通过饲料预防病毒传播的制作方法

1.本发明处理饲料中病毒病原体的威胁。


背景技术：

2.已经提出饲料和饲料成分是在商业猪群中引入猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,pedv)的促成因素。这种感染途径已经在实验环境中被证明是可能的(dee等人，“an evaluation of contaminated complete feed as a vehicle for porcine epidemic diarrhea virus infection ofpigs following consumption via natural feeding behavior:proof of concept”bmc veterinary research,2014；10:176)。
3.猪健康信息中心(swine health information center,shic)、国家猪肉委员会、国家猪肉生产商委员会和美国猪兽医协会建议增加更多的保持时间，以确保饲料中的病毒降解。对于常规豆粕，他们建议于4℃保持143天以实现99.99％的降解(猪健康信息中心，2019年5月7日发布的“research on viral transmission in feedstuffs yields,new information”)。
4.wo 2011/017367公开了含有与壬酸混合的缓冲丙酸或乙酸的抗微生物组合物。wo 2016/081716的实施方式公开了动物饲料，所述动物饲料包含约0.01重量％至约5重量％的中链脂肪酸和精油混合物的组合。gebhardt等人评定了在喷雾干燥的猪血浆和猪妊娠饮食中包含0.5％的苯甲酸、包含0.02％的精油产品以及它们的组合(gebhardt等人，“determining the impact of commercial feed additives as potential porcine epidemic diarrhea virus mitigation strategies as determined by polymerase chain reaction analysis and bioassay”,translational animal science，2019年1月1日，(1):134-142；引言中的引文)。
5.是一种市售产品，其据称对抗饲料和/或成分中的病毒病原体。这种产品的供应商建议每公吨饲料的包含率为4kg，对应于0.4重量％。如果农场主遵循这一建议，则饲料成本每公吨饲料增加约19.8美元。因为肉类行业对成本非常敏感，每公吨19.8美元的附加成本可能会令人望而却步。
6.需要更便宜和/或更有效的解决方案。


技术实现要素：

7.当对抗饲料中的病毒病原体时，人们会假设混合物浓度的显著增加和/或时间的增加会增加治疗的有效性。如果使用苯甲酸、丁子香酚和百里香酚的混合物，则情况就不一定如此。
8.为了减轻猪流行性腹泻病毒(pedv)，gebhardt等人教导使用包含0.5％的苯甲酸和包含0.02％的精油产品。令人惊讶的是，如果与苯甲酸组合使用的精油包含丁子香酚和百里香酚，则较低的浓度就足够了。本发明的一个实施方式涉及一种抑制动物饲料中的猪
流行性腹泻病毒的方法，其中将苯甲酸、丁子香酚和百里香酚以基于饲料总重量小于0.5重量％的总量添加到动物饲料中。本发明的一个优选实施方式涉及一种抑制动物饲料中的猪流行性腹泻病毒的方法，其中苯甲酸以基于饲料总重量0.25重量％至0.475重量％的量添加到动物饲料中，和/或其中包含丁子香酚和百里香酚的粉末以基于饲料总重量0.010重量％至0.019重量％的量添加。与丁子香酚和百里香酚相比，商购可得的苯甲酸片相对便宜。因此，所要求保护的解决方案比仅包含较高水平的精油的现有技术解决方案更便宜。
9.同样低的浓度也有效缓和猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,prrsv)和塞内卡病毒a(seneca virus a,sva)。本发明的一个实施方式涉及一种抑制动物饲料中的prrs病毒和/或sva的方法，其中将苯甲酸、丁子香酚和百里香酚以基于饲料总重量小于0.5重量％的总量添加到动物饲料中。一个优选实施方式涉及一种抑制动物饲料中的prrs病毒和/或sva的方法，其中苯甲酸以基于饲料总重量0.25重量％至0.475重量％的量添加到动物饲料中，和/或其中包含丁子香酚和百里香酚的粉末以基于饲料总重量0.010重量％至0.019重量％的量添加。
10.尽管向饲料中添加基于饲料总重量小于0.5重量％的总量的苯甲酸、丁子香酚和百里香酚有效缓和了所有三种病毒(即prrsv病毒、sva病毒和pedv病毒)，但是该混合物在这种浓度下比作用于prrsv和sva更快地作用于pedv。缓和速度是非常有益的，因为它允许减少猪健康信息中心(shic)和其他机构推荐的保持时间。本发明的一个优选实施方式涉及包含苯甲酸、丁子香酚和百里香酚的混合物用于减少施加以允许降解动物饲料中的猪流行性腹泻病毒所需的保持时间的用途。
11.pcr(聚合酶链式反应)测试已被证明是对prrsv和pedv敏感的。本发明的一个实施方式涉及一种制备饲料的计算机实施的方法，所述方法包括以下步骤：
12.a)提供至少一种饲料成分的样本，以及通过实时定量逆转录聚合酶链式反应来确定至少一种预定病毒的ct值；
13.b)提供模型，所述模型限定在饲料成分被病毒污染的情况下ct值在范围内；
14.c)使用所述模型来确定是否需要将用于灭活病毒的缓和剂添加到包含步骤a)的饲料成分的饲料中。
15.ct值代表循环分数，其中仪器可以首先检测来源于扩增反应的荧光(阈值循环)，如例如在bustin,s.a.,&mueller,r.(2005),“real-time reverse transcription pcr(qrt-pcr)and its potential use in clinical diagnosis”clinical science,109(4),365-379中进一步解释的。如果ct值“在范围内”，则病毒的数量高到足以通过实时定量逆转录聚合酶链式反应容易地检测到。如果ct值“在范围外”，则病毒的数量为零或低到病毒不会造成任何危害。对于本文所讨论的病毒，ct值≥38是不存在相应病毒的指示。ct值≤37是存在相应病毒的指示。
具体实施方式
16.本发明尤其涉及一种用于确定向饲料中添加缓和剂以灭活可能存在于旨在制备所述饲料的饲料成分中的病毒的需求的计算机实现的方法。优选的缓和剂是包含苯甲酸片和粉末的混合物，所述粉末包含丁子香酚和百里香酚。所述混合物即使仅以低浓度添加到饲料中时也能快速灭活病毒。这尤其适用于(但不仅限于)猪流行性腹泻病毒(pedv)。因此，
通过本发明，使得动物饲料不含有害的病毒rna。
17.本发明的动物饲料
18.本发明的动物饲料可以优选是用于鸟、鱼或哺乳动物的饲料。在本发明的一个优选实施方式中，动物饲料是猪饲料。猪饲料的典型成分是经研磨的玉米或其他谷物，以及大豆或其他植物源蛋白质产品。
19.本发明的动物饲料包含苯甲酸、丁子香酚和百里香酚，使得其优选不含病毒rna(核糖核酸)。优选地，“不含病毒rna”是指相应ct值为38或更高。更优选地，这意味着通过实时定量逆转录聚合酶链式反应不能检测到病毒rna。
20.本发明优选地涉及选自由以下项组成的组的病毒：猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和塞内卡病毒。如在本发明的上下文中所使用的，“猪流行性腹泻病毒”、ped病毒和pedv是同义词。如在本发明的上下文中所使用的，猪繁殖与呼吸综合征病毒、prrs病毒和prrsv是同义词。如在本发明的上下文中所使用的，塞内卡病毒a和sva是同义词。因此，“不含病毒rna”优选意指通过实时定量逆转录聚合酶链式反应检测不到来自pedv、prrs和/或sva的病毒rna。当存在多种病毒毒株时，所有毒株都被包括在内。在prrsv的情况下，优选的毒株是prrsv 174。在一些美国的养猪地区，这种prrsv毒株相当普遍；它被认为是剧毒和严重的。
21.在一些实施方式中，术语“病毒rna”优选不指来自塞内卡病毒a的病毒rna，因为在sva的情况下，pcr可能给出假阳性结果。在此实施方式中，“不含病毒rna”优选是指通过实时定量逆转录聚合酶链式反应检测不到来自pedv和prrs的病毒rna。
22.本发明的动物饲料包含基于饲料总重量，总量优选小于0.5重量％，更优选小于0.4重量％的苯甲酸、丁子香酚和百里香酚。在最优选的实施方式中，本发明的动物饲料包含苯甲酸片和粉末，所述粉末包含丁子香酚和百里香酚，其中基于饲料总重量，苯甲酸片和所述粉末的总量为0.312重量％。
23.在另一个实施方式中，本发明的动物饲料包含：
[0024]-基于饲料总重量，0.25重量％至0.475重量％，优选0.25重量％至0.4重量％，最优选0.25重量％至0.39重量％的苯甲酸，以及
[0025]-基于饲料总重量，0.010重量％至0.019重量％的粉末，其中所述粉末包含丁子香酚和百里香酚，并且
[0026]
其中苯甲酸与丁子香酚之间的重量比为优选至少500:1，更优选至少833:1并且优选至多2500:1，和/或其中苯甲酸与百里香酚之间的重量比为优选至少250:1，更优选至少333:1并且优选至多为500:1。
[0027]
在一个实施方式中，本发明的动物饲料包含苯甲酸和粉末，其中所述粉末包含丁子香酚和百里香酚以及优选地至少一种辅助化合物。此类粉末是在nutritional products(switzerland)商购可得的。在一个优选的实施方式中，本发明的动物饲料包含苯甲酸片和粉末，其中所述粉末包含丁子香酚、百里香酚和至少一种辅助化合物，并且其中所述粉末包含基于粉末总重量，优选10重量％至60重量％，更优选10重量％至53重量％，最优选10重量％至30重量％的辅助化合物。丁子香酚和百里香酚优选与饲料成分和任何可能存在的病毒物理接触。因此，包含丁子香酚、百里香酚和至少一种辅助化合物的粉末优选不进行包衣。因此，包含丁子香酚、百里香酚和至少一种辅助化合物的粉末优选包含少于5重
量％的完全氢化脂肪、部分氢化脂肪和/或未氢化脂肪。在这些实施方式中，优选添加基于饲料总重量，0.25重量％至0.475重量％的苯甲酸。这种粉末优选以基于饲料总重量0.010重量％至0.019重量％的总量添加。苯甲酸片是在nutritional products(switzerland)商购可得的。
[0028]
本发明的方法
[0029]
本发明还涉及一种抑制动物饲料中的病毒的方法，其中将苯甲酸(优选苯甲酸片)和包含丁子香酚和百里香酚的粉末以基于饲料总重量优选小于0.5重量％的总量，更优选小于0.48重量％的总量添加到动物饲料中。这种方法适用于抑制任何种类的潜在有害病毒。在一个优选实施方式中，本发明涉及一种抑制猪流行性腹泻病毒、抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒或抑制无包膜rna病毒例如塞内卡病毒a的方法。在最优选的实施方式中，本发明涉及一种抑制猪流行性腹泻病毒的方法。在所述方法中，优选向饲料中添加基于饲料总重量0.25重量％至0.475重量％的苯甲酸，而包含丁子香酚和百里香酚的粉末优选以基于饲料总重量0.010重量％至0.019重量％的量添加。
[0030]
在动物饲料中，苯甲酸、丁子香酚和百里香酚的组合优选与饲料成分和任何可能存在的病毒物理接触。因此，包含丁子香酚和百里香酚的粉末应该优选不进行脂质包衣。包含丁子香酚和百里香酚的粉末优选不是球粒。如在本发明方法中所使用的包含丁子香酚和百里香酚的粉末包含基于粉末总重量，优选小于5重量％，更优选小于4重量％，甚至更优选小于3重量％的完全氢化的、部分氢化的和/或未氢化的脂肪。其他辅助化合物例如填充剂和助流剂是可接受的。如在本发明方法中使用的包含丁子香酚和百里香酚的粉末包含基于粉末总重量，优选1重量％至50重量％，更优选5重量％至40重量％，最优选10重量％至30重量％的辅助化合物。
[0031]
本发明的用途
[0032]
大多数病毒都有半衰期。因此，半衰期是一定数量的病毒中有一半自然死亡所需的时间。因为病毒在饲料中的存活能力是有限的，所以保持时间是一种缓和病毒风险的方式。最近，猪健康信息中心(shic)已经在其网站上发布了用于计算合适的保持时间的指南。
[0033]
在本发明的上下文中，术语“保持时间”是指饲料或饲料成分在饲喂给动物之前储存的时间段。典型的保持时间是几天或甚至几周。
[0034]
包含苯甲酸、丁子香酚和百里香酚的混合物灭活饲料和饲料成分中的rna病毒。因此，保持时间变得没有实际意义，或者至少大大缩短。本发明涉及包含苯甲酸、丁子香酚和百里香酚的混合物用于减少经施加以允许动物饲料中的病毒降解所需的保持时间的用途。因此，保持时间优选减少到少于7天，更优选少于6天，甚至更优选少于5天，最优选少于3天。在一个优选的实施方式中，来自猪流行性腹泻病毒、来自猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或来自塞内卡病毒a的病毒rna被降解。
[0035]
因此，本发明涉及包含苯甲酸、丁子香酚和百里香酚的混合物用于减少经施加以允许动物饲料中来自猪流行性腹泻病毒、来自猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或来自塞内卡病毒a的病毒rna降解所需的保持时间的用途，其中保持时间优选减少到少于7天，更优选少于6天，甚至更优选少于5天，最优选少于3天。最优选的实施方式涉及包含苯甲酸、丁子香酚和百里香酚的混合物用于减少经施加以允许动物饲料中来自猪流行性腹泻病毒的病毒rna降解所需的保持时间的用途，其中保持时间减少至优选少于3天。
[0036]
在关于这些实施方式的混合物中，苯甲酸与丁子香酚之间的重量比为优选至少500:1，更优选至少833:1并且优选至多2500:1，其中苯甲酸与百里香酚之间的重量比为优选至少250:1，更优选至少333:1并且优选至多为500:1。
[0037]
本发明的计算机实现的方法
[0038]
通常，饲料是由饲料厂制备的。为此，饲料厂购买主要饲料成分(例如磨碎的玉米和豆粕)和其他饲料成分(例如矿物质、维生素和其他饲料添加剂)。基于饲料总重量，以优选至少20重量％的量存在的饲料成分是“主要饲料成分”。
[0039]
商购可得的饲料成分可能变得被有害病毒污染，尤其是在其运输或物理移动期间。因此，饲料厂必须采取措施来确保他们出售的饲料不含有害病毒。一种措施是将饲料成分和/或饲料储存几天或几周(保持时间)。这一措施假定在饲料随后最终移动至将消耗所述饲料的地方期间几乎没有或没有进一步污染风险。
[0040]
本发明的计算机实现的方法允许减少保持时间和/或使得保持时间完全没有意义。在一个优选实施方式中，本发明的计算机实现的方法确保只有在已经确认有害病毒存在的情况下才添加用于灭活病毒的缓和剂。
[0041]
本发明的计算机实现的方法可以基于各种形式的硬件、软件、固件、处理器、分布式服务器(例如，如在云计算中所使用的)或它们的组合。在一个实施方式中，本发明的计算机实现的方法涉及使用通信基础设施，例如互联网。
[0042]
本发明的计算机实现的方法需要通过实时定量逆转录聚合酶链式反应来确定ct值。为此，需要pcr装置。因此，当实现本发明的计算机实现的方法时，优选地使用硬件和软件的组合。
[0043]
软件可以被实现为有形地体现在程序存储设备上的应用程序，或者在用户的计算环境中(例如，作为小应用程序)和在审阅者的计算环境中实现的软件的不同部分，其中审阅者可以位于远程站点处(例如，在服务提供商的设施处)。
[0044]
通过实时定量逆转录聚合酶链式反应确定的ct值随后被用于模型中，所述模型限定了在饲料成分被例如pedv和prrsv的病毒污染的情况下在范围内的ct值。在优选实施方式中，本发明的模型是决策树。决策树是含有条件控制语句的模型。在一个特别优选的实施方式中，本发明的方法包括以下条件控制语句中的至少一者：
[0045]
如果所确定的pedv的ct值为37或以下，
[0046]
则建议向含有ct值已被确定为37或以下的饲料成分的饲料中添加至少一种缓和剂(优选地是苯甲酸、丁子香酚和百里香酚的混合物)，
[0047]
否则建议避免添加用于灭活病毒的缓和剂
[0048]
如果所确定的prrs的ct值为37或以下，
[0049]
则建议向含有ct值已被确定为37或以下的饲料成分的饲料中添加至少一种缓和剂(优选地是苯甲酸、丁子香酚和百里香酚的混合物)，
[0050]
否则建议避免添加用于灭活病毒的缓和剂
[0051]
如果所确定的无包膜病毒(例如sva病毒)的ct值为37或以下，
[0052]
则建议向含有ct值已被确定为37或以下的饲料成分的饲料中添加至少一种缓和剂(优选地是苯甲酸、丁子香酚和百里香酚的混合物)，
[0053]
否则建议避免添加用于灭活病毒的缓和剂
[0054]
ct值≤37表示存在相应的病毒，即在ct值≤37的情况下，应添加用于灭活病毒的缓和剂。在最优选的实施方式中，本发明的方法包括以下条件控制语句或由以下条件控制语句组成：
[0055]
如果所确定的pedv的ct值为37或以下，
[0056]
则建议向含有ct值已被确定为37或以下的饲料成分的饲料中添加至少一种缓和剂(优选地是苯甲酸、丁子香酚和百里香酚的混合物)，
[0057]
否则建议避免添加用于灭活病毒的缓和剂
[0058]
如果所确定的prrs的ct值为37或以下，
[0059]
则建议向含有ct值已被确定为37或以下的饲料成分的饲料中添加至少一种缓和剂(优选地是苯甲酸、丁子香酚和百里香酚的混合物)，
[0060]
否则建议避免添加用于灭活病毒的缓和剂
[0061]
在一个实施方式中，一种用于执行本发明的方法的应用程序被上传到计算机平台和/或由计算机平台执行，所述计算机平台具有硬件，例如一个或多个中央处理单元(central processing unit,cpu)、随机存取存储器(random access memory,ram)和输入/输出(input/output,i/o)接口。这通常包括至少一个计算机处理器。计算机处理器可以是通常在个人台式计算机、便携式计算机、大型机、小型计算机、便携式电子设备(例如，平板电脑或智能手机)中发现的处理器。各种其他外围设备，例如附加的数据存储设备和打印设备，可以连接至计算机平台。本发明的一个实施方式涉及一种制备饲料的计算机实现的方法，所述方法包括以下步骤：
[0062]
a)提供至少一种饲料成分的样本，以及通过实时定量逆转录聚合酶链式反应来确定至少一种预定病毒的ct值；
[0063]
b)提供模型，所述模型限定在饲料成分被病毒污染的情况下ct值在范围内；
[0064]
c)使用所述模型来确定是否需要将用于灭活病毒的缓和剂添加到包含步骤a)的饲料成分的饲料中，
[0065]
其中所述至少一种饲料成分优选为主要饲料成分，和/或其中所述至少一种饲料成分优选选自由以下项组成的组：玉米、磨碎的玉米、大豆产品、豆粕、菜籽粕(canola meal)、小麦和大麦，并且
[0066]
其中所述缓和剂优选是包含苯甲酸、丁子香酚和百里香酚的混合物，并且其中如果所确定的pedv和/或prrs的ct值为37或以下，则所述混合物以基于饲料总重量，优选小于0.5重量％的量添加。
[0067]
尽管本文优选的缓和剂有效灭活无包膜病毒例如sva，但是所述缓和剂并不总是完全分解无包膜病毒的rna。在灭活但未完全分解病毒的情况下，非存活病毒的无害rna部分可能会残留下来。在这种情况下，pcr测试可能提供假阳性结果，并且因此，在昂贵且可能耗时的实验室测试中确定相应的ct值没有益处。因此，本发明的一个实施方式涉及一种确定是否需要向饲料中添加缓和剂以灭活可能存在于旨在制备所述饲料的饲料成分中的病毒的计算机实现的方法，所述方法包括：
[0068]
a)提供至少一种饲料成分的样本，以及通过实时定量逆转录聚合酶链式反应来确定至少一种预定病毒的ct值；
[0069]
b)提供模型，所述模型限定在饲料成分被病毒污染的情况下ct值在范围内；
[0070]
c)使用所述模型来确定是否需要将缓和剂(例如苯甲酸、丁子香酚和百里香酚的混合物)添加到包含步骤a)的饲料成分的饲料中，
[0071]
其中不测定塞内卡病毒a的ct值，并且其中优选不测定任何无包膜病毒的ct值。
[0072]
本发明的另一个实施方式涉及一种制备饲料的计算机实现的方法，所述方法包括以下步骤：
[0073]
a)提供至少一种饲料成分的样本，以及通过实时定量逆转录聚合酶链式反应来确定至少一种预定病毒的ct值；
[0074]
b)提供模型，所述模型限定在饲料成分被病毒污染的情况下ct值在范围内；
[0075]
c)使用所述模型来确定是否需要将用于灭活病毒的缓和剂添加到包含步骤a)的饲料成分的饲料中，
[0076]
其中不测定塞内卡病毒a的ct值，并且其中优选不测定任何无包膜病毒的ct值，并且
[0077]
其中步骤b)和c)优选地包括以下两个动作中的至少一个动作：
[0078]
动作1：
[0079]
如果所确定的pedv的ct值为37或以下，
[0080]
则向含有ct值已被确定为37或以下的饲料成分的饲料中添加至少一种缓和剂，
[0081]
否则避免添加用于灭活病毒的缓和剂，
[0082]
动作2：
[0083]
如果所确定的prrs的ct值为37或以下，
[0084]
则向含有ct值已被确定为37或以下的饲料成分的饲料中添加至少一种缓和剂，
[0085]
否则避免添加用于灭活病毒的缓和剂
[0086]
实施例
[0087]
实施例1
[0088]
在实施例1中，将rna病毒以受控方式引入猪饲料中。
[0089]
通过混合磨碎的玉米、豆粕和其它饲料成分来制备全价猪饲料。实施例1中制备的饲料的确切组成在下表1中指示。以这种方式制备2722千克(2.722公吨)批次的饲料。
[0090]
表1
[0091][0092]
在制造饲料后，将饲料运送并放入农场饲料储存箱中。这种饲料足够100头猪吃15天的时段。一旦饲料箱已被装满，就在第0天将已经预先冷冻的、存储在-80℃并含有三种选定rna病毒的454克冰块落入饲料箱顶部。因为冰块落在该批饲料的顶部，所以冰块可以自然融化成液体，从而使三种病毒能够渗透到饲料中。在研究持续时间(15天)内，含有三种rna病毒的经渗透饲料流到饲料箱的底部(通过重力)，并通过含有柔性螺旋钻的塑料管转移到猪舍中。当饲料通过螺旋钻逐渐转移到猪舍中时，发生了一些附加混合，以向猪提供饲料的自由采食。
[0093]
冰块中含有的三种rna病毒是：猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv 174)、猪流行性腹泻病毒(pedv)和塞内卡病毒a(sva)。在这些病毒中，sva是唯一的无包膜病毒。prrsv 174和pedv是包膜病毒。sva有时被选为口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,fmdv)的替代品。fmdv也是一种无包膜病毒。有包膜病毒的存活通常不同于无包膜病毒的存活。
[0094]
454g/454ml冰块的组成如下：
[0095]
·
100ml sva(5log tcid50/ml，ct＝20.72)，以及
[0096]
·
100ml prrsv 174(5log tcid50/ml，ct＝21.38)，以及
[0097]
·
100ml pedv(5log tcid50/ml，ct＝24.25)，
[0098]
·
用154ml无血清极限必需培养基(minimum essential media,mem)平衡。
[0099]
所示ct值与pcr(聚合酶链式反应)相关。一般认为ct值≥38是不存在相应病毒的指示。因此，所测量的从20.72至24.5的ct值证实了相应病毒的存在。
[0100]
因为在第0天输送的那批饲料预计将持续达研究持续时间(15天)，所以在第6天将含有三种病毒的第二块冰块(与第0天使用的相同)落在饲料箱中剩余的饲料的顶部上。这样做是为了确保当第二块冰块融化时，剩余饲料也渗透有这三种病毒，并且饲料通过重力流动逐渐进入猪舍，进入所包含的螺旋钻系统，该螺旋钻系统向猪提供自由采食直到第15天。
[0101]
在第6天，在猪舍内的6个饲料槽中的每一个饲料槽上拉起单独的swiffer布，与猪进食饲料处存在的饲料粒子接触。之后，将布浸入无菌盐水中，并倒出3ml等分试样用于测试。通过pcr评估样本中病毒核酸的存在。
[0102]
在第15天，如上所述，再次使用单独的swiffer布进行测试。两次pcr分析的结果在表2中显示。符号“5/6”意指从猪舍内的6个饲料槽中测试了6个单独的样本，其中6个饲料槽样本(即喂食器样本)中的5个含有相应病毒的rna。符号“6/6”、“4/6”和“3/6”应以同样的方式理解。
[0103]
表2
[0104][0105]
动力学：
[0106]
当冰块落到饲料箱内的饲料顶部上时，该冰块逐渐且自然地融化，从而允许液体从饲料的上部部分开始向下渗透到饲料中。典型的饲料储藏箱，如本研究中使用的饲料储藏箱，的底部为圆锥形，使得所储存的饲料可以自然地向下流入料斗，在料斗中通过柔性螺旋钻转移到畜舍，并沉积到定位在猪舍内的任何数量的带有存储料斗的自动喂食器中。当猪舍中饲养的猪需要外部储藏箱中的饲料时，饲料从所述箱的底部中心被抽入螺旋钻中。一般来说，饲料从箱的中心抽取得更快，并且离箱的外侧周边最近的饲料趋于更慢地自然流动并且更晚进入猪舍。因此，当冰块落到箱中心中的饲料的顶部上并开始融化时，经渗透的饲料比其余饲料更快地流入螺旋钻和猪舍。如果冰块在到达螺旋钻时没有完全融化，则冰块的融化和分散是通过螺旋钻将经渗透的饲料转移到猪舍中的机械作用来进一步完成的。因此，当饲料被输送入猪舍时，螺旋钻的机械动作完成了进一步的混合和渗透。独立的螺旋钻穿过猪舍的墙壁(在螺旋钻周围是密封的)，以将饲料输送至猪。在冬季(在美国明尼苏达州)期间，当冰块在饲料箱内融化得更慢时，猪舍内的猪所持续的较高温度确保了当饲料穿过螺旋钻到达自动喂食器时，饲料中任何残留的冰粒变得完全融化，使得液体在被猪食用之前已经完全渗透到饲料中。在较低的温度下用病毒渗透饲料会增加病毒在更长时间段内保持有传染性的可能性。在6天后使第二块冰块落在箱中剩余的饲料的顶部上，确保了在接下来的9天(直到第15天)中消耗的饲料以与前6天期间的饲料相同的方式被渗透。
[0107]
表2所显示的数据的解释：
[0108]
分别在第6天和第15天检查喂食器中病毒rna的存在，是预期的病毒rna是否被成功引入饲料和饲料输送系统，并且是否可为有活力的以被猪摄食的测试。对于所有三种病
毒，在第6天和第15天获得了不同的结果。显然，通过在第0天简单地使单个冰块落入到箱的中心中，很难在前6天彻底污染进入畜舍的饲料，但是在第6天添加第二块冰块之后的剩余9天期间，饲料变得被更加彻底污染。表2中的结果也表明检测无包膜sva是挑战性的。然而，该批饲料中sva的存在是毫无疑问的，因为在第15天，所有的猪都表现出sva的临床病征，而不管它们是否是在畜舍中从给料槽/围栏饲喂的。
[0109]
实施例2
[0110]
在实施例2中，同时重复实施例1的测试。然而，在实施例2中，添加了包含苯甲酸片和包含百里香酚和丁子香酚的粉末的混合物，并包含有在表1中显示的饲料组合物。基于饲料总重量，制备了含有0.312重量％的混合物替代等量磨碎玉米的饲料。
[0111]
然后如实施例1中所解释的，在第6天(即，将第一块冰块引入饲料后6天)和第15天(即，引入第二块冰块后9天)取得喂食器样本。不同的时间跨度，“第0天
→
第6天”和“第6天
→
第15天”，在图1中示出。结果在下表3中显示。
[0112]
表3中的结果表明，包含苯甲酸片和包含百里香酚和丁子香酚的粉末(基于饲料总重量，总共0.312重量％)的混合物是减少饲料中三种不同种类病毒(即prrsv、pedv和sva)存在的非常有效的方式。在prrsv和sva的情况下，如果病毒已经暴露于苯甲酸、百里香酚和丁子香酚达更长时间段(最初的6天之后的9天)，则处理会更有效。在pedv的情况下，增加暴露时间没有附加益处。换句话说，苯甲酸、百里香酚和丁子香酚的混合物快速灭活pedv。
[0113]
病毒的快速灭活是有益的，因为养猪户偏好于在动物需要饲料之前不将饲料保持或隔离进行存储。任何保持时间的需要，尤其是更长的时间，使得农场主的生活更加复杂并且增加了与高效猪肉生产的存储和物流相关联的成本。此外，较长的保持时间可降低饲料的品质，因为随着时间段的延长，一些必需营养物(即维生素)的稳定性和保留会降低。另一方面，如果饲料保持时间将降低动物疾病传播的风险，则农场主非常愿意接受和使用饲料保持时间，所述动物疾病可能会导致农场主的动物生病和/或增加整个猪肉行业内更大的动物和经济损失的可能性。
[0114]
表3
[0115][0116]
*≥9天可能是从9天到15天的任何暴露；参见上面的小节“动力学”[0117]
实施例3
[0118]
在实施例3中，阐述了饲料中不同浓度的实施例2的混合物(即苯甲酸、百里香酚和丁子香酚)对第6天喂食器样本中三种病毒rna检测的影响。所测试的两种浓度是：
[0119]
低浓度：基于饲料总重量，0.312重量％的实施例2的混合物。
[0120]
高浓度：基于饲料总重量，0.52重量％的实施例2的混合物。
[0121]
在实施例3中，同时重复实施例2的测试。有关测试方法的细节，请参见实施例2。
[0122]
在第6天，如在先前实施例中所述，取得喂食器样本并进行分析。结果在表4中显
示，还包括来自实施例1和实施例2的结果)。
[0123]
表4
[0124][0125]
结果显示，苯甲酸、百里香酚和丁子香酚的混合物在两种浓度中较低的浓度下就已经有效地对抗prrsv、pedv和sva。对于这些病毒，不需要将混合物的浓度从基于饲料总重量0.312重量％增加到0.52重量％。这与农场主高度相关，因为任何对更高量的饲料添加剂的需求都会增加成本。
[0126]
实施例4
[0127]
实施例2和实施例3的结果的概要表明，苯甲酸、百里香酚和丁子香酚的混合物具有突出的对抗pedv的性能。更具体地，这些实施例表明苯甲酸、百里香酚和丁子香酚的混合物(i)在短时间后且(ii)在低浓度下有效对抗pedv。
[0128]
在所测试的饲料样本中的一些饲料样本中，尽管在相应的饲料中已经添加了苯甲酸、百里香酚和丁子香酚的混合物，但是仍可以通过pcr检测到来自pedv的rna。然而，阳性rna结果并不总是表明存在活的病毒。在灭活病毒的情况下，也可能获得pcr测试中的阳性rna结果(即pcr测试中的假阳性结果)。通过查看对应的动物数据，可以发现pcr测试中的假阳性结果：动物不会因摄入非活病毒而患病。
[0129]
为了证实基于饲料总重量的0.312重量％的混合物足以灭活pedv，进行了以下操作：
[0130]
·
测量猪从第0天到第15天的平均生长率(平均日增重，adg)
[0131]
·
在第15天对猪的临床症状(作为疾病证据的腹泻)的存在进行评分
[0132]
·
在第15天收集的直肠拭子样本(作为感染的证据)中测试猪的pedv病毒
[0133]
下表5中的结果显示，在第6天和第15天取得的喂食器样本中通过pcr检测到的任何pedv rna都来源于灭活的并因而无害的pedv。
[0134]
表5
[0135][0136]
表6还证实，如果含有pedv的冰块在不含苯甲酸、百里香酚和丁子香酚的饲料中融化，则猪会被pedv感染。此外，表6表明，对于灭活饲料中的pedv，较低浓度的本发明混合物的就足够。
[0137]
实施例5
[0138]
在实施例5中，如实施例4中所解释，测定了prrsv和sva对已经食用含或不含混合物的饲料的猪的影响。表6显示了完整的数据，包括来自实施例4的数据：
[0139]
表6
[0140][0141]1表示从生物样本中回收的带病毒的动物的百分比(prrsv＝血清，pedv＝直肠拭子，或sva＝扁桃体)。
[0142]2表示显示出疾病的临床病征的围栏的百分比(呼吸困难/体重减轻/毛发粗糙＝prrsv，腹泻＝pedv，或跛行/水疱＝sva)。