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一种i-CS/HAp-NK复合体及其制备方法和应用

2023-01-06 02:57:43 来源:中国专利 TAG:
一种i-cs/hap-nk复合体及其制备方法和应用
技术领域
:1.本发明属于材料合成和生物医药
技术领域
:,具体涉及一种i-cs/hap-nk复合体及其制备方法和应用。
背景技术
::2.公开该
背景技术
:部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解,而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。3.近年来,肿瘤发病率呈现持续上升的态势,死亡率居高不下。临床上一般采用包括手术治疗、放疗、化疗等的综合治疗方案。随着对癌症发病机制的深入了解,免疫治疗已成为肿瘤综合治疗的重要手段之一。目前,过继免疫细胞治疗、免疫检查点分子等多种免疫治疗方法在临床研究得到肯定,成为肿瘤治疗有潜力的新领域。4.自然杀伤(naturalkiller,nk)细胞是一种很有前途的癌症免疫治疗工具。nk细胞是天然免疫系统的重要组成部分,也是肿瘤免疫监测的关键。nk细胞通过细胞毒途径和产生细胞因子直接杀伤肿瘤细胞,杀伤作用更快更强,产生持续的抗肿瘤免疫反应。肿瘤中低氧、低营养的微环境导致nk细胞功能耗竭、数目减少,与肿瘤的发展密切相关。目前多数临床研究将nk细胞免疫疗法集中于血液瘤,而在实体瘤临床研究中nk细胞过继转输治疗效果并不理想。因此,开发一种能够提升肿瘤微环境中nk细胞存活能力和效应功能的策略和方案将具有重要的临床应用价值。5.nk细胞的效应功能依赖于nk细胞活化信号和抑制信号之间的平衡。活化受体是调节nk细胞功能的关键因素,其中nkg2d和4-1bb是nk细胞上主要的活化受体之一。细胞因子也在nk细胞激活、成熟和增殖中发挥重要作用,例如,il-21可以促进nk细胞的激活,il-2用于维持nk细胞的存活。因此,基于nk细胞表面的活化性受体和细胞因子设计联合激活nk细胞有望为实体瘤治疗提供新策略。技术实现要素:6.为了解决现有技术的不足,本发明的目的是提供一种i-cs/hap-nk复合体及其制备方法和应用。本发明基于羟基磷灰石纳米线的细胞因子吸附能力和抗体结合性能,联合温敏水凝胶在体内的缓释优势,制备了一种可实现nk细胞缓释、激活的i-cs/hap-nk复合物,体内外实验证实具有良好的抗肿瘤能力,有望为应用于实体肿瘤的治疗。7.为了实现上述目的,本发明是通过如下的技术方案来实现:第一方面,本发明提供了一种i-cs/hap-nk复合体的制备方法,包括以下步骤:分别利用细胞因子和抗体修饰羟基磷灰石纳米线,得到细胞因子修饰的羟基磷灰石纳米线和抗体修饰的羟基磷灰石纳米线;将细胞因子修饰的羟基磷灰石纳米线和抗体修饰的羟基磷灰石纳米线按质量比1:1-3混合,与nk细胞共培养36-60h,离心后使用pbs重悬获得沉淀,与温敏水凝胶溶液混匀,置于36-37℃,得到i-cs/hap-nk复合体。8.第二方面,本发明提供了一种i-cs/hap-nk复合体,由上述i-cs/hap-nk复合体的制备方法获得。9.第三方面,本发明提供了上述i-cs/hap-nk复合体在制备治疗肿瘤药物中的应用。10.上述本发明的一种或多种技术方案取得的有益效果如下:(1)本发明提供的i-cs/hap-nk复合体可实现nk细胞缓释,促进nk细胞的活化水平和功能效应,体内外实验证实具有良好的抗肿瘤能力,有望为应用于实体肿瘤的治疗;(2)温敏水凝胶在低温下保持液态,在人体体温下转变为固态,可以实现对nk细胞的有效包裹;(3)羟基磷灰石纳米线可以物理吸附细胞因子,从而实现细胞因子的释放,促进nk细胞活化;经过氨基化处理后,羟基磷灰石纳米线可以通过氨基-羧基作用与抗体稳定连接,调节nk细胞功能。附图说明11.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。12.图1为实施例1中温敏水凝胶冷冻干燥后的扫描电镜图(a)和在不同温度下的宏观照片(b);图2为实施例1中羟基磷灰石纳米线的扫描电镜图;图3为实施例1中羟基磷灰石纳米线(i)、氨基修饰的羟基磷灰石纳米线(ii)、抗体α-nkg2d和α-4-1bb修饰的羟基磷灰石纳米线(iii)的红外谱图;图4为实施例1中细胞因子白细胞介素-2、白细胞介素-21修饰的羟基磷灰石纳米线释放白细胞介素-2(a)、白细胞介素-21(b)的浓度时间曲线图和hapb释放igg(c)的浓度时间曲线图;图5为实施例1中羟基磷灰石与自然杀伤细胞的共聚焦结果图;图6为实施例1中自然杀伤细胞细胞凋亡水平图;图7为实施例1中自然杀伤细胞活/死染色结果图;图8为实施例1中自然杀伤细胞释放数量-时间曲线图;图9为实施例1中用于表明自然杀伤细胞活化水平的cd69(a)和用于表明自然杀伤细胞效应功能的干扰素γ(b)、穿孔素(c)、颗粒酶b(d)的含量对比图;图10为实施例1中肿瘤抑制实验的各组小鼠第七天和第十四天时的活体自发光图像;图11为实施例1中肿瘤抑制实验的各组小鼠第七天(a)和第十四天(b)时的肿瘤负荷图;图12为实施例1中肿瘤抑制实验的指标对比图,其中,a为肿瘤浸润自然杀伤细胞比例对比图,b为干扰素γ表达对比图,c为cd69表达对比图,d为穿孔素表达对比图,e为ki67表达对比图,f为颗粒酶b表达对比图。具体实施方式13.应该指出,以下详细说明都是示例性的,旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属
技术领域
:的普通技术人员通常理解的相同含义。14.需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。15.名词解释:pbs溶液为磷酸缓冲盐溶液,nk细胞为自然杀伤细胞,il-2为白细胞介素-2,il-21为白细胞介素-21,edc为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺,sulfo-nhs为n-羟基硫代琥珀酰亚胺,fbs为胎牛血清,hbs为hank's平衡盐溶液,hap-nk为羟基磷灰石-自然杀伤细胞,i-cs/hap-nk为可注射的水凝胶-羟基磷灰石-自然杀伤细胞(i为可注射的,injectable),ifn-γ为干扰素γ,pfn为穿孔素,gzmb为颗粒酶b,tink为肿瘤浸润自然杀伤细胞。16.本发明的第一种典型实施方式,一种i-cs/hap-nk复合体的制备方法,包括以下步骤:分别利用细胞因子和抗体修饰羟基磷灰石纳米线,得到细胞因子修饰的羟基磷灰石纳米线和抗体修饰的羟基磷灰石纳米线;将细胞因子修饰的羟基磷灰石纳米线和抗体修饰的羟基磷灰石纳米线按质量比1:1-3混合,与nk细胞共培养36-60h,离心后使用pbs重悬获得沉淀,与温敏水凝胶溶液混匀,置于36-37℃,得到i-cs/hap-nk复合体。17.该实施方式的一种或多种实施例中,所述羟基磷灰石纳米线的制备方法为:将naoh、cacl2和nah2po4·2h2o依次加入到水和乙醇的混合物中,加热,冷却到室温后离心得到所述羟基磷灰石纳米线。18.该实施方式的一种或多种实施例中,naoh的质量为0.3-0.8g,cacl2的质量为0.1-0.2g,nah2po4·2h2o的质量为0.15-0.3g。19.该实施方式的一种或多种实施例中,加热温度为200-250℃,加热时间为36-60h。20.该实施方式的一种或多种实施例中,所述细胞因子修饰的羟基磷灰石纳米线的制备方法为:将羟基磷灰石纳米线用pbs溶液重悬,加入细胞因子后,置于四度摇床10-14h,离心重悬后得到细胞因子修饰的羟基磷灰石纳米线。21.该实施方式的一种或多种实施例中,所述细胞因子为il-2、il-21中的一种或多种。22.il-21可以促进nk细胞的激活,il-2用于维持nk细胞的存活,利用细胞因子修饰可以有效促进nk细胞的激活。23.该实施方式的一种或多种实施例中,还包括抗体修饰的羟基磷灰石纳米线的制备方法:羟基磷灰石纳米线与3-氨基丙基三乙氧基硅烷在乙醇的水溶液中混合,将混合物的ph值调节到9-11,搅拌离心后得到氨基化的羟基磷灰石纳米线;氨基化的羟基磷灰石纳米线与edc和sulfo-nhs溶液在ph值为中性的条件下孵育30min之后,将抗体加入混合物中孵育,得到抗体修饰的羟基磷灰石纳米线;该实施方式的一种或多种实施例中,所述抗体为α-nkg2d、α-4-1-bb中的一种或多种。24.使用抗体对羟基磷灰石纳米线进行修饰,使得复合体可以稳定结合抗体,与对应活化受体相结合,从而调节nk细胞功能。25.羟基磷灰石纳米线具有较长的长度和较小的宽度,为其提供了较大的比表面积,可以通过物理吸附作用吸附细胞因子。经过氨基修饰的羟基磷灰石纳米线通过氨基-羧基反应,可以与抗体稳定连接。26.该实施方式的一种或多种实施例中,还包括温敏水凝胶溶液的制备方法:将壳聚糖溶液与β-甘油磷酸钠溶液在冰浴中混合,得到所述温敏水凝胶溶液。27.该实施方式的一种或多种实施例中,所述壳聚糖溶液通过壳聚糖溶于0.1m醋酸溶液得到,所述壳聚糖溶液的质量浓度为1-3%。28.温敏水凝胶可以根据温度变化实现相态变化,在人体体温下形成固态凝胶,有利于包裹nk细胞。29.该实施方式的一种或多种实施例中,所述β-甘油磷酸钠溶液为β-甘油磷酸钠的水溶液,所述β-甘油磷酸钠溶液的质量浓度为40-60%。30.该实施方式的一种或多种实施例中,所述壳聚糖溶液和β-甘油磷酸钠溶液的体积比为4:1-6:1。31.该实施方式的一种或多种实施例中,细胞因子修饰的羟基磷灰石纳米线和抗体修饰的羟基磷灰石纳米线的混合比例为1:2。32.该实施方式的一种或多种实施例中,共培养时间为48h。33.本发明的第二种典型实施方式,一种i-cs/hap-nk复合体,由上述i-cs/hap-nk复合体的制备方法获得。34.本发明的第三种典型实施方式,上述i-cs/hap-nk复合体在制备治疗肿瘤药物中的应用。35.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案,以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。36.实施例1取小鼠脾脏研磨成组织悬液,离心后加入红细胞裂解液,离心后得到脾脏单个核细胞。利用磁珠纯化试剂盒分选nk细胞,培养于α-mem 12.5�s 12.5%hbs 0.2mm肌醇 0.1mm2-巯基乙醇 0.02mm叶酸 100u/ml重组人il-2的完全培养基中,用于后续试验。37.将壳聚糖粉溶于0.1m醋酸溶液中得到2%壳聚糖溶液(cs溶液),β-甘油磷酸钠粉在水中溶解得到50%的β-甘油磷酸钠溶液(gp溶液)。之后将2%cs溶液和50%gp溶液按5:1的比例在冰浴中混合,制得温敏水凝胶(cs)。如图1a所示,扫描电子显微镜(sem)结果显示,冷冻干燥后的水凝胶呈多孔状。如图1b所示,在4℃时,温敏水凝胶呈液态;当环境温度升高至37℃时,形成固态水凝胶,有利于包裹细胞。38.将0.5gnaoh、176mgcacl2和230mgnah2po4·2h2o依次加入到水和乙醇的混合物中,220℃加热48h,冷却到室温后离心,得到羟基磷灰石纳米线(hap)。如图2所示,扫描电子显14(第十四天)实验组的肿瘤负荷均有明显下降,表明i-cs/hap-nk复合体能够明显降低肿瘤负荷。取出肿瘤后研磨,如图12a所示,i-cs/hap-nk复合体肿瘤浸润nk细胞的比例高,图12c表明i-cs/hap-nk复合体促进cd69表达提升,增强nk细胞体内活化水平。图12e表明i-cs/hap-nk复合体可以提高增殖指标ki67,促进nk细胞体内增殖。图12b、d、f表明i-cs/hap-nk复合体组的ifn-γ(图12b)、pfn(图12d)、gzmb(图12f)的表达更高,表明i-cs/hap-nk复合体可提高nk细胞体内效应功能。上述指标的提高表明了i-cs/hap-nk复合体可以在体内抑制肿瘤。45.实施例2取小鼠脾脏研磨成组织悬液,离心后加入红细胞裂解液,离心后得到脾脏单个核细胞。利用磁珠纯化试剂盒分选nk细胞,培养于α-mem 12.5�s 12.5%hbs 0.2mm肌醇 0.1mm2-巯基乙醇 0.02mm叶酸 100u/ml重组人il-2的完全培养基中,用于后续试验。46.将壳聚糖粉溶于0.1m醋酸溶液中得到2%壳聚糖溶液(cs溶液),β-甘油磷酸钠粉在水中溶解得到50%的β-甘油磷酸钠溶液(gp溶液)。之后将2%cs溶液和50%gp溶液按5:1的比例在冰浴中混合,制得温敏水凝胶(cs)。47.将0.5gnaoh、176mgcacl2和230mgnah2po4·2h2o依次加入到水和乙醇的混合物中,220℃加热48h,冷却到室温后离心,得到羟基磷灰石纳米线(hap)。48.将羟基磷灰石纳米线用pbs溶液重悬,加入细胞因子il-2、il-21后,置于四度摇床11h,离心重悬后得到细胞因子il-2、il-21修饰的羟基磷灰石纳米线,记为hapa。hap与3-氨基丙基三乙氧基硅烷在乙醇的水溶液中混合,将混合物的ph值调节到9,搅拌离心后得到hap-nh2。所制备的hap-nh2纳米线与edc和sulfo-nhs溶液在ph值为7的条件下孵育30min。之后,将α-nkg2d和α-4-1bb加入混合物中孵育,得到抗体α-nkg2d和α-4-1bb修饰的羟基磷灰石纳米线(hapb)。49.hapa:hapb以质量比1:1的比例与1×106个nk细胞共培养18h,离心后用pbs重悬hap-nk沉淀,加入cs溶液混匀后置于37℃,获得i-cs/hap-nk复合体。50.实施例3取小鼠脾脏研磨成组织悬液,离心后加入红细胞裂解液,离心后得到脾脏单个核细胞。利用磁珠纯化试剂盒分选nk细胞,培养于α-mem 12.5�s 12.5%hbs 0.2mm肌醇 0.1mm2-巯基乙醇 0.02mm叶酸 100u/ml重组人il-2的完全培养基中,用于后续试验。51.将壳聚糖粉溶于0.1m醋酸溶液中得到2%壳聚糖溶液(cs溶液),β-甘油磷酸钠粉在水中溶解得到50%的β-甘油磷酸钠溶液(gp溶液)。之后将2%cs溶液和50%gp溶液按5:1的比例在冰浴中混合,制得温敏水凝胶(cs)。52.将0.5gnaoh、176mgcacl2和230mgnah2po4·2h2o依次加入到水和乙醇的混合物中,220℃加热48h,冷却到室温后离心,得到羟基磷灰石纳米线(hap)。53.将羟基磷灰石纳米线用pbs溶液重悬,加入细胞因子il-2、il-21后,置于四度摇床14h,离心重悬后得到细胞因子il-2、il-21修饰的羟基磷灰石纳米线,记为hapa。hap与3-氨基丙基三乙氧基硅烷在乙醇的水溶液中混合,将混合物的ph值调节到11,搅拌离心后得到hap-nh2。所制备的hap-nh2纳米线与edc和sulfo-nhs溶液在ph值为7的条件下孵育30min。之后,将α-nkg2d和α-4-1bb加入混合物中孵育,得到抗体α-nkg2d和α-4-1bb修饰的羟基磷灰石纳米线(hapb)。54.hapa:hapb以质量比1:3的比例与1×106个nk细胞共培养28h,离心后用pbs重悬hap-nk沉淀,加入cs溶液混匀后置于36.5℃,获得i-cs/hap-nk复合体。55.实施例4取小鼠脾脏研磨成组织悬液,离心后加入红细胞裂解液,离心后得到脾脏单个核细胞。利用磁珠纯化试剂盒分选nk细胞,培养于α-mem 12.5�s 12.5%hbs 0.2mm肌醇 0.1mm2-巯基乙醇 0.02mm叶酸 100u/ml重组人il-2的完全培养基中,用于后续试验。56.将壳聚糖粉溶于0.1m醋酸溶液中得到1%壳聚糖溶液(cs溶液),β-甘油磷酸钠粉在水中溶解得到60%的β-甘油磷酸钠溶液(gp溶液)。之后将1%cs溶液和60%gp溶液按6:1的比例在冰浴中混合,制得温敏水凝胶(cs)。57.将0.4gnaoh、150mgcacl2和200mgnah2po4·2h2o依次加入到水和乙醇的混合物中,220℃加热48h,冷却到室温后离心,得到羟基磷灰石纳米线(hap)。58.将羟基磷灰石纳米线用pbs溶液重悬,加入细胞因子il-2、il-21后,置于四度摇床12h,离心重悬后得到细胞因子il-2、il-21修饰的羟基磷灰石纳米线,记为hapa。hap与3-氨基丙基三乙氧基硅烷在乙醇的水溶液中混合,将混合物的ph值调节到9,搅拌离心后得到hap-nh2。所制备的hap-nh2纳米线与edc和sulfo-nhs溶液在ph值为7的条件下孵育30min。之后,将α-nkg2d和α-4-1bb加入混合物中孵育,得到抗体α-nkg2d和α-4-1bb修饰的羟基磷灰石纳米线(hapb)。59.hapa:hapb以质量比1:2的比例与1×106个nk细胞共培养28h,离心后用pbs重悬hap-nk沉淀,加入cs溶液混匀后置于36.5℃,获得i-cs/hap-nk复合体。60.实施例5取小鼠脾脏研磨成组织悬液,离心后加入红细胞裂解液,离心后得到脾脏单个核细胞。利用磁珠纯化试剂盒分选nk细胞,培养于α-mem 12.5�s 12.5%hbs 0.2mm肌醇 0.1mm2-巯基乙醇 0.02mm叶酸 100u/ml重组人il-2的完全培养基中,用于后续试验。61.将壳聚糖粉溶于0.1m醋酸溶液中得到3%壳聚糖溶液(cs溶液),β-甘油磷酸钠粉在水中溶解得到40%的β-甘油磷酸钠溶液(gp溶液)。之后将1%cs溶液和60%gp溶液按4:1的比例在冰浴中混合,制得温敏水凝胶(cs)。62.将0.6gnaoh、176mgcacl2和250mgnah2po4·2h2o依次加入到水和乙醇的混合物中,220℃加热48h,冷却到室温后离心,得到羟基磷灰石纳米线(hap)。63.将羟基磷灰石纳米线用pbs溶液重悬,加入细胞因子il-2、il-21后,置于四度摇床12h,离心重悬后得到细胞因子il-2、il-21修饰的羟基磷灰石纳米线,记为hapa。hap与3-氨基丙基三乙氧基硅烷在乙醇的水溶液中混合,将混合物的ph值调节到9,搅拌离心后得到hap-nh2。所制备的hap-nh2纳米线与edc和sulfo-nhs溶液在ph值为7的条件下孵育30min。之后,将α-nkg2d和α-4-1bb加入混合物中孵育,得到抗体α-nkg2d和α-4-1bb修饰的羟基磷灰石纳米线(hapb)。64.hapa:hapb以质量比1:2的比例与1×106个nk细胞共培养24h,离心后用pbs重悬hap-nk沉淀,加入cs溶液混匀后置于36.5℃,获得i-cs/hap-nk复合体。65.以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12当前第1页12
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