重组人干扰素λ1鼻喷雾剂及其用途的制作方法

重组人干扰素
λ
1鼻喷雾剂及其用途
技术领域
1.本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及一种重组人干扰素λ1鼻喷雾剂及其用途。


背景技术：

2.鼻腔给药系统是指在鼻腔内使用，经鼻黏膜吸收而发挥局部或全身治疗作用的制剂。近年来，鼻腔给药以其生物利用度高、可避免药物胃肠道刺激、降解和肝脏首过效应、速效、使用方便、具有脑靶向性等优势，日益受到人们的重视，成为制剂学领域的研究热点之一。
3.影响鼻腔给药吸收的剂型因素包括药物本身的结构和性质、药物浓度和剂量、剂型、ph、渗透压、防腐剂、生物粘附剂选择等因素。对于生物大分子量药物，鼻喷雾剂大部分选择鼻喷雾制剂。选用合适的生物粘附剂是鼻喷雾剂设计的重要内容，合适的生物粘附剂可以延长药物滞留时间、提高膜通透性等，同时也需要考虑生物粘附剂的毒副作用。对于生物大分子来说，选择合适的鼻喷雾制剂配方可以提高稳定性，降低对蛋白酶抑制剂的依赖；同时抑菌剂的选择也是生物大分子药物稳定性重点考虑的因素。
4.呼吸道鼻粘膜是人体抗病毒的第一道屏障，选用干扰素配制的鼻喷雾制剂是抗病毒治疗研究的热门方向，然而，i型干扰素由于受体表达广泛，干扰素α配制的鼻喷雾制剂通常具有头晕、咽痛、头痛、乏力等流感样症候副作用。干扰素λ属于ⅲ型干扰素，主要在上皮细胞和肝细胞中表达，是呼吸道病毒感染过程中气道上皮细胞诱导的主要干扰素。因此，相对于干扰素α，干扰素λ具有更高的组织特异性。选用干扰素λ做为抗病毒鼻喷雾制剂具有很高的有效性和安全性。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种重组人干扰素λ1鼻喷雾剂，其应用于抗病毒，以干扰素λ1作为为有效组分的鼻喷雾制剂，具体地，所述鼻喷雾剂包括重组人干扰素λ1、ph在4.5～5.5范围的乙酸盐缓冲液、壳聚糖、苯扎溴铵。本发明还提供了所述鼻喷雾剂的配制方法，及其在治疗和/或预防病毒感染中的用途。
6.本发明的第一方面，提供了一种重组人干扰素λ1鼻喷雾剂，所述鼻喷雾剂包含：(a) 重组人干扰素λ1；(b) ph4.5-5.5范围的乙酸盐缓冲液，所述缓冲液中乙酸盐的浓度为10～50mmol/l；(c) 生物粘附剂；和(d) 抑菌剂；其中，所述生物粘附剂为壳聚糖，所述抑菌剂为壳聚糖和苯扎溴铵，并且所述壳聚糖的浓度为0.05～0.2%，所述苯扎溴铵的浓度为0.005～0.02%，按所述鼻喷雾剂的总体积计。
7.在另一优选例中，所述重组人干扰素λ1包括野生型人干扰素λ1和人干扰素λ1活性
突变体。
8.在另一优选例中，所述重组人干扰素λ1是野生型人干扰素λ1，其氨基酸序列如genbank: aev89427.1中所示。
9.在另一优选例中，所述鼻喷雾剂中重组人干扰素λ1浓度为0.1～1mg/ml。
10.在另一优选例中，所述乙酸盐缓冲液中乙酸盐的浓度为20～25mmol/l。
11.在另一优选例中，所述乙酸盐缓冲液为乙酸钠缓冲液。
12.在另一优选例中，所述乙酸盐缓冲液为20 mmol/l的乙酸钠缓冲液，ph 4.5。
13.在另一优选例中，所述乙酸盐缓冲液为20 mmol/l的乙酸钠缓冲液，ph 5.0。
14.在另一优选例中，所述乙酸盐缓冲液为20 mmol/l的乙酸钠缓冲液，ph 5.5。
15.在另一优选例中，所述乙酸盐缓冲液为25 mmol/l的乙酸钠缓冲液，ph 5.0。
16.在另一优选例中，所述乙酸盐缓冲液为25 mmol/l的乙酸钠缓冲液，ph 5.5。
17.在另一优选例中，所述鼻喷雾剂中壳聚糖的浓度为0.05% (m/v)。
18.在另一优选例中，所述鼻喷雾剂中壳聚糖的浓度为0.1% (m/v)。
19.在另一优选例中，所述鼻喷雾剂中壳聚糖的浓度为0.2% (m/v)。
20.在另一优选例中，所述鼻喷雾剂中苯扎溴铵的浓度为0.005% (v/v)。
21.在另一优选例中，所述鼻喷雾剂中苯扎溴铵的浓度为0.01% (v/v)。
22.在另一优选例中，所述鼻喷雾剂中苯扎溴铵的浓度为0.02% (v/v)。
23.在另一优选例中，所述鼻喷雾剂中壳聚糖的浓度为0.05% (m/v)，且苯扎溴铵的浓度为0.01% (v/v)。
24.在另一优选例中，所述鼻喷雾剂中壳聚糖的浓度为0.05% (m/v)，且苯扎溴铵的浓度为0.005% (v/v)。
25.在另一优选例中，所述鼻喷雾剂中壳聚糖的浓度为0.05% (m/v)，且苯扎溴铵的浓度为0.02% (v/v)。
26.在另一优选例中，所述鼻喷雾剂包含：0.1～1mg/ml的重组人干扰素λ1，ph 5.0的25 mmol/l的乙酸钠缓冲溶液，0.05%的壳聚糖和0.01%的苯扎溴铵，按所述鼻喷雾剂的总体积计。
27.在另一优选例中，所述鼻喷雾剂不含二价盐离子。
28.在另一优选例中，所述鼻喷雾剂不含中性盐。
29.在另一优选例中，所述中性盐包括但不限于氯化钠、氯化钾。
30.在另一优选例中，所述鼻喷雾剂不含蛋白稳定剂。
31.在另一优选例中，所述蛋白稳定剂包括但不限于聚山梨酯80、聚山梨酯20。
32.在另一优选例中，所述鼻喷雾剂具有以下特征：所述鼻喷雾剂在25℃的温度条件下稳定存在至少3个月，较佳地6个月；和/或在37
±
2℃的温度条件下稳定存在至少1个月，较佳地3个月。
33.在另一优选例中，“稳定存在”是指所述制剂的外观、可见异物、蛋白含量、纯度、生物学活性等关键质量参数均无显著变化。
34.本发明的第二方面，提供了一种制备如本发明第一方面所述的重组人干扰素λ1鼻喷雾剂的方法，所述方法包括以下步骤：(i) 提供纯化的重组人干扰素λ1原液；
(ii) 将纯化的重组人干扰素λ1原液换液至乙酸盐缓冲液中，并添加苯扎溴铵和壳聚糖，过滤后即获得所述的重组人干扰素λ1鼻喷雾剂。
35.在另一优选例中，步骤(i)中的纯化的重组人干扰素λ1原液经过包括高密度发酵、包涵体制备、包涵体复性、超滤及两步source 30s的纯化制备获得。
36.在另一优选例中，所述乙酸盐缓冲液中乙酸盐的浓度为10～50mmol/l，ph4.5-5.5。
37.在另一优选例中，所述壳聚糖的浓度为0.05～0.2%，所述苯扎溴铵的浓度为0.005～0.02%，按所述鼻喷雾剂的总体积计。
38.本发明的第三方面，提供了一种如本发明第一方面所述的重组人干扰素λ1鼻喷雾剂在制备用于治疗和/或预防病毒感染的药物中的用途。
39.在另一优选例中，所述病毒为呼吸道病毒。
40.在另一优选例中，所述病毒选自下组：新冠病毒、西尼罗河病毒、水泡性口炎病毒或其组合。
41.在另一优选例中，所述病毒为新冠病毒。
42.在另一优选例中，所述新冠病毒包括新冠病毒野生型毒株、新冠病毒奥密克戎株ba.2。
43.在另一优选例中，所述病毒为西尼罗河病毒。
44.在另一优选例中，所述病毒为水泡性口炎病毒。
45.本发明的第四方面，提供了一种治疗和/或预防病毒感染的方法，包括步骤：向有需要的受试者施用如本发明第一方面所述的重组干扰素λ1鼻喷雾剂。
46.在另一优选例中，所述有需要的受试者包括人类和非人类哺乳动物。
47.在另一优选例中，所述病毒为呼吸道病毒。
48.在另一优选例中，所述病毒选自下组：新冠病毒、西尼罗河病毒、水泡性口炎病毒或其组合。
49.在另一优选例中，所述病毒为新冠病毒。
50.在另一优选例中，所述新冠病毒包括新冠病毒野生型毒株、新冠病毒奥密克戎株ba.2。
51.在另一优选例中，所述病毒为西尼罗河病毒。
52.在另一优选例中，所述病毒为水泡性口炎病毒。
53.应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
54.图1显示了重组人干扰素λ1及其活性突变体纯度分析图。
55.图2显示了鼻喷雾剂辅料候选配方鼻喷测试评分统计。
56.图3显示了金黄色葡萄球菌在不同抑菌剂中培养7天的抑菌效果测试。
57.图4显示了白色念珠菌在不同抑菌剂中培养7天的抑菌效果测试。
58.图5显示了金黄色葡萄球菌和白色念珠菌在苯扎溴铵和/或壳聚糖抑菌剂中培养7
天的抑菌效果测试。
59.图6显示了干扰素λ1鼻喷雾剂抗新冠病毒原型株效果图。
60.图7显示了干扰素λ1鼻喷雾剂抑制新冠病毒奥密克戎株杀伤细胞效果图。
61.图8显示了干扰素λ1鼻喷雾剂西尼罗河病毒效果图。
62.图9显示了小鼠鼻甲组织的新冠病毒载量（标示为0的点的小鼠检测结果为阴性）。
63.图10显示了小鼠肺组织的新冠病毒载量（标示为0的点的小鼠检测结果为阴性）。
64.图11显示了小鼠脑组织的新冠病毒载量（未显示的点的小鼠检测结果为阴性）。
具体实施方式
65.本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地开发了一种可稳定存在并保存且适用于鼻喷用的重组人干扰素λ1鼻喷雾剂，包括重组人干扰素λ1（野生型和活性突变体）、ph在4.5～5.5范围的乙酸钠缓冲液、壳聚糖、苯扎溴铵。本发明通过以下几个方面进行筛选：(1) 重组人干扰素λ1稳定保存基础缓冲液筛选：通过筛选不同组合的缓冲液类型、ph、浓度、组合蛋白稳定剂等条件筛选，确定蛋白可稳定保存的基础缓冲液及可添加物。实验证明，在37℃
±
2℃加速处理1个月后，在合适的ph范围的乙酸钠缓冲液中，蛋白可稳定保存，可添加一定浓度的中性盐和聚山梨酯80。
66.(2) 鼻喷雾剂辅料初步筛选：通过步骤（1）选择的基础缓冲液筛选溶解性好、可操作性强、鼻腔易于接受的生物粘附剂，通过测试发现，在已有的ph范围内，例如羧甲基纤维素钠可溶性差，此外部分生物粘附剂具有比较强烈的干燥感或瘙痒症状，因此，壳聚糖在酸性ph条件下可溶性强，同时鼻腔给药可接受度较佳。通过鼻腔可接受度测试，添加中性盐将影响鼻部刺激，添加聚山梨酯20或聚山梨酯80导致气味性增加，可接受度下降。
67.(3) 抑菌剂筛选：确定抑菌效果最强、毒性小、使用浓度低的抑菌剂。实验证明，鼻喷雾剂常用的苯甲醇和苯乙醇抑菌需要较高的浓度（0.5%），而且单用一种抑菌剂抗真菌效果不佳，苯扎溴铵通过与生物粘附剂壳聚糖联用在0.005%即可达到明显的抑菌效果。
68.(4) 组合基础缓冲液、抑菌剂、生物粘附剂等配方，通过稳定性测试可见异物、纯度、生物学活性等质量属性发现，羧甲基纤维素钠易导致干扰素λ沉淀，苯甲醇和苯乙醇将影响干扰素λ保存后纯度。通过抑菌测试发现，组合壳聚糖和苯扎溴铵的低盐缓冲液，抑菌效果强于苯扎溴铵。
69.综合研究显示，本发明的重组干扰素λ1鼻喷雾剂可稳定保存、刺激性小、无气味性、抑菌效果最强，在25℃
±
2℃加速处理3个月后，其外观、可见异物、纯度、生物学活性等质量属性均无变化。因此，本发明的干扰素λ1鼻喷雾剂可以作为一种可快速大量生产，并长期保存的抗病毒治疗和/或预防药物。在此基础上，完成了本发明。
70.术语为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
71.如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1%。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
72.如本文所用，术语“治疗”指给予患者内用或外用治疗剂，包含本发明的针对肿瘤的疫苗及其组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，以有效缓解一种或多种疾病症状的治疗剂的量(治疗有效量)给予患者。
73.如本文所用，术语“任选”或“任选的”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。例如，“任选的单糖或二糖”是指特定的单糖或二糖可以有但不是必须有，可以是1个、2个或3个。
74.人干扰素λ1（人白介素29）人干扰素λ1又称白介素29，属于ⅲ型干扰素，主要在上皮细胞和肝细胞中表达，是呼吸道病毒感染过程中气道上皮细胞诱导的主要干扰素。本发明的重组人干扰素λ1鼻喷雾剂以重组人干扰素λ1作为活性成分。在本发明的一个优选实施方式中，所述重组人干扰素λ1为野生型人干扰素λ1，其氨基酸序列如genbank: aev89427.1中所示。在本发明的另一个优选实施方式中，所述重组人干扰素λ1为人干扰素λ1活性突变体，所述活性突变体的氨基酸序列与野生型人干扰素λ1的氨基酸序列具有至少70%的序列同一性,且保留野生型人干扰素λ1的生物活性。
75.本发明的重组人干扰素λ1鼻喷雾剂本发明提供了一种重组人干扰素λ1鼻喷雾剂，所述鼻喷雾剂包含：(a) 重组人干扰素λ1；(b) ph4.5-5.5范围的乙酸盐缓冲液，所述缓冲液中乙酸盐的浓度为10～50mmol/l；(c) 生物粘附剂；和(d) 抑菌剂；其中，所述生物粘附剂为壳聚糖，所述抑菌剂为壳聚糖和苯扎溴铵，并且所述壳聚糖的浓度为0.05～0.2%，所述苯扎溴铵的浓度为0.005～0.02%，按所述鼻喷雾剂的总体积计。并且，所述鼻喷雾剂不含二价盐离子；不含氯化钠、氯化钾等中性盐；不含聚山梨酯80、聚山梨酯20等蛋白稳定剂。
76.在本发明的一个优选实施方式中，所述鼻喷雾剂包含0.1～1mg/ml的重组人干扰素λ1，ph 5.0的25 mmol/l的乙酸钠缓冲溶液，0.05% (m/v)的壳聚糖和0.01% (v/v)的苯扎溴铵。
77.本发明所述鼻喷雾剂具有以下特征：所述鼻喷雾剂在25℃的温度条件下稳定存在至少3个月，较佳地6个月；和/或在37
±
2℃的温度条件下稳定存在至少1个月，较佳地3个月。
78.其中，“稳定存在”是指所述制剂的外观、可见异物、蛋白含量、纯度、生物学活性等关键质量参数均无显著变化。
79.本发明的重组人干扰素λ1鼻喷雾剂是一种可用于治疗和/或预防病毒感染的制剂，因此，术语“重组人干扰素λ1鼻喷雾剂”和“抗病毒用重组人干扰素λ1鼻喷雾剂”可互换使用，均指本发明制备的含有重组人干扰素λ1作为活性成分的鼻喷雾形式的液体制剂。
80.重组人干扰素λ1鼻喷雾剂的制备方法本发明还提供了所述重组人干扰素λ1鼻喷雾剂的制备方法，包括以下步骤：(i) 提供纯化的重组人干扰素λ1原液；(ii) 将纯化的重组人干扰素λ1原液换液至乙酸盐缓冲液中，并添加苯扎溴铵和壳聚糖，过滤后即获得所述的重组人干扰素λ1鼻喷雾剂。
81.如步骤(i)中所述的重组人干扰素λ1原液是经过包括高密度发酵、包涵体制备、包
涵体复性、超滤及两步source 30s的纯化制备获得。具体地，包括以下步骤：(1) 将人干扰素λ1基因构建至大肠杆菌表达载体pet-28a( )上，并转导入大肠杆菌株bl21（de3）中，高密度发酵表达含有重组干扰素λ1的包涵体；(2) 破菌后收集包涵体，利用高盐缓冲液洗涤包涵体；(3) 选用含dtt的6mol/l盐酸胍溶解包涵体，溶解比例为1:20质量体积比，溶解后用6mol/l尿素稀释2～3倍后，以1:20的比例进一步稀释至含0.2～0.4mol/l精氨酸、1～4mmol/l 还原型谷胱甘肽、0.25～1mmol/l 氧化型谷胱甘肽、ph7.5的复性液中，2～10℃复性至少12小时；(4) 超滤换液至ph7.5,电导率低于5ms/cm的缓冲液后，利用含ph7.5的缓冲液进行第一轮source 30s纯化，并收集目的蛋白洗脱液；(5) 将第一轮source 30s纯化的目的蛋白洗脱液ph调节至5.0，利用含ph5.0的缓冲液进行第二轮source 30s纯化，并收集目的蛋白洗脱液；(6) 将步骤(5)中收集的目的蛋白洗脱液用截留量为100kda的超滤膜包超滤，收集透出液去除内毒素，从而获得纯化的重组人干扰素λ1原液。
82.重组人干扰素λ1鼻喷雾剂的用途和施用方法本发明还通过了所述重组人干扰素λ1鼻喷雾剂在制备用于治疗和/或预防病毒感染的药物中的用途。在本发明的一个优选实施方式中，所述病毒为呼吸道病毒，包括但不限于新冠病毒、西尼罗河病毒、水泡性口炎病毒。其中，所述新冠病毒包括但不限于新冠病毒野生型毒株、新冠病毒奥密克戎株ba.2。
83.本发明的重组人干扰素λ1鼻喷雾剂含有治疗有效量的重组人干扰素λ1，术语“治疗有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。该效果可通过例如抗原水平来检测。治疗效果也包括生理性症状的减少。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量。在本发明中，所述重组人干扰素λ1鼻喷雾剂中含有0.1～1mg/ml的重组人干扰素λ1，该含量在保证鼻喷雾剂中重组人干扰素λ1稳定性的基础上，可以满足施用时药物浓度。
84.本发明的重组人干扰素λ1鼻喷雾剂可以以喷鼻的方式单独施用从而治疗和/或预防病毒感染，同时，也可以与其他抗病毒剂，或其他治疗剂联合施用。
85.与常规鼻喷雾剂配方相比，本发明的创新点是开发了一种可广谱应用于抗呼吸道病毒的鼻喷雾剂，其主要优点包括：(1) 本发明的鼻喷雾剂含人干扰素λ1，相比于其它类型干扰素，该成分的作用局部特异性强、安全性高，同时可广谱应用于多种呼吸道病毒的治疗和/或预防；(2) 本发明的在鼻喷雾剂基础缓冲液中选择了相对较低的ph缓冲液(ph4.5-5.5)，区别于常规鼻喷雾剂的ph选择（ph6～8），有利于重组人干扰素λ1的稳定性，但不影响鼻喷雾使用；(3) 本发明的在鼻喷雾剂组合了最佳的生物粘附剂类型、浓度，最佳的抑菌剂类型、浓度，最佳的其它添加物组合选择，达到最佳的重组人干扰素λ1的稳定性、鼻喷后刺激性、抑菌效果，同时也最大程度降低了高浓度抑菌剂引起的毒副作用。
[0086] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york: cold spring harbor laboratory press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0087] 实施例实施例1：重组人干扰素λ1原液制备和检测选取野生型人干扰素λ1氨基酸序列，构建至大肠杆菌表达载体pet-28a( )上，并在bl21（de3）中，高密度发酵，通过iptg诱导37℃表达4小时，收集大肠杆菌菌体。利用高压匀浆法破菌后收集包涵体，利用含1mol/l氯化钠缓冲液洗涤包涵体。包涵体用含10mmol/l dtt的6mol/l盐酸胍溶解，溶解比例为1:20质量体积比，溶解后用6mol/l尿素稀释2倍后，以1:20的比例进一步稀释至含0.2mol/l精氨酸、1mmol/l还原型谷胱甘肽、0.25mmol/l氧化型谷胱甘肽、ph7.5的复性液中，2～10℃复性14小时。复性后超滤换液至20mm tris/hcl，ph7.5的缓冲液中，电导率低于5ms/cm后，利用含ph7.5的缓冲液进行第一轮source 30s纯化，并收集洗脱电导率约为20ms/cm左右的洗脱峰组分。利用10%乙酸将洗脱组分ph调整至5.0，用含ph5.0的乙酸钠缓冲液进行第二轮source 30s纯化，并收集洗脱电导率约为45ms/cm左右的洗脱峰组分。利用100kda超滤膜包超滤收集透出液去除内毒素，即为重组人干扰素λ1原液，进行含量、纯度、活性和杂质残留的检测，纯度详见图1中的a。
[0088]
重组人干扰素λ1活性突变体制备和检测方法同上，纯度详见图1中的b。
[0089]
实施例2：重组人干扰素λ1基础缓冲液筛选将实施例1中制备的重组人干扰素λ1原液分别利用超滤或配制的方式配制如下表1所示的候选基础缓冲液配方。分别开展37℃、25℃加速稳定性研究，分别鉴定可见异物、纯度、含量、生物学活性等项目，其中有显著区别的结果如表1所示：表1ph达到6.0后制剂配方的蛋白成分易发生聚集，同时也有一定的降解，导致纯度下降（如表1中的e），即该制剂配方ph不高于5.5。在基础缓冲液选择上，乙酸缓冲液略优于柠
檬酸缓冲液（如表1中的g和h）。而添加多种二价盐离子并组合聚山梨酯80和蔗糖，可能导致部分蛋白产生聚集（如表1中的d）。其余条件，例如中性盐、聚山梨酯80、蔗糖等添加物均不影响干扰素λ1的稳定性。
[0090]
实施例3：鼻喷雾剂辅料初步筛选（不含干扰素λ1）为测试鼻腔可接受的最佳鼻喷雾剂配方，本实施例根据实施例2结果，选择ph5.0, 25mm 乙酸缓冲溶液为基础缓冲液，按如下表2分别添加中性盐、聚山梨酯80及生物粘附剂。配制后分装至鼻喷瓶中，由10名志愿者测试并分别对气味性、刺激性等效果进行评分，评分越高，可接受度越高，满分为10分，统计评分结果见图2。
[0091]
表2通过评分结果显示，得出以下结论：（1）聚山梨酯80具有很明显的气味性，由于在不添加聚山梨酯80的条件下干扰素λ1已经具有较高的稳定性，因此，鼻喷雾剂中不添加该类具气味性的蛋白稳定性；（2）虽然常规生物大分子药物制剂中，保持一定的盐浓度具有一定的必要性，但是在鼻喷雾剂，盐浓度升高会增加一定的刺激性，因此，本制剂配方不添加中性盐；（3）在生物粘附剂比较中，卡拉胶具有明显的干燥感，可能导致鼻子瘙痒，羧甲基纤维素的可接受度也较高，不过刺激性最小的是壳聚糖。
[0092]
实施例4：抑菌剂筛选在本实施例中，首先筛选了3种鼻喷雾剂常见的抑菌剂，包括苯甲酸钠、苯甲醇、苯乙醇的抑菌效果，如表3所示；并分别利用金黄色葡萄糖球菌和白色念珠菌测试抑菌剂的抑菌效果，分别评估抑菌剂对原核微生物和真菌的抑菌效果。
[0093]
表3具体方法及结果：4.1 菌种菌液准备
金黄色葡萄球菌：胰酪大豆胨琼脂平板培养金黄色葡萄球菌，用无菌生理盐水冲洗平板表面收集金黄色葡萄球菌，然后稀释至适宜的浓度及体积。
[0094]
白色念珠菌：用沙氏葡萄糖琼脂平板培养白色念珠菌，用无菌生理盐水冲洗平板表面收集白色念珠菌，然后稀释至事宜的浓度及体积。
[0095]
4.2 测试抑菌溶液接菌种每个配方分别配制2管含对应浓度抑菌剂的培养基配方，两管分别接种金黄色葡萄球菌和白色念珠菌，混匀后20~25℃生化培养箱中培养。
[0096]
4.3 金黄色葡萄糖球菌测试接种培养7天后，取样先稀释5倍，再10倍梯度稀释至10-3
，取0.5ml加入至tsb平板计数培养24h，即10-4
梯度的计数结果。另1、2、3号样品计数10-3
梯度。同时对10号样品进行详细计数。结果如图3所示：(1) 对照组10号计数菌量：10
11
/ml(2) 1、2、3号稀释1000倍菌落数为：0，含菌量《103/ml抑菌效率降低大于8个lg(3) 4号样品含菌量5
×
106/ml，抑菌效率至少降4~5个lg(4) 5~9样品》107/ml，5、7抑菌效率小于4个lg(5) 6、8、9号抑菌效果不明显。
[0097]
4.4 白色念珠菌测试接种培养7天后，取样先稀释5倍，再10倍梯度稀释至10-3
，取0.5ml加入至沙氏葡萄糖琼脂平板计数培养48h，即10-6
梯度的计数结果。同时对1~10号样品进行详细计数。结果如图4所示，结果显示1~10号均稀释106，菌落数均在10~40之间，菌落数均为103/ml，1~9号试剂对白色念球菌无明显的抑菌效果。结果显示，1~10号均稀释106，菌落数均在10~40之间，菌落数均为103/ml，1~9号抑菌剂对白色念球菌无明显的抑菌效果。
[0098]
由于测试的以上3种抑菌剂对真菌的抑菌效果均不明显，因此，增加苯扎溴铵抑菌的考察，同时由于本品最终选择壳聚糖作为生物粘附剂，理论上壳聚糖也有一定的抑菌效果，因此，尝试不再加抑菌剂或组合其它抑菌剂（壳聚糖与苯甲醇组合或苯乙醇将导致干扰素λ1稳定性下降，详见实施例5），测试样品如表4所示，观察抑菌效果。
[0099]
表4抑菌效果如图5所示：金黄色葡萄球菌的抑菌效果检测显示，11、12、13、14号试剂原倍稀释接种菌种数量为0，对金黄色葡萄球菌均完全抑制，而15号可以降低6个lg，未达到完全抑制；白色念珠菌的抑菌效果检测显示，11号单独苯扎溴铵和15号单独的壳聚糖，均有一定的抑菌效果，但未达到几乎完全抑制，而12、13、14号试剂5倍稀释接种菌种数量为0，对白色念珠菌的几乎完全抑制，即便是将苯扎溴铵浓度降低至0.005%也可以达到相同的效果。
[0100]
本发明意外地发现苯扎溴铵和壳聚糖组合可以同时达到抑制原核微生物和真菌的最佳效果，由于壳聚糖是无毒的，而且苯扎溴铵毒性低，同时使用浓度较低，该组合的抑菌剂毒副作用低。
[0101]
实施例5：重组人干扰素λ1鼻喷雾剂组合测试确认通过实施例3和实施例4初步评估鼻喷剂辅料配方，包括生物粘附剂、抑菌剂等，本实施例进一步评估选用的辅料配方组合与重组人干扰素λ1的适用性。本实施例设计如表5所示配方，分别评估配制过程、配制后质量属性及稳定性进一步评估鼻喷雾剂配方设计的合理性。
[0102]
表中结果显示，（1）在含羧甲基纤维素的配方中，添加重组人干扰素λ1后蛋白易出现沉淀，因此该配方被排除（表5中o所示）；（2）含苯乙醇的制剂中，部分干扰素λ1蛋白性质出现变化，纯度下降（表5中m所示）；（3）在含苯甲醇的制剂中，加速处理1个月后，干扰素λ1出现降解，导致纯度下降（表5中n所示）；（4）干扰素λ1不可高于1mg/ml（表5中u所示），由于干扰素λ1的比活力高于106iu/mg，在鼻喷雾剂中单次喷出50μl的条件下，单次喷出的活性单位达到5万iu，可以满足药物浓度需求。
[0103]
综合以上结果，在0.05～0.2%的壳聚糖浓度范围以及0.005～0.02%苯扎溴铵浓度范围，均可以使鼻喷雾剂满足蛋白稳定及抑菌效果。
[0104]
表5实施例6：中试批鼻喷雾剂稳定性研究本研究利用中试批制备的重组人干扰素λ1原液，按配方：ph5.0, 25mm 乙酸缓冲溶液，0.05%壳聚糖，0.01%苯扎溴铵，0.5mg/ml 干扰素λ1配制三批鼻喷雾剂半成品，除菌过滤后分装至西林瓶中并开展稳定性研究。稳定性研究方案如下表6：表6
检测方法：(1) 外观及可见异物检查人员调节位置，使供试品位于眼部的明视距离处，供试品至人眼距离为25 cm。除去容器标签，擦净容器外壁。手持容器颈部，轻轻旋转和翻转容器，使药液中存在的可见异物悬浮，注意不使药液产生气泡，并分别在黑色和白色背景下，目视检查，重复3次，总时限为20s。
[0105]
检测供试品中，不得检出明显可见异物。如也未检出微细可见异物，判为符合规定。
[0106]
细微可见异物的说明：第一，白点，系指不能辨清平面或棱角的白色物体；第二，细小蛋白质絮状物或蛋白质颗粒，系指半透明的小于约1 mm的絮状沉淀或蛋白质颗粒；第三，少量絮状物或蛋白质颗粒，系指在规定检查时间中，较难计数的蛋白质絮状物或蛋白质颗粒；第四，微量沉积物，系指静置后供试品中的微小沉淀物，轻轻转动后有烟雾状沉淀浮起，轻摇即散失者；第五，摇不散的沉淀，系指久置后蛋白质溶液出现少量沉淀物，轻轻摇动后不能分散消失者。
[0107]
(2) 蛋白含量利用lowry法蛋白含量测定试剂盒，分别精密量取0.2 mg/ml、0.4 mg/ml、0.6 mg/ml、0.8 mg/ml、1.0 mg/ml标准蛋白质溶液6μl置于96孔板中，每种标准品做两个副孔，即每种标准品检测三次；各孔依次加30μl试剂a，摇匀；各孔依次加180μl试剂b，摇匀，室温放置10min，在波长750nm处测定od750吸光值。
[0108]
以标准蛋白质溶液的od750吸光值绘制标准曲线，取直线回归方程，将供试品的od750吸光值代入直线回归方程，即得供试品的蛋白质含量。
[0109]
(3) 纯度（sds-page）取供试品，与还原型上样缓冲液3:1混合后，沸水浴5 min。用15%的丙烯酰胺浓度的胶分析样品，200v电压恒压电泳45min。电泳结束后，可采用考马斯亮蓝染色法对凝胶中的蛋白条带进行显色，并扫描成像。计算分子量干扰素λ1条带占所有组分的比例即为纯度。
[0110]
(4) 纯度（sec-hplc）色谱柱：tsk g3000
①
供试品预处理取供试品，10000rpm离心10分钟后取上清。
[0111]
②
样品分析程序运行时间：40 min
数据记录时间：30min流速：0.5 ml/min取供试品上样，根据以上参数设置分析方法进行分析，分析结果利用软件计算目的蛋白峰面积占比。
[0112]
(5) 生物学活性病毒株：水泡性口炎病毒（vsv病毒）细胞株：人肝癌细胞（hepg2）检测原理：干扰素λ可以保护人肝癌细胞（hepg2）免受水泡性口炎病毒（vsv）破坏的作用，并对存活的hepg2细胞染色，在一定波长处测定其吸光度，获得干扰素λ对hepg2细胞的保护效应曲线，以此计算干扰素λ生物学活性。
[0113]
检测过程：利用含10�s的dmem培养基将hepg2细胞以一定的细胞浓度孵育至96孔板中，于37℃，5% co2培养箱中培养4~6小时。将待测样品用7�s的dmem培养基按一定比例稀释并加至细胞培养板中，继续培养18～24小时后，弃去细胞培养上清，加入一定滴度的vsv病毒，于37℃，5% co2培养箱中培养24小时。培养完成后弃去细胞培养板中的上清液，每孔加入染色液50μl，室温放置30分钟后，用流水小心冲去染色液，并吸干残留水分，每孔加入脱色液100μl，室温放置3~5分钟。将96孔板放入多功能酶标仪，混匀并以630nm为参比波长，在570nm波长处测定吸光度，记录测定结果并计算相对对照品的生物学活性。
[0114]
完成3个月稳定性研究后，总结研究结果，如表7所示。在所述的制剂成品3个月加速稳定性研究中，外观、可见异物、蛋白含量、纯度（sds-page）、纯度（sec-hplc）、生物学活性等关键质量参数均在质量可控范围内。
[0115]
表7实施例7：重组人干扰素λ1鼻喷雾剂抗新冠病毒原型株研究病毒：新冠病毒原型株细胞：转染血管紧张素转化酶2（ace2）的人宫颈癌细胞株（hela-ace2）操作步骤：将hela-ace2在96孔板中铺板后与含10μg/ml重组人干扰素λ1（野生型）的鼻喷雾剂（配方：ph5.0, 25mm 乙酸缓冲溶液，0.05%壳聚糖，0.01%苯扎溴铵）稀释液孵育20小时后，加入新冠病毒孵育24小时，固定后分别利用新冠康复患者血清检测细胞上清和细胞中的病毒，如图6所示。
[0116]
结果显示，相比对照组，添加含10μg/ml重组人干扰素λ1的鼻喷雾剂的细胞上清与细胞含病毒量均显著下降，该结果说明重组含干扰素λ1鼻喷雾剂可以显著抑制新冠病毒原型株的复制。
[0117] 实施例8：重组人干扰素λ1鼻喷雾剂抗新冠病毒奥密克戎株研究
病毒：新冠病毒奥密克戎株ba.2细胞：人肺腺癌细胞株（calu-3）操作步骤：将calu-3在96孔板中铺板后与分别含10、100、1000ng/ml重组人干扰素λ1（野生型）的鼻喷雾剂（配方：ph5.0, 25mm 乙酸缓冲溶液，0.05%壳聚糖，0.01%苯扎溴铵）稀释液孵育20小时后，加入新冠病毒孵育24小时，分别检测calu-3细胞的病变率，如图7所示。
[0118]
结果显示，添加重组人干扰素λ1鼻喷雾剂可以显著抑制新冠病毒奥密克戎株对细胞的杀伤作用，起到保护细胞的作用。
[0119] 实施例9：干扰素λ1鼻喷雾剂抗西尼罗河病毒研究病毒：西尼罗河病毒细胞：人肝癌细胞株（huh-7）操作步骤：将huh-7在96孔板中铺板后与含10μg/ml重组人干扰素λ1活性突变体的鼻喷雾剂（配方：ph5.0, 25mm 乙酸缓冲溶液，0.05%壳聚糖，0.01%苯扎溴铵）稀释液孵育20小时后，加入新冠病毒孵育24小时，固定后分别利用病毒特异性抗体检测细胞上清和细胞中的病毒，如图8所示。
[0120]
结果显示，相比对照组，添加含10μg/ml重组人干扰素λ1活性突变体的鼻喷雾剂的细胞上清与细胞含病毒量均显著下降，该结果说明含重组人干扰素λ1活性突变体的鼻喷雾剂可以显著抑制西尼罗河病毒的复制。
[0121] 实施例10：干扰素λ1鼻喷雾剂可以显著降低k18-ace2转基因小鼠新冠病毒感染率及感染后载量病毒：新冠病毒sars-cov-2 omicron ba.2突变株动物模型：k18-hace2转基因小鼠选取9-10周龄的k18-hace2转基因小鼠，共40只，分为五组（空白组；阴性对照组，感染病毒，不给药；低剂量组，感染病毒，2μg干扰素λ1；中剂量组，感染病毒，5μg干扰素λ1；高剂量组，感染病毒，20μg干扰素λ1），每组8只小鼠。将2μg干扰素λ1、5μg干扰素λ1和20μg干扰素λ1分别溶于50μl鼻喷雾剂稀释液。各组小鼠按组别剂量设置分别在攻毒前24、12和攻毒后12和24小时给药，给药方式为小鼠麻醉后鼻腔内给药。攻毒方式为麻醉后鼻内接种，病毒接种滴度为103。攻毒5天后分别取小鼠的鼻甲、肺和脑组织，采用荧光定量pcr方法检测各组织的新冠病毒载量，检测时以gapdh为内参。结果如图所示，2、5、20μg剂量干扰素λ1均可以显著抑制鼻甲、肺和脑组织新冠病毒的载量，检测结果为阴性比例高，感染率显著降低。
[0122]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。