car表达细胞和/或桥接蛋白。第二次或更多次递送可仅是car表达细胞，仅是桥接蛋白或两者的组合。在向个体提供两个或多个剂量的car表达细胞和/或桥接蛋白的情况下，各剂量之间的给药时间可为l、2、3、4、5、6、7或更多天。[0185]在一些情况下，先前接受过car表达细胞治疗的患者可接受桥接蛋白治疗，以重新定向car表达细胞的效应功能。在一些情况下，先前接受过car表达细胞和桥接蛋白治疗的患者可接受不同的桥接蛋白治疗，以重新定向car表达细胞的效应功能。这可治疗患者的新肿瘤或新感染。这可在抗原丢失的情况下完成。[0186]在任何提供的实施方式中，可用多于一种桥接蛋白治疗患者以将car表达细胞的效应子功能导向多个标靶。[0187]实施方式的药物组合物(例如，包含表达car的t细胞)可以单独使用或与其他公认的可用于治疗癌症的试剂组合使用。无论是单独递送还是与其他试剂组合递送，实施方式的药物组合物都可以通过多种途径递送至哺乳动物，具体是人体的各个部位，以实现具体的效果。本领域的技术人员将认识到，尽管有多于一种途径可用于给药，但具体途径可提供比另一途径更立即和更有效的反应。例如，皮内递送可用于治疗黑色素瘤。局部或全身递送可以通过给药，包括将制剂应用或滴入体腔、吸入或吹入气雾剂，或通过胃肠外引入，包括肌肉内、静脉内、门静脉内、肝内、腹膜、皮下或皮内给药来实现。[0188]实施方式的组合物可以单位剂量形式提供，其中每个剂量单位，例如注射剂，单独或与其他活性剂的适当组合含有预定量的组合物。本文所用的术语单位剂型是指物理上离散的单位，适合作为人和动物受试者的单位剂量，每个单位包含预定量的实施方式的组合物，单独或与其他活性剂组合，经计算该量足以与药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂联合使用，以产生所需的效果。实施方式单位剂量形式的规格取决于与具体对象中药物组合物相关的具体药效学。[0189]理想地，有效量或足够数量的分离的转导t细胞存在于组合物中并被引入对象中，以便建立长期的、特异性的抗肿瘤反应以减小肿瘤的大小或消除肿瘤生长或再生长，否则将导致这种治疗的缺失。理想地，在其他相同条件时与不存在转导t细胞相比，重新引入对象的转导t细胞的量导致肿瘤大小有10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的减小。如本文所用，术语“抗肿瘤有效量”是指有效量的car表达免疫效应细胞以减少对象中的癌细胞或肿瘤生长。[0190]因此，转导的免疫效应细胞(如t细胞)的量应考虑到给药途径，并应使转导的免疫效应细胞有足够的数量被引入，以达到预期的治疗反应。此外，本文所述组合物中包含的每种活性剂的量(例如，每个待接触的细胞的量或每一定体重的量)在不同的应用中可以有所不同。一般来说，转导t细胞的浓度最好足以在被治疗的对象中提供至少约1×106至约1×109个转导的t细胞，甚至更理想的是约1×107至约5×108个转导的t细胞，尽管任何合适的数量可以被使用或高于，例如，大于5×108个细胞，或低于，例如，小于1×107个。剂量安排可以基于已确立的基于细胞的疗法(例如，参见topalian和rosenberg，1987；美国专利号4,690,915)，或者可以使用另一种连续输注策略。[0191]这些数值提供了实践者在优化实施方式的方法时使用的转导t细胞范围的一般指南。本文所述的此类范围决不排除使用更高或更低量的组分，这在具体应用中可以是有保证的。例如，实际剂量和时间表可以根据组合物是否与其他药物组合物联合给药，或根据药代动力学、药物处置和代谢的个体差异而变化。本领域的技术人员可以根据具体情况的紧急情况容易地做出任何必要的调整。[0192]ix.实施方式的试剂盒[0193]本文所述的任何组合物都可以包含在一个试剂盒中。在一些实施方式中，试剂盒中提供了car桥接蛋白和/或car表达免疫效应细胞，其还可以包括适用于扩增细胞的试剂，例如培养基、apc、工程改造的apc、生长因子、抗体(例如，用于分选或表征car表达细胞)和/或编码转基因的质粒。[0194]在一个非限制性实例中，嵌合抗原受体表达构建体、一种或多种用于产生嵌合抗原受体表达构建体的试剂、用于转染表达构建体的细胞，和/或一种或多种用于获得用于转染表达构建体的同种异体细胞的仪器(此类仪器可以是注射器、移液管、镊子，和/或任何此类医学认可的仪器)。[0195]在一些实施方式中，试剂盒提供了用于消除内源性tcrα/β表达和/或mhc表达的表达构建体(例如，β-2微球蛋白)、一种或多种用于生成该构建体的试剂和/或car 细胞。在一些实施方式中，包括编码锌指核酸酶的表达构建体。[0196]在一些方面中，该试剂盒包括用于细胞电穿孔的试剂或装置。[0197]试剂盒可包含一种或多种适当等分的实施方式的组合物或用于产生实施方式的组合物的试剂。试剂盒的组分可包装在水性介质中或以冻干形式包装。试剂盒的容器用具可包括至少一个小瓶、试管、培养瓶、瓶、注射器或其他容器用具，其中可以放置组分，并且优选地，适当地等分。如果试剂盒中有多个组分，则试剂盒通常还将包含第二、第三或其他附加容器，可以将其他组分单独放入其中。然而，各种组分的组合可包含在小瓶中。实施方式的试剂盒通常还包括用于容纳嵌合抗原受体构建体和任何其他试剂容器的装置，进行商业销售。此类容器可包括注射或吹塑的塑料容器，例如，所需的小瓶被保留在其中。[0198]x.实施例[0199]包括以下实施例以演示本发明的优选实施方式。本领域技术人员应当理解，在下面的实施例中公开的技术代表发明人发现的在本公开的实践中发挥良好作用的技术，因此可以被视为构成其实践的优选模式。在本文基础上，本领域技术人员应懂得，在本文要旨和范围内可对本文所述具体实施方式进行多种改变而仍然得出相同或相近结果。[0200]实施例1–car-抗原桥接蛋白的构建[0201]发明人试图开发一种桥接蛋白，以将hiv特异性cart细胞重新导向肿瘤细胞上表达的抗原，从而证明对这些标靶细胞的杀伤。为此，通过将gp120t与抗原结合域(如与感兴趣的标靶抗原结合的抗体)连接或融合，产生了桥接蛋白。[0202]方法[0203]构建设计和分子克隆。抗hivcart细胞先前是基于使用截短的cd4(cd4t)胞外结构域(car4)开发的，该结构域可识别hiv包膜(env，gp120)蛋白。与包含四个免疫球蛋白结构域(d1至d4)的全长cd4糖蛋白不同，cd4t使用由d1和d2结构域组成的截短的cd4蛋白。因此，car修饰的细胞将结合感染细胞上的hivenv。基本的car4设计如图5所示。[0204]慢病毒载体产生。通过用携带car的质粒以及慢病毒包装质粒pax2和vsvg转染hek293t细胞来产生慢病毒载体。在4-6小时补充细胞培养基，随后在12-24-48小时收集病毒颗粒。收集培养基，过滤以去除细胞碎片，并使用超速离心(19,500rpm，2小时)富集病毒颗粒。浓缩慢病毒载体的最终等分试样储存在-80℃。通过以一系列稀释度转导ht1080细胞并测量表达rqr8的细胞百分比来评估功能性病毒载体滴度。[0205]细胞和细胞系。原代t细胞由从日内瓦大学医院输血中心采购的匿名血沉棕黄层血液单位制备。用ficoll分离外周血单个核细胞(pbmc)，用miltenyi(美天旎生物技术公司)cd4/cd8微珠分离t细胞，并在液氮中冷冻保存。在这些原理研究证明中，转导以表达cd117的hl-60细胞被用作标靶细胞。[0206]cart细胞制造。将冷冻保存的t细胞解冻，在texmacs培养基中过夜培养，并在第二天使用cd3/cd28微珠(1:1比例)或transact(miltenyi,美天旎生物技术公司)活化，并以感染复数(moi)3-7用car构建体进行病毒转导。转导以高密度体积(200万个细胞/ml/cm2)进行，并在18-24小时后补充培养基，此后每隔一天以100万个/ml的细胞密度维持t细胞。[0207]在t细胞转导后5-7天进行流式细胞术。细胞被收获、洗涤、重悬于facs缓冲液(不含ca/mg2 的pbs、2mmedta、0.5％bsa)中并用cd34抗体(qbend10)染色20-30分钟以评估报告基因(rqr8)表达细胞的频率。染色后，用pbs洗涤细胞，重悬于facs缓冲液中，并通过流式细胞术评估细胞表面表达。[0208]桥接蛋白设计与产生。基于截短的糖蛋白120(gp120t)与igg和二抗体格式的化学偶联，设计了一种桥接蛋白构建体。化学合成了具有马来酰亚胺环的11个氨基酸的截短gp120片段(ssggdpeivth；seqidno:6)。为了允许偶联，igg和双抗体蛋白是用半胱氨酸残基生产的。化学偶联起始于二硫苏糖醇(dtt)还原和添加gp120t-马来酰亚胺(图6)。[0209]细胞毒性测试。car4t细胞与标靶细胞共培养18-24小时，效应细胞与标靶细胞的比例为1:1。还添加偶联抗体至最终浓度为500nm。car4t细胞与hl-60细胞上的肿瘤相关抗原(在这种情况下为cd117)结合的能力是通过测量共培养物中剩余的活靶细胞百分比下降的比例来评估的。[0210]b.结果[0211]桥接蛋白结合cd4并被重定向以杀死肿瘤细胞。发明人首先着手证明gp120t与igg的成功偶联，以及与t细胞上表达的cd4蛋白的结合(图7a)。为了对此进行测试，将原代t细胞暴露于不同浓度的igg偶联物30分钟，然后洗涤两次以去除未结合的igg，并用fitc标记的蛋白a染色以检测cd4结合的igg蛋白。igg偶联蛋白能够结合原代t细胞上的天然cd4，重要的是，与使用抗cd4抗体(分别为58.5％和56.9％)相比，重现了同等百分比的cd4阳性细胞。[0212]接着，进行相似的实验以确认igg偶联物与car4受体的结合。为此，用携带car4构建体的慢病毒载体转导ht1080细胞，并将细胞暴露于不同浓度的igg或igg偶联蛋白。如图7b中的流式细胞术直方图所示，当使用igg偶联的桥接蛋白时，fitc标记的蛋白a的中值荧光强度(mfi)明显成比例增加，但当单独使用igg时未观察到此种情况。[0213]最后，发明人试图证明桥接蛋白能够重新引导car4t细胞靶向并杀死肿瘤细胞(图7c和7d)。在本实验中，将表达cd117的hl-60肿瘤细胞与car4t细胞(1:1比例)和多种桥接蛋白构型(500nm)共培养。发明人还建立了抗cd117双抗体，在该评估中其与gp120t偶联。在24共培养后，当使用igg偶联(65％)和双抗体偶联(90％)的桥接蛋白时，当标准化为对照(仅car4t细胞，无桥蛋白)时，观察到靶细胞的细胞毒性显著增加。这证明桥接蛋白可以高效地结合于cart细胞并将其重新导向肿瘤细胞从而引起特异性细胞毒性。[0214]c.概述和结论[0215]这确认了抗体偶联物能够桥接hiv特异性cart细胞到表达感兴趣的抗原的肿瘤细胞，用于重新定向hiv特异性cart细胞的细胞毒性。一旦结合，cart细胞就会表现出对肿瘤细胞的有效杀伤，这在使用双抗体-gp120t偶联物时更为明显。进一步的实验包括将car4t细胞重新导向其他有关的肿瘤相关抗原，包括针对b细胞恶性肿瘤的cd19、cd20和cd22，以及在实体瘤上表达的抗原。[0216]***[0217]根据本公开，本文公开和要求保护的所有方法都可以在不进行不当实验的情况下制造和执行。虽然已经根据优选实施方式描述了本公开的组合物和方法，但对于本领域技术人员来说，显而易见的是，在不脱离本公开的概念、精神和范围的情况下，可以对本文所述方法的步骤或步骤序列进行改变。更具体而言，可以用化学和生理相关的某些试剂代替本文所述的试剂，同时可以得到相同或类似的结果。所有此类类似替代和修改对于本领域技术人员而言是显而易见地被视为在所附权利要求所定义的本公开的精神、范围和概念范围内的。[0218]参考文献[0219]以下参考文献在一定程度上提供了补充本文所述内容的示例性程序或其他细节，通过引用具体纳入本文。[0220]美国专利申请公开号2002/0168707[0221]美国专利申请公开号2003/0051263[0222]美国专利申请公开号2003/0055020[0223]美国专利申请公开号2003/0159161[0224]美国专利申请公开号2004/0064842[0225]美国专利申请公开号2004/0265839[0226]美国专利申请公开号2009/0004142[0227]美国专利申请公开号2009/0017000[0228]美国专利号4,690,915[0229]美国专利号5,302,523[0230]美国专利号5,322,783[0231]美国专利号5,384,253[0232]美国专利号5,464,765[0233]美国专利号5,486,359[0234]美国专利号5,538,877[0235]美国专利号5,538,880[0236]美国专利号5,550,318[0237]美国专利号5,563,055[0238]美国专利号5,580,859[0239]美国专利号5,589,466[0240]美国专利号5,591,616[0241]美国专利号5,610,042[0242]美国专利号5,656,610[0243]美国专利号5,702,932[0244]美国专利号5,736,524[0245]美国专利号5,780,448[0246]美国专利号5,789,215[0247]美国专利号5,908,782[0248]美国专利号5,945,100[0249]美国专利号5,981,274[0250]美国专利号5,994,136[0251]美国专利号5,994,624[0252]美国专利号6,013,516[0253]美国专利号6,225,042[0254]美国专利号6,355,479[0255]美国专利号6,362,001[0256]美国专利号6,410,319[0257]美国专利号6,506,559[0258]美国专利号6,573,099[0259]美国专利号6,790,662[0260]ep1507865[0261]wo94/09699[0262]wo95/06128[0263]wo96/39487[0264]wo2005/028630[0265]wo2007/103009[0266]wo2010/079430[0267]wo2014/190273[0268]wo2015/123642[0269]wo2019/186274[0270]angel等,“佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯(12-0-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate)对人胶原酶基因的诱导是由位于5'侧接区域的诱导增强子元件介导的”,mol.cell.biol.,7:2256-2266,，1987a。[0271]angel等.,"佛波醇酯诱导基因包含一个由tpa调节的反式作用因子识别的常见顺式元件,"cell,49:729-739,1987b。[0272]atchison和perry,"串联κ免疫球蛋白启动子在κ增强子存在时同样活跃：对增强子功能模型的启示,"cell,46:253-262,1986。[0273]ausubel等.,《新编分子生物学实验指南》(currentprotocolsinmolecularbiology),格林出版联合公司与约翰威利父子公司(greenepubl.assoc.inc.&johnwiley&sons,inc.)，马萨诸塞州,1996。[0274]banerji等，“淋巴细胞特异性细胞增强子位于免疫球蛋白重链基因连接区域的下游”，cell，35:729-740,1983。[0275]banerji等，“远端sv40dna序列增强了β-珠蛋白基因的表达”，cell，27:299-308,1981。[0276]berkhout等，“tat通过新生rna标靶反式激活人类免疫缺陷病毒,”cell,59:273-282,1989。[0277]blanar等，“一种与mhci类基因h-2kb的干扰素反应序列结合的γ-干扰素诱导因子”，emboj.，8:1139-1144,1989。[0278]blomer等，j.virol.，71(9):6641-6649，1997.[0279]bodine和ley,"增强子元件位于人γ球蛋白基因3’端,"emboj.,6:2997-3004,1987。[0280]boshart等，“一个强增强子位于人类巨细胞病毒立即早期基因的上游，”cell，41:521-530,1985。[0281]braddock等，"hiv-itat活化细胞核中预合成的rna"，cell，58:269-279，1989。[0282]bulla和siddiqui，"乙肝病毒增强子从内部位置调节乙肝病毒表面抗原基因的转录"，j.virol.，62：1437-1441，1988。[0283]campbell和villarreal，"多瘤病毒单个增强子核心序列的功能分析：细胞特定的dna复制与转录的解耦"，mol.cell.biol.,8:1993-2004,1988.[0284]campo等，"牛乳头瘤病毒1型基因组中的转录控制信号"，nature，303：77-80，1983。[0285]capecchi,nature,348:109,1990.[0286]celander和haseltine,"糖皮质激素对小鼠白血病病毒转录元件的调控是由病毒增强区的决定因素指定的,"j.virology,61:269-275,1987.[0287]celander等，"小鼠白血病病毒增强区中的调控元件介导糖皮质激素反应性"，j.virology，62:1314-1322，1988。[0288]chandler等，“体外糖皮质激素受体特异性结合的dna序列在体内呈现异源启动子激素反应”，cell，33：489-499，1983。[0289]chang等，“葡萄糖调节蛋白(grp94和grp78)基因共享共同的调控域并受共同的反式作用因子协调调控，”mol.cell.biol.,9:2153-2162,1989.[0290]chatterjee等，"甲状腺刺激素α基因受甲状腺激素的负向调节:受体与tata盒相邻的相互作用，"procnatl.acadsci.u.s.a.,86:9114-9118,1989。[0291]chen和okayama，“质粒dna对哺乳动物细胞的高效转化”，mol.cell.biol，7:2745-2752,1987。[0292]chevalier等,mol.cell,10:895-905(2002)。[0293]choi等，“多重耐药人类细胞中交叉耐药模式的改变源于mdr-1(p-糖蛋白)基因的自发突变，”cell，53:519-529,1989。[0294]cohen等，“人类c-ha-ras1基因的重复序列元件3'端具有增强子活性”，j.cell.physiol.增刊，5:75-81,1987。[0295]costa等，“小鼠转甲状腺素蛋白(前白蛋白)基因的细胞特异性增强子在一个位点结合共同因子，在其他两个位点结合肝脏特异性因子，”mol.cell.biol,8:81-90,1988。[0296]cripe等，“角质形成细胞依赖性增强子以及病毒e2反式激活因子和阻遏基因产物对人乳头瘤病毒16e6-e7启动子的转录调控：对宫颈癌发生的影响”，emboj.，6：3745-3753，1987。[0297]culotta和hamer，“小鼠金属硫蛋白基因金属反应元件的精细定位”，mol.cell.biol.,9:1376-1380,1989.[0298]dandolo等，“小鼠胚胎癌细胞中多瘤病毒转录的调控”，j.virology，47:55-64，1983。[0299]devilliers等，“多瘤病毒dna复制需要增强子”，nature，312:242-246,1984。[0300]deschamps等，“原癌基因fos上游转录增强子元件的鉴定”，science,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：：1.
技术领域：
：5.本公开总体涉及免疫学、病毒学和医学领域。更具体地说，它涉及将表达car的免疫效应细胞重新导向任何感兴趣的抗原的桥接蛋白，以及利用其治疗疾病的方法。6.2.相关领域的描述7.最近，经工程改造的免疫效应细胞已成为治疗病毒性疾病和癌症的一种有吸引力的疗法。例如，t细胞可以经工程改造为表达嵌合抗原受体(car)，其靶向任何感兴趣的具体抗原。这种细胞能够有靶向性地杀死表达癌症标志物的细胞或任何感染病原体的细胞。尽管这些新疗法很有前景，但仍存在脱靶毒性和工程改造的细胞在治疗对象中缺乏持久性的问题。例如，肿瘤异质性和标靶抗原表达的丧失是开发有效的嵌合抗原受体(car)t细胞疗法的显著挑战。存在非常少的肿瘤特异性抗原(即仅在肿瘤细胞上表达的抗原)，而大多数是与肿瘤相关(即在肿瘤细胞上过度表达，但在健康细胞上表达程度较低)。肿瘤也有失去car靶向抗原表达的倾向，因此许多研究小组正在开发双特异性和三特异性cart细胞，以捕获更多样化的肿瘤细胞。这在b细胞恶性肿瘤的背景下得到了很好的描述，其中针对cd19、cd20和cd22的多特异性cart细胞正在临床开发中。实体瘤和实体瘤微环境是一个更大的挑战，需要克服更多的肿瘤异质性。因此，非常需要新的，更先进的靶向免疫效应细胞的方法。技术实现要素：8.本文提供了嵌合抗原受体(car)桥接蛋白，其将单特异性car-t细胞重新导向替代性或多个标靶抗原。例如，提供了融合蛋白和抗体偶联物，它们一方面与car结合，另一方面与选择的标靶抗原结合。因此，与创建多特异性car相比，本文提供的桥接蛋白通过多特异性桥接蛋白将单变体car-t细胞重新导向多种抗原。单个或多个桥蛋白可以依序或作为一个部分一起输注，以实现同时的多靶向方法。9.在一些实施方式中，本公开提供了嵌合抗原受体(car)桥接蛋白，其包含(1)抗原结合域和(2)car结合域，其包含hiv-1gp120蛋白的至少部分。在一些方面中，car结合域与抗原结合域化学偶联。在一些方面中，car桥接蛋白进一步包含抗体fc结构域。在一些方面中，fc结构域位于car结合域和抗原结合域之间。在一些方面中，car结合域位于抗原结合域和fc结构域之间。在一些方面中，car桥接蛋白进一步包含抗原结合域和car结合域之间的接头序列。在一些方面中，car结合域包含seqidno:6中提供的序列。在一些方面中，fc结构域包含人类fc结构域序列。在其他方面中，fc结构域包含人类重链fc结构域序列。在另一些方面中，fc结构域包含人类重链fc结构域序列的ch2和ch3区。在另一方面中，fc结构域相对于野生型人类重链fc结构域序列包含取代，这些取代阻止与fcgr受体结合。在其他方面，该fc结构域包含与seqidno:4提供的序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％相同性的序列。10.在一些方面中，该抗原结合域结合于肿瘤抗原或病毒抗原。在一些方面中，抗原结合域包含与感兴趣的抗原相互作用的肽。在一些方面中，抗原结合域包含识别感兴趣抗原的抗体的抗原结合部分。在一些方面中，抗原结合域包含配体的至少部分,其与感兴趣的抗原相互作用。在一些方面中，抗原结合域能够与cd19、cd20或cd22结合。在其他方面，抗原结合域能够与冠状病毒刺突蛋白结合。在另一方面中，冠状病毒刺突蛋白是sars-cov-1或sars-cov-2刺突蛋白。在一些方面中，该抗原结合域包含ace2胞外结构域的至少部分。在另一方面中，ace2胞外结构域的所述部分是ace2t结构域。在另一方面中，该ace2t结构域包含与seqidno:2的序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％相同性的序列。11.在一些方面中，car桥接蛋白进一步包含car结合域、fc域和/或抗原结合域之间的至少一个接头序列。在一些方面中，car桥接蛋白包含car结合域、fc结构域和/或抗原结合域各自之间的接头序列。在一些方面中，接头序列包含gggs的序列(seqidno:7)。在一些方面中，接头序列包含由seqidno:8提供的序列。在一些方面中，car桥接蛋白形成同二聚体。12.在其他实施方式中，本公开提供了包含car结合域和抗原结合域的嵌合抗原受体(car)桥接蛋白。在一些方面中，car结合域与抗原结合域化学偶联。在一些方面中，car桥接蛋白进一步包含抗体fc结构域。在一些方面中，fc结构域位于car结合域和抗原结合域之间。在其他方面中，car结合域位于抗原结合域和fc结构域之间。在一些方面中，car结合域包含与car胞外部分相互作用的肽。在一些方面中，car结合域包含识别car的胞外部分的抗体的抗原结合部分。在一些方面中，car结合域包含配体的至少部分,其与car胞外部分相互作用。在一些方面中，car结合域包含hiv-1gp120蛋白的至少部分。在一些方面中，car结合域包含seqidno:6中提供的序列。在某些方面中，car结合域基本上由seqidno:6中提供的序列组成。在某些方面中，car结合域由seqidno:6中提供的序列组成。13.在一些方面中，fc结构域包含人类fc结构域序列。在一些方面中，fc结构域包含人类重链fc结构域序列。在一些方面中，fc结构域包含人重链fc结构域序列的ch2和ch3区。在一些方面中，fc结构域相对于野生型人类重链fc结构域序列包含取代，这些取代阻止与fcgr受体结合。在一些方面中，该fc结构域包含与seqidno:4提供的序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％相同性的序列。在一些方面中，该抗原结合域结合于肿瘤抗原或病毒抗原。在一些方面中，抗原结合域包含与感兴趣的抗原相互作用的肽。在一些方面中，抗原结合域包含识别感兴趣抗原的抗体的抗原结合部分。在一些方面中，抗原结合域包含配体的至少部分,其与感兴趣的抗原相互作用。在一些方面中，抗原结合域能够与cd19、cd20或cd22结合。在一些方面中，抗原结合域能够与冠状病毒刺突蛋白结合。在另一些方面中，冠状病毒刺突蛋白是sars-cov-1或sars-cov-2刺突蛋白。14.在一些方面中，该抗原结合域包含ace2胞外结构域的至少部分。在一些方面中，部分ace2胞外结构域是ace2t结构域。在另一方面中，该ace2t结构域包含与seqidno:2的序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％相同性的序列。在一些方面中，car桥接蛋白进一步包含car结合域、fc结构域和/或抗原结合域之间的至少一个接头序列。在一些方面中，car桥接蛋白包含car结合域和抗原结合域，以及可选地，fc结构域之间的接头序列。在一些方面中，接头序列包含gggs的序列(seqidno:7)。在一些方面中，接头序列包含由seqidno:8提供的序列。在一些方面中，car桥接蛋白形成同二聚体。15.在其他实施方式中，本公开提供了编码本公开的car桥接蛋白的核酸分子。在一些方面中，编码car桥接蛋白的序列操作性地连接至表达控制序列。在一些方面中，核酸分子被进一步定义为表达载体。在一些方面中，表达载体是附加型载体。在一些实施方式中，表达载体是病毒载体。在另一些方面中，该病毒载体是腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒或慢病毒载体。16.在其他实施方式中，本公开提供了药物组合物，其在药学上可接受的运载体中包含本公开的car桥接蛋白。在一些方面中，药物组合物进一步包含免疫效应细胞群，所述免疫效应细胞群体包含car桥接蛋白的car结合域所结合的car多肽。17.在进一步的实施方式中，本公开提供了治疗有需要的对象的方法，该方法包括向对象施用有效量的本公开的car桥接蛋白。在一些方面中，对象先前已被施用免疫效应细胞群，所述免疫效应细胞群体包含car桥接蛋白的car结合域所结合的car多肽。在一些方面中，该方法进一步包括向对象施用有效量包含car多肽的免疫效应细胞群，car桥接蛋白的car结合域结合该car多肽。在一些方面中，细胞与对象同种异体。在一些方面中，细胞与对象自体同源。在一些方面，细胞hla匹配于对象。在一些方面中，对象具有冠状病毒感染。在一些方面中，对象具有sar-cov感染。在一些方面中，对象具有sar-cov-2感染。在一些方面中，对象患有covid-19。在一些方面中，car桥接蛋白包含(i)与seqidno:2的序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％相同性的抗原结合域；以及(ii)car结合域，其包含seqidno:6中提供的序列，并且其中car多肽包含cd4结构域作为其抗原结合域。在一些方面中，对象患有癌症。在一些方面中，car桥接蛋白包含能够与cd19、cd20或cd22结合的抗原结合域。18.在另一实施方式中，本公开提供了包含car结合域和抗原结合域的嵌合抗原受体(car)桥接蛋白。在一些方面中，抗原结合域与car结合域化学偶联。在一些方面中，抗原结合域和car结合域包含在融合蛋白中。在一些方面中，car桥接蛋白进一步包含抗体fc结构域。在一些方面中，fc结构域位于car结合域和抗原结合域之间。在其他方面中，car结合域位于抗原结合域和fc结构域之间。在一些方面中，car结合域包含与car胞外部分相互作用的肽。在一些方面中，car结合域包含识别car的胞外部分的抗体的抗原结合部分。在一些方面中，car结合域包含配体的至少部分，其与car胞外部分相互作用。在一些方面中，car结合域结合到对car的标靶具有特异性的部分car。在一些方面中，car包括scfv，并且其中car结合域结合于scfv的可变区。在一些方面中，car结合域包含抗体或其抗原结合片段。在一些方面中，car结合域包括scfv。19.在一些方面中，car结合域包含hiv-1gp120蛋白的至少部分。在一些方面中，car结合域包含seqidno:6中提供的序列。在一些方面中，car是cd19特异性car，并且car结合域结合于cd19特异性car。在一些方面中，car结合域包含抗体或其抗原结合片段。在一些方面中，car结合域包含scfv。在一些方面中，car结合域包含cd19蛋白的至少部分。在一些方面中，fc结构域包含人类fc结构域序列。在一些方面中，fc结构域包含人类重链fc结构域序列。在一些方面中，fc结构域包含人重链fc结构域序列的ch2和ch3区。在一些方面中，fc结构域相对于野生型人类重链fc结构域序列包含取代，这些取代阻止与fcgr受体结合。在一些方面中，fc结构域包含与seqidno:4提供的序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％相同性的序列。在一些方面中，该抗原结合域结合于肿瘤抗原或病毒抗原。20.在一些方面中，抗原结合域包含与感兴趣的抗原相互作用的肽。在一些方面中，抗原结合域包含识别感兴趣抗原的抗体的抗原结合部分。在一些方面中，抗原结合域包含配体的至少部分，其与感兴趣的抗原相互作用。在一些方面中，抗原结合域结合cd19、cd20或cd22。在一些方面中，抗原结合域能够与冠状病毒刺突蛋白结合。在一些方面中，冠状病毒刺突蛋白是sars-cov-1或sars-cov-2刺突蛋白。在一些方面中，抗原结合域包含ace2胞外结构域的至少部分。在一些方面中，ace2胞外结构域的所述部分是ace2t结构域。在另一方面中，该ace2t结构域包含与seqidno:2的序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％相同性的序列。在一些方面中，car桥接蛋白进一步包含car结合域、fc结构域和/或抗原结合域之间的至少一个接头序列。在一些方面中，car桥接蛋白包含car结合域和抗原结合域，以及可选地，fc结构域之间的接头序列。在一些方面中，接头序列包含gggs的序列(seqidno:7)。在一些方面中，接头序列包含由seqidno:8提供的序列。在一些方面中，car桥接蛋白形成同二聚体。21.在其他实施方式中，本公开提供了编码本公开的car桥接蛋白的核酸分子。在一些方面中，编码car桥接蛋白的序列被操作性地连接至表达控制序列。在其他方面中，car桥接蛋白被进一步定义为表达载体。在一些方面中，表达载体是附加型载体。在一些实施方式中，表达载体是病毒载体。在一些方面中，该病毒载体是腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒或慢病毒载体。22.在其他实施方式中，本公开提供了药物组合物，其在药学上可接受的运载体中包含本公开的car桥接蛋白。在一些方面中，药物组合物进一步包含免疫效应细胞群，所述免疫效应细胞群体包含car桥接蛋白的car结合域所结合的car多肽。23.在另一些实施方式中，本公开提供了治疗有需要的对象的方法，该方法包括向对象施用有效量的本公开的car桥接蛋白。在一些方面中，对象先前已被施用有效量包含car多肽的免疫效应细胞群，car桥接蛋白的car结合域结合该car多肽。在一些方面中，该方法进一步包括向对象施用有效量包含car多肽的免疫效应细胞群，car桥接蛋白的car结合域结合该car多肽。在一些方面中，细胞与对象同种异体。在一些方面中，细胞与对象自体同源。在一些方面，细胞hla匹配于对象。在一些方面中，对象具有冠状病毒感染。在一些方面中，对象具有sar-cov感染。在其他方面中，对象具有sar-cov-2感染。在另一些方面中，对象患有covid-19。在一些方面中，car桥接蛋白包含(i)与seqidno:2的序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％相同性的抗原结合域；以及(ii)car结合域，其包含seqidno:6中提供的序列，并且其中car多肽包含cd4结构域作为其抗原结合域。在某些方面中，car结合域基本上由seqidno:6中提供的序列组成。在某些方面中，car结合域由seqidno:6中提供的序列组成。在一些方面中，对象患有癌症。在一些方面中，car桥接蛋白包含能够与cd19、cd20或cd22结合的抗原结合域。在一些方面中，car桥接蛋白的car结合域包含cd19蛋白的至少部分。24.通过以下详细说明，本发明的其他目的、特征和优点将显而易见。然而，应当理解，在指示本发明的优选实施方式的同时，详细描述和具体实施例仅是示例说明，因为本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员而言将由该详细描述变得显而易见。25.附图简述26.以下所述附图属于本说明书的一部分，包括于此用以进一步说明本文某些方面的内容。以下一幅或多幅附图与具体实施方式的详细描述有助于更好地理解本发明。27.图1a-1e.重新定向cart细胞的桥接蛋白的示意图。图1a说明了使用桥接蛋白将cd4cart细胞重定向到标靶细胞的一般概念。图1b说明了cd4cart细胞直接作用和通过桥接蛋白作用的特点。图1c说明了将cd4cart细胞重定向到冠状病毒感染细胞的桥接蛋白。图1d说明了同时或依次靶向肿瘤，其可用于靶向多种恶性细胞或克服肿瘤细胞为逃避靶向治疗而利用的抗原丢失。图1e说明了使用桥接蛋白将cd19特异性cart细胞重定向到标靶细胞的一般概念。28.图2a-2c.示例性桥接蛋白的示意图。图2a说明了具有抗原结合域、fc区和car结合域的二聚体桥接蛋白。图2b说明了将car结合域(如gp120t所代表的)偶联至igg抗体的方法。图2c说明了具有car结合域(如gp120t所代表的)、fc区和抗原结合域的桥接蛋白的各种实施方式。29.图3.cd4特异性cart细胞的示意图。30.图4a-4c.示例性桥接蛋白的进一步示意图。图4a显示了一种有代表性的重新定向cd19特异性car细胞的方法。图4b说明了具有抗原结合域、fc区和cd-19car结合域的二聚体桥接蛋白，例如cd19、截短的cd19(与car结合)或对cd19car具有特异性的抗体结构域。图4c说明了将car结合域(如cd19t所代表的)偶联至igg抗体的方法。31.图5.抗hiv的car构建体，显示了用于生产靶向hivenv的car-t细胞的car构建体的所有元件。32.图6.gp120的cd4结合环与igg抗体的化学偶联。gp120cd4结合环(ssggdpeivth)的序列在seqidno:6中提供。33.图7a-7d.桥接蛋白概念的开发和测试。图7a显示了与gp120的cd4结合环(gp120t)偶联的igg，以及facs等值线图，显示了桥接蛋白与原代t细胞上cd4受体的结合。图7b提供car4结合的桥接蛋白的facs直方图和中值荧光强度(mfi)。图7c提供了car4t细胞通过igg和双抗体偶联抗体重新导向肿瘤细胞的实验的示意图。图7d说明了与单独的car4t细胞、car4t细胞与igg、car4t细胞与igg-gp120t偶联物以及car4t细胞与双抗体-gp120t偶联物共培养24小时后存活肿瘤细胞的百分比。具体实施方式34.本文提供了可用于重定向car-t细胞的桥接蛋白，例如，被设计为识别和杀死hiv感染细胞的治疗性cd4特异性car-t细胞。在该示例中，桥接蛋白可包含截短的gp120胞外结构域，该结构域融合到能与感兴趣的标靶抗原结合的蛋白结构域(图1a和1b)。例如，蛋白质结构域可以是ace2胞外结构域(cov用于感染人体细胞的天然受体)。当cov感染细胞时，病毒刺突蛋白会在细胞表面表达。因此，在gp120-ace2桥接蛋白存在的情况下，cd4特异性car-t细胞将结合至存在于cov感染细胞表面的病毒刺突蛋白(图1c)。35.桥接蛋白可包含截短的gp120肽，该肽融合或偶联于结合感兴趣的标靶抗原的蛋白结构域。在一个示例中，桥接蛋白可包含截短的gp120肽、人类fc区、与感兴趣的标靶抗原结合的蛋白结构域，以及一个或多个接头序列。在一个示例性的实施方式中，桥接蛋白可包含从n端到c端或从c端或n端的ace2的ace2t部分，该部分是包含cov结合所需的所有三个结构域的ace2胞外结构域部分，人类fc结构域和截短的gp120肽，每个结构域由接头分开(图2a)。在另一个示例性的实施方式中，桥接蛋白可包含从n端到c端或从c端或n端的ace2的ace2t部分，该部分是包含cov结合所需的所有三个结构域的ace2胞外结构域部分，截短的gp120肽和人类fc结构域，每个结构域由接头分开(图2a)。由于fc结构域之间的相互作用，桥接蛋白将作为同二聚体存在。36.桥接蛋白将重新引导cd4-cart细胞识别和杀死表达感兴趣抗原(例如cov刺突蛋白)的细胞，(图1c)。cd4-cart细胞可使其内源性tcr和/或mhc基因沉默以防止同种异体反应性(图3)。cd4-cart细胞可进一步具有一种或多种抑制性受体(例如pd1和/或tim3)，其被沉默以使t细胞能够持续存在并提供更持久的治疗效果(图3)。这些t细胞可以从健康的供体细胞中制备，使其成为一种“现成的”方案，其(a)可以快速提供给患者，(b)不受潜在疾病的影响(来自cov感染患者的t细胞被严重耗竭)和(c)具有成本效益(》100剂由单个供体单位制备)(图3)。37.在另外的方面中，实施方式的桥接蛋白可用于重新靶向其他类型的表达car的效应细胞，例如cd19cart细胞。接受抗cd19cart细胞治疗的患者经常遇到cd19抗原丢失，导致疾病复发。同时或依次施用桥接蛋白可以允许将抗cd19cart细胞重新导向恶性细胞上的其他抗原的方法。因此，此类方法允许治疗其他难治性疾病。38.i.定义39.如本文所用，就特定成分而言，“基本上不含”在本文中用于表示该特定成分未被有意配制入组合物和/或仅作为污染物存在或以痕量存在。因此，由组合物的任何非计划污染产生的该指定成分的总量远低于0.05％，优选低于0.01％。最优选的是使用标准分析方法无法检测到指定成分的量的组合物。40.如本说明书中所用，“一”或“一个/种”可指一个/种或多个/种。如本文权利要求中所用，当与词语“包括/包含”结合使用时，词语“一”或“一个/种”可指一个或多于一个。41.在权利要求中使用的术语“或”表示“和/或”，除非特别指出仅指替代方式，或替代方式互相排除，但公开内容支持仅指替代方式和“和/或”的定义。如本文所用，“另一”可指至少第二个/种或更多个/种。42.在本技术全文中，术语“约”用于表示数值包括装置误差的固有变化,方法中的固有变化被用于确认数值、研究对象之间存在的差异，或在规定数值10％范围内的值。43.本文所用“核酸”、“核酸序列”、“寡核苷酸”、“多核苷酸”或其他语法等同形式表示共价接合在一起的至少两个核苷酸，其为脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸是任何长度的聚合物，包括，例如，20、50、100、200、300、500、1000、2000、3000、5000、7000、10000等。本文所述的多核苷酸通常包含磷酸二酯键，但在某些情况下，包含可具有至少一个不同键的核酸类似物，例如磷酰胺，硫代磷酸、二硫代磷酸或o-甲基磷酰亚胺键，以及肽核酸骨架和键。可以制备天然多核苷酸和类似物的混合物；或者，可以制备不同的多核苷酸类似物的混合物，以及天然产生的多核苷酸和类似物的混合物。以下是多核苷酸的非限制性例子：基因或基因片段、外显子、内含子、信使rna(mrna)、转移rna、核糖体rna、核酶、cdna、crna、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任意序列的分离dna、任意序列的分离rna、核酸探针和引物。多核苷酸可包括修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，对核苷酸结构的修饰可在聚合物的组装之前或之后赋予。核苷酸序列可间插有非核苷酸成分。多核苷酸聚合后可被进一步修饰，如通过与标记性成分偶联。该术语也包括双链和单链分子。除非另有说明或要求，术语多核苷酸包括双链形式和已知或预测构成双链形式的两种互补单链形式中的每一种。多核苷酸由4种核苷酸碱基的具体序列组成：腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)，并且当多核苷酸是rna时，尿嘧啶(u)替代胸腺嘧啶(t)。因此，术语“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母表示。除非另有说明，否则具体多核苷酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列以及明确指出的序列。具体而言，可通过产生一个或多个选定(或所有)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来获得简并密码子取代。44.术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中指氨基酸残基的聚合物。这些术语也适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然产生氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然产生的氨基酸聚合物、包含修饰残基的那些和非天然产生的氨基酸聚合物。在本情况中，术语“多肽”包含抗体或其片段。45.如本文使用，"安全港"概况是指将外源遗传物质在一些位点处插入工程改造细胞基因组中，此情况下转基因表达持续(即不被沉默)且不破坏内源基因的表达。例如，“遗传安全港概况”可以指位于内源基因的编码和表达控制区之外的转基因事件。在一些方面中，鉴定工程改造的细胞是否具有安全港概况可包括进行全基因组测序或整合位点分析。46.ii.桥接蛋白47.桥接蛋白包含car结合域和与感兴趣的标靶抗原结合的蛋白结构域。在一些情况下，car结合域和与感兴趣的目标抗原结合的蛋白结构域可以是两个结构域的化学融合体。该排列可以是多聚体，例如双抗体或多聚体。多聚体很可能是通过将轻链和重链的可变部分交叉配对成双抗体形成的。48.在一些实施方式中，桥接蛋白包含car结合域、抗原结合域，以及，可选地，一种或多种接头序列。在一些情况下，接头位于car结合域和抗原结合域之间。在一些情况下，car结合域直接融合于抗原结合域。49.在一些实施方式中，桥接蛋白包含car结合域、人类fc区，抗原结合域，以及，可选地，一种或多种接头序列。在一个实施方式中，桥接蛋白可包含从n端到c端或从c端或n端的抗原结合域、人类fc结构域和car结合域，每个结构域或被接头分开或直接融合(图2a-2c)。在另一个实施方式中，桥接蛋白可包含从n端到c端或从c端或n端的抗原结合域、car结合域和人类fc结构域，每个结构域或被接头分开或直接融合(图2a-2c)。由于fc结构域之间形成的二硫键的存在，桥接蛋白可以同二聚体存在。然而，在任何提供的实施方式中，桥接蛋白可以是单体。50.car结合域51.桥接蛋白包含car结合域。car结合域是足以与car-t细胞表达的car相互作用的蛋白结构域，其效应功能被寻求重新定向。car结合域可位于fc结构域和抗原结合域之间，或者car结合域可位于桥接蛋白的任一末端。car结合域可包含特异性识别car的抗体或抗体片段的抗原结合部分。在car包含配体作为其标靶结构域的情况下，桥接蛋白的car结合域可包含结合配体的受体的部分。在car包含受体作为其标靶结构域的情况下，桥接蛋白的car结合域可包含结合受体的配体的部分。例如，如果car包含cd4结构域作为其标靶结构域，则桥接蛋白的car结合域可包含gp120结构域。例如，gp120结构域可以是如seqidno:6所示的截短的gp120结构域，它是gp120胞外结构域的11个氨基酸片段，能有效地与cd4结合。作为另一个示例，如果car包含一个抗cd19结构域作为其标靶结构域，桥接蛋白的car结合域可包含cd19的至少部分，足以被car的抗cd19结构域结合(图1e)。52.b.fc结构域53.桥接蛋白可包含fc结构域。fc结构域可位于car结合域和抗原结合域之间，或者fc结构域可位于桥接蛋白的任一末端。在一些实施方式中，fc结构域可包含人类fc结构域序列。fc结构域可以是人类重链fc结构域序列。fc结构域可只包含人类重链fc结构域的ch2和ch3区。fc结构域可含有防止fc与fcgr受体结合的取代，以减少cart细胞效应功能的非特异性靶向风险。例如，fc结构域可包含d265a和/或n297a的取代，它们分别对应seqidno:4中的第46和78位。在一些方面中，fc结构域的序列与由seqidno:4提供的序列有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。在一些方面中，fc结构域的序列与由seqidno:4提供的序列有大约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。在一些方面中，fc结构域具有与由seqidno:4提供的序列相同的序列。在一些方面中，fc结构域由密码子优化的核酸编码。在一些方面中，fc结构域由序列编码，该序列具有与由seqidno:3中提供的序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。在一些方面中，fc结构域由序列编码，该序列具有与由seqidno:3中提供的序列大约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。在一些方面中，fc结构域由序列编码，该序列与由seqidno:3中提供的序列相同。54.c.抗原结合域55.桥接蛋白包含能够结合任何感兴趣抗原的抗原结合域。抗原结合域可位于car结合域和fc域之间，或者抗原结合域可位于桥接蛋白的任一末端。抗原结合域可包含特异性识别抗原的抗体或抗体片段的抗原结合部分。56.抗体的抗原结合片段是指蛋白质的一部分，该蛋白质能够与抗原特异性结合。在某些实施方式中，抗原结合片段来自于包含一个或多个cdr的抗体，或与抗原结合但不包含完整的天然抗体结构的任何其他抗体片段。在某些实施方式中，抗原结合片段不是来自抗体，而是来自受体。抗原结合片段的实例包括但不限于双抗体、fab、fab'、f(ab')2、fv片段、二硫化物稳定的fv片段(dsfv)、(dsfv)2、双特异性dsfv(dsfv-dsfv')、二硫化物稳定的双抗体(dsdiabody)、单链抗体分子(scfv)、scfv二聚体(二价双抗体)、多特异性抗体、单域抗体(sdab)，骆驼科动物抗体或纳米抗体、结构域抗体，和二价结构域抗体。57.在抗原是配体的情况下，桥接蛋白的抗原结合域可包含能与配体结合的受体的部分(图2c)。在抗原是受体的情况下，桥接蛋白的抗原结合域可包含能与受体结合的配体的部分。例如，如果抗原是cov刺突蛋白，桥接蛋白的抗原结合域可包含ace2的胞外结构域。在一些方面中，ace2的胞外结构域可以是ace2胞外结构域的截短部分(ace2t)。ace2胞外结构域的ace2t部分可不包含天然ace2胞外结构域的近端，该结构域包含adam17、tmprss11d和tmprss2裂解位点，其用于产生可溶形式的ace2并促进cov感染。排除蛋白酶的裂解位点防止桥接蛋白的意外裂解。58.在某些实施方式中，抗原结合结构域可以包含与受体(例如冠状病毒刺突蛋白)结合的肽(例如ace2的胞外结构域)。标靶结合域可包含ace2胞外结构域的ace2t部分。ace2t部分包含cov结合所需的所有三个结构域。ace2胞外结构域的ace2t部分不包含天然ace2胞外结构域的近端，其包含对产生可溶形式的ace2和促进cov感染很重要的两个切割位点。59.在一些方面中，ace2胞外结构域的ace2t部分的序列与由seqidno:2提供的序列有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。在一些方面中，ace2胞外结构域的ace2t部分的序列与由seqidno:2提供的序列有大约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。在一些方面中，ace2胞外结构域的ace2t部分具有与由seqidno:2提供的序列相同的序列。60.在一些方面中，ace2胞外结构域的ace2t部分由密码子优化的核酸编码。在一些方面中，ace2胞外结构域的ace2t部分是由与seqidno:1提供的序列有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的序列所编码的。在一些方面中，ace2胞外结构域的ace2t部分是由与seqidno:1提供的序列有大约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的序列所编码的。在一些方面中，ace2胞外结构域的ace2t部分是由与seqidno:1提供的序列相同的序列所编码的。61.其他示例性抗原包括癌细胞上的表面抗原(图1d)和感染细胞上的表面抗原。癌细胞上的表面抗原可以是肿瘤特异性抗原，即仅在肿瘤细胞上表达的抗原。癌细胞上的表面抗原可是肿瘤相关抗原，即在健康细胞上表达但在肿瘤细胞上过表达的抗原。癌细胞表面抗原的实例包括her-3、her1/her-3融合；cd19；cd123；cd22；cd30；cd171；cs-1(也称为cd2子集1、cracc、slamf7、cd319和19a24)；c型凝集素样分子-1(cll-1或clecl1)；cd33；表皮生长因子受体变体iii(egfrviii)；神经节苷脂g2(gd2)；神经节苷脂gd3(aneu5ac(2-8)aneu5ac(2-3)bdgalp(1-4)bdglcp(1-1)cer)；tnf受体家族成员b细胞成熟(bcma)；tn抗原((tnag)或(galnacα-ser/thr))；前列腺特异性膜抗原(psma)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)；fms样酪氨酸激酶3(flt3)；肿瘤相关糖蛋白72(tag72)；cd38；cd44v6；癌胚抗原(cea)；上皮细胞粘附分子(epcam)；b7h3(cd276)；套件(cd117)；白细胞介素13受体亚基α-2(il-13ra2或cd213a2)；间皮素；白细胞介素11受体α(il-11ra)；前列腺干细胞抗原(psca)；蛋白酶丝氨酸21(testisin或prss21)；血管内皮生长因子受体2(vegfr2)；路易斯(y)抗原；cd24；血小板衍生生长因子受体β(pdgfr-β)；阶段特异性胚胎抗原4(ssea-4)；cd20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶erbb2(her2/neu)；粘蛋白1，细胞表面相关(muc1)；表皮生长因子受体(egfr)；神经细胞粘附分子(ncam)；前列腺；前列腺酸性磷酸酶(pap)；延伸因子2突变(elf2m)；埃弗林b2；成纤维细胞活化蛋白α(fap)；胰岛素样生长因子1受体(igf-i受体)、碳酸酐酶ix(caix)；蛋白酶体(前体，巨蛋白因子)亚基，β型，9(lmp2)；糖蛋白100(gp100)；由断点簇区(bcr)和abelson鼠白血病病毒癌基因同源物1(abl)(bcr-abl)组成的癌基因融合蛋白；酪氨酸酶；肝配蛋白a型受体2(epha2)；岩藻糖基gm1；唾液酸路易斯粘附分子(sle)；神经节苷脂gm3(aneu5ac(2-3)bdgalp(1-4)bdglcp(1-1)cer)；转谷氨酰胺酶5(tgs5)；高分子量黑色素瘤相关抗原(hmwmaa)；邻乙酰基-gd2神经节苷脂(oacgd2)；叶酸受体β；肿瘤内皮标志物1(tem1/cd248)；肿瘤内皮标志物7相关(tem7r)；密蛋白6(cldn6)；促甲状腺激素受体(tshr)；g蛋白偶联受体c类第5组，成员d(gprc5d)；x染色体开放阅读框61(cxorf61)；cd97；cd179a；间变性淋巴瘤激酶(alk)；聚唾液酸；胎盘特异性1(plac1)；globoh糖神经酰胺(globoh)的六糖部分；乳腺分化抗原(ny-br-1)；重组人尿斑蛋白2(upk2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(havcr1)；肾上腺素受体3(adrb3)；泛连接蛋白3(panx3)；g蛋白偶联受体20(gpr20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座k9(ly6k)；嗅觉受体51e2(or51e2)；tcrγ替代阅读框蛋白(tarp)；肾母细胞瘤蛋白(wt1)；癌症/睾丸抗原1(ny-eso-1)；癌症/睾丸抗原2(lage-1a)；黑色素瘤相关抗原1(mage-a1)；ets易位变异基因6，位于染色体12p(etv6-aml)；精子蛋白17(spa17)；x抗原家族，成员1a(xage1)；血管生成素结合细胞表面受体2(tie2)；黑色素瘤癌睾丸抗原-1(mad-ct-1)；黑色素瘤癌睾丸抗原-2(mad-ct-2)；fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；前列腺素；幸存下来；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1(pcta-1或半乳凝素8)，t细胞识别的黑色素瘤抗原1(黑色素a或marti)；大鼠肉瘤(ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(htert)；肉瘤易位断点；黑色素瘤细胞凋亡抑制剂(ml-iap)；erg(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(tmprss2)ets融合基因)；n-乙酰氨基葡萄糖转移酶v(na17)；配对盒蛋白pax-3(pax3)；雄激素受体；细胞周期蛋白b1；v-myc禽骨髓细胞瘤病病毒癌基因神经母细胞瘤衍生同源物(mycn)；ras同源家族成员c(rhoc)；酪氨酸酶相关蛋白2(trp-2)；细胞色素p4501b1(cyp1b1)；ccctc-结合因子(锌指蛋白)-样(boris或印迹位点调节剂的兄弟)，t细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(sart3)；配对盒蛋白pax-5(pax5)；顶体结合蛋白sp32(oy-tes1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(lck)；激酶锚定蛋白4(akap-4)；滑膜肉瘤，x断点2(ssx2)；高级糖基化终产物受体(rage-1)；肾遍在蛋白1(ru1)；肾遍在蛋白2(ru2)；豆荚蛋白；人乳头瘤病毒e6(hpve6)；人乳头瘤病毒e7(hpve7)；肠羧基酯酶；热休克蛋白70-2突变(muthsp70-2)；cd79a；cd79b；cd72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(lair1)；iga受体的fc片段(fcar或cd89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族a成员2(lilra2)；cd300分子样家族成员f(cd300lf)；c型凝集素结构域家族12成员a(clec12a)；骨髓基质细胞抗原2(bst2)；含有egf样模块的粘蛋白样激素受体样2(emr2)；淋巴细胞抗原75(ly75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(gpc3)；fc受体样5(fcrl5)；和免疫球蛋白λ样多肽1(igll1)。受感染细胞表面抗原的实例包括病毒刺突蛋白或包膜蛋白(例如hiv-1gp120、hiv-1gp41、hiv-1gp160、sars-covs蛋白、sars-cov-2s蛋白、merss蛋白、埃博拉病毒糖蛋白、流感血凝素、流感神经氨酸酶、丙型肝炎e1、丙型肝炎e2、登革热病毒e二聚体、基孔肯雅病毒e1、基孔肯雅病毒e1、巨细胞病毒糖蛋白、单纯疱疹病毒gb、单纯疱疹病毒gh、单纯疱疹病毒gl、单纯疱疹病毒gm、爱泼斯坦-巴尔病毒gp350和爱泼斯坦-巴尔病毒gp42)。62.d.接头63.桥接蛋白可包含位于融合多肽序列之间的至少一个肽接头(或间隔子)，以允许正确折叠和/或防止融合结构域的空间位阻。肽接头可为柔性接头。在一些方面中，接头的长度在2至20个肽之间，2至18个肽之间，2至16个肽之间，2至14个肽之间，2至12个肽之间，2至10个肽之间，4至20个肽之间，4至18个肽之间，4至16个肽之间，4至14个肽之间，4至12个肽之间，或4至10个肽之间。在一些方面中，接头序列包含gggs的序列(seqidno:7)。在一些方面中，接头包含序列ssggggsggggggss(seqidno:9)或序列ssggggsggggggssrss(seqidno:10)。优选地，接头包含序列ssggggs(seqidno:8).在桥接蛋白包含多于一个接头的情况下，桥接蛋白中的每个接头可具有相同的序列或每个接头可以具有不同的序列。64.或者，桥接蛋白的car结合域和抗原结合域可为化学偶联的。例如，抗原结合结构域的半胱氨酸残基可与硫醇反应性试剂进行位点特异性和有效的耦合。硫醇反应性试剂可为，例如，马来酰亚胺、碘乙酰胺、吡啶基二硫化物或其他硫醇反应性偶联伴侣。因此，桥接蛋白的car结合域部分可包含，例如，马来酰亚胺环。然后可以用二硫苏糖醇(dtt)还原和添加car结合域-马来酰亚胺开始化学偶联。65.iii.嵌合抗原受体66.嵌合抗原受体(car)分子是重组融合蛋白，其特征在于它们能够结合标靶(例如冠状病毒刺突蛋白)，并通过存在于其胞质尾部的免疫受体活化基序(itam)传递活化信号，从而活化基因修饰的免疫效应细胞，用于杀伤、增殖和细胞因子产生。67.根据本实施方式的嵌合抗原受体可通过本领域已知的任何方法制备，但优选使用重组dna技术制备。通过分子克隆的标准技术(基因组文库筛选、pcr、引物辅助连接、定点突变等)，可以制备编码嵌合抗原受体多个区域的核酸序列，并将其组装成完整的编码序列。由此产生的编码区可以插入到表达载体中，并用于转化合适的宿主同种异体或自体同源免疫效应细胞。68.本文所述的car的实施方式包含编码标靶特异性嵌合抗原受体(car)多肽的核酸，该多肽包含胞内信号传导结构域、跨膜结构域和包含标靶结合结构域的胞外结构域。可选地，car可以包含位于跨膜结构域和靶结合域之间的铰链结构域。在某些方面中，实施方式的car进一步包含将car的表达指引到细胞表面的信号肽。例如，在一些方面中，car可包含来自gm-csf的信号肽。69.在某些实施方式中，当存在少量标靶时，car还可以与膜结合细胞因子共同表达以改善持久性。例如，car可以与膜结合il-15共表达。70.根据car结构域的排列和结构域中使用的具体序列，表达car的免疫效应细胞可对标靶细胞具有不同水平的活性。在某些方面中，不同的car序列可被引入免疫效应细胞以生成经工程改造的细胞，选择具有提高的src的工程改造细胞，并测试所选细胞活性，以鉴定预测具有最大治疗功效的car构建物。71.嵌合构建体可作为裸dna或在合适的载体中被引入免疫效应细胞。本领域已知使用裸dna通过电穿孔稳定转染细胞的方法。参见例如美国专利号6,410,319。裸dna通常是指编码嵌合受体的dna，该嵌合受体以适当表达方向包含在质粒表达载体中。或者，可使用病毒载体(例如，逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或慢病毒载体)将嵌合构建体引入免疫效应细胞。根据本发明方法使用的合适载体在免疫效应细胞中不复制。已知大量基于病毒的载体，其中病毒在细胞中的拷贝数低到足以维持细胞生存，例如，基于hiv、sv40、ebv、hsv或bpv的载体。72.a.抗原结合域73.在某些实施方式中，抗原结合结构域可包含单克隆抗体的互补决定区、单克隆抗体的可变区和/或其抗原结合片段。例如，抗原结合域可以包含结合cd19的抗体的互补决定区。互补决定区(“cdr)”是在抗原受体(例如免疫球蛋白和t细胞受体)蛋白质的可变结构域中发现的一个短氨基酸序列，它与抗原互补，从而为受体提供对该具体抗原的特异性。抗原受体的每条多肽链包含三个cdr(cdr1、cdr2和cdr3)。由于抗原受体通常由两条多肽链组成，因此每个与抗原接触的抗原受体有六个cdr—每条重链和轻链包含三个cdr。由于大多数与免疫球蛋白和t细胞受体相关的序列变异在cdr中发现，这些区域有时被称为高变结构域。其中，cdr3表现出最大的可变性，因为它是通过vj(重链和tcrαβ链中的vdj)区域重组编码的。在另一个实施方式中，该特异性源自与受体结合的肽(例如，细胞因子)。在另一个实施方式中，该特异性源自与病毒糖蛋白结合的受体(例如cd4的胞外结构域，例如cd4的d1和d2结构域)。在抗原结合域源自cd4的方面，形成抗原结合域的cd4部分可被突变以限制与mhcii类的结合。74.设想car核酸，具体地，scfv序列是人类基因，用于增强人类患者细胞免疫疗法。在具体的实施方式中，提供全长carcdna或编码区。抗原结合区或结构域可包含源自具体小鼠或人或人源化单克隆抗体的单链可变片段(scfv)的vh和vl链片段。该片段也可以是抗原特异性抗体的任意数量的不同抗原结合域。在更具体的实施方式中，该片段是针对人密码子用途进行优化以在人类细胞中表达的序列编码的抗原特异性scfv。在某些方面中，car的vh和vl结构域由接头序列(例如whitlow接头)分隔。通过引用纳入本文的国际(pct)专利公开号wo2015/123642中还提供了可根据实施方式修改或使用的car构建物。75.如前所述，原型car编码包含源自一种单克隆抗体(mab)的vh和vl结构域的scfv，其与跨膜结构域和一个或多个胞质信号传导结构域(例如，共刺激结构域和信号传导结构域)耦合。因此，car可包含与感兴趣的抗原(例如肿瘤相关抗原)结合的抗体的lcdr1-3序列和hcdr1-3序列。然而，在另一方面中，识别了与感兴趣的抗原结合的多种抗体中的两种，并且构建了一种car，其包含：(1)与抗原结合的第一抗体的hcdr1-3序列；和(2)与抗原结合的第二抗体的lcdr1-3序列。这种包含来自两种不同抗原结合性抗体的hcdr和lcdr序列的car可具有优先结合抗原的特定构型(例如，与正常组织相比优先与癌细胞结合的构象)的优势。76.或者，可以使用从不同mab衍生的vh和vl链来工程改造car，以生成一组car t细胞。car的抗原结合域可包含第一抗体的lcdr1-3序列和第二抗体的hcdr1-3序列的任意组合。77.b.铰链结构域78.在某些方面中，实施方式的car多肽可包含位于抗原结合域和跨膜结构域之间的铰链结构域。在某些情况下，铰链结构域可包含在car多肽中，以在标靶结合域和细胞表面之间提供足够的距离，或减轻可对car修饰的t细胞的标靶结合或效应功能产生不利影响的空间位阻。铰链结构域包含与fc受体(例如fcγr2a或fcγr1a)结合的序列。例如，铰链序列可包含来自与fc受体结合的人免疫球蛋白(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1、iga2、igm、igd或ige)的fc结构域。79.在一些情况下，car铰链结构域可以源自人免疫球蛋白(ig)恒定区或其部分，包含ig铰链，或来自人cd8a跨膜结构域(facdiyiwaplagtcgvlllslvitlycnhrn；seqidno:11)和cd8a铰链区(kptttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgld；seqidno:12)。在一个方面，car铰链结构域可以包含一个铰链-ch2-ch3区域的抗体同种型igg4(eskygppcppcpapeflggpsvflfppkdtlmisrtpevtcvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnlpssiektiskakgqprepqvytlppqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslgkm；seqidno:13)。在某些方面中，可以在抗体重链ch2结构域中引入点突变，以减少car-修饰的免疫效应细胞的糖基化和非特异性fcγ受体结合。80.在某些方面中，实施方式的car铰链结构域包含igfc结构域，其包含相对于野生型igfc结构域减少fc受体结合的至少一个突变。例如，car铰链结构域可包含igg4-fc结构域，该结构域包含相对于野生型igg4-fc结构域减少fc-受体结合的至少一个突变。在一些方面中，car铰链结构域包含在相对于野生型igg4-fc序列对应于l235和/或n297的位置处具有突变(例如氨基酸缺失或取代)的igg4-fc结构域。例如，car铰链结构域可包含具有相对于野生型igg4-fc序列的l235e和/或n297q突变的igg4-fc结构域。在其它方面中，car铰链结构域可包含igg4-fc结构域，该结构域在l235位置处具有氨基酸取代，以取代亲水性氨基酸，例如r、h、k、d、e、s、t、n或q，或具有与“e”类似的性质的氨基酸，例如d。在某些方面，car铰链结构域可包含在位置n297处具有氨基酸取代的igg4-fc结构域，该氨基酸具有类似于“q”的性质，例如s或t。81.c.跨膜结构域82.标靶特异性胞外结构域和胞内信号传导结构域可通过跨膜结构域连接。可作为跨膜结构域一部分的多肽序列包括但不限于人类cd4跨膜结构域、人类cd28跨膜结构域、人类cd3ζ跨膜结构域或半胱氨酸突变的人类cd3ζ结构域，或来自其他人类跨膜信号蛋白的其他跨膜结构域，如cd16、cd8和红细胞生成素受体。在一些方面中，例如，跨膜结构域可包含与美国专利公开号2014/0274909(例如cd8和/或cd28跨膜结构区)或美国专利号8906682(例如cd8a跨膜结构体)之一中提供的序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的序列，两者均通过引用全文的方式纳入本文。在某些具体的方面，跨膜区可源自(即至少包括)t细胞受体的α、β或ζ链，cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154。在某些特定的方面中，跨膜结构域可以与cd8a跨膜结构或cd28跨膜结构域有85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性。83.d.胞内信号传导结构域84.实施方式的嵌合抗原受体的胞内信号传导结构域负责活化经工程改造以表达car的免疫细胞的至少一种正常效应功能。术语“效应功能”是指分化的细胞的专门功能。例如，t细胞的效应功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。原初、记忆或记忆型t细胞中的效应功能包括抗原依赖性增殖。因此，术语“胞内信号传导结构域”是指蛋白质中传导效应功能信号并指导细胞执行特定功能的部分。在一些方面中，细胞内信号传导结构域衍生自天然受体的胞内信号传导结构域。此类天然受体的例子包括t细胞受体的ζ链或其任何同系物(例如，η、δ、γ或ε)、mb1链、b29、fcriii、fcri以及信号传导分子的组合，例如cd3ζ和cd28、cd27、4-1bb/cd137、icos/cd278、il-2rβ/cd122、il-2rα/cd132、dap10、dap12、cd40、ox40/cd134及其组合，以及其他类似分子和片段。可以使用活化蛋白家族其他成员的细胞内信号传导部分，例如fcγriii和fcεri。85.虽然通常使用整个胞内信号传导结构域，但在许多情况下，不需要使用完整胞内多肽。在可使用胞内信号传导结构域的截短部分的范围内，只要该截短部分仍能传递效应功能信号，则可使用该截短部分代替完整链。因此，术语“胞内信号传导结构域”指包含胞内信号传导结构域的截短部分，其足以在car结合到标靶时传导效应功能信号。可使用一个或多个胞质结构域，因为所谓的第三代car具有至少两个或三个融合在一起的信号传导结构域以产生叠加或协同效应，例如，cd28和4-1bb可以组合在car构建物中。在某些具体方面，胞内信号传导结构域包含与cd3ζ胞内结构域(rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr；seqidno:14)、cd28胞内结构域、cd137胞内结构域或包含融合到4-1bb胞内结构域的cd28胞内结构域的结构域具有85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的序列。在优选实施方式中，人类cd3ζ胞内结构域用作实施方式的car的胞内信号传导结构域。86.在具体实施方式中，car中的胞内受体信号转导结构域包含t细胞抗原受体复合物的结构域，例如cd3的ζ链，也包含fcγriii共刺激信号转导结构域、cd28、cd27、dap10、cd137、ox40、cd2，单独或例如与ζcd3串联。在具体实施方式中，胞内结构域(可称为胞质结构域)包含一个或多个tcrζ链、cd28、cd27、ox40/cd134、4-1bb/cd137、fcεriγ、icos/cd278、il-2rβ/cd122、il-2rα/cd132、dap10、dap12和cd40的部分或全部。在一些实施方式中，在胞内结构域中使用内源性t细胞受体复合物的任何部分。例如，可使用一个或多个胞质结构域，因为所谓的第三代car具有至少两个或三个信号结构域融合在一起以产生加和或协同效应。87.在一些实施方式中，car还包含其他共刺激结构域。其他共刺激结构域可包括但不限于cd28、cd27、ox-40(cd134)、dap10和4-1bb(cd137)中的一个或多个。除了cd3ζ引发的主要信号之外，插入人car中的人共刺激受体提供的附加信号对于t细胞的充分活化非常重要，并且有助于提高过继免疫疗法的体内持久性和治疗成功率。88.iv.内源基因表达的修饰89.在一些方面中，工程改造的免疫效应细胞被修饰以降低或消除一种或多种内源基因的表达。例如，工程改造的免疫效应细胞可被修饰以敲低或敲除至少一种免疫检查点蛋白。所述至少一种免疫检查点蛋白可选自以下组：pd1、ctla4、lag3、tim3、tigit、cd96、btla、kirs、腺苷a2a受体、vista、ido、fas、sirpα、cish、shp-1、foxp3、lair1、pvrig、ppp2ca、ppp2cb、ptpn6、ptpn22、cd160、crtam、siglec7、siglec9、cd244、tnfrsf10b、tnfrsf10a、casp8、casp10、casp3、casp6、casp7、fadd、tgfbrii、tgfrbri、smad2、smad3、smad4、smad10、ski、skil、tgif1、il10ra、il10rb、hmox2、il6r、il6st、eif2ak4、csk、pag1、sit1、prdm1、batf、gucy1a2、gucy1a3、gucy1b2，和gucy1b3。在一些方面中，工程改造的免疫效应细胞被修饰以降低或消除一种或多种hiv共同受体的表达。例如，工程改造的免疫效应细胞被修饰，使得ccr5表达被沉默。90.作为另一个示例，工程改造的免疫效应细胞中的hla基因可以各种方式进行修饰。例如，工程改造的免疫效应细胞可被工程改造，使得它们不在其表面上表达功能性hla-a、hla-b和/或hla-c。hla-a阴性工程改造的免疫效应细胞可源自于hla-纯合个体。或者，经工程改造的免疫效应细胞可为hla-a纯合。进一步的，工程改造的免疫效应细胞，无论它们是hla-a阴性还是hla-a纯合，在hla-b、hla-c和/或hla-drb1等位基因上可以是hla纯合子。91.在一些方面中，工程改造的免疫效应细胞可被修饰以敲低或敲除一种或多种t细胞受体成分的表达。例如，在一些方面中，细胞缺乏或已降低tcrα、tcrβ、tcrα和tcrβ、tcrγ、tcrδ、tcrγ和tcrδ或前述的任何组合的表达。这可以通过任何合适的方式发生，包括通过引入锌指核酸酶(zfn)，例如，靶向一种或多种tcr受体成分的恒定区。92.敲除内源基因可包括向细胞中引入特异性靶向内源基因位点的人工核酸酶。在各个方面中，人工核酸酶可以是锌指核酸酶、talen或crispr/cas9在各个方面中，将人工核酸酶引入细胞中可包括将编码人工核酸酶的mrna引入细胞中。93.例如，在一些方面中，标靶内源基因包括由锌指核酸酶、talen或crispr/cas9系统产生的使基因或基因产物无功能的缺失或突变。这种缺失或突变可发生在标靶内源基因的两个等位基因中。94.敲低内源基因的表达可包括将抑制性核酸引入细胞，例如编码mirna的构建体。抑制性核酸可抑制基因的转录或阻止细胞中基因转录物的翻译。抑制性核酸可以是16到1000个核苷酸长，并且在某些实施方式中是18到100个核苷酸长。在某些实施方式中，抑制性核酸是分离的核酸，与感兴趣的基因结合或杂交。抑制性核酸可使标靶基因的表达沉默至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％，并且优选至少75％。95.抑制性核酸在本领域中是众所周知的。例如，美国专利6,506,559和6,573,099，以及美国专利公开号2003/0051263、2003/0055020、2004/0265839、2002/0168707、2003/0159161和2004/0064842中描述了sirna、shrna、mirna和双链rna，所有这些在此通过引用全文的方式纳入本文。在多个方面中，敲低内源性基因的表达可包括使用mirna表达构建体、多个mirna及其应用以敲低目标基因表达。在一些方面中，表达构建体包括启动子元件、间隔序列和mirna编码序列。此类mirna表达构建体的示例可见于wo2019/186274和美国专利号9,556,433，其每一个都以引用全文的方式纳入本文。96.在某些方面中，表达载体用于表达感兴趣的核酸，例如抑制具体基因表达的核酸。表达需要在载体中提供适当的信号，其中包括各种调节元件，例如来自病毒和哺乳动物来源的增强子/启动子，它们驱动感兴趣的基因在宿主细胞中的表达。还定义了被设计以优化宿主细胞中rna稳定性的元件。还提供了用于使用许多主要药物选择标志物来建立表达产物的永久、稳定的细胞克隆的条件，如同将药物选择标志物的表达与多肽的表达连接起来的元件一样。97.a.调控元件98.在本技术中，术语“表达构建体”或“表达载体”意在包括任何类型的基因构建体，其包含编码基因产物的核酸，其中部分或全部核酸编码序列能够被转录。转录物可以翻译成蛋白质，但不一定如此。在某些实施方式中，表达包括基因转录和将mrna翻译成基因产物。在其他实施方式中，表达仅包括编码感兴趣基因的核酸的转录，即，如同实施方式的rna分子的情况一样。99.在某些实施方式中，编码基因产物的核酸处于启动子的转录控制之下。“启动子”是指由细胞的合成机制识别或引入合成机制的dna序列，需要其以起始基因的特异性转录。短语"在转录控制下"指启动子相对于核酸处于正确的位置和取向，以控制rna聚合酶启动和基因表达。100.此处将使用术语启动子来指代聚集在真核rna聚合酶(pol)i、ii或iii的起始位点周围的一组转录控制模块。对启动子如何组织的思考大多来自对几个病毒polii启动子的分析，包括hsv胸苷激酶(tk)和sv40早期转录单元的启动子。这些研究，再加上最近的工作，表明启动子包括不连续的功能模块，每个模块由大约7-20bp的dna组成，并含有供于转录活化剂或抑制剂蛋白的一个或多个识别位点。101.每个启动子中有至少一个模块用于定位rna合成的起始位点。最著名的例子是tata盒，但在一些缺乏tata盒的启动子中，例如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和sv40晚期基因的启动子，覆盖起始位点本身的离散元件有助于确定起始位置。102.其它启动子元件调控转录起始的频率。通常，这些位于起始位点上游30-110bp的区域，尽管最近已被证明许多启动子在起始位点下游也含有功能元件。启动子元件之间的间隙通常是柔性的，使得当元件翻转或相对于彼此移动时保留启动子功能。在tk启动子中，在活性开始下降之前，启动子元件之间的间距可以增加到50bp。取决于启动子，个体元件似乎可协同或单独发挥作用以活化转录。103.在一些实施方式中，该启动子包括延长因子1短(ef1)启动子。在其他实施方式中，可以使用人类巨细胞病毒(cmv)立即早期基因启动子、sv40早期启动子、rous肉瘤病毒长末端重复、大鼠胰岛素启动子和甘油醛-3-磷酸脱氢酶来获得感兴趣的编码序列的高水平表达。也可以考虑使用本领域众所周知的其他病毒或哺乳动物细胞或细菌噬菌体启动子来实现感兴趣的编码序列的表达，只要表达水平足以满足给定的目的。104.通过使用具有熟知的特性的启动子，可以优化转染或转化后感兴趣的蛋白质的表达水平和模式。此外，选择响应于具体生理信号而受到调节的启动子可以允许基因产物的可诱导表达。表1和表2列出了在本发明的上下文中可用于调节感兴趣的基因表达的几种调节元件。该列表并非旨在穷举促进基因表达所涉及的所有可能元件，而是仅作为其示例。在一些方面中，根据本实施方式使用的启动子是非组织特异性启动子，例如组成型启动子。105.增强子是增加来自位于同一dna分子上远端位置的启动子的转录的遗传元件。增强子的组成方式很像启动子。也就是说，它们由许多单独的元件组成，每个元件都与一种或多种转录蛋白结合。106.增强子和启动子之间的基本区别是操作性的。增强子区域作为一个整体必须能够在远端刺激转录；对于启动子区域或其组成元件而言，这不一定是正确的。另一方面，启动子必须有一个或多个元件，在具体的位置和具体的方向上指导rna合成的起始，而增强子则缺乏这些特点。启动子和增强子通常是重叠和连续的，通常看起来具有非常相似的模块化组织。107.下面是病毒启动子、细胞启动子/增强子和诱导型启动子/增强子的列表，它们可以在表达构建体中与编码感兴趣的基因或mirna的核酸组合使用(表1和表2)。此外，任何启动子/增强子组合(根据真核启动子数据库epdb)也可用于驱动感兴趣的基因或mirna的表达。截短的启动子可也被用于驱动表达。如果提供适当的细菌聚合酶，真核细胞可以支持某些细菌启动子的细胞质转录，无论是作为递送复合物的一部分或是作为附加的基因表达构建体。108.109.110.[0111][0112][0113][0114][0115]在使用任何cdna插入物的情况下，通常会包括多聚腺苷酸化信号以影响基因转录物的适当多聚腺苷酸化。多腺苷酸化信号的性质被认为并不是本发明成功实施的关键，可采用任何这样的序列，如人类生长激素和sv40多腺苷酸化信号。然而，在一些方面中，多腺苷酸化信号序列不包括在本实施方式的载体中。例如，在慢病毒载体中加入这样的信号序列(在3'ltr之前)可以降低所产生的慢病毒滴度。[0116]在核酸构建体中可包括一个间隔序列。间隔子的存在似乎可以提高mirna的敲低效率(stegmeier等，2005)。间隔子可以是任任何核苷酸序列。在一些方面中，间隔子是gfp。[0117]作为表达盒的一个元件，还可以考虑使用终止子。这些元件可以起到提高信息水平的作用，并减少从盒读到其他序列的情况。[0118]b.可选择标志物[0119]在本发明的某些实施方式中，细胞含有本发明的核酸构建体，细胞可通过在表达构建体中包括一个标志物而在体外、体内或体内被识别。这样的标志物会给细胞带来可识别的变化，使含有表达构建体的细胞易于识别。通常，加入药物选择标志物有助于克隆和转化体的选择，例如，赋予新霉素(neomycin)、嘌呤霉素(puromycin)、透明霉素(hygromycin)、dhfr、gpt、博来霉素(zeocin)和组氨酸醇(histidinol)抗性的基因是有用的可选择标志物。或者，可使用酶，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(cat)。免疫学标志物也可以被使用。所用的可选择标志物并不被认为是重要的，只要它能够与编码基因产物的核酸同时表达即可。可选择标志物进一步的示例是本领域技术人员所熟知的。[0120]v.核酸分子和表达载体的递送[0121]在某些方面中，可以构建用于递送本实施方式的核酸的载体，以在细胞中表达这些因子。在具体方面中，以下系统和方法可用于向所需的细胞类型输送核酸。[0122]a.同源重组[0123]在本实施方式的某些方面中，编码本实施方式核酸分子的载体可以具体方式引入细胞，例如，通过同源重组。目前在干细胞中表达基因的方法涉及使用病毒载体(例如，慢病毒载体)或随机整合到基因组中的转基因。这些方法尚未成功，部分原因是随机整合的载体可以活化或抑制内源基因表达，和/或沉默转基因表达。与随机整合相关的问题可以通过与标靶基因组中具体基因座的同源重组来部分克服。[0124]同源重组(hr)，也称为一般重组，是一种用于所有生命形式的基因重组，其中核苷酸序列在两条相似或相同的dna链之间交换。自20世纪80代中期以来，该技术一直是哺乳动物细胞基因组工程的标准方法。该过程涉及物理破坏和dna最终重连的几个步骤。该过程在自然界中被最广泛使用于修复可致死的dna双链断裂。此外，同源重组在减数分裂过程中产生新的dna序列组合，减数分裂是真核生物产生生殖细胞如精子和卵子的过程。这些新的dna组合代表了后代的遗传变异，使种群能够随着时间的推移演化适应变化的环境条件。同源重组也用于水平基因转移，以在不同菌株和物种的细菌与病毒之间交换遗传物质。同源重组也被用作分子生物学中的一种技术，用于将遗传变化引入标靶生物体。[0125]同源重组可用作靶向基因组修饰。标准hr在哺乳动物细胞中的效率仅为经处理细胞的10-6至10-9(capecchi,1990)。兆核酸酶或归巢核酸内切核酸酶，例如i-scei的使用已被用于提高hr的效率。天然兆核酸酶以及具有修饰靶向特异性的工程改造兆核酸酶已被用于提高hr效率(pingoud和silva，2007；chevalier等，2002)。提高hr效率的另一条途径是工程改造具有可编程dna特异性结构域的嵌合核酸内切酶(silva等,2011)。锌指核酸酶(zfn)是此类嵌合分子的一个示例，其中锌指dna结合域与iis型限制性核酸内切酶(如foki)的催化结构域融合(如durai等，2005；wo2005028630所述)).另一类此类特异性分子包括与iis型限制性核酸内切酶如foki的催化结构域融合的转录激活子样效应物(tale)dna结合结构域(miller等，2011：wo2010079430)。[0126]b.核酸递送系统[0127]本领域技术人员将能够通过标准重组技术构建载体(例如，参见sambrook等，2001和ausubel等，1996，两者均通过引用纳入本文)。载体包括但不限于质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(如yac)，例如逆转录病毒载体(如来源于moloney小鼠白血病病毒载体(momlv)、mscv、sffv、mpsv、snv等)，慢病毒载体(例如，衍生自hiv-1、hiv-2、siv、biv、fiv等)、腺病毒(ad)载体，包括其复制感受态、复制缺陷型及其无病毒形式、腺相关病毒(aav)载体、猿猴病毒40(sv-40)载体、牛乳头瘤病毒载体、爱泼斯坦-巴尔病毒载体、疱疹病毒载体，痘苗病毒载体、哈维鼠肉瘤病毒载体、鼠乳癌病毒载体、rous肉瘤病毒载体。[0128]1.附加型载体[0129]在本发明的某些方面也可提供基于质粒或脂质体的染色体外(即附加型)载体的用途，例如，用于体细胞的重编程。此类附加型载体可包括例如基于orip的载体和/或编码ebv蛋白ebna-1衍生物的载体。这些载体可允许将大的dna片段引入细胞并在染色体外保持，每个细胞周期复制一次，高效地分配给子代细胞，并且基本上不引起免疫反应。[0130]具体地，基于orip的表达载体复制所需的唯一病毒蛋白ebna-1不会引发细胞免疫反应，因为它已经开发出一种高效的机制来绕过在mhci类分子上呈递其抗原所需的处理过程(levitskaya等,1997)。此外，ebna-1可以反式作用以增强克隆基因的表达，在一些细胞系中诱导克隆基因的表达高达100倍(langle-rouault等，1998；evans等，1997)。最后，这种基于orip的表达载体的制造成本很低。[0131]其他染色体外载体包括其他基于嗜淋巴疱疹病毒的载体。嗜淋巴疱疹病毒是一种疱疹病毒，它在淋巴母细胞(例如，人b淋巴母细胞)中复制，并在其自然生命周期的一部分中成为质粒。单纯疱疹病毒(hsv)不是“淋巴营养性”疱疹病毒。示例性的嗜淋巴疱疹病毒包括但不限于ebv、卡波西氏肉瘤疱疹病毒(kshv)；松鼠猴疱疹病毒(herpesvirussaimiri,hs)和马立克氏病病毒(mdv)。还考虑了其他来源的基于附加体的载体，例如酵母ars、腺病毒、sv40或bpv。[0132]本领域技术人员将能够通过标准重组技术构建载体(例如，参见maniatis等，1988和ausubel等，1994，两者均通过引用纳入本文)。[0133]载体还可以包含进一步调节基因递送和/或基因表达，或以其他方式为标靶细胞提供有益特性的其他成分或功能。此类其他成分包括，例如，影响结合或靶向细胞的成分(包括介导细胞类型或组织特异性结合的成分)；影响细胞摄取载体核酸的成分；影响多核苷酸摄取后在细胞内定位的成分(例如介导核定位的试剂)；和影响多核苷酸表达的成分。[0134]此类成分还可包括标志物，例如可检测和/或选择性标志物，其可用于检测或选择已经摄入并表达由载体递送的核酸的细胞。此类成分可以作为载体的天然特征提供(例如使用具有介导结合和摄取的成分或功能的某些病毒载体)，或者可以修饰载体以提供此类功能。大量此类载体在本领域中是已知的并且通常是可用的。当载体维持在宿主细胞中时，载体可以在有丝分裂期间作为自主结构由细胞稳定复制，纳入宿主细胞的基因组内，或维持在宿主细胞的细胞核或细胞质中。[0135]2.基于转座子的系统[0136]根据一个具体的实施方式，核酸的引入可使用转座子-转座酶系统。使用的转座子-转座酶系统可以是众所周知的睡美人、青蛙王子转座子-转座酶系统(有关后者的描述，请参见例如ep1507865)或ttaa特异性的转座子搭载系统。[0137]转座子是可以移动到单个细胞基因组内的不同位置的dna序列，这一过程称为转座。在这个过程中，它们可以引起突变并改变基因组中的dna数量。转座子也曾被称为跳跃基因，是移动遗传元件的示例。[0138]有多种移动遗传元件，它们可以基于其转座机制进行分组。i类移动遗传元件，或逆转录转座子，首先转录为rna，然后通过逆转录酶逆转录回dna，接着插入基因组中的另一个位置来复制自身。ii类移动遗传元件使用转座酶直接从一个位置移动到另一个位置，以在基因组中进行“剪切和粘贴”。[0139]3.病毒载体[0140]在产生重组病毒载体时，非必需基因通常被异源(或非天然)蛋白质或核酸的基因或编码序列取代。病毒载体是一种表达构建体，它利用病毒序列将核酸，且可能将蛋白质引入细胞。某些病毒通过ph依赖性或ph非依赖性机制感染细胞或进入细胞，将其遗传载物整合到宿主细胞基因组中并稳定有效地表达病毒基因的能力使它们成为外源核酸转移进入细胞(例如，哺乳动物细胞)的有吸引力的候选者。下文描述了可用于递送本发明某些方面核酸的病毒载体的非限制示例。[0141]由于逆转录病毒能够将其基因整合到宿主基因组中，转移大量外来遗传物质，感染广泛的物种和细胞类型以及被包装在具体的细胞系中，因此有望成为基因递送载体(miller，1992)。[0142]为了构建逆转录病毒载体，将核酸插入病毒基因组中某些病毒序列的位置，以产生复制缺陷型病毒。为了生产病毒粒子，构建了包含gag、pol和env基因但不含ltr和包装成分的包装细胞系(mann等，1983)。当含有cdna的重组质粒与逆转录病毒ltr和包装序列一起被引入具体的细胞系时(例如，通过磷酸钙沉淀)，包装序列允许重组质粒的rna转录物(即载体基因组)被包装成病毒颗粒，然后分泌到培养基中(nicolas和rubenstein，1988；temin，1986；mann等，1983)。然后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选对其进行浓集，并用于基因转移。根据用于覆盖载体颗粒表面的包膜蛋白的趋向性，逆转录病毒载体能够感染多种细胞类型。然而，整合和稳定表达需要宿主细胞的分裂(paskind等，1975)。[0143]慢病毒是复杂的逆转录病毒，除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env外，还包含其他具有调节或结构功能的基因。慢病毒载体是本领域众所周知的(参见，例如，naldini等，1996；zufferey等，1997；blomer等，1997；giry-laterriere等，2011；美国专利6,013,516和5,994,136)。[0144]重组慢病毒载体能够感染非分裂细胞，并且可用于体内和体外基因转移以及核酸序列的表达。例如，能够感染非分裂细胞的重组慢病毒，其中合适的宿主细胞被两个或多个携带包装功能的载体转染，名为gag、pol和env，以及rev，在美国专利5,994,136中有所描述，通过引用纳入本文。[0145]c.核酸递送[0146]将核酸(例如dna或rna)引入要用本发明编程的细胞中，可使用如本文所述或本领域普通技术人员已知的任何合适的方法进行核酸递送以转化细胞。此类方法包括但不限于直接递送dna，例如通过离体转染(wilson等，1989；nabel等，1989)，通过注射(美国专利号5,994,624、5,981,274、5,945,100、5,780,448、5,736,524、5,702,932、5,656,610、5,589,466和5,580,859，均通过引用纳入本文)，包括显微注射(harland和weintraub，1985；美国专利号5,789,215，通过引用纳入本文)；通过电穿孔法(美国专利号5,384,253，通过引用纳入本文；tur-kaspa等，1986；potter等，1984)；通过磷酸钙沉淀法(graham和vandereb，1973；chen和okayama，1987；rippe等，1990)；使用deae葡聚糖，然后使用聚乙二醇(gopal，1985)；通过直接声波加载(fechheimer等，1987)；通过脂质体介导的转染(nicolau和sene，1982；fraley等，1979；nicolau等，1987；wong等，1980；kaneda等，1989；kato等，1991)和受体介导的转染(wu和wu，1987；wu和wu，1988)；通过微粒轰击(pct申请号wo94/09699和95/06128；美国专利号5,610,042；5,322,783、5,563,055、5,550,318、5,538,877和5,538,880，每一个都通过引用纳入本文)；通过与碳化硅纤维搅拌(kaeppler等，1990；美国专利号5,302,523和5,464,765，均通过引用纳入本文)；通过农杆菌介导的转化(美国专利号5,591,616和5,563,055，均通过引用纳入本文)；通过干燥/抑制介导的dna摄取(potrykus等，1985)，以及这些方法的任何组合。通过应用诸如这些的技术，细胞器、细胞、组织或生物体可被稳定地或瞬时地转化。[0147]2.脂质体介导的转染[0148]在本发明的某个实施方式中，核酸可被包裹在脂质复合物中，例如脂质体。脂质体是以磷脂双层膜和内部水性介质为表征的囊泡结构。多层脂质体具有水性介质隔开的多重脂质层。当磷脂悬浮在过量水溶液中时其自动形成。脂质组分在形成闭合结构之前经历自我重排，并且在脂质双层之间捕获水和溶解的溶质(ghosh和bachhawat,1991)。还考虑了与lipofectamine(gibcobrl)或superfect(qiagen)复合的核酸。使用的脂质体的量可根据脂质体的性质以及使用的细胞而变化，例如，可考虑每1至1000万个细胞约5至约20μg载体dna。[0149]脂质体介导的核酸递送和外源dna的体外表达非常成功(nicolau和sene，1982；fraley等，1979；nicolau等，1987)。脂质体介导的外源dna在培养的鸡胚胎、hela和肝癌细胞中的递送和表达的可行性也已得到证实(wong等，1980)。[0150]在本发明的某些实施方式中，脂质体可与凝血性病毒(hemagglutinatingvirus,hvj)复合。这已被证明有助于与细胞膜融合并促进脂质体包裹的dna进入细胞(kaneda等，1989)。在其他实施方式中，脂质体可与核非组蛋白染色体蛋白(hmg1)复合或结合使用(kato等，1991)。在另外的实施方式中，脂质体可与hvj和hmg-1复合或结合使用。在其他实施方式中，递送载剂可包含配体和脂质体。[0151]3.电穿孔[0152]在本发明的某些实施方式中，通过电穿孔将核酸引入细胞器、细胞、组织或生物体。电穿孔涉及将细胞和dna悬浮液暴露于高压放电。受体细胞可以通过机械创伤使其更容易发生转化。使用的载体的量可根据使用的细胞性质而变化，例如，可考虑每1至1000万个细胞约5至约20μg载体dna。-[0153]使用电穿孔对真核细胞进行转染已经相当成功。小鼠前b淋巴细胞已被人κ免疫球蛋白基因转染(potter等，1984)，大鼠肝细胞已用这种方式被氯霉素乙酰基转移酶基因转染(turkaspa等，1986)。[0154]4.磷酸钙[0155]在本发明的其他实施方式中，使用磷酸钙沉淀将核酸引入细胞。人类kb细胞已使用该技术转染了腺病毒5dna(graham和vandereb，1973)。同样以这种方式，用新霉素标志物基因转染小鼠l(a9)、小鼠c127、cho、cv1、bhk、nih3t3和hela细胞(chen和okayama，1987)，并用多种标志物基因转染大鼠肝细胞基因(rippe等,1990)。[0156]5.deae葡聚糖[0157]在另一个实施方式中，使用deae葡聚糖随后使用聚乙二醇将核酸递送到细胞中。以这种方式，报告质粒被引入小鼠骨髓瘤和红白血病细胞(gopal，1985)。[0158]d.细胞培养[0159]通常，本发明的细胞在培养基中培养，培养基是能够维持细胞生长富含营养的缓冲溶液。[0160]适用于根据本文所述方法分离、扩增和分化干细胞的培养基包括但不限于高葡萄糖达氏改良伊氏培养基(dmem)、dmem/f-12、l-15培养基(liebovitzl-15)、rpmi1640、iscove改良杜氏培养基(imdm)和opti-memsfm(英杰有限公司(invitrogeninc.))。化学成分确定的培养基包含最低必需培养基，例如iscove改良杜氏培养基(imdm)(gibco)，辅以人血清白蛋白、人excyte脂蛋白、运铁蛋白、胰岛素、维生素、必需和非必需氨基酸、丙酮酸钠、谷氨酰胺和丝裂原也是合适的。如本文所用，有丝分裂原是指刺激细胞分裂的试剂。试剂可以是化学物质，通常是某种形式的蛋白质，它会促使细胞开始细胞分裂，从而引发有丝分裂。在一个实施方式中，无血清培养基例如美国专利号5,908,782和wo96/39487所述，以及美国专利号5,486,359中所述“完全培养基”，被考虑用于本文所述的方法。在一些实施方式中，培养基补充有10％胎牛血清(fbs)、人自体血清、人ab血清或补充有肝素(2u/ml)的富含血小板的血浆。细胞培养物可维持在co2气氛中，例如5％至12％，以维持培养液的ph值，在潮湿气氛中于37℃孵育并传代以维持融合度低于85％。[0161]vi.免疫效应细胞[0162]免疫效应细胞可以是t细胞(例如调节性t细胞、cd4 t细胞，cd8 t细胞，或γδt细胞)；自然杀伤(nk)细胞；不变nk细胞；或nkt细胞。本文还提供了产生和工程改造免疫效应细胞的方法以及使用和给予细胞用于过继细胞治疗的方法，在这种情况下，细胞可以是自体或同种异体的。因此，免疫效应细胞可用于免疫治疗，例如靶向癌细胞。[0163]免疫效应细胞可分离自对象、具体是人对象。免疫效应细胞可从感兴趣的对象获得，例如怀疑患有具体的疾病或病症的对象、怀疑患有具体疾病或病症倾向的对象、正在接受特定疾病或疾病治疗的对象、健康志愿者或健康捐献者的对象，或从血库获得。免疫效应细胞可从其存在的对象体内的任何组织或器官中收集、富集和/或纯化，包括但不限于血液、脐带血、脾脏、胸腺、淋巴结、骨髓、手术过程中移除和/或暴露的组织，以及通过活检手术获得的组织。分离的免疫效应细胞可直接使用，也可以例如通过冷冻储存一段时间。[0164]富集、分离和/或纯化免疫效应细胞的组织/器官可从活体和非活体对象中分离，其中非活体对象为器官供体。从脐带血中分离的免疫效应细胞可具有增强的免疫调节能力，例如通过cd4或cd8阳性t细胞抑制来测量。为了增强免疫调节能力，免疫效应细胞可从合并的血液，具体是合并的脐带血中分离出来。合并的血液可来自2个或更多来源，例如3、4、5、6、7、8、9、10或更多来源(例如，供体对象)。[0165]免疫细胞群可从需要治疗或患有与免疫效应细胞活性降低相关疾病的对象获得。因此，这些细胞将是需要治疗的受试者的自体细胞。或者，免疫效应细胞群可从供体获得，优选同种异体供体。同种异体供体细胞可与人白细胞抗原(hla)相容，也可不相容。为了使对象相容，可以对同种异体细胞进行处理以降低免疫原性。[0166]免疫效应细胞的来源包括同种异体和自体来源。在一些情况下，免疫效应细胞可从干细胞或诱导型多能干细胞(ipsc)分化而来。因此，可以从脐带血、外周血、人胚胎干细胞或ipscs中分离出用于根据实施方式进行工程改造的细胞。例如，同种异体t细胞可以被修饰成包括嵌合抗原受体(并且可选地，以缺乏功能性tcr和/或mhc)。在一些方面中，免疫效应细胞是原代人t细胞，例如源自人外周血单个核细胞(pbmc)的t细胞、在用g-csf刺激后收集的pbmc、骨髓或脐带血。在转染或转导(例如，使用car表达构建体)后，细胞可被立即输注或储存。在某些方面中，在转染后，细胞可在基因转移进细胞后约1、2、3、4、5天或更长时间作为批量群体在离体繁殖数天、数周或数月。在另外的方面中，在转染之后，克隆转染子并且克隆证明存在单个整合的或游离型维持的表达盒或质粒，并且离体扩增嵌合抗原受体的表达。选择用于扩增的克隆展示了特异性识别和裂解抗原表达的标靶细胞的能力。可通过用il-2或结合共同γ链的其他细胞因子(例如il-7、il-12、il-15、il-21等)刺激来扩增重组t细胞。重组t细胞可通过人工抗原呈递细胞的刺激进行扩增。重组t细胞可在人工抗原呈递细胞上扩增，或用一种抗体，如okt3，在t细胞表面交联cd3。重组t细胞的亚群可在人工抗原呈递细胞上或用一种抗体(如campath)来删除，该抗体能结合t细胞表面的cd52。在另外的方面中，基因修饰的细胞可被冷冻保存。[0167]在另一方面中，该实施方式的免疫效应细胞已被选择用于高线粒体呼吸潜力(src)。如本文所用，“具有高线粒体src的免疫效应细胞”是指具有比相应的平均免疫效应细胞(例如，t细胞)更高的线粒体活性或线粒体数量的免疫效应细胞(例如，t细胞)。因此，在一些方面中，实施方式的细胞组合物包含具有高线粒体src的免疫效应细胞群，例如具有高线粒体src的car表达t细胞群。[0168]具有高线粒体src的免疫效应细胞(例如cd8 t细胞)在应激条件下(例如高肿瘤负荷、缺氧、糖酵解营养缺乏或抑制性细胞因子环境)可表现出相对于具有较低src的细胞更高的存活率。此外，被选择用于高线粒体src的免疫效应细胞可保留细胞毒活性，即使在应激条件下也是如此。因此，通过选择具有高线粒体src的免疫效应细胞，可以产生用于治疗和car构建体测试的改进细胞组成。[0169]在一方面中，提供了转基因免疫效应细胞，其包含可用于确定转基因效应细胞的线粒体src的报告基因。例如，转基因细胞可包含与线粒体定位信号连接的报告多肽。例如，报告基因可以是荧光多肽，例如增强型黄色荧光蛋白(yfp)或增强型绿色荧光蛋白(egfp)，以及线粒体定位信号可以来自谷氧还蛋白(grx2)。在这种情况下，荧光报告基因识别出具有高线粒体src的car t细胞。例如，可以根据荧光强度对表达报告基因的转基因细胞进行分类，并注入体内进行肿瘤杀伤。同样，可以进行转基因细胞对标靶细胞的离体杀伤测试，以确定例如候选car多肽的治疗效果。[0170]在一些方面中，根据实施方式使用的线粒体报告基因可以是内源基因。在进一步的方面中，线粒体报告基因可以是外源基因，例如编码荧光报告蛋白的基因。在一些方面中，荧光报告蛋白可包含线粒体定位序列。在某些方面中，用于选择具有高src的免疫效应细胞的方法可包括流式细胞术或facs。[0171]在某些方面中，用于鉴定具有src的免疫效应细胞的报告基因的表达可处于核启动子(例如，hef1a)的控制下。在某些方面中，报告基因的表达可处于线粒体启动子的控制下。在某些方面中，表达的报告蛋白可包含线粒体定位序列。在某些方面中，表达的报告蛋白可被导向细胞表面。在某些方面中，报告基因的表达可处于线粒体启动子的控制下并且表达的报告蛋白可被导向细胞表面。在一些方面中，外源报告基因可以侧接转座子重复序列或病毒ltr。在一些方面中，外源报告基因可包含在染色体外核酸中，例如mrna或附加型载体。[0172]vii.增殖免疫效应细胞的方法[0173]在一些情况下，实施方式的免疫效应细胞(例如，t细胞)与活化和增殖细胞(aapc)共培养，以帮助细胞扩增。例如，抗原呈递细胞(apc)在制备本实施方式的治疗组合物和细胞治疗产品中是有用的。有关抗原呈递系统的制备和使用的一般指南，请参见例如，美国专利号6,225,042、6,355,479、6,362,001及6,790,662；美国专利申请公开号2009/0017000和2009/0004142；以及国际公开号wo2007/103009，每一个都通过引用的形式纳入本文。[0174]在一些情况下，aapcs表达感兴趣的抗原(例如cov刺突蛋白)。此外，在一些情况下，apc可以表达结合具体car多肽或一般car多肽(例如，通用活化和繁殖细胞(uapc))的抗体。此类方法公开于国际(pct)专利公开号wo/2014/190273，其通过引用纳入本文。除了感兴趣的抗原外，aapc系统还可包括至少一个外源辅助分子。可使用任何合适数量和组合的辅助分子。辅助分子可选自例如共刺激分子和粘附分子等辅助分子。示例性的共刺激分子包括cd70和b7.1(b7.1先前被称为b7，也被称为cd80)，它们与t细胞表面的cd28和/或ctla-4分子结合，从而例如，影响t细胞扩增、th1分化、短期t细胞存活，和细胞因子分泌，例如白细胞介素(il)-2(参见kim等，2004)。粘附分子可包括碳水化合物结合性糖蛋白(如选择素)、跨膜结合糖蛋白(如整合素)、钙依赖性蛋白(如钙粘蛋白)和单次跨膜免疫球蛋白(ig)超家族蛋白(如胞间粘附分子(icam))，其促进例如细胞对细胞或细胞对基质的接触。示例性粘附分子包括lfa-3和icam，例如icam-1。例如，美国专利号6,225,042，6,355,479和6,362,001中举例说明了用于筛选、克隆、制备和表达示例性辅助分子(包括共刺激分子和粘附分子)的技术、方法和试剂，通过引用纳入本文。[0175]选择成为aapc的细胞，优选在细胞内抗原加工、细胞内肽运输和/或细胞内mhci类或ii类分子肽加载方面存在缺陷，或者是变温的(即，对温度挑战的敏感性低于哺乳动物细胞系)，或同时具有缺陷和变温特性。优选地，被选择成为aapc的细胞也缺乏表达外源性mhci类或ii类分子的至少一种内源对应物(例如，如上所述的内源性mhci类或ii类分子和/或内源辅助分子)的能力，和被引入细胞的辅助分子成分。此外，aapc优选保留细胞在被修饰以生成aapc之前所具有的缺陷和变温特性。示例性的aapc构成或来自与抗原加工(tap)缺陷细胞系相关的转运体，如昆虫细胞系。示例性变温昆虫细胞系是果蝇属细胞系，例如schneider2细胞系(参见，例如，schneider1972)。用于制备、生长和培养schneider2细胞的说明性方法提供于美国专利号6,225,042、6,355,479和6,362,001。[0176]在一个实施方式中，aapc也经历冻融循环。在示例性冻融循环中，可通过使含有aapc的合适容器与适量液氮、固体二氧化碳(即干冰)，或类似低温材料接触来冷冻aapc，从而迅速冷冻。然后将冷冻的apc解冻，方法是从低温材料中取出aapc并暴露在环境室温条件下，或者通过使用温水浴或暖手以促进更短解冻时间来促进解冻过程.此外，aapc可在解冻前被冷冻和储存较长时间。冷冻的aapc也可被解冻，然后在进一步使用前冻干。优选地，可对冻融程序产生不利影响的防腐剂，例如二甲亚砜(dmso)、聚乙二醇(peg)和其他防腐剂，不存在于包含经过冻融循环的aapc的培养基中，或者基本上被去除，例如通过将aapc转移到基本上不含此类防腐剂的培养基中。[0177]在进一步的实施方式中，aapc的异种核酸和内源性核酸可通过交联失活，使得在失活后基本上没有细胞生长、复制或核酸表达发生。在一个实施方式中，aapc在外源mhc和辅助分子表达，此类分子在aapc表面呈递以及向呈递的mhc分子加载所选肽或肽后的某个点失活。因此，这种失活的和选择的肽负载aapc，虽然基本上不能增殖或复制，但保留了选择的肽呈递功能。优选地，交联还产生基本上不含污染微生物如细菌和病毒的aapc，而基本上不降低aapc的抗原呈递细胞功能。因此，交联保持了重要的aapc功能，同时有助于减轻对使用aapc开发的细胞治疗产品的安全性的担忧。对于与交联和aapc相关的方法，参见例如美国专利申请公开号20090017000，其通过引用纳入本文。[0178]viii.治疗性应用[0179]在一些方面中，实施方式的car桥接蛋白和嵌合抗原受体构建体和细胞在患有或怀疑患有冠状病毒感染的对象中具有应用。可以使用的合适的免疫效应细胞包括细胞毒性淋巴细胞(ctl)。正如本领域技术人员所熟知的那样，从对象身上分离这些细胞的各种方法都是容易获得的。例如，使用细胞表面标志物的表达或使用市面上的试剂盒(如皮尔斯,伊利诺伊州罗克福德的isocelltm)。[0180]一旦确定转染或转导的免疫效应细胞(例如，t细胞)能够以所需的调节和所需的水平将嵌合抗原受体表达为表面膜蛋白，就可以确定嵌合抗原受体是否在宿主细胞中具有功能以提供所需的信号诱导。随后，将转导的免疫效应细胞重新引入或给药于对象以活化受试者的抗肿瘤反应。为了便于给药，可以将根据实施方式将转导的t细胞与适当的运载体或稀释剂一起制成适合体内给药的药物组合物或植入物，其还可以是药学上可接受的。制造这种组合物或植入物的方法在本领域中已有描述(参见，例如，《雷明顿药物科学》(remington'spharmaceuticalsciences)，第16版，马克编，1980)。在适当的情况下，转导的t细胞可以按照其各自给药途径的常用方式配制成半固体或液体形式的制剂，例如胶囊、溶液、注射、吸入剂或气雾剂。可以使用本领域已知的方法来防止或最小化组合物的释放和吸收，直到它到达目标组织或器官，或确保组合物的定时释放。然而，理想的采用一种药学上可接受的形式，其不会对表达嵌合抗原受体的细胞产生影响。因此，最好是将转导的t细胞制成含有平衡盐溶液，优选是汉克氏平衡盐溶液，或正常盐水的药物组合物。[0181]在某些实施方式中，将实施方式的car表达细胞递送给有需要的个体，例如患有癌症或感染的个体。然后，这些细胞会增强个体的免疫系统，以攻击相应的癌症或病原体感染的细胞。在某些情况下，向个体提供一个或多个剂量的抗原特异性car细胞。在向个体提供两个或更多剂量的抗原特异性car细胞的情况下，两次给药之间的持续时间应足以允许在个体中增殖的时间，并且在具体实施方式中，两次给药之间的持续时间为l、2、3、4、5、6、7或更多天。例如，用于治疗效果的合适剂量是每次至少105个或约105至约1010个细胞之间，优选地在一系列的给药周期中。一个示例性的给药方案包括四个为期一周的剂量升级周期，从第0天至少约105个细胞开始，例如在启动患者内部剂量递增方案的几周内逐步增加到约1010个细胞的目标剂量。合适的给药方式包括静脉注射、皮下注射、腔内注射(例如通过储存器接入装置)、腹膜内注射和直接注射到肿瘤块中。[0182]在某些实施方式中，在递送桥接蛋白之前将表达car的细胞递送给有需要的个体。在一些情况下，car表达细胞和桥接蛋白之间给药的持续时间可以是1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、2周、3周、4周、5周、6周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月或更长时间。在一些情况下，向个体提供一个或多个剂量的car表达细胞和/或桥接蛋白。在向个体提供两个或多个剂量的car表达细胞和/或桥接蛋白的情况下，各剂量之间的给药时间可为l、2、3、4、5、6、7或更多天。[0183]在某些实施方式中，在递送桥接蛋白之后将car表达的细胞递送给有需要的个体。在一些情况下，桥接蛋白和car表达细胞之间给药的持续时间可以是1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、2周、3周、4周、5周、6周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月或更长时间。在一些情况下，向个体提供一个或多个剂量的car表达细胞和/或桥接蛋白。在向个体提供两个或多个剂量的car表达细胞和/或桥接蛋白的情况下，各剂量之间的给药时间可为l、2、3、4、5、6、7或更多天。[0184]在某些实施方式中，car表达细胞被递送给需要的个体，同时递送桥接蛋白。在一些情况下，向个体提供一个或多个剂量的car表达细胞和/或桥接蛋白。第二次或更多次递送可仅是car表达细胞，仅是桥接蛋白或两者的组合。在向个体提供两个或多个剂量的car表达细胞和/或桥接蛋白的情况下，各剂量之间的给药时间可为l、2、3、4、5、6、7或更多天。[0185]在一些情况下，先前接受过car表达细胞治疗的患者可接受桥接蛋白治疗，以重新定向car表达细胞的效应功能。在一些情况下，先前接受过car表达细胞和桥接蛋白治疗的患者可接受不同的桥接蛋白治疗，以重新定向car表达细胞的效应功能。这可治疗患者的新肿瘤或新感染。这可在抗原丢失的情况下完成。[0186]在任何提供的实施方式中，可用多于一种桥接蛋白治疗患者以将car表达细胞的效应子功能导向多个标靶。[0187]实施方式的药物组合物(例如，包含表达car的t细胞)可以单独使用或与其他公认的可用于治疗癌症的试剂组合使用。无论是单独递送还是与其他试剂组合递送，实施方式的药物组合物都可以通过多种途径递送至哺乳动物，具体是人体的各个部位，以实现具体的效果。本领域的技术人员将认识到，尽管有多于一种途径可用于给药，但具体途径可提供比另一途径更立即和更有效的反应。例如，皮内递送可用于治疗黑色素瘤。局部或全身递送可以通过给药，包括将制剂应用或滴入体腔、吸入或吹入气雾剂，或通过胃肠外引入，包括肌肉内、静脉内、门静脉内、肝内、腹膜、皮下或皮内给药来实现。[0188]实施方式的组合物可以单位剂量形式提供，其中每个剂量单位，例如注射剂，单独或与其他活性剂的适当组合含有预定量的组合物。本文所用的术语单位剂型是指物理上离散的单位，适合作为人和动物受试者的单位剂量，每个单位包含预定量的实施方式的组合物，单独或与其他活性剂组合，经计算该量足以与药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂联合使用，以产生所需的效果。实施方式单位剂量形式的规格取决于与具体对象中药物组合物相关的具体药效学。[0189]理想地，有效量或足够数量的分离的转导t细胞存在于组合物中并被引入对象中，以便建立长期的、特异性的抗肿瘤反应以减小肿瘤的大小或消除肿瘤生长或再生长，否则将导致这种治疗的缺失。理想地，在其他相同条件时与不存在转导t细胞相比，重新引入对象的转导t细胞的量导致肿瘤大小有10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的减小。如本文所用，术语“抗肿瘤有效量”是指有效量的car表达免疫效应细胞以减少对象中的癌细胞或肿瘤生长。[0190]因此，转导的免疫效应细胞(如t细胞)的量应考虑到给药途径，并应使转导的免疫效应细胞有足够的数量被引入，以达到预期的治疗反应。此外，本文所述组合物中包含的每种活性剂的量(例如，每个待接触的细胞的量或每一定体重的量)在不同的应用中可以有所不同。一般来说，转导t细胞的浓度最好足以在被治疗的对象中提供至少约1×106至约1×109个转导的t细胞，甚至更理想的是约1×107至约5×108个转导的t细胞，尽管任何合适的数量可以被使用或高于，例如，大于5×108个细胞，或低于，例如，小于1×107个。剂量安排可以基于已确立的基于细胞的疗法(例如，参见topalian和rosenberg，1987；美国专利号4,690,915)，或者可以使用另一种连续输注策略。[0191]这些数值提供了实践者在优化实施方式的方法时使用的转导t细胞范围的一般指南。本文所述的此类范围决不排除使用更高或更低量的组分，这在具体应用中可以是有保证的。例如，实际剂量和时间表可以根据组合物是否与其他药物组合物联合给药，或根据药代动力学、药物处置和代谢的个体差异而变化。本领域的技术人员可以根据具体情况的紧急情况容易地做出任何必要的调整。[0192]ix.实施方式的试剂盒[0193]本文所述的任何组合物都可以包含在一个试剂盒中。在一些实施方式中，试剂盒中提供了car桥接蛋白和/或car表达免疫效应细胞，其还可以包括适用于扩增细胞的试剂，例如培养基、apc、工程改造的apc、生长因子、抗体(例如，用于分选或表征car表达细胞)和/或编码转基因的质粒。[0194]在一个非限制性实例中，嵌合抗原受体表达构建体、一种或多种用于产生嵌合抗原受体表达构建体的试剂、用于转染表达构建体的细胞，和/或一种或多种用于获得用于转染表达构建体的同种异体细胞的仪器(此类仪器可以是注射器、移液管、镊子，和/或任何此类医学认可的仪器)。[0195]在一些实施方式中，试剂盒提供了用于消除内源性tcrα/β表达和/或mhc表达的表达构建体(例如，β-2微球蛋白)、一种或多种用于生成该构建体的试剂和/或car 细胞。在一些实施方式中，包括编码锌指核酸酶的表达构建体。[0196]在一些方面中，该试剂盒包括用于细胞电穿孔的试剂或装置。[0197]试剂盒可包含一种或多种适当等分的实施方式的组合物或用于产生实施方式的组合物的试剂。试剂盒的组分可包装在水性介质中或以冻干形式包装。试剂盒的容器用具可包括至少一个小瓶、试管、培养瓶、瓶、注射器或其他容器用具，其中可以放置组分，并且优选地，适当地等分。如果试剂盒中有多个组分，则试剂盒通常还将包含第二、第三或其他附加容器，可以将其他组分单独放入其中。然而，各种组分的组合可包含在小瓶中。实施方式的试剂盒通常还包括用于容纳嵌合抗原受体构建体和任何其他试剂容器的装置，进行商业销售。此类容器可包括注射或吹塑的塑料容器，例如，所需的小瓶被保留在其中。[0198]x.实施例[0199]包括以下实施例以演示本发明的优选实施方式。本领域技术人员应当理解，在下面的实施例中公开的技术代表发明人发现的在本公开的实践中发挥良好作用的技术，因此可以被视为构成其实践的优选模式。在本文基础上，本领域技术人员应懂得，在本文要旨和范围内可对本文所述具体实施方式进行多种改变而仍然得出相同或相近结果。[0200]实施例1–car-抗原桥接蛋白的构建[0201]发明人试图开发一种桥接蛋白，以将hiv特异性cart细胞重新导向肿瘤细胞上表达的抗原，从而证明对这些标靶细胞的杀伤。为此，通过将gp120t与抗原结合域(如与感兴趣的标靶抗原结合的抗体)连接或融合，产生了桥接蛋白。[0202]方法[0203]构建设计和分子克隆。抗hivcart细胞先前是基于使用截短的cd4(cd4t)胞外结构域(car4)开发的，该结构域可识别hiv包膜(env，gp120)蛋白。与包含四个免疫球蛋白结构域(d1至d4)的全长cd4糖蛋白不同，cd4t使用由d1和d2结构域组成的截短的cd4蛋白。因此，car修饰的细胞将结合感染细胞上的hivenv。基本的car4设计如图5所示。[0204]慢病毒载体产生。通过用携带car的质粒以及慢病毒包装质粒pax2和vsvg转染hek293t细胞来产生慢病毒载体。在4-6小时补充细胞培养基，随后在12-24-48小时收集病毒颗粒。收集培养基，过滤以去除细胞碎片，并使用超速离心(19,500rpm，2小时)富集病毒颗粒。浓缩慢病毒载体的最终等分试样储存在-80℃。通过以一系列稀释度转导ht1080细胞并测量表达rqr8的细胞百分比来评估功能性病毒载体滴度。[0205]细胞和细胞系。原代t细胞由从日内瓦大学医院输血中心采购的匿名血沉棕黄层血液单位制备。用ficoll分离外周血单个核细胞(pbmc)，用miltenyi(美天旎生物技术公司)cd4/cd8微珠分离t细胞，并在液氮中冷冻保存。在这些原理研究证明中，转导以表达cd117的hl-60细胞被用作标靶细胞。[0206]cart细胞制造。将冷冻保存的t细胞解冻，在texmacs培养基中过夜培养，并在第二天使用cd3/cd28微珠(1:1比例)或transact(miltenyi,美天旎生物技术公司)活化，并以感染复数(moi)3-7用car构建体进行病毒转导。转导以高密度体积(200万个细胞/ml/cm2)进行，并在18-24小时后补充培养基，此后每隔一天以100万个/ml的细胞密度维持t细胞。[0207]在t细胞转导后5-7天进行流式细胞术。细胞被收获、洗涤、重悬于facs缓冲液(不含ca/mg2 的pbs、2mmedta、0.5％bsa)中并用cd34抗体(qbend10)染色20-30分钟以评估报告基因(rqr8)表达细胞的频率。染色后，用pbs洗涤细胞，重悬于facs缓冲液中，并通过流式细胞术评估细胞表面表达。[0208]桥接蛋白设计与产生。基于截短的糖蛋白120(gp120t)与igg和二抗体格式的化学偶联，设计了一种桥接蛋白构建体。化学合成了具有马来酰亚胺环的11个氨基酸的截短gp120片段(ssggdpeivth；seqidno:6)。为了允许偶联，igg和双抗体蛋白是用半胱氨酸残基生产的。化学偶联起始于二硫苏糖醇(dtt)还原和添加gp120t-马来酰亚胺(图6)。[0209]细胞毒性测试。car4t细胞与标靶细胞共培养18-24小时，效应细胞与标靶细胞的比例为1:1。还添加偶联抗体至最终浓度为500nm。car4t细胞与hl-60细胞上的肿瘤相关抗原(在这种情况下为cd117)结合的能力是通过测量共培养物中剩余的活靶细胞百分比下降的比例来评估的。[0210]b.结果[0211]桥接蛋白结合cd4并被重定向以杀死肿瘤细胞。发明人首先着手证明gp120t与igg的成功偶联，以及与t细胞上表达的cd4蛋白的结合(图7a)。为了对此进行测试，将原代t细胞暴露于不同浓度的igg偶联物30分钟，然后洗涤两次以去除未结合的igg，并用fitc标记的蛋白a染色以检测cd4结合的igg蛋白。igg偶联蛋白能够结合原代t细胞上的天然cd4，重要的是，与使用抗cd4抗体(分别为58.5％和56.9％)相比，重现了同等百分比的cd4阳性细胞。[0212]接着，进行相似的实验以确认igg偶联物与car4受体的结合。为此，用携带car4构建体的慢病毒载体转导ht1080细胞，并将细胞暴露于不同浓度的igg或igg偶联蛋白。如图7b中的流式细胞术直方图所示，当使用igg偶联的桥接蛋白时，fitc标记的蛋白a的中值荧光强度(mfi)明显成比例增加，但当单独使用igg时未观察到此种情况。[0213]最后，发明人试图证明桥接蛋白能够重新引导car4t细胞靶向并杀死肿瘤细胞(图7c和7d)。在本实验中，将表达cd117的hl-60肿瘤细胞与car4t细胞(1:1比例)和多种桥接蛋白构型(500nm)共培养。发明人还建立了抗cd117双抗体，在该评估中其与gp120t偶联。在24共培养后，当使用igg偶联(65％)和双抗体偶联(90％)的桥接蛋白时，当标准化为对照(仅car4t细胞，无桥蛋白)时，观察到靶细胞的细胞毒性显著增加。这证明桥接蛋白可以高效地结合于cart细胞并将其重新导向肿瘤细胞从而引起特异性细胞毒性。[0214]c.概述和结论[0215]这确认了抗体偶联物能够桥接hiv特异性cart细胞到表达感兴趣的抗原的肿瘤细胞，用于重新定向hiv特异性cart细胞的细胞毒性。一旦结合，cart细胞就会表现出对肿瘤细胞的有效杀伤，这在使用双抗体-gp120t偶联物时更为明显。进一步的实验包括将car4t细胞重新导向其他有关的肿瘤相关抗原，包括针对b细胞恶性肿瘤的cd19、cd20和cd22，以及在实体瘤上表达的抗原。[0216]***[0217]根据本公开，本文公开和要求保护的所有方法都可以在不进行不当实验的情况下制造和执行。虽然已经根据优选实施方式描述了本公开的组合物和方法，但对于本领域技术人员来说，显而易见的是，在不脱离本公开的概念、精神和范围的情况下，可以对本文所述方法的步骤或步骤序列进行改变。更具体而言，可以用化学和生理相关的某些试剂代替本文所述的试剂，同时可以得到相同或类似的结果。所有此类类似替代和修改对于本领域技术人员而言是显而易见地被视为在所附权利要求所定义的本公开的精神、范围和概念范围内的。[0218]参考文献[0219]以下参考文献在一定程度上提供了补充本文所述内容的示例性程序或其他细节，通过引用具体纳入本文。[0220]美国专利申请公开号2002/0168707[0221]美国专利申请公开号2003/0051263[0222]美国专利申请公开号2003/0055020[0223]美国专利申请公开号2003/0159161[0224]美国专利申请公开号2004/0064842[0225]美国专利申请公开号2004/0265839[0226]美国专利申请公开号2009/0004142[0227]美国专利申请公开号2009/0017000[0228]美国专利号4,690,915[0229]美国专利号5,302,523[0230]美国专利号5,322,783[0231]美国专利号5,384,253[0232]美国专利号5,464,765[0233]美国专利号5,486,359[0234]美国专利号5,538,877[0235]美国专利号5,538,880[0236]美国专利号5,550,318[0237]美国专利号5,563,055[0238]美国专利号5,580,859[0239]美国专利号5,589,466[0240]美国专利号5,591,616[0241]美国专利号5,610,042[0242]美国专利号5,656,610[0243]美国专利号5,702,932[0244]美国专利号5,736,524[0245]美国专利号5,780,448[0246]美国专利号5,789,215[0247]美国专利号5,908,782[0248]美国专利号5,945,100[0249]美国专利号5,981,274[0250]美国专利号5,994,136[0251]美国专利号5,994,624[0252]美国专利号6,013,516[0253]美国专利号6,225,042[0254]美国专利号6,355,479[0255]美国专利号6,362,001[0256]美国专利号6,410,319[0257]美国专利号6,506,559[0258]美国专利号6,573,099[0259]美国专利号6,790,662[0260]ep1507865[0261]wo94/09699[0262]wo95/06128[0263]wo96/39487[0264]wo2005/028630[0265]wo2007/103009[0266]wo2010/079430[0267]wo2014/190273[0268]wo2015/123642[0269]wo2019/186274[0270]angel等,“佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯(12-0-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate)对人胶原酶基因的诱导是由位于5'侧接区域的诱导增强子元件介导的”,mol.cell.biol.,7:2256-2266,，1987a。[0271]angel等.,"佛波醇酯诱导基因包含一个由tpa调节的反式作用因子识别的常见顺式元件,"cell,49:729-739,1987b。[0272]atchison和perry,"串联κ免疫球蛋白启动子在κ增强子存在时同样活跃：对增强子功能模型的启示,"cell,46:253-262,1986。[0273]ausubel等.,《新编分子生物学实验指南》(currentprotocolsinmolecularbiology),格林出版联合公司与约翰威利父子公司(greenepubl.assoc.inc.&johnwiley&sons,inc.)，马萨诸塞州,1996。[0274]banerji等，“淋巴细胞特异性细胞增强子位于免疫球蛋白重链基因连接区域的下游”，cell，35:729-740,1983。[0275]banerji等，“远端sv40dna序列增强了β-珠蛋白基因的表达”，cell，27:299-308,1981。[0276]berkhout等，“tat通过新生rna标靶反式激活人类免疫缺陷病毒,”cell,59:273-282,1989。[0277]blanar等，“一种与mhci类基因h-2kb的干扰素反应序列结合的γ-干扰素诱导因子”，emboj.，8:1139-1144,1989。[0278]blomer等，j.virol.，71(9):6641-6649，1997.[0279]bodine和ley,"增强子元件位于人γ球蛋白基因3’端,"emboj.,6:2997-3004,1987。[0280]boshart等，“一个强增强子位于人类巨细胞病毒立即早期基因的上游，”cell，41:521-530,1985。[0281]braddock等，"hiv-itat活化细胞核中预合成的rna"，cell，58:269-279，1989。[0282]bulla和siddiqui，"乙肝病毒增强子从内部位置调节乙肝病毒表面抗原基因的转录"，j.virol.，62：1437-1441，1988。[0283]campbell和villarreal，"多瘤病毒单个增强子核心序列的功能分析：细胞特定的dna复制与转录的解耦"，mol.cell.biol.,8:1993-2004,1988.[0284]campo等，"牛乳头瘤病毒1型基因组中的转录控制信号"，nature，303：77-80，1983。[0285]capecchi,nature,348:109,1990.[0286]celander和haseltine,"糖皮质激素对小鼠白血病病毒转录元件的调控是由病毒增强区的决定因素指定的,"j.virology,61:269-275,1987.[0287]celander等，"小鼠白血病病毒增强区中的调控元件介导糖皮质激素反应性"，j.virology，62:1314-1322，1988。[0288]chandler等，“体外糖皮质激素受体特异性结合的dna序列在体内呈现异源启动子激素反应”，cell，33：489-499，1983。[0289]chang等，“葡萄糖调节蛋白(grp94和grp78)基因共享共同的调控域并受共同的反式作用因子协调调控，”mol.cell.biol.,9:2153-2162,1989.[0290]chatterjee等，"甲状腺刺激素α基因受甲状腺激素的负向调节:受体与tata盒相邻的相互作用，"procnatl.acadsci.u.s.a.,86:9114-9118,1989。[0291]chen和okayama，“质粒dna对哺乳动物细胞的高效转化”，mol.cell.biol，7:2745-2752,1987。[0292]chevalier等,mol.cell,10:895-905(2002)。[0293]choi等，“多重耐药人类细胞中交叉耐药模式的改变源于mdr-1(p-糖蛋白)基因的自发突变，”cell，53:519-529,1989。[0294]cohen等，“人类c-ha-ras1基因的重复序列元件3'端具有增强子活性”，j.cell.physiol.增刊，5:75-81,1987。[0295]costa等，“小鼠转甲状腺素蛋白(前白蛋白)基因的细胞特异性增强子在一个位点结合共同因子，在其他两个位点结合肝脏特异性因子，”mol.cell.biol,8:81-90,1988。[0296]cripe等，“角质形成细胞依赖性增强子以及病毒e2反式激活因子和阻遏基因产物对人乳头瘤病毒16e6-e7启动子的转录调控：对宫颈癌发生的影响”，emboj.，6：3745-3753，1987。[0297]culotta和hamer，“小鼠金属硫蛋白基因金属反应元件的精细定位”，mol.cell.biol.,9:1376-1380,1989.[0298]dandolo等，“小鼠胚胎癌细胞中多瘤病毒转录的调控”，j.virology，47:55-64，1983。[0299]devilliers等，“多瘤病毒dna复制需要增强子”，nature，312:242-246,1984。[0300]deschamps等，“原癌基因fos上游转录增强子元件的鉴定”，science,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