一种残膜回收机防缠绕挑膜装置的制 一种秧草收获机用电力驱动行走机构

与NKG2D结合的抗体的制作方法

2022-04-16 12:01:29 来源:中国专利 TAG:
本发明总体上涉及与NKG2D结合的抗体,包括多特异性抗原结合分子,例如用于活化T细胞和/或NK细胞。此外,本发明涉及编码此类抗体的多核苷酸,以及包含此类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于生产所述抗体的方法,以及涉及将所述抗体用于治疗疾病的方法。
背景技术
癌症免疫疗法是一个非常活跃的研究领域,并且现在癌症免疫疗法被用于治疗许多不同类型的癌症。尽管使用免疫检查点抑制剂获得了有希望的临床结果,但仍然只有低比例的患者对这些新型疗法有反应。这清楚地表明,除了检查点抑制之外,对活化免疫系统的新型差异化治疗方法的需求很高,以提高更多晚期癌症患者的临床益处。NKG2D是在1991年首次描述的在细胞毒性效应细胞上表达的活化受体(Houchnins等人(1991)JExpMed173,1017-1020)。它在细胞质尾部没有自己的信号传导基序,但经由带电荷的氨基酸与10kDa的衔接蛋白DNAX活化蛋白(DAP10)相缔合。DAP10具有细胞质YxxM基序,其在其酪氨酸残基磷酸化后募集磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K),最终导致NK细胞的活化、细胞毒性和CD8T细胞共刺激。NKG2D在几乎所有NK细胞、CD8T细胞、γδT细胞和一个亚组的NKT细胞上组成型表达,但不在正常组织中表达(Bauer等人(1999)Science285,727-729)。NKG2D表达可以被不同的细胞因子调节;IL-2和IL-15诱导上调,而TGFβ和IL-21显示下调NKG2D。还可以检测肿瘤浸润淋巴细胞NKG2D。NKG2D经由上调NKG2D配体(NKG2DL)作为转化细胞的传感器。许多病毒和肿瘤已经发展出经由NKG2D逃避感知的机制,这表明该受体在肿瘤和病毒感染的免疫监视中起着重要作用,并且使其成为癌症免疫疗法的一个引人注目的靶标。Kwong等人已经报道了一种具有双重拮抗和激动活性的抗NKG2D抗体KYK-2.0。(Kwong等人,(2008)JMolBiol384,1143-1156;WO2010/017103)。WO2016/134371中已经报道了由其衍生的双特异性抗体。已经报道了靶向NKG2D、CD16和肿瘤相关抗原的三特异性抗体,例如在WO2018/148445中。然而,仍然需要具有改进的功效和/或安全性的靶向NKG2D的抗体,例如用于癌症免疫疗法。技术实现要素:本发明提供了新型抗体,包括多特异性抗体,其与NKG2D结合并且对于治疗目的具有特别有利的特性。本发明人已经开发出具有出乎意料的、改进的特性的新型抗体,其与NKG2D结合。例如,这些抗体以高亲和力与NKG2D(人类和食蟹猴两者)结合,并且特别表现出与表达NKG2D的免疫细胞的结合以及对其的激动活性(即活化或共刺激)。本发明还涵盖与NKG2D和第二抗原结合的多特异性抗原结合分子,掺入新型NKG2D抗体并且将良好的功效和可生产性与低毒性和有利的药代动力学特性相结合。这些(多特异性)抗体可以用于治疗目的,特别是用于癌症的疗法,特别是癌症免疫疗法。重要的是,本发明的(多特异性)抗体特别适合与其他免疫治疗剂,例如T细胞活化剂组合。在第一方面,本发明提供了一种与NKG2D结合的抗体,其中所述抗体包含第一抗原结合结构域,所述第一抗原结合结构域包含(i)重链可变区(VH),其包含SEQIDNO:73的重链互补决定区(HCDR)1,选自由SEQIDNO:74、SEQIDNO:102、SEQIDNO:103、SEQIDNO:104和SEQIDNO:105组成的组的HCDR2,以及SEQIDNO:75的HCDR3;和轻链可变区(VL),其包含SEQIDNO:76的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQIDNO:77的LCDR2和SEQIDNO:78的LCDR3;(ii)VH,其包含SEQIDNO:65的HCDR1、SEQIDNO:66的HCDR2和SEQIDNO:67的HCDR3;和VL,其包含SEQIDNO:68的LCDR1、SEQIDNO:69的LCDR2和SEQIDNO:70的LCDR3;(iii)VH,其包含SEQIDNO:1的HCDR1、SEQIDNO:2的HCDR2和SEQIDNO:3的HCDR3;和VL,其包含SEQIDNO:4的LCDR1、SEQIDNO:5的LCDR2和SEQIDNO:6的LCDR3;(iv)VH,其包含SEQIDNO:25的HCDR1、SEQIDNO:26的HCDR2和SEQIDNO:27的HCDR3;和VL,其包含SEQIDNO:28的LCDR1、SEQIDNO:29的LCDR2和SEQIDNO:30的LCDR3;(v)VH,其包含SEQIDNO:49的HCDR1、SEQIDNO:50的HCDR2和SEQIDNO:51的HCDR3;和VL,其包含SEQIDNO:52的LCDR1、SEQIDNO:53的LCDR2和SEQIDNO:54的LCDR3;(vi)VH,其包含SEQIDNO:57的HCDR1、SEQIDNO:58的HCDR2和SEQIDNO:59的HCDR3;和VL,其包含SEQIDNO:60的LCDR1、SEQIDNO:61的LCDR2和SEQIDNO:62的LCDR3;(vii)VH,其包含SEQIDNO:9的HCDR1、SEQIDNO:10的HCDR2和SEQIDNO:11的HCDR3;和VL,其包含SEQIDNO:12的LCDR1、SEQIDNO:13的LCDR2和SEQIDNO:14的LCDR3;(viii)VH,其包含SEQIDNO:17的HCDR1、SEQIDNO:18的HCDR2和SEQIDNO:19的HCDR3;和VL,其包含SEQIDNO:20的LCDR1、SEQIDNO:21的LCDR2和SEQIDNO:22的LCDR3;(ix)VH,其包含SEQIDNO:33的HCDR1、SEQIDNO:34的HCDR2和SEQIDNO:35的HCDR3;和VL,其包含SEQIDNO:36的LCDR1、SEQIDNO:37的LCDR2和SEQIDNO:38的LCDR3;或(x)VH,其包含SEQIDNO:41的HCDR1、SEQIDNO:42的HCDR2和SEQIDNO:43的HCDR3;和VL,其包含SEQIDNO:44的LCDR1、SEQIDNO:45的LCDR2和SEQIDNO:46的LCDR3。在一个方面,本发明提供了一种与NKG2D结合的抗体,其中所述抗体包含第一抗原结合结构域,所述第一抗原结合结构域包含(i)VH,其包含与选自由SEQIDNO:79、SEQIDNO:106、SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112和SEQIDNO:113组成的组的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列;和/或VL,其包含与SEQIDNO:80的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列;(ii)VH,其包含与SEQIDNO:71的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列;和/或VL,其包含与SEQIDNO:72的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列;(iii)VH,其包含与SEQIDNO:7的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性的氨基酸序列;和/或VL,其包含与SEQIDNO:8的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列;(iv)VH,其包含与SEQIDNO:31的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列;和/或VL,其包含与SEQIDNO:32的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列;(v)VH,其包含与SEQIDNO:55的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列;和/或VL,其包含与SEQIDNO:56的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列;(vi)VH,其包含与SEQIDNO:63的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列;和/或VL,其包含与SEQIDNO:64的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列;(Vii)VH,其包含与SEQIDNO:15的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列;和/或VL,其包含与SEQIDNO:16的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列;(viii)VH,其包含与SEQIDNO:23的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列;和/或VL,其包含与SEQIDNO:24的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列;(ix)VH,其包含与SEQIDNO:39的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列;和/或VL,其包含与SEQIDNO:40的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列;或(x)VH,其包含与SEQIDNO:47的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列;和/或VL,其包含与SEQIDNO:48的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一个方面,抗体是IgG,特别是IgG1抗体。在一个实施例中,抗体是全长抗体。在另一方面,抗体是选自下组的抗体片段:Fv分子、scFv分子、Fab分子和F(ab')2分子。在一个方面,抗体是多特异性抗体,特别是双特异性抗体。在一个方面,抗体包含与第二抗原结合的第二抗原结合结构域。在一个方面,第二抗原是靶细胞抗原,特别是肿瘤细胞抗原。在一个方面,抗体包含由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域。在一个方面,Fc结构域是IgG,特别是IgG1Fc结构域。在一个方面,Fc结构域是人Fc结构域。在一个方面,Fc结构域包含降低与Fc受体的结合和/或效应子功能的一个或更多个氨基酸取代。在一个方面,抗体不与FcγRIIIa(CD16a)结合。在一个方面,第一抗原结合结构域和/或所述第二抗原结合结构域是Fab分子。在一个方面,第一抗原结合结构域是Fab分子,其中所述Fab轻链和所述Fab重链的所述可变结构域VL和VH彼此替换或所述恒定结构域CL和CH1彼此替换,特别是所述可变结构域VL和VH彼此替换。在一个此类方面,第二抗原结合结构域是常规Fab分子。在另一个此类方面,第二抗原结合结构域是Fab分子,其中在所述恒定结构域CL中,124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号),并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号);而在所述恒定结构域CH1中,147位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据KabatEU索引编号),并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据KabatEU索引编号)。在替代方面,第二抗原结合结构域是Fab分子,其中所述Fab轻链和所述Fab重链的所述可变结构域VL和VH彼此替换或所述恒定结构域CL和CH1彼此替换,特别是所述可变结构域VL和VH彼此替换。在一个此类方面,第一抗原结合结构域是常规Fab分子。在另一个此类方面,第一抗原结合结构域是Fab分子,其中在所述恒定结构域CL中,124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号),并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号);而在所述恒定结构域CH1中,147位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据KabatEU索引编号),并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据KabatEU索引编号)。在一个方面,第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域各自是Fab分子,并且所述抗体包含由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域;并且(i)所述第一抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的第一亚基的N端,并且所述第二抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的第二亚基的N端,或者(ii)所述第二抗原结合结构域在所述Fab重链的C末端融合至所述Fc结构域的所述第一亚基的N末端,且所述第一抗原结合结构域在所述Fab重链的C末端融合至所述Fc结构域的所述第二亚基的N末端。在一个方面,所述Fc结构域包含促进所述Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰。在一个方面,所述Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替换,从而在第一亚基的CH3结构域内产生凸起,所述凸起可定位在第二亚基的CH3结构域内的空腔中,并且所述Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替换,从而在第二亚基的CH3结构域内产生空腔,第一亚基的CH3结构域内的所述凸起可定位在所述空腔内。根据本发明的另一个方面,提供了编码本发明的抗体的分离的多核苷酸和包含本发明的分离的多核苷酸的宿主细胞。在另一方面,提供了生产与NKG2D结合的抗体的方法,所述方法包括以下步骤:(a)在适合表达所述抗体的条件下培养本发明的宿主细胞,以及任选地(b)回收所述抗体。本发明还涵盖通过本发明的方法生产的与NKG2D结合的抗体。本发明进一步提供了包含本发明的抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。本发明还涵盖使用本发明的抗体和药物组合物的方法。在一个方面,本发明提供了用作药物的根据本发明的抗体或药物组合物。在一个方面,提供了根据本发明的用于治疗疾病的抗体或药物组合物。在一个具体方面,疾病为癌症。在一个具体方面,所述使用与T细胞活化剂组合进行,例如与CD3结合的抗体,特别是与CD3和靶抗原(特别是肿瘤细胞抗原)结合的双特异性抗体。还提供了根据本发明的抗体或药物组合物在制造药物中的用途,根据本发明的抗体或药物组合物在制造用于治疗疾病、特别是癌症的药物中的用途。在一个具体方面,所述治疗与T细胞活化剂组合进行,例如与CD3结合的抗体,特别是与CD3和靶抗原(特别是肿瘤细胞抗原)结合的双特异性抗体。本发明还提供了一种治疗个体中的疾病、特别是癌症的方法,包所述括向所述个体施用有效量的根据本发明的抗体或药物组合物。在一个具体方面,所述方法进一步包括施用T细胞活化剂,例如与CD3结合的抗体,特别是与CD3和靶抗原(特别是肿瘤细胞抗原)结合的双特异性抗体。附图说明图1.实例1中构建的NKG2D受体和MIC-B配体的示意图。相对于构建体的受体或配体部分,将NKG2D受体和MIC-B配体作为单体(“mono”)或二聚体(“di”),与人或鼠Fc结构域融合或不融合地进行克隆。除了dihuNKG2DECDmuIgG1Fc以外,所有构建体都携带至少一个用于定点生物素化的avi标签。(A)hisavihuNKG2DECD,(B)monohuNKG2DECDFckhavi,(C)dihuNKG2DECDFcavi,(D)dihuNKG2DECDmuIgG1Fc,(E)dicyNKG2DECDFcavi,(F)dimuNKG2DECDFcavi,(G)ECDFLMIC-BFcavi。图2.通过ELISA筛选用于MIC-B竞争的抗NKG2D抗体。显示了相对于重组生物素化人NKG2D与没有抗NKG2D抗体的平板固定MIC-B的结合,NKG2D与MIC-B结合的抑制百分比。图3.通过抗NKG2D抗体重新定向裂解靶细胞。如通过从标记的P815靶细胞中释放钙黄绿素来确定抗NKG2D抗体的细胞杀伤百分比。每个克隆的抗体浓度(从左到右)为40.0、13.33、4.44、1.48、0.49、0.165、0.055、0.018、0.006、0.002μg/ml。图4.SPR传感图的实例,显示与不同表位结合的抗体的两次注射。图5.与非结合对照抗体相比,抗NKG2D抗体与(A)人NK细胞系NK92、(B)扩增的人NK细胞、(C)扩增的人γδT细胞,和(D)新鲜分离的人CD8T细胞的结合是通过流式细胞术测量的。图6.用抗NKG2D抗体活化NKG2D阳性免疫细胞。人NK细胞系NK92与在蛋白A珠上捕获的抗NKG2D抗体(IgG1)一起共培养。通过使用CBA技术测量释放到上清液中的INFγ来确定NK细胞的活化。图7.用抗NKG2D抗体活化NKG2D阳性免疫细胞。人NK细胞系NK92与在蛋白A珠(A)上或溶液(B)中捕获的抗NKG2D抗体(IgG1)一起共培养。通过使用CBA技术测量释放到上清液中的INFγ来确定NK细胞的活化。图8.用抗NKG2D抗体活化NKG2D阳性免疫细胞。人原代扩增的NK细胞与在蛋白A珠上捕获的抗NKG2D抗体(IgG1)一起共培养。通过CBA技术测量释放到上清液中的INFγ和TNFα来确定NK细胞的活化。图9.用抗NKG2D抗体活化NKG2D阳性免疫细胞。人原代扩增的γδT细胞与在蛋白A珠上捕获的抗NKG2D抗体(IgG1)一起共培养。通过CBA技术测量释放到上清液中的TNFα来确定NK细胞的活化。图10.CD8T细胞克隆与抗NKG2D抗体一起的共刺激。将NLV特异性(A和B)和MART1特异性(C)CD8T细胞克隆在平板中培养,该平板中含有包被的抗NKG2D抗体(IgG1),联合固定浓度的CD3抗体(A和C)或不存在CD3抗体(B)。如通过流式细胞术确定的CD25上调被用作CD8T细胞克隆的活化标记。图11.与非人源化亲本兔序列395(P1AE4972)相比,抗NKG2D抗体395的人源化VH结构域的比对,其中HCDR2中的未配对半胱氨酸被丝氨酸替换(位置由星号指示)。图12.NKG2D双特异性抗体形式的示意图(以CEA作为示例性第二特异性)。(A)D形式、(B)J形式、(C)K形式、(D)I形式、(E)L形式、(F)M形式。图13.在JurkatNFATNKG2D报告细胞测定中,联合5nMCEA-TCB,在MKN-45细胞上测试了若干种抗NKG2D抗体作为靶向CEA的双特异性构建体的功能活性。通过测量处理5小时后的发光来确定JurkatNFATNKG2D报告细胞的活化。图14.在JurkatNFATNKG2D报告细胞测定中,联合5nMCEA-TCB,在MKN-45细胞上,以不同的双特异性形式(以CEA作为第二特异性)测试了抗-NKG2D抗体320的功能活性。通过测量处理5小时后的发光来确定JurkatNFATNKG2D报告细胞的活化。图15.具有抗NKG2D抗体320的NKG2DxCEA双特异性抗体与NKG2D阳性NK92细胞(A)和CEA阳性LS180细胞(B)的结合,是通过流式细胞术测量,并且将其与各自的IgG进行比较。图16.在JurkatNFATNKG2D报告细胞测定中,联合5nMCEA-TCB,在MKN45细胞上,以不同的双特异性形式(以CEA作为第二特异性)测试了抗-NKG2D抗体5C5(A)和013(B)的功能活性。通过测量加入处理5小时后的发光来确定JurkatNFATNKG2D报告细胞的活化。图17.在JurkatNFATNKG2D报告细胞测定中,联合5nMCEA-TCB,在MKN45细胞上,将抗NKG2D抗体395的两种双特异性形式(M和I)的功能活性与抗NKG2D抗体320的I形式的功能活性进行比较。通过测量加入处理5小时后的发光来确定JurkatNFATNKG2D报告细胞的活化。图18.具有抗NKG2D抗体395的NKG2DxCEA双特异性抗体与NKG2D阳性NK92细胞(A)和CEA阳性LS180细胞(B)的结合,是通过流式细胞术测量,并且将其与各自的IgG进行比较。图19.在存在具有不同CEA表达水平的肿瘤细胞系的情况下,在JurkatNFATNKG2D报告细胞测定中,测试了两种不同的NKG2DxCEA双特异性抗体的功能活性。通过测量处理5小时后的发光来确定JurkatNFATNKG2D报告细胞的活化。(A)I形式的具有抗NKG2D抗体320的双特异性抗体,(B)M形式的具有抗NKG2D抗体395的双特异性抗体。图20.如通过流式细胞术测量,M形式的具有抗NKG2D抗体395的双特异性抗体与新鲜分离的PBMC内的CD8T细胞(A)、NK细胞(B)和CD4T细胞(C)的结合。图21.如通过流式细胞术测量,用T细胞双特异性抗体(TCB)和M形式的具有抗NKG2D抗体395的NKG2DxCEA双特异性抗体的组合活化CD8T细胞。(A,B)用0.1nMCEA-TCB(2)单独处理或与0.4nMNKG2DxCEA双特异性抗体联合处理LS180肿瘤细胞48h后,PBMC内CD8T细胞上的CD69(A)和CD25(B)的上调。(C,D)用CEA-TCB单独处理或与2nM的NKG2DxCEA双特异性抗体联合处理MKN-45细胞48h后,PBMC内CD8T细胞上的CD69(C)和CD25(D)的上调。图22.通过流式细胞术测量双特异性M形式的抗NKG2D抗体395的人源化变体与在NK92细胞上表达的NKG2D的结合,并且与亲本抗NKG2D抗体(P1AE4972)进行比较。(A)P1AE4973、P1AE4975、P1AE4977。(B)P1AE4978、P1AE4979、P1AE4980、P1AE4981。图23.在JurkatNFATNKG2D报告细胞测定中,联合5nMCEA-TCB,在MKN-45细胞(A,B)和HT-29细胞(C,D)上测试了双特异性M形式的抗NKG2D抗体395的人源化变体的功能活性,并且与具有亲本抗体(P1AE4972)的各自形式的活性进行比较。通过测量处理5小时后的发光来确定JurkatNFATNKG2D报告细胞的活化。图24.在JurkatNFATNKG2D报告细胞测定中,使用CEA阴性肿瘤细胞系(HeLa(A))和两个CEA阳性肿瘤细胞系HT29(B)和MKN-45(C)),测试了与TCB联合的双特异性M形式的人源化抗NKG2D抗体变体P1AE4980的功能活性。通过测量处理5小时后的发光来确定JurkatNFATNKG2D报告细胞的活化。图25.在JurkatNFATNKG2D报告细胞测定中,在具有递增浓度的脱落的CEA(sCEA)(A)的MKN-45细胞上,测试了与CEA-TCB联合的NKG2DxCEA双特异性抗体(人源化抗NKG2D抗体变体P1AE4980,M形式)的功能活性。同时,在同一测定(B)中,测试了与CEA-TCB联合的NKG2DxCEA双特异性抗体的功能活性,并且以单独的CEA-TCB作为参考。通过测量处理5小时后的发光来确定JurkatNFATNKG2D报告细胞的活化。图26.在JurkatNFATNKG2D报告细胞测定中,在MKN-45细胞上,将在可溶性NKG2D配体MICA(sMICA,10μg/ml)或ULBP2(sULBP2,10μg/ml)存在下的NKG2DxCEA双特异性抗体(人源化抗NKG2D抗体变体P1AE4980,M形式)与CEA-TCB的功能活性和NKG2DxCEA双特异性抗体(在没有配体的情况下)与CEA-TCB的活性进行比较。通过测量处理5小时后的发光来确定JurkatNFATNKG2D报告细胞的活化。图27.实例19中制备的NKG2DxCEA双特异性抗体的示意图,含有抗体P1AE4980作为NKG2D结合物,以及抗体huA5B7及其亲和力成熟的变体作为CEA结合物。图28.将具有抗CEA抗体huA5B7、P002.139和P001.177的两种亲和力成熟的变体的双特异性NKG2DxCEA抗体与在LS180肿瘤细胞上表达的CEA的结合,与含有亲本CEA结合物huA5B7的相应双特异性NKG2DxCEA抗体的结合进行比较。用荧光标记的二抗检测双特异性抗体的结合,并且通过流式细胞术分析荧光。图29。在96孔板中,在JurkatNFATNKG2D报告细胞测定中,联合5nMCEA-TCB,在高CEA表达MKN45细胞上,测试了含有huA5B7、P002.139或P001.177作为CEA结合物的双特异性NKG2DxCEA抗体的功能活性。通过测量加入处理5小时后的发光来确定JurkatNFATNKG2D报告细胞的活化。图30。在384孔板中,在JurkatNFATNKG2D报告细胞测定中,联合5nMCEA-TCB(A,C)或1nMCEA-TCB(B,D),在中度CEA表达LS180细胞(A,B)和低CEA表达HT29细胞(C,D)上,对含有huA5B7、P002.139或P001.177作为CEA结合物的双特异性NKG2DxCEA抗体测试了其功能活性。通过测量加入处理3小时后的发光来确定JurkatNFATNKG2D报告细胞的活化。图31.通过流式细胞术测试了抗NKG2D抗体C26、ADI27743和P1AE4980与NK92细胞上的NKG2D的结合。用荧光标记的二抗检测结合的抗体。图32.通过流式细胞术测试含有C26、ADI27743或P1AE4980作为NKG2D结合物的双特异性NKG2DxCEA抗体与NK92细胞上的NKG2D的结合。用荧光标记的二抗检测结合的抗体。图33。在JurkatNFATNKG2D报告细胞测定中,联合5nMCEA-TCB,在高CEA表达MKN45肿瘤细胞系上,测试了含有C26、ADI27743或P1AE4980作为NKG2D结合物的双特异性NKG2DxCEA抗体。通过测量加入处理6小时后的发光来确定JurkatNFATNKG2D报告细胞的活化。图34。在JurkatNFATNKG2D报告细胞测定中,联合5nMCEA-TCB,在低CEA表达HT-29肿瘤细胞系上,测试了含有C26、ADI27743或P1AE4980作为NKG2D结合物的双特异性NKG2DxCEA抗体。通过测量加入处理6小时后的发光来确定JurkatNFATNKG2D报告细胞的活化。图35.用包含野生型的或效应子沉默的Fc结构域的NKG2D抗体处理PBMC24h,随后通过流式细胞术确定NK细胞上的CD69上调。具体实施方式I.定义除非在下文中另外定义,否则本文使用的术语通常如本领域中所使用的。如本文所用,关于抗原结合结构域等的术语“第一”、“第二”或“第三”在每种类型的部分多于一种时用于方便区分。除非明确说明,否则这些术语的使用并非旨在赋予部分的特定次序或取向。术语“抗NKG2D抗体”和“结合NKG2D的抗体”是指这样的抗体,其能够以足够的亲和力结合NKG2D,使得所述抗体可用作靶向NKG2D的诊断和/或治疗剂。在一个方面,例如通过表面等离子体共振(SPR)测量的,抗NKG2D抗体与不相关的、非NKG2D蛋白的结合程度小于抗体与NKG2D结合的约10%。在某些方面,与NKG2D结合的抗体具有≤1μM、≤500nM、≤200nM、或≤100nM的解离常数(KD)。如例如通过SPR测量,当抗体的KD为1μM或更小时,则称该抗体与NKG2D“特异性结合”。在某些方面,抗NKG2D抗体与NKG2D的表位结合,所述表位在来自不同物种的NKG2D中是保守的。相反,与某种抗原“不结合”的抗体不能以足够的亲和力与所述抗原结合,使得该抗体可用作靶向所述抗原的诊断剂和/或治疗剂。在某些方面,与某种抗原不结合的抗体对所述抗原具有>1μM的解离常数(KD)。本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用,并且涵盖各种抗体结构,其包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如,双特异性抗体)和抗体片段,只要它们表现出期望的抗原结合活性即可。“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子,其包含完整抗体的一部分,该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2;双体抗体;线性抗体;单链抗体分子(例如,scFv和scFab);单结构域抗体;以及由抗体片段形成的多特异性抗体。关于某些抗体片段的综述,请参见Hollinger和Hudson,NatureBiotechnology23:1126-1136(2005)。术语“全长抗体”、“完整抗体”和“整个抗体”在本文中可互换使用以指代具有与天然抗体结构基本上相似的结构的抗体。如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体,即除了可能的变异抗体外,该群体中包括的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位,所述可能的变异抗体例如含有天然存在的突变或是在单克隆抗体制备物的生产过程中产生的,此类变体通常以微量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反,单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此,修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的,并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如,单克隆抗体可以通过多种技术制备,包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法,以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法,在本文中描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。“分离的”抗体为已从其自然环境的组分中分离的抗体。在一些方面,将抗体纯化至大于95%或99%的纯度,纯度通过例如电泳(例如,SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如,离子交换或反相HPLC、亲和色谱法、尺寸排阻色谱法)方法测定。关于评定抗体纯度的方法的综述,请参见例如Flatman等人,J.Chromatogr.B848:79-87(2007)。在一些方面,本发明提供的抗体是分离的抗体。术语“嵌合”抗体是指这样的抗体,在所述抗体中重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种,而重链和/或轻链的其余部分来源于不同的来源或物种。“人源化”抗体是指这样的嵌合抗体,其包含来自非人CDR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基。在某些方面,人源化抗体将基本上包含所有的至少一个、通常两个可变结构域,其中所有或基本上所有CDR对应于非人抗体的CDR,并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。此类可变结构域在本文中称为“人源化可变区”。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。在一些方面,人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如,CDR残基所来源于的抗体)的相应残基取代,例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经历人源化的抗体。“人抗体”是这样的抗体,该抗体具有的氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列,或来源于利用人抗体全套库或其他人抗体编码序列的非人源的抗体的氨基酸序列。人抗体的该定义特别地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。在某些方面,人抗体来源于非人转基因哺乳动物,例如小鼠、大鼠或兔。在某些方面,人抗体来源于杂交瘤细胞系。在本文中从人抗体文库分离出的抗体或抗体片段也被认为是人抗体或人抗体片段。术语“抗原结合结构域”是指抗体的一部分,该部分包含与抗原的部分或全部结合并互补的区域。抗原结合结构域可以由例如一个或多个抗体可变结构域(也称为抗体可变区)提供。在优选的方面,抗原结合结构域包含抗体轻链可变结构域(VL)和抗体重链可变结构域(VH)。术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构,其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和互补决定区(CDR)。参见,例如,Kindt等人,KubyImmunology,第6版,W.H.Freeman&Co,第91页(2007)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外,结合特定抗原的抗体可分别使用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域来进行分离,以筛选互补VL或VH结构域的文库。参见,例如,Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993);Clarkson等人,Nature352:624-628(1991)。如本文所用,与可变区序列有关的“Kabat编号”是指由Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)提出的编号系统。如本文所用,重链和轻链的所有恒定区和恒定结构域的氨基酸位置根据Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)中描述的Kabat编号系统进行编号,并且在本文中被称为“根据Kabat编号”或“Kabat编号”。具体地讲,将Kabat编号系统(参见Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)的第647页至第660页)用于κ和λ同种型的轻链恒定结构域CL,并且将KabatEU索引编号系统(参见第661页至第723页)用于重链恒定结构域(CH1、铰链、CH2和CH3),这在本文中通过在此种情况下称为“根据KabatEU索引编号”或“KabatEU索引编号”来进一步阐明。如本文所用,术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域中在序列上高变并且确定抗原结合特异性的各个区域,例如“互补决定区”(“CDR”)。一般来讲,抗体包含六个CDR;三个在VH中(HCDR1、HCDR2、HCDR3),并且三个在VL中(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。本文中的示例性CDR包括:(a)出现在以下氨基酸残基处的高可变环:26至32(L1)、50至52(L2)、91至96(L3)、26至32(H1)、53至55(H2)和96至101(H3)(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987));(b)出现在以下氨基酸残基处的CDR:24至34(L1)、50至56(L2)、89至97(L3)、31至35b(H1)、50至65(H2)和95至102(H3)(Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991));以及(c)出现在以下氨基酸残基处的抗原接触点:27c至36(L1)、46至55(L2)、89至96(L3)、30至35b(H1)、47至58(H2),以及93至101(H3)(MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996))。除非另外指明,否则CDR根据出处同上的Kabat等人所述的方法确定。本领域的技术人员将理解,CDR名称也可以根据出处同上的Chothia所述的方法、出处同上的McCallum所述的方法或者任何其他在科学上接受的命名系统来确定。“框架”或“FR”是指除互补决定区(CDR)之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成:FR1、FR2、FR3和FR4。因此,HVR序列和FR序列通常在VH(或VL)中以如下次序出现:FR1-HCDR1(LCDR1)-FR2-HCDR2(LCDR2)-FR3-HCDR3(LCDR3)-FR4。除非另外指明,否则可变结构域中的CDR残基和其他残基(例如,FR残基)在本文中根据Kabat等人,出处同上编号。出于本文目的的“受体人框架”是这样的框架,其包含来源于如下所定义的人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列。“来源于”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含与所述人免疫球蛋白框架或人共有框架相同的氨基酸序列,或者其可以包含氨基酸序列变化。在一些方面,氨基酸变化的数量为10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少或2个或更少。在一些方面,VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。“人共有框架”是这样的框架,其表示在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常存在的氨基酸残基。一般而言,人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自于可变结构域序列的亚组。一般而言,序列的亚组是如Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,NIHPublication91-3242,BethesdaMD(1991),第1-3卷中所述的亚组。本文中的术语“免疫球蛋白分子”是指具有天然存在的抗体的结构的蛋白质。例如,IgG类免疫球蛋白是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白,其由通过二硫键键合的两条轻链和两条重链组成。从N端到C端,每条重链具有可变结构域(VH)(也称为可变重链结构域或重链可变区),接着是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)(也称为重链恒定区)。类似地,从N端到C端,每条轻链具有可变结构域(VL)(也称为轻链可变结构域或轻链可变区),接着是一个恒定轻链(CL)结构域(也称为轻链恒定区)。免疫球蛋白的重链可以归类为以下五种类型之一:α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM),它们中的一些可以进一步分为多个亚型,例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。免疫球蛋白的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而归类为以下两种类型之一:κ和λ。免疫球蛋白实质上由通过免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和一个Fc结构域组成。抗体或免疫球蛋白的“类”是指其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,并且这些抗体中的一些可以进一步分为亚类(同种型),例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。“Fab分子”是指由免疫球蛋白的重链(“Fab重链”)的VH和CH1结构域以及轻链(“Fab轻链”)的VL和CL结构域组成的蛋白质。所谓“交叉”Fab分子(也称为“Crossfab”),意指以下Fab分子:其中Fab重链和轻链的可变结构域或恒定结构域发生交换(即互相替换),即交叉Fab分子包含由轻链可变结构域VL和重链恒定结构域1CH1组成的肽链(VL-CH1,在N端至C端方向),以及由重链可变结构域VH和轻链恒定结构域CL组成的肽链(VH-CL,在N端至C端方向)。为清楚起见,在其中Fab轻链的可变结构域和Fab重链的可变结构域发生交换的交叉Fab分子中,包含重链恒定结构域1CH1的肽链在本文中称为(交叉)Fab分子的“重链”。相反地,在其中Fab轻链的恒定结构域和Fab重链的恒定结构域发生交换的交叉Fab分子中,包含重链可变结构域VH的肽链在本文中称为(交叉)Fab分子的“重链”。与之相比,所谓“常规”Fab分子,意指处于其天然形式的Fab分子,即,包含由重链可变结构域和恒定结构域组成的重链(VH-CH1,在N端至C端方向),以及由轻链可变结构域和恒定结构域组成的轻链(VL-CL,在N端至C端方向)。本文的术语“Fc结构域”或“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C端区,该C端区含有恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个方面,人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而,由宿主细胞产生的抗体可以经历对来自重链C端的一个或更多个(特别是一个或两个)氨基酸的翻译后切割。因此,由宿主细胞通过表达编码全长重链的特定核酸分子产生的抗体可以包括全长重链,或者所述抗体可以包括全长重链的切割变体。这可能是重链的最后两个C端氨基酸为甘氨酸(G446)和赖氨酸(K447,根据KabatEU索引编号)时的情况。因此,Fc区的C端赖氨酸(Lys447)或者C端甘氨酸(Gly446)和赖氨酸(Lys447)可能存在,也可能不存在。如果没有另外指明,则包含Fc区(或如本文所定义的Fc结构域的亚基)的重链的氨基酸序列在本文中被表示为没有C末端甘氨酸-赖氨酸二肽。在一个方面,包括如本文所指定的Fc区(亚基)的重链包含在根据本发明的抗体中,该重链包含另外的C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447,根据KabatEU索引编号)。在一个方面,包括如本文所指定的Fc区(亚基)的重链包含在根据本发明的抗体中,所述重链包含另外的C末端甘氨酸残基(G446,根据KabatEU索引编号)。除非本文另外指明,否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统(也称为EU索引)来编号的,如在Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD,1991(还可参见上文)中所述。如本文所用,Fc结构域的“亚基”是指形成二聚Fc结构域的两种多肽中的一种,即包含免疫球蛋白重链的C端恒定区的多肽,该多肽能够稳定自缔合。例如,IgGFc结构域的亚基包含IgGCH2恒定结构域和IgGCH3恒定结构域。所谓“融合”,意指组分(例如Fab分子和Fc结构域亚基)直接地或经由一个或更多个肽连接基通过肽键链接。术语“多特异性”意指该抗体能够特异性地结合至少两种不同的抗原决定簇。多特异性抗体可以是例如双特异性抗体。典型地,双特异性抗体包含两个抗原结合位点,这两个抗原结合位点中的每一个对不同的抗原决定簇具有特异性。在某些方面,该多特异性(例如双特异性)抗体能够同时结合两种抗原决定簇,特别是在两种不同细胞上表达的两种抗原决定簇。如本文所用的术语“价”表示在抗原结合分子中存在指定数目的抗原结合位点。因此,术语“与抗原单价结合”表示在抗原结合分子中存在对抗原具有特异性的一个(并且不超过一个)抗原结合位点。“抗原结合位点”是指提供与抗原的相互作用的抗原结合分子的位点,即一个或多个氨基酸残基。例如,抗体的抗原结合位点包含来自互补决定区(complementaritydeterminingregion,CDR)的氨基酸残基。天然免疫球蛋白分子通常具有两个抗原结合位点,Fab分子通常具有单个抗原结合位点。如本文所用,术语“抗原决定簇”或“抗原”是指多肽大分子上的位点(例如一段连续的氨基酸或由非连续氨基酸的不同区域组成的构象构型),抗原结合结构域与所述位点结合,从而形成抗原结合结构域-抗原复合物。有用的抗原决定簇可以在例如肿瘤细胞的表面上、病毒感染细胞的表面上、其他患病细胞的表面上、免疫细胞的表面上、血清中的游离物和/或细胞外基质(ECM)中找到。在一个优选方面,抗原是人类蛋白质。除非另外指明,否则“NKG2D”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然NKG2D,该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语包括“全长”的未加工NKG2D,以及通过细胞中加工产生的任何形式的NKG2D。该术语还涵盖NKG2D的天然存在变体,例如剪接变体或等位基因变体。在一个方面,NKG2D是人NKG2D,特别是人NKG2D的细胞外结构域(ECD)。人NKG2D及其ECD的氨基酸序列分别在SEQIDNO:87和SEQIDNO:88中示出。还参见UniProt(www.uniprot.org)条目P26718(第176版)。在另一方面,NKG2D是食蟹猴(Macacafascicularis)NKG2D,特别是食蟹猴NKG2D的ECD。食蟹猴NKG2D及其ECD的氨基酸序列分别在SEQIDNO:89和SEQIDNO:90中示出。还参见UniProt条目P61252(第71版)。在另一方面,NKG2D是鼠(Musmusculus)NKG2D,特别是鼠NKG2D的ECD。鼠NKG2D及其ECD的氨基酸序列分别在SEQIDNO:91和SEQIDNO:92中示出。还参见UniProt条目O54709(第151版)。在某些方面,本发明的抗体与在来自不同物种的NKG2D抗原中保守的NKG2D(特别是人和食蟹猴NKG2D)的表位结合。在优选的方面,抗体与人NKG2D结合。在一个方面,第一抗原结合结构域与人和食蟹猴NKG2D交叉反应(即结合)。如本文所用的“靶细胞抗原”是指存在于靶细胞表面上的抗原决定簇,该靶细胞为例如肿瘤中的细胞(例如癌细胞或肿瘤基质的细胞)(在此情况下,“肿瘤细胞抗原”)。优选地,靶细胞抗原不是NKG2D,和/或在与NKG2D不同的细胞上表达。在一方面,靶细胞抗原为CEA。“CEA”代表癌胚抗原(也称为癌胚抗原相关细胞粘附分子5(CEACAM5))。人CEA的氨基酸序列示出于UniProt条目P06731(第188版)中。如本文所用的“CEA”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然CEA,该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖“全长”的未加工CEA,以及由细胞中的加工所产生的任何形式的CEA。该术语还涵盖CEA的天然存在的变体,例如剪接变体或等位基因变体。在一个方面,CEA是人CEA。在一个方面,CEA是细胞膜结合的CEA。在一个方面,CEA是在细胞(例如癌细胞)的表面上表达的CEA。“亲和力”是指分子(例如,抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如,抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明,否则如本文所用,“结合亲和力”是指内在结合亲和力,其反映了结合对的成员(例如抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可由解离常数(KD)表示。亲和力可以通过本领域已知的完善确立的方法测量,包括本文所述的那些方法。用于测量亲和力的优选方法是表面等离子体共振(SPR)。“亲和力成熟的”抗体是指在一个或多个互补决定区(CDR)中具有一个或多个改变的抗体,与不具有此类改变的亲本抗体相比,此类改变导致了抗体对抗原的亲和力的改善。“降低的结合”(例如降低的与Fc受体的结合)是指对相应相互作用的亲和力降低,如例如通过SPR测量的。为清楚起见,该术语还包括将亲和力降低至零(或低于分析方法的检测极限),即完全消除相互作用。相反地,“增加的结合”是指对相应相互作用的结合亲和力增加。如本文所用,“T细胞活化”是指T淋巴细胞,特别是细胞毒性T淋巴细胞的一种或多种细胞应答,选自:增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性和活化标记的表达。测量T细胞激活的合适测定是本领域已知的并在本文中描述的。如本文所用的“T细胞活化剂”是指能够诱导T细胞活化的分子,例如通过与T细胞受体(例如CD3)(的组分)结合并且将其活化。因此,示例性的T细胞活化剂可以是与CD3、特别是CD3的ε亚基结合的抗体。可用于本发明的特定T细胞活化剂是与CD3和靶细胞抗原(例如肿瘤细胞抗原)结合的双特异性抗体。这种T细胞活化双特异性抗体在本文中也称为“T细胞双特异性抗体”或“TCB”。除非另外指明,否则“CD3”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然CD3,该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖“全长”的未加工CD3,以及由细胞中的加工所产生的任何形式的CD3。该术语还涵盖CD3的天然存在的变体,例如剪接变体或等位基因变体。在一个方面,CD3是人CD3,特别是人CD3的ε亚基(CD3ε)。人CD3ε的氨基酸序列示出于UniProt(www.uniprot.org)条目P07766(第202版)中。在另一方面,CD3是食蟹猴(Macacafascicularis)CD3,特别是食蟹猴CD3ε。食蟹猴CD3ε的氨基酸序列以NCBIGenBankno.BAB71849.1示出。在某些方面,可用于本发明的T细胞活化剂与在来自不同物种的CD3抗原中保守的CD3(特别是人和食蟹猴CD3)的表位结合。在优选的方面,T细胞活化剂与人CD3结合。“促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰”是对肽骨架的操纵或Fc结构域亚基的翻译后修饰,其减少或防止包含Fc结构域亚基的多肽与相同多肽缔合以形成同源二聚体。如本文所用,“促进缔合的修饰”优选地包括对期望缔合的两个Fc结构域亚基(即Fc结构域的第一亚基和第二亚基)中的每一者进行的单独修饰,其中所述修饰彼此互补以促进这两个Fc结构域亚基的缔合。例如,促进缔合的修饰可以改变所述Fc结构域亚基中的一者或两者的结构或电荷,以便分别使它们的缔合在空间上或静电上有利。因此,(异源)二聚化发生在包含第一Fc结构域亚基的多肽与包含第二Fc结构域亚基的多肽之间,就融合至每个亚基的另外组分(例如抗原结合结构域)而言则可能是不同的。在一些方面,促进Fc结构域的第一和第二亚基缔合的修饰包括Fc结构域中的氨基酸突变,特别是氨基酸取代。在一个优选的方面,所述促进Fc结构域的第一和第二亚基缔合的修饰在Fc结构域的两个亚基中的每个亚基中包含单独的氨基酸突变,特别是氨基酸取代。术语“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区、随着抗体同种型的变化而变化的那些生物活性。抗体效应子功能的示例包括:C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、下调细胞表面受体(例如B细胞受体),以及B细胞活化。“活化性Fc受体”是这样的Fc受体:其在被抗体的Fc结构域接合后引发刺激携带该受体的细胞执行效应子功能的信号传导事件。人活化性Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。在一个方面,活化性Fc受体是FcγRIIIa(CD16a)。UniProt条目P08637(第203版)中描述了人FcγRIIIa(CD16a)及其序列。抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是导致免疫效应细胞裂解抗体包被的靶细胞的免疫机制。靶细胞是与包含Fc区的抗体或其衍生物特异性结合的细胞,该特异性结合通常是通过Fc区的N末端的蛋白质部分。如本文所用,术语“降低的ADCC”被定义为在靶细胞周围的培养基中给定抗体浓度下在给定时间内通过上面定义的ADCC机制裂解的靶细胞数量减少,和/或在靶细胞周围的培养基中通过ADCC机制在给定时间内实现对给定数量的靶细胞的裂解所必需的抗体浓度增加。ADCC降低是相对于使用相同的标准生产、纯化、配制和储存方法(该等方法为本领域技术人员已知的),由相同类型的宿主细胞产生但尚未被工程化的相同抗体介导的ADCC。例如,由在Fc结构域中包含降低ADCC的氨基酸取代的抗体介导的ADCC的降低是相对于由在Fc结构域中没有该氨基酸取代的相同抗体介导的ADCC。用于测量ADCC的合适测定法是本领域中熟知的(参见例如PCT公开号WO2006/082515或PCT公开号WO2012/130831)。如本文所用,术语“工程化、工程化的、工程改造”被认为包括对肽骨架的任何操纵,或对天然存在的或重组的多肽或其片段的翻译后修饰。工程改造包括对氨基酸序列、糖基化模式或单独氨基酸的侧链基团的修饰,以及这些方法的组合。如本文所用的术语“氨基酸突变”表示涵盖氨基酸取代、缺失、插入和修饰。可以进行取代、缺失、插入和修饰的任何组合以获得最终构建体,前提条件是所述最终构建体具有所需特征,例如减少的与Fc受体的结合,或增加的于另一种肽的缔合。氨基酸序列缺失和插入包括氨基酸的氨基末端和/或羧基末端缺失和插入。优选的氨基酸突变是氨基酸取代。出于改变例如Fc区的结合特征的目的,非保守氨基酸取代,即用具有不同结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代一种氨基酸,是特别优选的。氨基酸取代包括用非天然存在的氨基酸或用二十种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如4-羟基脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸、5-羟基赖氨酸)进行替代。可以使用本领域熟知的遗传或化学方法来产生氨基酸突变。遗传方法可包括定点诱变、PCR、基因合成等。设想通过除基因工程之外的方法(诸如化学修饰)改变氨基酸侧链基团的方法也是有用的。本文可使用各种名称来指示相同的氨基酸突变。例如,将Fc结构域的329位处的脯氨酸取代为甘氨酸可以表示为329G、G329、G329、P329G、或Pro329Gly。相对于参考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(%)”被定义为在比对候选序列与参考多肽序列并且引入空位(如果必要的话)以实现最大的序列同一性百分比之后,并且在不考虑将任何保守取代作为序列同一性的组成部分的情况下,候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以通过本领域技术范围内的各种方式来实现,例如使用公众可获得的计算机软件,诸如BLAST、BLAST-2、ClustalW、Megalign(DNASTAR)软件或FASTA程序包。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数,包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。可替代地,可以使用序列比较计算机程序ALIGN-2来生成同一性百分比值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.编写,并且源代码已经与用户文档一起提交到U.S.CopyrightOffice,WashingtonD.C.,20559,在那里以美国版权登记号TXU510087注册,并且在WO2001/007611中有所描述。除非另外指明,否则出于本文的目的,用BLOSUM50比较矩阵,使用FASTA包第36.3.8c版或更高版本的ggsearch程序产生氨基酸序列同一性%值。FASTA程序包由以下文献创作:W.R.Pearson和D.J.Lipman,“ImprovedToolsforBiologicalSequenceAnalysis”,PNAS85(1988):2444-2448;W.R.Pearson“Effectiveproteinsequencecomparison”Meth.Enzymol.266(1996):227-258;以及Pearson等人,(Genomics46(1997)24-36)并且可从www.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml或www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta公开获得。可替代地,可以使用可在fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi处访问的公共服务器来比较序列,使用ggsearch(全局蛋白质:蛋白质)程序和默认选项(BLOSUM50;开放:-10;ext:-2;Ktup=2)来确保执行全局而非局部比对。在输出比对标头中给出氨基酸同一性百分比。术语“多核苷酸”或“核酸分子”包括包含核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质。每个核苷酸由碱基组成,特别是嘌呤或嘧啶碱基(即胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(即脱氧核糖或核糖)和磷酸基团。通常,核酸分子通过碱基序列进行描述,由此所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基序列通常表示为从5'至3'。在本文中,术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(DNA)(包括例如互补DNA(cDNA)和基因组DNA)、核糖核酸(RNA)(特别是信使RNA(mRNA))、DNA或RNA的合成形式,以及包含这些分子中的两种或更多种的混合聚合物。核酸分子可以是线性的或环状的。此外,术语核酸分子包括有义链和反义链,以及单链和双链形式。此外,本文所描述的核酸分子可含有天然存在的或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的示例包括具有衍生化的糖或磷酸主链键或经化学修饰的残基的经修饰的核苷酸碱基。核酸分子还涵盖适合作为用于本发明的抗体的体外和/或体内(例如,在宿主或患者体内)直接表达的载体的DNA和RNA分子。此类DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)载体可以是未修饰的或经修饰的。例如,可以对mRNA进行化学修饰以增强RNA载体的稳定性和/或编码分子的表达,使得可以将mRNA注射到受试者体内以产生体内抗体(参见例如Stadler等人,(2017)NatureMedicine23:815-817,或EP2101823B1)。“分离的”核酸分子是指已自其自然环境的组分中分离的核酸分子。分离的核酸分子包括这样的核酸分子,其包含在通常含有所述核酸分子的细胞中,但所述核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。“编码抗体的分离的多核苷酸(或核酸)”是指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一个或多个多核苷酸分子,包括在单一载体或不同的载体中的此类多核苷酸分子,以及存在于宿主细胞中一个或多个位置的此类多核苷酸分子。如本文所用的术语“载体”是指能够载运与其相连的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体,以及并入其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。术语“宿主细胞”“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用,并且是指外源核酸已被引入其中的细胞,包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”,其包括原代转化细胞和来源于所述原代转化细胞的子代,不考虑传代次数。子代可能不与亲本细胞的核酸内容物完全一致,而是可能含有突变。本文包括如在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代。宿主细胞是可用于产生本发明的抗体的任何类型的细胞系统。宿主细胞包括培养的细胞,例如哺乳动物的培养细胞,诸如仅举几个示例HEK细胞、CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞,还包括转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。在一个方面,本发明的宿主细胞是真核细胞,特别是哺乳动物细胞。在一个方面,宿主细胞不是人体内的细胞。术语“药物组合物”或“药物制剂”是指处于允许包含在其中的活性成分的生物活性有效的形式,并且不含对于将被施用组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外组分的制剂。“药用载剂”是指药物组合物或配制物中除有效成分之外的成分,其对受试者是无毒的。药用载剂包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。如本文所用,“治疗”(及其语法变体)是指试图改变所治疗个体的疾病的自然病程,并且可以执行以用于预防或可以在临床病理学过程中执行的临床干预措施。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态,以及缓解或改善预后。在一些方面,本发明的抗体用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物,诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。在某些方面,个体或受试者是人。药剂(例如药物组合物)的“有效量”是指能够以必需的剂量在必需的时段内有效地实现期望的治疗或预防结果的量。术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包括的说明书,其含有涉及此类治疗产品的使用的有关适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或警告的信息。II.组合物和方法本发明提供了与NKG2D结合的抗体,包括与NKG2D和第二抗原结合的多特异性抗体。这些抗体对NKG2D显示出优异的结合和激动活性,并结合其他有利于治疗应用的特性,例如关于功效和安全性、药代动力学以及可生产性。本发明的抗体可用于例如治疗疾病,例如癌症。本发明的抗体特别适用于(共)刺激细胞毒性T细胞,例如联合T细胞活化剂,诸如T细胞双特异性抗体(TCB)。本发明的抗体还可以有效地活化其他表达NKG2D的免疫细胞,例如自然杀伤(NK)细胞和γδT细胞,甚至不需要通过活化性Fc受体(例如FcγRIIIa(CD16a))的同时刺激。通过避免需要Fc受体结合并且活化其功能,本发明的抗体被认为能够有效活化免疫细胞,与需要Fc受体结合并且活化其功能的NKG2D抗体相比,全身副作用的风险更小。本发明的抗体也可以以多特异性形式使用,与NKG2D和靶细胞抗原(例如肿瘤抗原)结合,从而实现靶向免疫细胞活化,但也不与活化性Fc受体(特别是FcγRIIIa(CD16a))结合,从而降低全身性副作用的风险。A.抗NKG2D抗体本发明提供了与NKG2D结合的抗体。在第一方面,本发明提供了一种与NKG2D结合的抗体,其中所述抗体包含第一抗原结合结构域,所述第一抗原结合结构域包含(i)重链可变区(VH),其包含SEQIDNO:73的重链互补决定区(HCDR)1,选自由SEQIDNO:74、SEQIDNO:102、SEQIDNO:103、SEQIDNO:104和SEQIDNO:105组成的组的HCDR2,以及SEQIDNO:75的HCDR3;和轻链可变区(VL),其包含SEQIDNO:76的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQIDNO:77的LCDR2和SEQIDNO:78的LCDR3;(ii)VH,其包含SEQIDNO:65的HCDR1、SEQIDNO:66的HCDR2和SEQIDNO:67的HCDR3;和VL,其包含SEQIDNO:68的LCDR1、SEQIDNO:69的LCDR2和SEQIDNO:70的LCDR3;(iii)VH,其包含SEQIDNO:1的HCDR1、SEQIDNO:2的HCDR2和SEQIDNO:3的HCDR3;和VL,其包含SEQIDNO:4的LCDR1、SEQIDNO:5的LCDR2和SEQIDNO:6的LCDR3;(iv)VH,其包含SEQIDNO:25的HCDR1、SEQIDNO:26的HCDR2和SEQIDNO:27的HCDR3;和VL,其包含SEQIDNO:28的LCDR1、SEQIDNO:29的LCDR2和SEQIDNO:30的LCDR3;(v)VH,其包含SEQIDNO:49的HCDR1、SEQIDNO:50的HCDR2和SEQIDNO:51的HCDR3;和VL,其包含SEQIDNO:52的LCDR1、SEQIDNO:53的LCDR2和SEQIDNO:54的LCDR3;(vi)VH,其包含SEQIDNO:57的HCDR1、SEQIDNO:58的HCDR2和SEQIDNO:59的HCDR3;和VL,其包含SEQIDNO:60的LCDR1、SEQIDNO:61的LCDR2和SEQIDNO:62的LCDR3;(vii)VH,其包含SEQIDNO:9的HCDR1、SEQIDNO:10的HCDR2和SEQIDNO:11的HCDR3;和VL,其包含SEQIDNO:12的LCDR1、SEQIDNO:13的LCDR2和SEQIDNO:14的LCDR3;(viii)VH,其包含SEQIDNO:17的HCDR1、SEQIDNO:18的HCDR2和SEQIDNO:19的HCDR3;和VL,其包含SEQIDNO:20的LCDR1、SEQIDNO:21的LCDR2和SEQIDNO:22的LCDR3;(ix)VH,其包含SEQIDNO:33的HCDR1、SEQIDNO:34的HCDR2和SEQIDNO:35的HCDR3;和VL,其包含SEQIDNO:36的LCDR1、SEQIDNO:37的LCDR2和SEQIDNO:38的LCDR3;或(x)VH,其包含SEQIDNO:41的HCDR1、SEQIDNO:42的HCDR2和SEQIDNO:43的HCDR3;和VL,其包含SEQIDNO:44的LCDR1、SEQIDNO:45的LCDR2和SEQIDNO:46的LCDR3。在一个方面,本发明提供了一种与NKG2D结合的抗体,其中所述抗体包含第一抗原结合结构域,所述第一抗原结合结构域包含(i)VH,其包含与选自由SEQIDNO:79、SEQIDNO:106、SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112和SEQIDNO:113组成的组的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列;和/或VL,其包含与SEQIDNO:80的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列;(ii)VH,其包含与SEQIDNO:71的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列;和/或VL,其包含与SEQIDNO:72的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列;(iii)VH,其包含与SEQIDNO:7的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性的氨基酸序列;和/或VL,其包含与SEQIDNO:8的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列;(iv)VH,其包含与SEQIDNO:31的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列;和/或VL,其包含与SEQIDNO:32的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列;(v)VH,其包含与SEQIDNO:55的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列;和/或VL,其包含与SEQIDNO:56的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列;(vi)VH,其包含与SEQIDNO:63的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列;和/或VL,其包含与SEQIDNO:64的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列;(vii)VH,其包含与SEQIDNO:15的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列;和/或VL,其包含与SEQIDNO:16的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列;(viii)VH,其包含与SEQIDNO:23的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列;和/或VL,其包含与SEQIDNO:24的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列;(ix)VH,其包含与SEQIDNO:39的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列;和/或VL,其包含与SEQIDNO:40的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列;或(x)VH,其包含与SEQIDNO:47的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列;和/或VL,其包含与SEQIDNO:48的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一个方面,所述抗体包含第一抗原结合结构域,所述第一抗原结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含SEQIDNO:73的重链互补决定区(HCDR)1,选自由SEQIDNO:74、SEQIDNO:102、SEQIDNO:103、SEQIDNO:104和SEQIDNO:105组成的组的HCDR2、以及SEQIDNO:75的HCDR3,所述轻链可变区包含SEQIDNO:76的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQIDNO:77的LCDR2和SEQIDNO:78的LCDR3。在一个方面,所述抗体包含第一抗原结合结构域,所述第一抗原结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含SEQIDNO:73的重链互补决定区(HCDR)1、SEQIDNO:74的HCDR2、以及SEQIDNO:75的HCDR3,所述轻链可变区包含SEQIDNO:76的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQIDNO:77的LCDR2和SEQIDNO:78的LCDR3。在一个方面,所述抗体包含第一抗原结合结构域,所述第一抗原结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含SEQIDNO:73的重链互补决定区(HCDR)1、SEQIDNO:102的HCDR2、以及SEQIDNO:75的HCDR3,所述轻链可变区包含SEQIDNO:76的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQIDNO:77的LCDR2和SEQIDNO:78的LCDR3。在一个特定方面,所述抗体包含第一抗原结合结构域,所述第一抗原结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含SEQIDNO:73的重链互补决定区(HCDR)1、SEQIDNO:104的HCDR2、以及SEQIDNO:75的HCDR3,所述轻链可变区包含SEQIDNO:76的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQIDNO:77的LCDR2和SEQIDNO:78的LCDR3。在一个方面,抗体为人源化抗体。在一个方面,抗原结合结构域是人源化抗原结合结构域(即人源化抗体的抗原结合结构域)。在一个方面,VH和/或VL是人源化可变区。在一个方面,VH是人源化可变区并且VL是人可变区。在一个方面,VH和/或VL包含受体人框架,诸如人免疫球蛋白框架或人共有框架。在一个方面,VH包含以下重链可变区序列的一个或多个重链框架序列(即FR1、FR2、FR3和/或FR4序列):选自由SEQIDNO:79、SEQIDNO:106,SEQIDNO:107,SEQIDNO:108,SEQIDNO:109,SEQIDNO:110,SEQIDNO:111,SEQIDNO:112和SEQIDNO:113组成的组的重链可变区序列,更特别是选自由SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112和SEQIDNO:113组成的组的重链可变区序列,最特别是SEQIDNO:112的重链可变区序列。在一个方面,VH包含氨基酸序列,与以下至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同:选自由SEQIDNO:79、SEQIDNO:106、SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112和SEQIDNO:113组成的组的氨基酸序列,更特别是选自由SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112和SEQIDNO:113组成的组的氨基酸序列,最特别是SEQIDNO:112的氨基酸序列。在一个方面,VH包含氨基酸序列,与以下至少约有95%相同:选自由SEQIDNO:79、SEQIDNO:106、SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112和SEQIDNO:113组成的组的氨基酸序列,更特别是选自由SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112和SEQIDNO:113组成的组的氨基酸序列,最特别是SEQIDNO:112的氨基酸序列。在一个方面,VH包含氨基酸序列,与以下至少约有98%相同:选自由SEQIDNO:79、SEQIDNO:106、SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112和SEQIDNO:113组成的组的氨基酸序列,更特别是选自由SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112和SEQIDNO:113组成的组的氨基酸序列,最特别是SEQIDNO:112的氨基酸序列。在某些方面,至少具有95%、96%、97%、98%或99%同一性的VH序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失,但是包含该序列的抗体保留了与NKG2D结合的能力。在某些方面,在选自由以下项组成的组的氨基酸序列中:SEQIDNO:79、SEQIDNO:106、SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112和SEQIDNO:113,更特别是在选自由以下项组成的组的氨基酸序列中:SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112和SEQIDNO:113,最特别是在SEQIDNO:112的氨基酸序列中,总共有1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些方面,取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即,在FR中)。在一个方面,VH包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列:SEQIDNO:79、SEQIDNO:106、SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112和SEQIDNO:113,更特别是选自由以下项组成的组的氨基酸序列:SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112和SEQIDNO:113,最特别是SEQIDNO:112的氨基酸序列。任选地,VH包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列:SEQIDNO:79、SEQIDNO:106、SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112和SEQIDNO:113,更特别是选自由以下项组成的组的氨基酸序列:SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112和SEQIDNO:113,最特别是SEQIDNO:112的氨基酸序列,包括该序列的翻译后修饰。在一个方面,VL包含SEQIDNO:80的轻链可变区序列的一个或多个轻链框架序列(即FR1、FR2、FR3和/或FR4序列)。在一个方面,VL包含与SEQIDNO:80的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列。在一个方面,VL包含与SEQIDNO:80的氨基酸序列至少约有95%相同的氨基酸序列。在一个方面,VL包含与SEQIDNO:80的氨基酸序列至少约有98%相同的氨基酸序列。在某些方面,至少具有95%、96%、97%、98%或99%同一性的VL序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失,但是包含该序列的抗体保留了与NKG2D结合的能力。在某些方面,在SEQIDNO:80的氨基酸序列中,总共有1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些方面,取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即,在FR中)。在一个方面,所述VL包含SEQIDNO:80的氨基酸序列。任选地,所述VL包含SEQIDNO:80的氨基酸序列,包括该序列的翻译后修饰。在一个方面,VH包含氨基酸序列,与以下至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同:选自由SEQIDNO:79、SEQIDNO:106、SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112和SEQIDNO:113组成的组的氨基酸序列,更特别是选自由SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112和SEQIDNO:113组成的组的氨基酸序列,最特别是SEQIDNO:112的氨基酸序列;并且VL包含与SEQIDNO:80的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列。在一个方面,VH包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列:SEQIDNO:79、SEQIDNO:106、SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112和SEQIDNO:113,更特别是选自由以下项组成的组的氨基酸序列:SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112和SEQIDNO:113,最特别是SEQIDNO:112的氨基酸序列;并且所述VL包含SEQIDNO:80的氨基酸序列。在另一个方面,本发明提供了与NKG2D结合的抗体,其中该抗体包含第一抗原结合结构域,所述第一抗原结合结构域包含VH和VL,所述VH包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列:SEQIDNO:79、SEQIDNO:106、SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112和SEQIDNO:113,更特别是选自由以下项组成的组的氨基酸序列:SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112和SEQIDNO:113,最特别是SEQIDNO:112的氨基酸序列;并且所述VL包含SEQIDNO:80的氨基酸序列。在另一个方面,本发明提供了与NKG2D结合的抗体,其中该抗体包含第一抗原结合结构域,所述第一抗原结合结构域包含VH序列和VL序列,所述VH序列选自由以下项组成的组:SEQIDNO:79、SEQIDNO:106、SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112和SEQIDNO:113,更特别是所述VH序列选自由以下项组成的组:SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112和SEQIDNO:113,最特别是所述VH序列是SEQIDNO:112的VH序列;并且所述VL序列是SEQIDNO:80的VL序列。在另一方面,本发明提供了与NKG2D结合的抗体,其中该抗体包含第一抗原结合结构域,所述第一抗原结合结构域包含VH和VL,所述VH包含VH的重链CDR序列,所述VH选自由以下项组成的组:SEQIDNO:79、SEQIDNO:106、SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112和SEQIDNO:113,更特别是所述VH选自由以下项组成的组:SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112和SEQIDNO:113,最特别是所述VH是SEQIDNO:112的VH;所述VL包含SEQIDNO:80的VL的轻链CDR序列。在另一个方面,所述第一抗原结合结构域包含VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列和SEQIDNO:11的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列,所述VH选自由以下项组成的组:SEQIDNO:79、SEQIDNO:106、SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112和SEQIDNO:113,更特别是所述VH选自由以下项组成的组:SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112和SEQIDNO:113,最特别是所述VH是SEQIDNO:112的VH。在一个方面,所述VH包含VH的重链CDR序列,和框架,所述VH选自由以下项组成的组:SEQIDNO:79、SEQIDNO:106、SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112和SEQIDNO:113,更特别是所述VH选自由以下项组成的组:SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112和SEQIDNO:113,最特别是所述VH是SEQIDNO:112的VH,所述框架与以下的VH的框架序列至少有95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性:选自由SEQIDNO:79、SEQIDNO:106、SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112和SEQIDNO:113组成的组的VH,更特别是选自由SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112和SEQIDNO:113组成的组的VH,最特别是SEQIDNO:112的VH。在一个方面,所述VH包含VH的重链CDR序列,和框架,所述VH选自由以下项组成的组:SEQIDNO:79、SEQIDNO:106、SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112和SEQIDNO:113,更特别是所述VH选自由以下项组成的组:SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112和SEQIDNO:113,最特别是所述VH是SEQIDNO:112的VH,所述框架与以下的VH的框架序列至少有95%的序列同一性:选自由SEQIDNO:79、SEQIDNO:106、SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112和SEQIDNO:113组成的组的VH,更特别是选自由SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112和SEQIDNO:113组成的组的VH,最特别是SEQIDNO:112的VH。在另一方面,所述VH包含VH的重链CDR序列,和框架,所述VH选自由以下项组成的组:SEQIDNO:79、SEQIDNO:106、SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112和SEQIDNO:113,更特别是所述VH选自由以下项组成的组:SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112和SEQIDNO:113,最特别是所述VH是SEQIDNO:112的VH,所述框架与以下的VH的框架序列至少有98%的序列同一性:选自由SEQIDNO:79、SEQIDNO:106、SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112和SEQIDNO:113组成的组的VH,更特别是选自由SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112和SEQIDNO:113组成的组的VH,最特别是SEQIDNO:112的VH。在一个方面,VL包含SEQIDNO:80的VL的轻链CDR序列,和框架,所述框架与SEQIDNO:80的VL的框架序列至少有95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。在一个方面,VL包含SEQIDNO:80的VL的轻链CDR序列,和框架,所述框架与SEQIDNO:80的VL的框架序列至少有95%的序列同一性。在另一方面,VL包含SEQIDNO:80的VL的轻链CDR序列,和框架,所述框架与SEQIDNO:80的VL的框架序列至少有98%的序列同一性。在一个方面,所述抗体包含第一抗原结合结构域,所述第一抗原结合结构域包含VH和VL,所述VH包含SEQIDNO:65的HCDR1、SEQIDNO:66的HCDR2和SEQIDNO:67的HCDR3,所述VL包含SEQIDNO:68的LCDR1、SEQIDNO:69的LCDR2和SEQIDNO:70的LCDR3。在一个方面,抗体为人抗体。在一个方面,抗原结合结构域是人抗原结合结构域(即人抗体的抗原结合结构域)。在一个方面,VH和/或VL是人可变区。在一个方面,VH和/或VL包含人框架,例如人免疫球蛋白框架。在一个方面,VH包含SEQIDNO:71的重链可变区序列的一个或多个重链框架序列(即FR1、FR2、FR3和/或FR4序列)。在一个方面,VH包含与SEQIDNO:71的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列。在一个方面,VH包含与SEQIDNO:71的氨基酸序列至少约有95%相同的氨基酸序列。在一个方面,VH包含与SEQIDNO:71的氨基酸序列至少约有98%相同的氨基酸序列。在某些方面,至少具有95%、96%、97%、98%或99%同一性的VH序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失,但是包含该序列的抗体保留了与NKG2D结合的能力。在某些方面,在SEQIDNO:71的氨基酸序列中,总共有1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些方面,取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即,在FR中)。在一个方面,VH包含SEQIDNO:71的氨基酸序列。任选地,VH包含SEQIDNO:71的氨基酸序列,包括该序列的翻译后修饰。在一个方面,VL包含SEQIDNO:72的轻链可变区序列的一个或多个轻链框架序列(即FR1、FR2、FR3和/或FR4序列)。在一个方面,VL包含与SEQIDNO:72的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列。在一个方面,VL包含与SEQIDNO:72的氨基酸序列至少约有95%相同的氨基酸序列。在一个方面,VL包含与SEQIDNO:72的氨基酸序列至少约有98%相同的氨基酸序列。在某些方面,至少具有95%、96%、97%、98%或99%同一性的VL序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失,但是包含该序列的抗体保留了与NKG2D结合的能力。在某些方面,在SEQIDNO:72的氨基酸序列中,总共有1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些方面,取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即,在FR中)。在一个方面,所述VL包含SEQIDNO:72的氨基酸序列。任选地,所述VL包含SEQIDNO:72的氨基酸序列,包括该序列的翻译后修饰。在一个方面,所述VH包含与SEQIDNO:71的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列,并且所述VL包含与SEQIDNO:72的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列。在一个方面,所述VH包含SEQIDNO:71的氨基酸序列,并且所述VL包含SEQIDNO:72的氨基酸序列。在另一个方面,本发明提供了与NKG2D结合的抗体,其中所述抗体包含第一抗原结合结构域,所述第一抗原结合结构域包含VH和VL,所述VH包含SEQIDNO:71的氨基酸序列,所述VL包含SEQIDNO:72的氨基酸序列。在另一个方面,本发明提供了与NKG2D结合的抗体,其中所述抗体包含第一抗原结合结构域,所述第一抗原结合结构域包含SEQIDNO:71的VH序列和SEQIDNO:72的VL序列。在另一方面,本发明提供了与NKG2D结合的抗体,其中所述抗体包含第一抗原结合结构域,所述第一抗原结合结构域包含VH和Vl,所述VH包含SEQIDNO:71的VH的重链CDR序列,所述VL包含SEQIDNO:72的VL的轻链CDR序列。在另一个方面,第一抗原结合结构域包含SEQIDNO:71的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列和SEQIDNO:72的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。在一个方面,VH包含SEQIDNO:71的VH的重链CDR序列,和框架,所述框架与SEQIDNO:71的VH的框架序列至少有95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。在一个方面,VH包含SEQIDNO:71的VH的重链CDR序列,和框架,所述框架与SEQIDNO:71的VH的框架序列至少有95%的序列同一性。在另一方面,VH包含SEQIDNO:71的VH的重链CDR序列,和框架,所述框架与SEQIDNO:71的VH的框架序列至少有98%的序列同一性。在一个方面,VL包含SEQIDNO:72的VL的轻链CDR序列,和框架,所述框架与SEQIDNO:72的VL的框架序列至少有95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。在一个方面,VL包含SEQIDNO:72的VL的轻链CDR序列,和框架,所述框架与SEQIDNO:72的VL的框架序列至少有95%的序列同一性。在另一方面,VL包含SEQIDNO:72的VL的轻链CDR序列,和框架,所述框架与SEQIDNO:72的VL的框架序列至少有98%的序列同一性。在一个方面,所述抗体包含第一抗原结合结构域,所述第一抗原结合结构域包含VH和VL,所述VH包含SEQIDNO:1的HCDR1、SEQIDNO:2的HCDR2和SEQIDNO:3的HCDR3,所述VL包含SEQIDNO:4的LCDR1、SEQIDNO:5的LCDR2和SEQIDNO:6的LCDR3。在一个方面,抗体为人抗体。在一个方面,抗原结合结构域是人抗原结合结构域(即人抗体的抗原结合结构域)。在一个方面,VH和/或VL是人可变区。在一个方面,VH和/或VL包含人框架,例如人免疫球蛋白框架。在一个方面,VH包含SEQIDNO:7的重链可变区序列的一个或多个重链框架序列(即FR1、FR2、FR3和/或FR4序列)。在一个方面,VH包含与SEQIDNO:7的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列。在一个方面,VH包含与SEQIDNO:7的氨基酸序列至少约有95%相同的氨基酸序列。在一个方面,VH包含与SEQIDNO:7的氨基酸序列至少约有98%相同的氨基酸序列。在某些方面,至少具有95%、96%、97%、98%或99%同一性的VH序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失,但是包含该序列的抗体保留了与NKG2D结合的能力。在某些方面,在SEQIDNO:7的氨基酸序列中,总共有1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些方面,取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即,在FR中)。在一个方面,VH包含SEQIDNO:7的氨基酸序列。任选地,VH包含SEQIDNO:7的氨基酸序列,包括该序列的翻译后修饰。在一个方面,VL包含SEQIDNO:8的轻链可变区序列的一个或多个轻链框架序列(即FR1、FR2、FR3和/或FR4序列)。在一个方面,VL包含与SEQIDNO:8的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列。在一个方面,VL包含与SEQIDNO:8的氨基酸序列至少约有95%相同的氨基酸序列。在一个方面,VL包含与SEQIDNO:8的氨基酸序列至少约有98%相同的氨基酸序列。在某些方面,至少具有95%、96%、97%、98%或99%同一性的VL序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失,但是包含该序列的抗体保留了与NKG2D结合的能力。在某些方面,在SEQIDNO:8的氨基酸序列中,总共有1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些方面,取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即,在FR中)。在一个方面,所述VL包含SEQIDNO:8的氨基酸序列。任选地,所述VL包含SEQIDNO:8的氨基酸序列,包括该序列的翻译后修饰。在一个方面,所述VH包含与SEQIDNO:7的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列,并且所述VL包含与SEQIDNO:8的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列。在一个方面,所述VH包含SEQIDNO:7的氨基酸序列,并且所述VL包含SEQIDNO:8的氨基酸序列。在另一个方面,本发明提供了与NKG2D结合的抗体,其中所述抗体包含第一抗原结合结构域,所述第一抗原结合结构域包含VH和VL,所述VH包含SEQIDNO:7的氨基酸序列,所述VL包含SEQIDNO:8的氨基酸序列。在另一个方面,本发明提供了与NKG2D结合的抗体,其中所述抗体包含第一抗原结合结构域,所述第一抗原结合结构域包含SEQIDNO:7的VH序列和SEQIDNO:8的VL序列。在另一方面,本发明提供了与NKG2D结合的抗体,其中所述抗体包含第一抗原结合结构域,所述第一抗原结合结构域包含VH和Vl,所述VH包含SEQIDNO:7的VH的重链CDR序列,所述VL包含SEQIDNO:8的VL的轻链CDR序列。在另一个方面,第一抗原结合结构域包含SEQIDNO:7的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列和SEQIDNO:8的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。在一个方面,VH包含SEQIDNO:7的VH的重链CDR序列,和框架,所述框架与SEQIDNO:7的VH的框架序列至少有95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。在一个方面,VH包含SEQIDNO:7的VH的重链CDR序列,和框架,所述框架与SEQIDNO:7的VH的框架序列至少有95%的序列同一性。在另一方面,VH包含SEQIDNO:7的VH的重链CDR序列,和框架,所述框架与SEQIDNO:7的VH的框架序列至少有98%的序列同一性。在一个方面,VL包含SEQIDNO:8的VL的轻链CDR序列,和框架,所述框架与SEQIDNO:8的VL的框架序列至少有95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。在一个方面,VL包含SEQIDNO:8的VL的轻链CDR序列,和框架,所述框架与SEQIDNO:8的VL的框架序列至少有95%的序列同一性。在另一方面,VL包含SEQIDNO:8的VL的轻链CDR序列,和框架,所述框架与SEQIDNO:8的VL的框架序列至少有98%的序列同一性。在一个方面,本发明提供了与NKG2D结合的抗体,其中所述抗体包含第一抗原结合结构域,所述第一抗原结合结构域包含VH序列和VL序列,所述VH序列如在上文提供的方面中任一项所述,所述VL序列如在上文提供的方面中任一项所述。在一个方面,抗体包含人恒定区。在一个方面,抗体是包含人恒定区的免疫球蛋白分子,特别是包含人CH1、CH2、CH3和/或CL结构域的IgG类免疫球蛋白分子。人恒定结构域的示例性序列在SEQIDNO:83和SEQIDNO:84(分别为人κ和λCL结构域)和SEQIDNO:85(人IgG1重链恒定结构域CH1-CH2-CH3)中给出。在一个方面,所述抗体包含轻链恒定区,所述轻链恒定区包含与SEQIDNO:83或SEQIDNO:84的氨基酸序列,特别是SEQIDNO:83的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。在一个方面,所述抗体包含重链恒定区,所述重链恒定区包含与SEQIDNO:85的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。具体地,重链恒定区可包含如本文所述的Fc结构域中的氨基酸突变。在一个方面,第一抗原结合结构域包含人恒定区。在一个方面,第一抗原结合部分是包含人恒定区,特别是人CH1和/或CL结构域的Fab分子。在一个方面,第一抗原结合结构域包含轻链恒定区,该轻链恒定区包含的氨基酸序列,与SEQIDNO:83或SEQIDNO:84的氨基酸序列,特别是SEQIDNO:83的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。具体地,轻链恒定区可以包含如本文所述处于“荷电改性”下的氨基酸突变和/或如果在交叉Fab分子中则可以包含对一个或多个(特别是两个)N末端氨基酸的缺失或取代。在一个方面,第一抗原结合结构域包含重链恒定区,该重链恒定区包含的氨基酸序列,与包含在SEQIDNO:85所示氨基酸序列中的CH1结构域序列至少约有95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。具体地,重链恒定区(特别是CH1结构域)可以包含如本文所述处于“荷电改性”下的氨基酸突变。在一个方面,抗体为单克隆抗体。在一个方面,抗体是IgG,特别是IgG1抗体。在一个方面,抗体是全长抗体。在另一方面,抗体是选自下组的抗体片段:Fv分子、scFv分子、Fab分子和F(ab’)2分子;特别是Fab分子。在另一方面,抗体片段是双体抗体、三体抗体或四体抗体。根据本发明的抗体中包含的第一抗原结合结构域与NKG2D结合。在一个优选的方面,抗体包含不超过一个与NKG2D结合的抗原结合结构域。在一个方面,抗体提供了与NKG2D的单价结合。在其他方面,抗体包含多于一个(例如两个、三个或四个)与NKG2D结合的抗原结合结构域。在一个方面,抗体提供了与NKG2D的多价结合。在一个方面,抗体包含与NKG2D结合的两个抗原结合结构域。在一个方面,抗体提供了与NKG2D的二价结合。在另一方面,抗体包含四个与NKG2D结合的抗原结合结构域。在一个方面,抗体提供了与NKG2D的四价结合。在其中抗体包含多于一个与NKG2D结合的抗原结合结构域的方面,优选地所有这些抗原结合结构域都是相同的,即它们具有相同的分子形式(例如常规的或交叉的Fab分子)并且包含相同的氨基酸序列。在另一方面,第一抗原结合结构域是选自下组的抗体片段:Fv分子、scFv分子、Fab分子和F(ab’)2分子。在一个方面,第一抗原结合结构域是Fab分子。在一个优选的方面,第一抗原结合结构域是Fab分子,其中所述Fab轻链和所述Fab重链的所述可变结构域VL和VH彼此替换或所述恒定结构域CL和CH1彼此替换,特别是所述可变结构域VL和VH彼此替换(即第一抗原结合结构域是交叉Fab分子)。在另一个方面,根据上述实施例中任一项所述的抗体可单独或组合地并入如以下第II.A.1.-10节所述的特征。在一个优选的方面,抗体包含Fc结构域,特别是IgGFc结构域,更特别是IgG1Fc结构域。在一个方面,Fc结构域是人Fc结构域。在一个方面,所述Fc结构域是IgG1Fc结构域。Fc结构域由第一亚基和第二亚基构成,并且可以单独或组合地并入如下文关于Fc结构域域变体(第II.A.10.节)中所述的任何特征。在另一优选的方面,抗体包含与第二抗原结合的第二抗原结合结构域(即,抗体是多特异性抗体,如下文进一步描述的(第II.A.9.节)。1.抗体片段在某些方面,本文提供的抗体是抗体片段。在一个方面,抗体片段是Fab’、Fab’-SH或F(ab’)2分子,特别是如本文所述的Fab分子。“Fab’分子”与Fab分子的不同之处在于Fab’片段在CH1结构域的羧基末端添加了残基,这些残基包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是Fab’分子,其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离巯基。胃蛋白酶处理产生F(ab')2分子,该分子具有两个抗原结合位点(两个Fab分子)和Fc区的一部分。在另一方面,抗体片段是双体抗体、三体抗体或四体抗体。“双体抗体”是具有两个抗原结合位点的抗体片段,其可以是二价或双特异性的。参见,例如,EP404,097;WO1993/01161;Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003);和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)。三体抗体和四体抗体也在Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)中进行了描述。在另一个方面,抗体片段是单链Fab分子。“单链Fab分子”或“scFab”是由抗体重链可变结构域(VH)、抗体重链恒定结构域1(CH1)、抗体轻链可变结构域(VL)、抗体轻链恒定结构域(CL)和连接基组成的多肽,其中所述抗体结构域和所述连接基在N端至C端方向上具有以下顺序中的一种:a)VH-CH1-连接基-VL-CL、b)VL-CL-连接基-VH-CH1、c)VH-CL-连接基-VL-CH1,或d)VL-CH1-连接基-VH-CL。特别地,所述连接基是至少30个氨基酸,优选地在32个与50个氨基酸之间的多肽。所述单链Fab分子经由CL结构域与CH1结构域之间的天然二硫键而稳定化。此外,这些单链Fab分子可以通过经由插入半胱氨酸残基(例如根据Kabat编号的可变重链中的44位和可变轻链中的100位)产生链间二硫键,而进一步稳定化。在另一方面,抗体片段是单链可变片段(scFv)。“单链可变片段”或“scFv”是抗体的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的融合蛋白,是通过连接基连接的。特别地,连接基是10个至约25个氨基酸的短多肽,并且通常富含甘氨酸以获得柔性,以及富含丝氨酸或苏氨酸以获得溶解性,并且可以将VH的N-末端与VL的C-末端连接,或反之亦然。尽管去除了恒定区并且引入了连接基,但该蛋白质仍保留了原始抗体的特异性。关于scFv片段的综述,参见例如Plückthun,载于ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag,NewYork,第269至第315页(1994);还可参见WO93/16185;以及美国专利号5,571,894和5,587,458。在另一方面,抗体片段是单结构域抗体。“单结构域抗体”是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或者抗体的全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些方面,单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA;参见例如美国专利号6,248,516B1)。抗体片段可以通过各种技术制备,包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌)重组产生,如本文所述。2.嵌合抗体和人源化抗体在某些方面,本文提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于,例如,美国专利号4,816,567和Morrison等人,,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)中。在一个实例中,嵌合抗体包含非人可变区(例如,衍生自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长动物诸如猴的可变区)和人恒定区。在另一个实例中,嵌合抗体为其中类别或亚类已经与亲本抗体的类别或亚类改变的“类别转换”抗体。嵌合抗体包括其抗原结合片段。在某些方面,本文提供的抗体是人源化抗体。通常,将非人抗体人源化以减少对人的免疫原性,同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常,人源化抗体包含一个或多个可变结构域,其中CDR(或其部分)源自非人抗体,并且FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人恒定区的至少一部分。在一些方面,人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如,CDR残基所来源于的抗体)的相应残基取代,例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。人源化抗体及其制备方法在例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中综述,并且进一步描述于例如Riechmann等人,Nature332:323-329(1988);Queen等人,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA86:10029-10033(1989);美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409;Kashmiri等人,Methods36:25-34(2005)(描述了特异性决定区(SDR)移植);Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了“表面再塑”);Dall’Acqua等人,Methods36:43-60(2005)(描述了“FR改组”);以及Osbourn等人,Methods36:61-68(2005)和Klimka等人,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述了用于FR改组的“指导选择”方法)中。可用于人源化的人架构区包括但不限于:使用“最佳拟合”方法选择的架构区(参见例如Sims等人,J.Immunol.151:2296(1993));来源于轻链或重链可变区的特定子组的人抗体的共有序列的架构区(参见,例如,Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992);以及Presta等人,J.Immunol.,151:2623(1993));人成熟(体细胞突变)架构区或人类种系架构区(参见,例如,Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008));以及来源于筛选FR文库的架构区(参见,例如,Baca等人,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等人,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。3.人源化抗体在某些方面,本文提供的抗体是人抗体。可以使用本领域已知的各种技术来产生人抗体。人抗体一般描述于vanDijk和vandeWinkel,CurrOpinPharmacol.5:368-74(2001)和Lonberg,CurrOpinImmunol.20:450-459(2008)中。可以通过以下方式来制备人抗体:将免疫原施用于转基因动物,所述转基因动物已被修饰以响应于抗原激发而产生具有人可变区的完整人抗体或完整抗体。此类动物通常含有全部或部分人免疫球蛋白基因座,所述全部或部分人免疫球蛋白基因座替代内源性免疫球蛋白基因座,或者在动物的染色体外存在或随机整合至动物的染色体中。在此类转基因动物中,内源性免疫球蛋白基因座通常已被灭活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述,参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还参见例如描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584;描述技术的美国专利号5,770,429;描述K-M技术的美国专利号7,041,870,以及描述技术的美国专利申请公开号US2007/0061900)。可以进一步修饰来自由此类动物产生的完整抗体的人可变区,例如通过与不同的人恒定区组合。人抗体也可以通过基于杂交瘤的方法制备。已经描述了用于生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系(参见例如KozborJ.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur等人,MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,pp.51-63(MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987);和Boerner等人,J.Immunol.,147:86(1991))。经由人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也如Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)所述。另外的方法包括例如在美国专利号7,189,826(描述了从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,XiandaiMianyixue,26(4):265-268(2006)(描述了人-人杂交瘤)中描述的那些方法。人类杂交瘤技术(Trioma技术)也描述于Vollmers和Brandlein,HistologyandHistopathology,20(3):927-937(2005)和Vollmers和Brandlein,MethodsandFindingsinExperimentalandClinicalPharmacology,27(3):185-91(2005)中。人抗体还可以通过分离选自人源噬菌体展示文库的可变结构域序列产生。然后可以将此类可变结构域序列与预期的人恒定结构域结合。从抗体文库中选择人抗体的技术描述如下。4.源自文库的抗体在某些方面,本文提供的抗体衍生自文库。可以通过筛选组合文库中具有一个或多个所需活性的抗体来分离本发明的抗体。用于筛选组合文库的方法综述于例如Lerner等人,NatureReviews16:498-508(2016)中。例如,本领域已知多种方法用于产生噬菌体展示文库并对此类文库筛选具有所需结合特征的抗体。此类方法综述于例如Frenzel等人,mAbs8:1177-1194(2016);Bazan等人,HumanVaccinesandImmunotherapeutics8:1817-1828(2012)和Zhao等人,CriticalReviewsinBiotechnology36:276-289(2016)中,以及Hoogenboom等人,MethodsinMolecularBiology178:1-37(O’Brien等人编辑,HumanPress,Totowa,NJ,2001)中和Marks和Bradbury,MethodsinMolecularBiology248:161-175(Lo编辑,HumanPress,Totowa,NJ,2003)中。在某些噬菌体展示方法中,将VH和VL基因的所有组成成分通过聚合酶链式反应(PCR)单独克隆,并在噬菌体文库中随机重组,然后可以从所述噬菌体文库中筛选抗原结合噬菌体,如在Winter等人,AnnualReviewofImmunology12:433-455(1994)中所描述的。噬菌体通常将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或Fab片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体,而无需构建杂交瘤。可替代地,可以克隆所有天然组成成分(例如,来自人的所有天然组成成分)以提供针对广泛的非自身抗原和自身抗原的抗体的单一来源,而无需任何免疫,如由Griffiths等人在EMBOJournal12:725-734(1993)中所描述的。此外,还通过以下方式来合成天然文库:克隆来自干细胞的未重排的V基因区段;以及使用含有随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区并完成体外重排,如由Hoogenboom和Winter在JournalofMolecularBiology227:381-388(1992)中所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利出版物包括,例如:美国专利号5,750,373;7,985,840;7,785,903和8,679,490以及美国专利公开号2005/0079574、2007/0117126、2007/0237764和2007/0292936。本领域已知用于筛选具有一种或多种所需活性的抗体的组合文库的方法的其他实例包括核糖体和mRNA展示,以及对细菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或酵母细胞进行抗体展示和选择的方法。用于酵母表面展示的方法综述于例如Scholler等人,MethodsinMolecularBiology503:135-56(2012)和Cherf等人,MethodsinMolecularbiology1319:155-175(2015)以及Zhao等人,MethodsinMolecularBiology889:73-84(2012)中。用于核糖体展示的方法描述于例如He等人,NucleicAcidsResearch25:5132-5134(1997)和Hanes等人,PNAS94:4937-4942(1997)中。在本文中从人抗体文库分离出的抗体或抗体片段被认为是人抗体或人抗体片段。5.糖基化变体在某些方面,改变本文提供的抗体以增加或降低抗体糖基化的程度。抗体添加或缺失糖基化位点可以通过改变氨基酸序列以产生或去除一个或多个糖基化位点来方便地实现。当抗体包含Fc区时,与其相连的寡糖可以被改变。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含具有支链的双触角寡糖,所述双触角寡糖通常通过N-连接附接于Fc区的CH2结构域的Asn297。参见,例如,Wright等人TIBTECH15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物,例如,甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸,以及附接于双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些方面中,可对本发明的抗体中的寡糖进行修饰,以产生具有某些改善的特性的抗体变体。一方面,提供了具有非岩藻糖基化的寡糖的抗体变体,即缺少(直接或间接地)连接在Fc区的岩藻糖的寡糖结构。这样的非岩藻糖基化的寡糖(也称为“去岩藻糖基化”的寡糖)特别是N-连接的寡糖,其缺少在双触角寡糖结构的茎中连接第一GlcNAc的岩藻糖残基。一方面,提供了与天然或亲本抗体相比在Fc区中具有增加比例的非岩藻糖基化寡糖的抗体变体。例如,非岩藻糖基化寡糖的比例可以为至少约20%、至少约40%、至少约60%、至少约80%或甚至约100%(即不存在岩藻糖基化寡糖)。非岩藻糖基化寡糖的百分比,如例如WO2006/082515中所述,如通过MALDI-TOF质谱法测量的,是缺少岩藻糖残基的寡糖的(平均)量相对于与Asn297连接的所有寡糖(例如复杂、杂合和高甘露糖结构)之和。Asn297是指位于Fc区中约297位的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号);然而,由于抗体中的微小序列变化,Asn297也可以位于297位上游或下游大约±3个氨基酸,即在294位和300位之间。在Fc区中具有非岩藻糖基化寡糖比例增加的此类抗体可具有改善的FcγRIIIa受体结合和/或改善的效应子功能,特别是改善的ADCC功能。参见例如US2003/0157108和US2004/0093621。能够产生岩藻糖基化减少的抗体的细胞系的实例包括缺乏蛋白质岩藻糖基化的Lec13CHO细胞(Ripka等人.Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986);US2003/0157108;和WO2004/056312,尤其是在实例11中),以及敲除细胞系,例如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因,FUT8,敲除CHO细胞(参见,例如,Yamane-Ohnuki等人.Biotech.Bioeng.87:614-622(2004);Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006);和WO2003/085107),或具有降低或取消的GDP-岩藻糖合成或转运蛋白活性的细胞(参见,例如,US2004259150、US2005031613、US2004132140、US2004110282)。在另一方面,抗体变体提供了二等分的寡糖,例如,其中连接至抗体的Fc区的双触角寡糖被GlcNAc二等分。如上所述,这样的抗体变体可以具有减少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的实例描述于例如Umana等人,NatBiotechnol17,176-180(1999);Ferrara等人,BiotechnBioeng93,851-861(2006);WO99/54342;WO2004/065540,WO2003/011878。还提供了在附接于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体描述于例如WO1997/30087、WO1998/58964和WO1999/22764中。6.半胱氨酸工程抗体变体在某些方面,可能需要产生半胱氨酸工程化改造的抗体,例如THIOMABTM抗体,其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在优选的方面,取代的残基存在于抗体的可接近位点。如本文进一步描述的,通过用半胱氨酸取代那些残基,从而将反应性硫醇基团定位于抗体的可接近位点,并且可用于将抗体与其他部分(诸如药物部分或连接基-药物部分)缀合,以产生免疫缀合物。半胱氨酸工程化改造的抗体可以如例如在美国专利号7,521,541、8,30,930、7,855,275、9,000,130或WO2016040856中所述产生。7.抗体衍生物在某些方面,可进一步修饰本文提供的抗体以使其含有本领域已知且易于获得的另外的非蛋白质部分。适合于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性示例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇以及它们的混合物。由于其在水中的稳定性,聚乙二醇丙醛在制造中可具有优势。聚合物可具有任何分子量,并且可以具有支链或不具有支链。附接至抗体的聚合物的数目可变,并且如果附接了多于一个聚合物,那么它们可以为相同或不同的分子。通常,可基于以下考虑因素测定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型,包括但不限于抗体待改善的特定特性或功能、抗体衍生物是否将用于限定条件下的疗法等。8.免疫缀合物本发明还提供了免疫缀合物,其包含本文的抗NKG2D抗体,该抗体缀合(化学键合)至一种或多种治疗剂,例如细胞毒性剂、化学治疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如,蛋白毒素,细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素。一方面,免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC),其中抗体缀合至上述一种或多种治疗剂。通常使用连接基将抗体连接至一种或多种治疗剂。PharmacolReview68:3-19(2016)中列出了ADC技术的概述,其包括治疗剂、药物和连接基的实例。在另一方面,免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的本发明的抗体,所述酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-sarcin、油桐蛋白、石竹素蛋白(dianthinprotein)、美洲商陆蛋白(Phytolacaamericanaprotein)(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂(momordicacharantiainhibitor)、麻疯树毒素(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草抑制剂(sapaonariaofficinalisinhibitor)、明胶、mitogellin、局限曲霉素、酚霉素、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(tricothecenes)。在另一方面,免疫缀合物包括与放射性原子缀合以形成放射性缀合物的本发明的抗体。多种放射性同位素可用于生产放射性缀合物。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当放射性缀合物用于检测时,它可能包含用于闪烁显像研究的放射性原子,例如,Tc99m或I123,或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像,MRI)的自旋标记物,例如I123、I131、In111、F19、C13、N15、O17、钆、锰或铁。可以使用多种双功能蛋白偶联剂,诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨基酯的双官能衍生物(诸如己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)制备抗体和细胞毒剂的缀合物。例如,可以如Vitetta等人,Science238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)为一种示例性螯合剂,用于将放射性核苷酸缀合至抗体。参见WO94/11026。连接基可以为促进细胞中细胞毒性药物释放的“可切割连接基”。例如,可以使用对酸不稳定的连接基、肽酶敏感的连接基、对光不稳定的连接基、二甲基连接基或含二硫键的连接基(Chari等人,CancerRes.52:127-131(1992);美国专利号5,208,020)。本文的免疫缀合物或ADC明确考虑但不限于用交联剂制备的此类缀合物,包括但不限于市售的(例如,来自PierceBiotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC、磺基-SMPB和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。9.多特异性抗体在某些方面,本文提供的抗体是多特异性抗体,特别是双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两种不同的抗原决定簇(例如,两种不同的蛋白质,或同一蛋白质上的两种不同表位)具有结合特异性的单克隆抗体。在某些方面,多特异性抗体具有三种或更多种结合特异性。在某些方面,结合特异性中的一种是针对NKG2D的,并且另一种特异性是针对任何其他抗原的。在某些方面,多特异性抗体可结合NKG2D的两个(或更多个)不同的表位。多特异性(例如双特异性)抗体也可用于将细胞毒剂或细胞定位于表达NKG2D的细胞。可以将多特异性抗体制备为全长抗体或抗体片段。用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两种免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello,Nature305:537(1983))及“杵臼结构”工程化(参见例如,美国专利5,731,168,以及Atwell等人,J.Mol.Biol.270:26(1997))。多特异性抗体还可以通过以下方式来制备:工程化用于制备抗体Fc-异二聚体分子的静电操纵效应(参见例如,WO2009/089004);使两个或更多个抗体或片段交联(参见例如,美国专利4,676,980,以及Brennan等人,Science,229:81(1985));使用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体(参见例如,Kostelny等人,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)和WO2011/034605);使用用于避免轻链错配问题的通用轻链技术(参见例如,WO98/50431);使用用于制备双特异性抗体片段的“双体抗体”技术(参见例如Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993));以及使用单链Fv(scFv)二聚体(参见例如Gruber等人,J.Immunol.,,152:5368(1994));以及如Tutt等人J.Immunol.147:60(1991)中所述制备三特异性抗体。本文还包括具有三个或更多个抗原结合位点的工程化抗体,包括例如“章鱼抗体”或者DVD-Ig(参见例如,WO2001/77342和WO2008/024715)。具有三个或更多个抗原结合位点的多特异性抗体的其他示例可以在WO2010/115589、WO2010/112193、WO2010/136172、WO2010/145792和WO2013/026831中找到。多特异性抗体或其抗原结合片段还包括“双重作用FAb”或“DAF”,其包含与NKG2D以及另一种不同抗原结合或与NKG2D的两个不同表位结合的抗原结合位点(参见例如,US2008/0069820和WO2015/095539)。多特异性抗体也可以以不对称形式提供,其中在具有相同抗原特异性(所谓的“CrossMab”技术)的一个或多个结合臂中有结构域交叉,即通过交换VH/VL结构域(参见例如,WO2009/080252和WO2015/150447)、CH1/CL结构域(参见例如,WO2009/080253)或完整的Fab臂(参见例如,WO2009/080251、WO2016/016299,还参见Schaefer等人,PNAS,108(2011)1187-1191,以及Klein等人,MAbs8(2016)1010-20)。还可以通过将荷电或非荷电的氨基酸突变引入结构域界面以指导正确的Fab配对,以对不对称Fab臂进行工程化。参见例如WO2016/172485。多特异性抗体的各种其他分子形式是在本领域中已知的并且包括在本文中(参见例如Spiess等人,MolImmunol67(2015)95-106)。本发明的多特异性抗体的优选的方面描述如下。在一个方面,本发明提供了与NKG2D结合的抗体,其包含如本文所述的与NKG2D结合的第一抗原结合结构域,并且包含与第二抗原结合的第二抗原结合结构域。根据本发明的优选的方面,包含在抗体中的抗原结合结构域是Fab分子(即由重链和轻链组成的抗原结合结构域,每个抗原结合结构域包含可变结构域和恒定结构域)。在一个方面,第一抗原结合结构域和/或所述第二抗原结合结构域是Fab分子。在一个方面,所述Fab分子是人。在另一方面,所述Fab分子是人源化的。在另一方面,所述Fab分子包含人重链和轻链恒定结构域。优选地,所述抗原结合结构域中的至少一个抗原结合结构域是交叉Fab分子。这种修饰减少了来自不同Fab分子的重链和轻链的错配,从而提高了重组生产中本发明的(多特异性)抗体的产率和纯度。在可用于包含在本发明的(多特异性)抗体的优选的交叉Fab分子中,Fab轻链和Fab重链的可变结构域(分别为VL和VH)交换。然而,即使进行该结构域交换,由于错配的重链与轻链之间的所谓BenceJones型相互作用,(多特异性)抗体的制备可能包含某些副产物(参见Schaefer等人,PNAS,108(2011)11187-11191)。为了进一步减少来自不同Fab分子的重链和轻链的错配并且由此提高所需(多特异性)抗体的纯度和产率,可以在与第一抗原(NKG2D)结合的Fab分子或与第二抗原(例如靶细胞抗原,例如肿瘤细胞抗原)结合的Fab分子中的任一者的CH1和CL结构域的特定氨基酸位置处引入带相反电荷的荷电氨基酸,如本文进一步描述的。荷电改性是在(多特异性)抗体中包含的常规Fab分子中(例如显示在例如图12中),或在(多特异性)抗体中包含的VH/VL交叉Fab分子中(但不是两者都有)进行的。在优选的方面,荷电改性是在(多特异性)抗体(在优选的方面,与第二抗原,例如靶细胞抗原,例如肿瘤细胞抗原结合)中包含的常规Fab分子中进行的。在根据本发明的一个优选的方面,(多特异性)抗体能够同时与第一抗原(即NKG2D)和第二抗原(例如靶细胞抗原,例如肿瘤细胞抗原)结合。在一个方面,(多特异性)抗体能够通过同时与NKG2D和靶细胞抗原结合,从而交联表达NKG2D的细胞(例如T细胞或NK细胞)和靶细胞(例如肿瘤细胞)。在一个方面,这种同时结合导致靶细胞,特别是表达靶细胞抗原的肿瘤细胞的裂解。在一个方面,这种同时结合导致表达NKG2D的细胞(例如T细胞或NK细胞)的活化。在其他方面,这种同时结合导致选自下组的表达NKG2D的细胞(例如T细胞或NK细胞)的细胞反应:增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒活性和活化标记的表达。在一个方面,(多特异性)抗体与NKG2D结合而不同时与靶细胞抗原结合,不会导致表达NKG2D的细胞(例如T细胞或NK细胞)的活化。在这些方面的某些方面,本发明的(多特异性)抗体与T细胞活化剂组合,这些活化剂例如是与CD3结合的抗体,特别是与CD3和靶细胞抗原、特别是肿瘤细胞抗原结合的双特异性抗体。优选地,根据本发明任何方面的T细胞是细胞毒性T细胞。在一些方面,T细胞为CD8 T细胞。在其他方面,T细胞为γδT细胞。a)第一抗原结合结构域本发明的(多特异性)抗体包含至少一个与NKG2D结合的抗原结合结构域(第一抗原结合结构域)。在优选的方面,NKG2D是人NKG2D或食蟹猴NKG2D,最特别是人NKG2D。在一个方面,第一抗原结合结构域与人和食蟹猴NKG2D交叉反应(即结合)。在一些方面,NKG2D为NKG2D的细胞外结构域。在一个优选的方面,(多特异性)抗体包含不超过一个与NKG2D结合的抗原结合结构域。在一个方面,(多特异性)抗体提供了与NKG2D的单价结合。在其他方面,(多特异性)抗体包含多于一个(例如两个、三个或四个)与NKG2D结合的抗原结合结构域。在一个方面,(多特异性)抗体提供了与NKG2D的多价结合。在一个方面,(多特异性)抗体包含与NKG2D结合的两个抗原结合结构域。在一个方面,(多特异性)抗体提供了与NKG2D的二价结合。在另一方面,(多特异性)抗体包含四个与NKG2D结合的抗原结合结构域。在一个方面,(多特异性)抗体提供了与NKG2D的四价结合。在其中(多特异性)抗体包含多于一个与NKG2D结合的抗原结合结构域的方面,优选地所有这些抗原结合结构域都是相同的,即它们具有相同的分子形式(例如常规的或交叉的Fab分子)并且包含相同的氨基酸序列(在CH1和CL结构域中包括相同氨基酸取代,如本文所述(如果有的话))。在一个方面,与NKG2D结合的抗原结合结构域是选自下组的抗体片段:Fv分子、scFv分子、Fab分子和F(ab’)2分子。在一个优选的方面,与NKG2D结合的抗原结合结构域是Fab分子。在一些方面,与NKG2D结合的抗原结合结构域是如本文所述的交叉Fab分子,即这样的Fab分子,在所述Fab分子中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL彼此交换/替换或恒定结构域CH1和CL彼此交换/替换。在此类方面,与第二抗原(例如靶细胞抗原,例如肿瘤细胞抗原)结合的抗原结合结构域优选地是常规Fab分子。在替代方面,与NKG2D结合的抗原结合结构域是常规Fab分子。在此类方面,与第二抗原(例如靶细胞抗原,例如肿瘤细胞抗原)结合的抗原结合结构域是如本文所述的交叉Fab分子,即这样的Fab分子,在所述Fab分子中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL彼此交换/替换或恒定结构域CH1和CL彼此交换/替换。在优选的方面,第一抗原结合结构域是Fab分子,其中所述Fab轻链和所述Fab重链的所述可变结构域VL和VH彼此替换或所述恒定结构域CL和CH1彼此替换,特别是所述可变结构域VL和VH彼此替换(即,根据此类方面,第一抗原结合结构域是交叉Fab分子,其中Fab轻链和Fab重链的可变或恒定域被交换)。在一个此类方面,第二抗原结合结构域是常规Fab分子。b)第二抗原结合结构域在某些方面,本发明的(多特异性)抗体包含与第二抗原结合的抗原结合结构域(第二抗原结合结构域)。第二抗原优选地不是NKG2D,即不同于NKG2D。在一个方面,第二抗原是在与NKG2D不同的细胞上表达的抗原(例如在除T细胞或NK细胞之外的细胞上表达)。在一个方面,第二抗原不是活化性Fc受体,特别是FcγRIIIa(CD16a)。在一个方面,所述抗体不与活化性Fc受体结合,特别是FcγRIIIa(CD16a)。在一个方面,第二抗原不是CD3。在一个方面,抗体不与CD3结合。在优选的方面,第二抗原是靶细胞抗原,特别是肿瘤细胞抗原。在一个具体方面,第二抗原是CEA。根据本发明,第二抗原结合结构域能够将(多特异性)抗体引导至靶位点,例如引导至表达第二抗原的特定类型的肿瘤细胞。在一个优选的方面,(多特异性)抗体包含不超过一个与第二抗原结合的抗原结合结构域。在一个方面,(多特异性)抗体提供了与第二抗原的单价结合。在其他方面,(多特异性)抗体包含多于一个(例如两个、三个或四个)与第二抗原结合的抗原结合结构域。在一个方面,(多特异性)抗体提供了与第二抗原的多价结合。在一个方面,(多特异性)抗体包含与第二抗原结合的两个抗原结合结构域。在一个方面,(多特异性)抗体提供了与第二抗原的二价结合。在其中(多特异性)抗体包含多于一个与第二抗原结合的抗原结合结构域,特别是Fab分子的方面,优选地这些抗原结合结构域中的每一个都与相同的抗原决定簇结合。在甚至更优选的方面,优选地所有这些抗原结合结构域都是相同的,即它们具有相同的分子形式(例如常规的或交叉的Fab分子)并且包含相同的氨基酸序列(在CH1和CL结构域中包括相同氨基酸取代,如本文所述(如果有的话))。在一个方面,与第二抗原结合的抗原结合结构域是选自下组的抗体片段:Fv分子、scFv分子、Fab分子和F(ab’)2分子。在一个优选的方面,与第二抗原结合的抗原结合结构域是Fab分子。在另一方面,与第二抗原结合的抗原结合结构域是Fv分子。在一些方面,与第二抗原结合的抗原结合结构域是常规Fab分子。在此类方面,与NKG2D结合的抗原结合结构域是如本文所述的交叉Fab分子,即这样的Fab分子,在所述Fab分子中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL彼此交换/替换或恒定结构域CH1和CL彼此交换/替换。在替代方面,与第二抗原结合的抗原结合结构域是如本文所述的交叉Fab分子,即这样的Fab分子,在所述Fab分子中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL彼此交换/替换或恒定结构域CH1和CL彼此交换/替换。在此类方面,与NKG2D结合的抗原结合结构域是常规Fab分子。在一个方面,第二抗原结合结构域包含人恒定区。在一个方面,第二抗原结合结构域是包含人恒定区,特别是人CH1和/或CL结构域的Fab分子。人恒定结构域的示例性序列在SEQIDNO:83和SEQIDNO:84(分别为人κ和λCL结构域)和SEQIDNO:85(人IgG1重链恒定结构域CH1-CH2-CH3)中给出。在一个方面,第二抗原结合结构域包含轻链恒定区,该轻链恒定区包含的氨基酸序列,与SEQIDNO:83或SEQIDNO:84的氨基酸序列,特别是SEQIDNO:83的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。具体地,轻链恒定区可以包含如本文所述处于“荷电改性”下的氨基酸突变和/或如果在交叉Fab分子中则可以包含对一个或多个(特别是两个)N末端氨基酸的缺失或取代。在一个方面,第二抗原结合结构域包含重链恒定区,该重链恒定区包含的氨基酸序列,与包含在SEQIDNO:85所示氨基酸序列中的CH1结构域序列至少约有95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。具体地,重链恒定区(特别是CH1结构域)可以包含如本文所述处于“荷电改性”下的氨基酸突变。在一些方面,第二抗原是CEA,特别是人CEA。在一个方面,第二抗原结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含SEQIDNO:114的重链互补决定区(HCDR)1、SEQIDNO:115的HCDR2、以及SEQIDNO:116的HCDR3,所述轻链可变区包含SEQIDNO:117的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQIDNO:118的LCDR2和SEQIDNO:119的LCDR3。在一个方面,第二抗原结合结构域包含VH和VL,所述VH包含SEQIDNO:120的VH的重链CDR序列,所述VL包含SEQIDNO:121的VL的轻链CDR序列。在一个方面,第二抗原结合结构域的VH包含与SEQIDNO:120的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列,和/或第二抗原结合结构域的VL包含与SEQIDNO:121的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列。在一个方面,所述VH包含SEQIDNO:120的氨基酸序列,和/或所述VL包含SEQIDNO:121的氨基酸序列。在另一方面,第二抗原结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含SEQIDNO:122的重链互补决定区(HCDR)1、SEQIDNO:123的HCDR2、以及SEQIDNO:124的HCDR3,所述轻链可变区包含SEQIDNO:125的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQIDNO:126的LCDR2和SEQIDNO:127的LCDR3。在一个方面,第二抗原结合结构域是(来源于)人源化抗体。在一个方面,第二抗原结合结构域是人源化抗原结合结构域(即人源化抗体的抗原结合结构域)。在一个方面,第二抗原结合结构域的VH和/或VL是人源化可变区。在一个方面,第二抗原结合结构域的VH包含受体人框架,诸如人免疫球蛋白框架或人共有框架。在一个方面,第二抗原结合结构域的VH包含SEQIDNO:128的重链可变区序列的一个或多个重链框架序列(即FR1、FR2、FR3和/或FR4序列)。在一个方面,VH包含与SEQIDNO:128的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列。在一个方面,VH包含与SEQIDNO:128的氨基酸序列至少约有95%相同的氨基酸序列。在一个方面,VH包含与SEQIDNO:128的氨基酸序列至少约有98%相同的氨基酸序列。在某些方面,至少具有95%、96%、97%、98%或99%同一性的VH序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失,但是包含该序列的抗体保留了与第二抗原结合的能力。在某些方面,在SEQIDNO:128的氨基酸序列中,总共有1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些方面,取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即,在FR中)。在一个方面,VH包含SEQIDNO:128的氨基酸序列。任选地,VH包含SEQIDNO:128的氨基酸序列,包括该序列的翻译后修饰。在一个方面,第二抗原结合结构域的VL包含SEQIDNO:129的轻链可变区序列的一个或多个轻链框架序列(即FR1、FR2、FR3和/或FR4序列)。在一个方面,VL包含与SEQIDNO:129的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列。在一个方面,VL包含与SEQIDNO:129的氨基酸序列至少约有95%相同的氨基酸序列。在一个方面,VL包含与SEQIDNO:129的氨基酸序列至少约有98%相同的氨基酸序列。在某些方面,至少具有95%、96%、97%、98%或99%同一性的VL序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失,但是包含该序列的抗体保留了与第二抗原结合的能力。在某些方面,在SEQIDNO:129的氨基酸序列中,总共有1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些方面,取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即,在FR中)。在一个方面,所述VL包含SEQIDNO:129的氨基酸序列。任选地,所述VL包含SEQIDNO:129的氨基酸序列,包括该序列的翻译后修饰。在一个方面,第二抗原结合结构域的VH包含与SEQIDNO:128的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列,并且第二抗原结合结构域的VL包含与SEQIDNO:129的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列。在一个方面,所述VH包含SEQIDNO:128的氨基酸序列,并且所述VL包含SEQIDNO:129的氨基酸序列。在另一个方面,第二抗原结合结构域包含VH和VL,所述VH包含SEQIDNO:128的氨基酸序列,所述VL包含SEQIDNO:129的氨基酸序列。在另一个方面,第二抗原结合结构域包含SEQIDNO:128的VH序列和SEQIDNO:129的VL序列。在另一方面,第二抗原结合结构域包含VH和VL,所述VH包含SEQIDNO:128的VH的重链CDR序列,所述VL包含SEQIDNO:129的VL的轻链CDR序列。在另一个方面,第二抗原结合结构域包含SEQIDNO:128的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列和SEQIDNO:129的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。在一个方面,第二抗原结合结构域的VH包含SEQIDNO:128的VH的重链CDR序列,和框架,所述框架与SEQIDNO:128的VH的框架序列至少有95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。在一个方面,VH包含SEQIDNO:128的VH的重链CDR序列,和框架,所述框架与SEQIDNO:128的VH的框架序列至少有95%的序列同一性。在另一方面,VH包含SEQIDNO:128的VH的重链CDR序列,和框架,所述框架与SEQIDNO:128的VH的框架序列至少有98%的序列同一性。在一个方面,第二抗原结合结构域的VL包含SEQIDNO:129的VL的轻链CDR序列,和框架,所述框架与SEQIDNO:129的VL的框架序列至少有95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。在一个方面,VL包含SEQIDNO:129的VL的轻链CDR序列,和框架,所述框架与SEQIDNO:129的VL的框架序列至少有95%的序列同一性。在另一方面,VL包含SEQIDNO:129的VL的轻链CDR序列,和框架,所述框架与SEQIDNO:129的VL的框架序列至少有98%的序列同一性。在另一方面,第二抗原结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含SEQIDNO:165的重链互补决定区(HCDR)1、SEQIDNO:168的HCDR2、以及SEQIDNO:171的HCDR3,所述轻链可变区包含SEQIDNO:177的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQIDNO:126的LCDR2和SEQIDNO:179的LCDR3。在一个方面,第二抗原结合结构域包含(i)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含SEQIDNO:122的重链互补决定区(HCDR)1、SEQIDNO:123的HCDR2、以及SEQIDNO:172的HCDR3,所述轻链可变区包含SEQIDNO:125的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQIDNO:126的LCDR2和SEQIDNO:180的LCDR3;(ii)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含SEQIDNO:122的重链互补决定区(HCDR)1、SEQIDNO:123的HCDR2、以及SEQIDNO:173的HCDR3,所述轻链可变区包含SEQIDNO:125的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQIDNO:126的LCDR2和SEQIDNO:181的LCDR3;(iii)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含SEQIDNO:122的重链互补决定区(HCDR)1、SEQIDNO:123的HCDR2、以及SEQIDNO:174的HCDR3,所述轻链可变区包含SEQIDNO:125的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQIDNO:126的LCDR2和SEQIDNO:182的LCDR3;(iv)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含SEQIDNO:166的重链互补决定区(HCDR)1、SEQIDNO:169的HCDR2、以及SEQIDNO:124的HCDR3,所述轻链可变区包含SEQIDNO:178的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQIDNO:126的LCDR2和SEQIDNO:127的LCDR3;(v)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含SEQIDNO:122的重链互补决定区(HCDR)1、SEQIDNO:170的HCDR2、以及SEQIDNO:124的HCDR3,所述轻链可变区包含SEQIDNO:125的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQIDNO:126的LCDR2和SEQIDNO:127的LCDR3;(vi)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含SEQIDNO:122的重链互补决定区(HCDR)1、SEQIDNO:123的HCDR2、以及SEQIDNO:175的HCDR3,所述轻链可变区包含SEQIDNO:125的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQIDNO:126的LCDR2和SEQIDNO:183的LCDR3;(vii)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含SEQIDNO:122的重链互补决定区(HCDR)1、SEQIDNO:169的HCDR2、以及SEQIDNO:175的HCDR3,所述轻链可变区包含SEQIDNO:125的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQIDNO:126的LCDR2和SEQIDNO:183的LCDR3;(viii)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含SEQIDNO:122的重链互补决定区(HCDR)1、SEQIDNO:169的HCDR2、以及SEQIDNO:175的HCDR3,所述轻链可变区包含SEQIDNO:125的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQIDNO:126的LCDR2和SEQIDNO:183的LCDR3;(ix)重链可变区(VH),包含SEQIDNO:122的重链互补决定区(HCDR)1、SEQIDNO:123的HCDR2和SEQIDNO:176的HCDR3,轻链可变区(VL),包含SEQIDNO:125的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQIDNO:126的LCDR2和SEQIDNO:182的LCDR3;(x)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含SEQIDNO:122的重链互补决定区(HCDR)1、SEQIDNO:169的HCDR2、以及SEQIDNO:176的HCDR3,所述轻链可变区包含SEQIDNO:125的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQIDNO:126的LCDR2和SEQIDNO:182的LCDR3;(xi)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含SEQIDNO:166的重链互补决定区(HCDR)1、SEQIDNO:169的HCDR2、以及SEQIDNO:172的HCDR3,所述轻链可变区包含SEQIDNO:125的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQIDNO:126的LCDR2和SEQIDNO:180的LCDR3;或(xii)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含SEQIDNO:167的重链互补决定区(HCDR)1、SEQIDNO:170的HCDR2、以及SEQIDNO:172的HCDR3,所述轻链可变区包含SEQIDNO:125的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQIDNO:126的LCDR2和SEQIDNO:180的LCDR3。在一个方面,第二抗原结合结构域是(来源于)人源化抗体。在一个方面,第二抗原结合结构域是人源化抗原结合结构域(即人源化抗体的抗原结合结构域)。在一个方面,第二抗原结合结构域的VH和/或VL是人源化可变区。在一个方面,第二抗原结合结构域的VH包含受体人框架,诸如人免疫球蛋白框架或人共有框架。在一个方面,第二抗原结合结构域的VH包含选自由以下项组成的组的重链可变区序列的一个或多个重链框架序列(即FR1、FR2、FR3和/或FR4序列):SEQIDNO:184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204和206。在一个方面,VH包含与选自由以下项组成组的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列:SEQIDNO:184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204和206。在一个方面,VH包含与选自由以下项组成组的氨基酸序列至少约有95%相同的氨基酸序列:SEQIDNO:184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204和206。在一个方面,VH包含与选自由以下项组成组的氨基酸序列至少约有98%相同的氨基酸序列:SEQIDNO:184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204和206。在某些方面,至少具有95%、96%、97%、98%或99%同一性的VH序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失,但是包含该序列的抗体保留了与第二抗原结合的能力。在某些方面,在SEQIDNO:184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204或206的氨基酸序列中,总共有1至10个氨基酸被取代、插入和/或缺失。在某些方面,取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即,在FR中)。在一个方面,VH包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列:SEQIDNO:184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204和206。在任选地,VH包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列:SEQIDNO:184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204和206,包括该序列的翻译后修饰。在一个方面,第二抗原结合结构域的VL包含选自下组的轻链可变区序列的一个或多个轻链框架序列(即FR1、FR2、FR3和/或FR4序列):SEQIDNO:185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205和207。在一个方面,VL包含与选自下组的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列:SEQIDNO:185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205和207。在一个方面,VL包含与选自下组的氨基酸序列至少约有95%相同的氨基酸序列:SEQIDNO:185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205和207。在一个方面,VL包含与选自下组的氨基酸序列至少约有98%相同的氨基酸序列:SEQIDNO:185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205和207。在某些方面,至少具有95%、96%、97%、98%或99%同一性的VL序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失,但是包含该序列的抗体保留了与第二抗原结合的能力。在某些方面,在SEQIDNO:185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205或207的氨基酸序列中,总共有1至10个氨基酸被取代、插入和/或缺失。在某些方面,取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即,在FR中)。在一个方面,VL包含选自下组的氨基酸序列:SEQIDNO:185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205和207。任选地,VL包含选自下组的氨基酸序列:SEQIDNO:185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205和207,包括该序列的翻译后修饰。在一个方面,第二抗原结合结构域的VH包含(i)与SEQIDNO:184的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列,并且第二抗原结合结构域的VL包含与SEQIDNO:185的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列;(ii)与SEQIDNO:186的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列,并且第二抗原结合结构域的VL包含与SEQIDNO:187的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列;(iii)与SEQIDNO:188的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列,并且第二抗原结合结构域的VL包含与SEQIDNO:189的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列;(iv)与SEQIDNO:190的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列,并且第二抗原结合结构域的VL包含与SEQIDNO:191的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列;(v)与SEQIDNO:192的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列,并且第二抗原结合结构域的VL包含与SEQIDNO:193的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列;(vi)与SEQIDNO:194的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列,并且第二抗原结合结构域的VL包含与SEQIDNO:195的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列;(vii)与SEQIDNO:196的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列,并且第二抗原结合结构域的VL包含与SEQIDNO:197的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列;(viii)与SEQIDNO:198的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列,并且第二抗原结合结构域的VL包含与SEQIDNO:199的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列;(ix)与SEQIDNO:200的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列,并且第二抗原结合结构域的VL包含与SEQIDNO:201的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列;(x)与SEQIDNO:202的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列,并且第二抗原结合结构域的VL包含与SEQIDNO:203的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列;(xi)与SEQIDNO:204的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列,并且第二抗原结合结构域的VL包含与SEQIDNO:205的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列;或(xii)与SEQIDNO:206的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列,并且第二抗原结合结构域的VL包含与SEQIDNO:207的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列。在一个方面,VH包含(i)SEQIDNO:184的氨基酸序列,并且VL包含SEQIDNO:185的氨基酸序列;(ii)SEQIDNO:186的氨基酸序列,并且VL包含SEQIDNO:187的氨基酸序列;(iii)SEQIDNO:188的氨基酸序列,并且VL包含SEQIDNO:189的氨基酸序列;(iv)SEQIDNO:190的氨基酸序列,并且VL包含SEQIDNO:191的氨基酸序列;(v)SEQIDNO:192的氨基酸序列,并且VL包含SEQIDNO:193的氨基酸序列;(vi)SEQIDNO:194的氨基酸序列,并且VL包含SEQIDNO:195的氨基酸序列;(vii)SEQIDNO:196的氨基酸序列,并且VL包含SEQIDNO:197的氨基酸序列;(viii)SEQIDNO:198的氨基酸序列,并且VL包含SEQIDNO:199的氨基酸序列;(ix)SEQIDNO:200的氨基酸序列,并且VL包含SEQIDNO:201的氨基酸序列;(x)SEQIDNO:202的氨基酸序列,并且VL包含SEQIDNO:203的氨基酸序列;(xi)SEQIDNO:204的氨基酸序列,并且VL包含SEQIDNO:205的氨基酸序列;或(xii)SEQIDNO:206的氨基酸序列,并且VL包含SEQIDNO:207的氨基酸序列。在另一个方面,第二抗原结合结构域包含(i)包含SEQIDNO:184的氨基酸序列的VH和包含SEQIDNO:185的氨基酸序列的VL;(ii)包含SEQIDNO:186的氨基酸序列的VH和包含SEQIDNO:187的氨基酸序列的VL;(iii)包含SEQIDNO:188的氨基酸序列的VH和包含SEQIDNO:189的氨基酸序列的VL;(iv)包含SEQIDNO:190的氨基酸序列的VH和包含SEQIDNO:191的氨基酸序列的VL;(v)包含SEQIDNO:192的氨基酸序列的VH和包含SEQIDNO:193的氨基酸序列的VL;(vi)包含SEQIDNO:194的氨基酸序列的VH和包含SEQIDNO:195的氨基酸序列的VL;(vii)包含SEQIDNO:196的氨基酸序列的VH和包含SEQIDNO:197的氨基酸序列的VL;(viii)包含SEQIDNO:198的氨基酸序列的VH和包含SEQIDNO:199的氨基酸序列的VL;(ix)包含SEQIDNO:200的氨基酸序列的VH和包含SEQIDNO:201的氨基酸序列的VL;(x)包含SEQIDNO:202的氨基酸序列的VH和包含SEQIDNO:203的氨基酸序列的VL;(xi)包含SEQIDNO:204的氨基酸序列的VH和包含SEQIDNO:205的氨基酸序列的VL;或(xii)包含SEQIDNO:206的氨基酸序列的VH和包含SEQIDNO:207的氨基酸序列的VL。在另一个方面,第二抗原结合结构域包含(i)SEQIDNO:184的VH序列和SEQIDNO:185的VL序列;(ii)SEQIDNO:186的VH序列和SEQIDNO:187的VL序列;(iii)SEQIDNO:188的VH序列和SEQIDNO:189的VL序列;(iv)SEQIDNO:190的VH序列和SEQIDNO:191的VL序列;(v)SEQIDNO:192的VH序列和SEQIDNO:193的VL序列;(vi)SEQIDNO:194的VH序列和SEQIDNO:195的VL序列;(vii)SEQIDNO:196的VH序列和SEQIDNO:197的VL序列;(viii)SEQIDNO:198的VH序列和SEQIDNO:199的VL序列;(ix)SEQIDNO:200的VH序列和SEQIDNO:201的VL序列;(x)SEQIDNO:202的VH序列和SEQIDNO:203的VL序列;(xi)SEQIDNO:204的VH序列和SEQIDNO:205的VL序列;或(vii)SEQIDNO:206的VH序列和SEQIDNO:207的VL序列。在另一方面,第二抗原结合结构域包含(i)包含SEQIDNO:184的VH的重链CDR序列的VH和包含SEQIDNO:185的VL的轻链CDR序列的VL;(ii)包含SEQIDNO:186的VH的重链CDR序列的VH和包含SEQIDNO:187的VL的轻链CDR序列的VL;(iii)包含SEQIDNO:188的VH的重链CDR序列的VH和包含SEQIDNO:189的VL的轻链CDR序列的VL;(iv)包含SEQIDNO:190的VH的重链CDR序列的VH和包含SEQIDNO:191的VL的轻链CDR序列的VL;(v)包含SEQIDNO:192的VH的重链CDR序列的VH和包含SEQIDNO:193的VL的轻链CDR序列的VL;(vi)包含SEQIDNO:194的VH的重链CDR序列的VH和包含SEQIDNO:195的VL的轻链CDR序列的VL;(vii)包含SEQIDNO:196的VH的重链CDR序列的VH和包含SEQIDNO:197的VL的轻链CDR序列的VL;(viii)包含SEQIDNO:198的VH的重链CDR序列的VH和包含SEQIDNO:199的VL的轻链CDR序列的VL;(ix)包含SEQIDNO:200的VH的重链CDR序列的VH和包含SEQIDNO:201的VL的轻链CDR序列的VL;(x)包含SEQIDNO:202的VH的重链CDR序列的VH和包含SEQIDNO:203的VL的轻链CDR序列的VL;(xi)包含SEQIDNO:204的VH的重链CDR序列的VH和包含SEQIDNO:205的VL的轻链CDR序列的VL;或(xii)包含SEQIDNO:206的VH的重链CDR序列的VH和包含SEQIDNO:207的VL的轻链CDR序列的VL。在另一个方面,第二抗原结合结构域包含(i)SEQIDNO:184的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列,以及SEQIDNO:185的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列;(ii)SEQIDNO:186的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列,以及SEQIDNO:187的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列;(iii)SEQIDNO:188的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列,以及SEQIDNO:189的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列;(iv)SEQIDNO:190的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列,以及SEQIDNO:191的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列;(v)SEQIDNO:192的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列,以及SEQIDNO:193的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列;(vi)SEQIDNO:194的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列,以及SEQIDNO:195的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列;(vii)SEQIDNO:196的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列,以及SEQIDNO:197的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列;(viii)SEQIDNO:198的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列,以及SEQIDNO:199的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列;(ix)SEQIDNO:200的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列,以及SEQIDNO:201的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列;(x)SEQIDNO:202的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列,以及SEQIDNO:203的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列;(xi)SEQIDNO:204的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列,以及SEQIDNO:205的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列;或(xii)SEQIDNO:206的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列,以及SEQIDNO:207的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。在一个方面,第二抗原结合结构域的VH包含选自由以下项组成的组的VH的重链CDR序列:SEQIDNO:184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204和206,以及与选自由以下项组成的组的VH的框架序列至少有95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的框架:SEQIDNO:184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204和206。在一个方面,VH包含选自由以下项组成的组的VH的重链CDR序列:SEQIDNO:184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204和206,以及与选自由以下项组成的组的VH的框架序列至少有95%的序列同一性的框架:SEQIDNO:184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204和206。在另一方面,VH包含选自由以下项组成的组的VH的重链CDR序列:SEQIDNO:184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204和206,以及与选自由以下项组成的组的VH的框架序列至少有98%的序列同一性的框架:SEQIDNO:184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204和206。在一个方面,第二抗原结合结构域的VL包含选自下组的VL的轻链CDR序列:SEQIDNO:185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205和207;以及与选自下组的VL的框架序列至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的框架:SEQIDNO:185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205和207。在一个方面,VL包含选自下组的VL的轻链CDR序列:SEQIDNO:185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205和207;以及与选自下组的VL的框架序列至少95%的序列同一性的框架:SEQIDNO:185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205和207。在另一方面,VL包含选自下组的VL的轻链CDR序列:SEQIDNO:185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205和207;以及与选自下组的VL的框架序列至少98%的序列同一性的框架:SEQIDNO:185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205和207。在一个方面,第二抗原结合结构域包含如在以上本节中提供的任何方面中的VH序列和如在以上本节中提供的任何方面中的VL序列。c)荷电改性本发明的(多特异性)抗体可以在其中所包含的Fab分子中包含氨基酸取代,所述氨基酸取代特别有效地减少轻链与不匹配重链的错配(Bence-Jones型副产物),所述错配可以发生在基于Fab的多特异性抗体的产生中,所述双/多特异性抗原结合分子在其结合臂中的一个(或在分子包含多于两个抗原结合Fab分子的情况下为多个)结合臂中具有VH/VL交换(同样参见PCT公开号WO2015/150447,特别是其中的实例,该PCT公开的全部内容以引用方式并入本文)。所需的(多特异性)抗体与不期望的副产物,特别是在(多特异性)抗体的结合臂中的一个结合臂中具有VH/VL结构域交换的多特异性抗体中出现的BenceJones型副产物的比率,可以通过在CH1和CL结构域中的特定氨基酸位置处引入带相反电荷的荷电氨基酸(有时在本文中称为“荷电改性”)来提高。因此,在其中所述(多特异性)抗体的第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域都是Fab分子的一些方面,并且在所述抗原结合结构域之一(特别是第一抗原结合结构域)中,Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH互相替换,i)在所述第二抗原结合结构域的恒定结构域CL中,位置124处的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代(根据Kabat编号),并且其中在所述第二抗原结合结构域的恒定结构域CH1中,位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸被带负电荷的氨基酸取代(根据KabatEU索引编号)。ii)在第一抗原结合结构域的恒定结构域CL中,124位的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代(根据Kabat编号),并且其中在第一抗原结合结构域的恒定结构域CH1中,147位的氨基酸或213位的氨基酸被带负电的氨基酸取代(根据KabatEU索引编号)。所述(多特异性)抗体不包含在i)和ii)中提及的两种修饰。具有VH/VL交换的抗原结合结构域的恒定结构域CL和CH1不互相替换(即保持未交换)。在一个更具体的方面,i)在第二抗原结合结构域的恒定结构域CL中,124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号),并且在第二抗原结合结构域的恒定结构域CH1中,147位的氨基酸或213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据KabatEU索引编号);或者ii)在第一抗原结合结构域的恒定结构域CL中,124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号),并且在第一抗原结合结构域的恒定结构域CH1中,147位的氨基酸或213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据KabatEU索引编号)。在一个这样的方面,在所述第二抗原结合结构域的恒定结构域CL中,位置124处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号),并且在所述第二抗原结合结构域的恒定结构域CH1中,位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据KabatEU索引编号)。在另一个方面,在所述第二抗原结合结构域的恒定结构域CL中,位置124处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号),并且在所述第二抗原结合结构域的恒定结构域CH1中,位置147处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据KabatEU索引编号)。在优选的方面,在所述第二抗原结合结构域的恒定结构域CL中,位置124处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)并且位置123处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号),并且在所述第二抗原结合结构域的恒定结构域CH1中,位置147处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据KabatEU索引编号)并且位置213处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据KabatEU索引编号)。在更优选的方面,在所述第二抗原结合结构域的恒定结构域CL中,位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号),并且在所述第二抗原结合结构域的恒定结构域CH1中,位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据KabatEU索引编号)并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据KabatEU索引编号)。在甚至更优选的方面,在所述第二抗原结合结构域的恒定结构域CL中,位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且位置123处的氨基酸被精氨酸(R)取代(根据Kabat编号),并且在所述第二抗原结合结构域的恒定结构域CH1中,位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据KabatEU索引编号)并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据KabatEU索引编号)。在优选的方面,如果根据上述方面的氨基酸取代在所述第二抗原结合结构域的恒定结构域CL和恒定结构域CH1中进行,则所述第二抗原结合结构域的恒定结构域CL是κ同种型。可替代地,根据上述方面的氨基酸取代可以在第一抗原结合结构域的恒定结构域CL和恒定结构域CH1中进行,而不是在第二抗原结合结构域的恒定结构域CL和恒定结构域CH1中进行。在优选的此类方面,第一抗原结合结构域的恒定结构域CL为κ同种型的。因此,在一个方面,在第一抗原结合结构域的恒定结构域CL中,124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号),并且在第一抗原结合结构域的恒定结构域CH1中,147位的氨基酸或213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据KabatEU索引编号)。在另一个方面,在所述第一抗原结合结构域的恒定结构域CL中,位置124处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号),并且在所述第一抗原结合结构域的恒定结构域CH1中,位置147处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据KabatEU索引编号)。在又一方面,在第一抗原结合结构域的恒定结构域CL中,124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号),并且在第一抗原结合结构域的恒定结构域CH1中,147位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据KabatEU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据KabatEU索引编号)。在一个方面,在第一抗原结合结构域的恒定结构域CL中,124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号),并且在第一抗原结合结构域的恒定结构域CH1中,147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据KabatEU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据KabatEU索引编号)。在另一方面,在第一抗原结合结构域的恒定结构域CL中,124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被精氨酸(R)取代(根据Kabat编号),并且在第一抗原结合结构域的恒定结构域CH1中,147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据KabatEU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据KabatEU索引编号)。在一个优选的方面,本发明的(多特异性)抗体包含(a)与NKG2D结合的第一抗原结合结构域,其中所述第一抗原结合结构域是Fab分子,其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH互相替换,并且包含重链链可变区(VH)和轻链可变区(VL),如在与本文第一抗原结合结构域相关提供的任何方面;(b)与第二抗原结合的第二抗原结合结构域;其中在第二(和如果存在的话,第三)抗原结合结构域的恒定结构域CL中,124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)(在一个优选的方面,由赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)(在一个优选的方面,由赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代);并且在第二(和如果存在的话,第三)抗原结合结构域的恒定结构域CH1中,147位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据KabatEU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据KabatEU索引编号)。d)多特异性抗体形式根据本发明的(多特异性)抗体可以具有多种构型。示例性配置在图12中描述。在优选的方面,(多特异性)抗体中包含的抗原结合结构域是Fab分子。在此类方面,第一抗原结合结构域、第二抗原结合结构域等在本文中可分别称为第一Fab分子、第二Fab分子等。在优选的方面,所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域各自是Fab分子。在一些方面,第一抗原结合结构域和/或第二(特别是第二)抗原结合结构域可以是Fv分子。在其中第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域各自是Fab分子的方面,优选地,所述第一抗原结合结构域是本文所述的交叉Fab分子(即Fab分子,其中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL彼此交换/替换或恒定结构域CH1和CL彼此交换/替换),并且所述第二抗原结合结构域是常规的Fab分子,或反之亦然。在其中(多特异性)抗体包含多于一个与NKG2D结合的抗原结合结构域和/或多于一个与第二抗原结合的抗原结合结构域的方面,优选地,所有与NKG2D结合的抗原结合结构域是如本文所述的交叉Fab分子,并且所有与第二抗原结合的抗原结合结构域都是常规Fab分子,或反之亦然。在优选的方面,本发明的(多特异性)抗体包含由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域。Fc结构域的第一亚基和第二亚基能够稳定缔合。根据本发明的(多特异性)抗体可以具有不同的构型,即第一抗原结合结构域、第二抗原结合结构域以及任选地另外的抗原结合结构域可以以不同方式彼此融合和与Fc结构域融合。组分可以直接彼此融合,或优选地经由一种或多种合适的肽连接基融合。当Fab分子与Fc结构域的亚基的N末端融合时,该融合通常是经由免疫球蛋白铰链区。在优选的方面,本发明的(多特异性)抗体包含(a)与NKG2D结合的第一抗原结合结构域,(b)与第二抗原结合的第二抗原结合结构域,和(c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域;其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域各自是Fab分子,并且其中(i)所述第一抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的第一亚基的N端,并且所述第二抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的第二亚基的N端,或(ii)所述第一抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的第二亚基的N端,并且所述第一抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的第一亚基的N端。图12F中描绘了示例性此类构型。在一个这样的方面,第一抗原结合结构域是如本文所述的交叉Fab分子,并且第二抗原结合结构域是常规Fab分子。在更具体的此类方面,第一抗原结合结构域是交叉Fab分子,其中可变结构域VH和VL彼此交换/替换,并且第二抗原结合结构域是包含如本文所述的荷电改性的常规Fab分子。在另一个这样的方面,第一抗原结合结构域是常规Fab分子,并且第二抗原结合结构域是如本文所述的交叉Fab分子。在更具体的此类方面,第一抗原结合结构域是包含如本文所述的荷电改性的常规Fab分子,并且第二抗原结合结构域是交叉Fab分子,其中可变结构域VH和VL彼此交换/替换。在另一个这样的方面,如本文所述,所述Fc结构域包含促进所述Fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的修饰。在又另一个这样的方面,(多特异性)抗体基本上由第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域和Fc结构域以及任选地一个或多个肽连接基组成。在其他方面,本发明的(多特异性)抗体包含(a)与NKG2D结合的第一抗原结合结构域,(b)与第二抗原结合的第二抗原结合结构域,(c)与NKG2D结合的第三抗原结合结构域,以及(d)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域;其中第一抗原结合结构域、第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自是Fab分子,并且其中(i)所述第一抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的第一亚基的N端,所述第二抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的第二亚基的N端,并且所述第三抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述第一抗原结合结构域的Fab重链的N端,或(ii)所述第一抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的第二亚基的N端,所述第二抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的第一亚基的N端,并且所述第三抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述第一抗原结合结构域的Fab重链的N端。图12E中描绘了示例性此类构型。在一个这样的方面,第一抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自是如本文所述的交叉Fab分子,并且第二抗原结合结构域是常规Fab分子。在更具体的此类方面,第一抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自是交叉Fab分子,其中可变结构域VH和VL彼此交换/替换,并且第二抗原结合结构域是包含如本文所述的荷电改性的常规Fab分子。在另一个这样的方面,第一抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自是常规Fab分子,并且第二抗原结合结构域是如本文所述的交叉Fab分子。在更具体的此类方面,第一抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自是包含如本文所述的荷电改性的常规Fab分子,并且第二抗原结合结构域是交叉Fab分子,其中可变结构域VH和VL彼此交换/替换。在另一个这样的方面,如本文所述,所述Fc结构域包含促进所述Fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的修饰。在又另一个这样的方面,(多特异性)抗体基本上由第一抗原结合结构域、第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域和Fc结构域以及任选地一个或多个肽连接基组成。在其他方面,本发明的(多特异性)抗体包含(a)与NKG2D结合的第一抗原结合结构域,(b)与第二抗原结合的第二抗原结合结构域,(c)与NKG2D结合的第三抗原结合结构域,以及(d)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域;其中第一抗原结合结构域、第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自是Fab分子,并且其中(i)所述第一抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的第一亚基的N端,所述第二抗原结合结构域在所述Fab重链的N端处融合至所述Fc结构域的第二亚基的C端,并且所述第三抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述第一抗原结合结构域的Fab重链的N端,或(ii)所述第一抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的第二亚基的N端,所述第二抗原结合结构域在所述Fab重链的N端处融合至所述Fc结构域的第一亚基的C端,并且所述第三抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述第一抗原结合结构域的Fab重链的N端。图12C中描绘了示例性此类构型。在一个这样的方面,第一抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自是如本文所述的交叉Fab分子,并且第二抗原结合结构域是常规Fab分子。在更具体的此类方面,第一抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自是交叉Fab分子,其中可变结构域VH和VL彼此交换/替换,并且第二抗原结合结构域是包含如本文所述的荷电改性的常规Fab分子。在另一个这样的方面,第一抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自是常规Fab分子,并且第二抗原结合结构域是如本文所述的交叉Fab分子。在更具体的此类方面,第一抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自是包含如本文所述的荷电改性的常规Fab分子,并且第二抗原结合结构域是交叉Fab分子,其中可变结构域VH和VL彼此交换/替换。在另一个这样的方面,如本文所述,所述Fc结构域包含促进所述Fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的修饰。在又另一个这样的方面,(多特异性)抗体基本上由第一抗原结合结构域、第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域和Fc结构域以及任选地一个或多个肽连接基组成。在其他方面,本发明的(多特异性)抗体包含(a)与NKG2D结合的第一抗原结合结构域,(b)与第二抗原结合的第二抗原结合结构域,(c)与NKG2D结合的第三抗原结合结构域,(d)与NKG2D结合的第四抗原结合结构域,(e)与NKG2D结合的第五抗原结合结构域,以及(f)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域;其中第一抗原结合结构域、第二抗原结合结构域、第三抗原结合结构域、第四抗原结合结构域和第五抗原结合结构域各自是Fab分子,并且其中(i)所述第一抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述第三抗原结合结构域的Fab重链的N端,并且所述第三抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的第一亚基的N端,(ii)所述第四抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述第五抗原结合结构域的Fab重链的N端,并且所述第五抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的第二亚基的N端,并且(iii)所述第二抗原结合结构域在所述Fab重链的N端处融合至所述Fc结构域的第一亚基或第二亚基的C端。图12B中描绘了示例性此类构型。在一个这样的方面,第一抗原结合结构域、第三抗原结合结构域、第四抗原结合结构域和第五抗原结合结构域各自是如本文所述的交叉Fab分子,并且第二抗原结合结构域是常规Fab分子。在更具体的此类方面,第一抗原结合结构域、第三抗原结合结构域、第四抗原结合结构域和第五抗原结合结构域各自是交叉Fab分子,其中可变结构域VH和VL彼此交换/替换,并且第二抗原结合结构域是包含如本文所述的荷电改性的常规Fab分子。在另一个这样的方面,第一抗原结合结构域、第三抗原结合结构域、第四抗原结合结构域和第五抗原结合结构域各自是常规Fab分子,并且第二抗原结合结构域是如本文所述的交叉Fab分子。在更具体的此类方面,第一抗原结合结构域、第三抗原结合结构域、第四抗原结合结构域和第五抗原结合结构域各自是包含如本文所述的荷电改性的常规Fab分子,并且第二抗原结合结构域是交叉Fab分子,其中可变结构域VH和VL彼此交换/替换。在另一个这样的方面,如本文所述,所述Fc结构域包含促进所述Fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的修饰。在又另一个这样的方面,(多特异性)抗体基本上由第一抗原结合结构域、第二抗原结合结构域、第三抗原结合结构域、第四抗原结合结构域和第五抗原结合结构域和Fc结构域以及任选地一个或多个肽连接基组成。在其他方面,本发明的(多特异性)抗体包含(a)与NKG2D结合的第一抗原结合结构域,(b)与第二抗原结合的第二抗原结合结构域,(c)与NKG2D结合的第三抗原结合结构域,(d)与第二抗原结合的第四抗原结合结构域,(e)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域;其中第一抗原结合结构域、第二抗原结合结构域、第三抗原结合结构域和第四抗原结合结构各自是Fab分子,并且其中所述第一抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的第一亚基的N端,所述第二抗原结合结构域在所述Fab重链的N端处融合至所述Fc结构域的第一亚基的C端,所述第三抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的第二亚基的N端,并且所述第四抗原结合结构域在所述Fab重链的N端处融合至所述Fc结构域的第二亚基的C端。图12A中描绘了示例性此类构型。在一个这样的方面,第一抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自是如本文所述的交叉Fab分子,并且第二抗原结合结构域和第四抗原结合结构域各自是常规Fab分子。在更具体的此类方面,第一抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自是交叉Fab分子,其中可变结构域VH和VL彼此交换/替换,并且第二抗原结合结构域和第四抗原结合结构域各自是包含如本文所述的荷电改性的常规Fab分子。在另一个这样的方面,第一抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自是常规Fab分子,并且第二抗原结合结构域和第四抗原结合结构域各自是如本文所述的交叉Fab分子。在更具体的此类方面,第一抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自是包含如本文所述的荷电改性的常规Fab分子,并且第二抗原结合结构域和第四抗原结合结构域各自是交叉Fab分子,其中可变结构域VH和VL彼此交换/替换。在另一个这样的方面,(多特异性)抗体基本上由第一抗原结合结构域、第二抗原结合结构域、第三抗原结合结构域和第四抗原结合结构域和Fc结构域以及任选地一个或多个肽连接基组成。在其他方面,本发明的(多特异性)抗体包含(a)与NKG2D结合的第一抗原结合结构域,(b)与第二抗原结合的第二抗原结合结构域,(c)与NKG2D结合的第三抗原结合结构域,以及(d)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域;其中第一抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自是Fab分子并且第二抗原结合结构域是Fv分子,并且其中所述第一抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的第一亚基的N端,所述第三抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的第二亚基的N端,并且所述第二抗原结合结构域(i)在所述Fv重链的N端处融合至所述Fc结构域的第一亚基的C端,并且在所述Fv轻链的N端处融合至所述Fc结构域的第二亚基的C端,或(ii)在所述Fv重链的N端处融合至所述Fc结构域的第二亚基的C端,并且在所述Fv轻链的N端处融合至所述Fc结构域的第一亚基的C端。图12D中描绘了示例性此类构型。在一个这样的方面,所述第一抗原结合结构域和所述第三抗原结合结构域各自是常规Fab分子。在另一个这样的方面,如本文所述,所述Fc结构域包含促进所述Fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的修饰。在又另一个这样的方面,(多特异性)抗体基本上由第一抗原结合结构域、第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域和Fc结构域以及任选地一个或多个肽连接基组成。在(多特异性)抗体的构型中,其中Fab分子在Fab重链的C末端处通过免疫球蛋白铰链区融合至Fc结构域的亚基中的每个的N末端,所述两个Fab分子、铰链区和Fc结构域基本上形成了免疫球蛋白分子。在一个优选的方面,免疫球蛋白分子是IgG类免疫球蛋白。在甚至更优选的方面,免疫球蛋白是IgG1亚类免疫球蛋白。在另一方面,免疫球蛋白是IgG4亚类免疫球蛋白。在另一个优选的方面,免疫球蛋白是人免疫球蛋白。在其他方面,免疫球蛋白是嵌合免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。在一个方面,免疫球蛋白包含人恒定区,特别是人Fc区。抗原结合结构域可以直接或通过肽接连接基与Fc结构域融合,该肽连接基包含一个或多个氨基酸,通常为约2-20个氨基酸。肽连接基是本领域中已知的并在本文中描述的。合适的非免疫原性肽连接基包括例如(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n或G4(SG4)n肽连接基。“n”通常为1至10的整数,通常为2至4。在一个方面,所述肽连接基的长度为至少5个氨基酸,在一个方面,长度为5至100个氨基酸,在另一个方面为10至50个氨基酸。在一个方面,所述肽连接基是(GxS)n或(GxS)nGm,其中G=甘氨酸,S=丝氨酸,并且(x=3、n=3、4、5或6,并且m=0、1、2或3)或(x=4、n=2、3、4或5并且m=0、1、2或3),在一个方面,x=4并且n=2或4。在一个方面,所述肽连接基是(G4S)2或(G4S)4。在特定方面,用于在上文描述的多特异性抗体形式中将第一和第二Fab分子的Fab重链彼此融合的肽连接基是(G4S)2。在另外的特定方面,用于将Fab分子或Fv分子融合到上文描述的多特异性抗体形式中的Fc结构域的C端的肽连接基是(G4S)4。合适的肽连接基还可以包含免疫球蛋白铰链区(的一部分)。特别地,在Fab分子与Fc结构域亚基的N末端融合的情况下,可以在具有或没有另外的肽连接基的情况下经由免疫球蛋白铰链区或其一部分进行融合。在特定方面,Fab分子与上文描述的多特异性抗体形式中的Fc结构域亚基的N端的融合是经由免疫球蛋白铰链区,优选地经由与Fc结构域相同亚类的免疫球蛋白铰链区(例如IgG1铰链区,其中Fc结构域属于IgG1亚类)。在一个方面,本发明提供了一种(多特异性)抗体,所述(多特异性)抗体包含(a)与NKG2D结合的第一抗原结合结构域,其中所述第一抗原结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含SEQIDNO:73的重链互补决定区(HCDR)1、SEQIDNO:104的HCDR2、以及SEQIDNO:75的HCDR3,所述轻链可变区包含SEQIDNO:76的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQIDNO:77的LCDR2和SEQIDNO:78的LCDR3。(b)与第二抗原,特别是靶细胞抗原,更特别是肿瘤细胞抗原结合的第二抗原结合结构域,和(c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域;其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域各自是Fab分子,并且其中(i)所述第一抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的第一亚基的N端,并且所述第二抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的第二亚基的N端,或(ii)所述第一抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的第二亚基的N端,并且所述第一抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的第一亚基的N端。在一个方面,本发明提供了一种(多特异性)抗体,所述(多特异性)抗体包含(a)与NKG2D结合的第一抗原结合结构域,其中所述第一抗原结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含SEQIDNO:73的重链互补决定区(HCDR)1、SEQIDNO:104的HCDR2、以及SEQIDNO:75的HCDR3,所述轻链可变区包含SEQIDNO:76的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQIDNO:77的LCDR2和SEQIDNO:78的LCDR3。(b)与第二抗原,特别是靶细胞抗原,更特别是肿瘤细胞抗原结合的第二抗原结合结构域,和(C)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域,包含促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰。其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域各自是Fab分子;其中(i)所述第一抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的第一亚基的N端,并且所述第二抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的第二亚基的N端,或(ii)所述第一抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的第二亚基的N端,并且所述第一抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的第一亚基的N端。在一个方面,本发明提供了一种(多特异性)抗体,所述(多特异性)抗体包含(a)与NKG2D结合的第一抗原结合结构域,其中所述第一抗原结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含SEQIDNO:73的重链互补决定区(HCDR)1、SEQIDNO:104的HCDR2、以及SEQIDNO:75的HCDR3,所述轻链可变区包含SEQIDNO:76的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQIDNO:77的LCDR2和SEQIDNO:78的LCDR3。(b)与第二抗原,特别是靶细胞抗原,更特别是肿瘤细胞抗原结合的第二抗原结合结构域,和(c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域;其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域各自是Fab分子;其中(i)所述第一抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的第一亚基的N端,并且所述第二抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的第二亚基的N端,或(ii)所述第一抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的第二亚基的N端,并且所述第一抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的第一亚基的N端;并且其中所述Fc结构域包含一个或多个降低与Fc受体的结合和/或效应子功能的氨基酸取代,和/或其中所述抗体不与FcγRIIIa(CD16a)结合。在一个方面,本发明提供了一种(多特异性)抗体,所述(多特异性)抗体包含a)与NKG2D结合的第一抗原结合结构域,其中所述第一抗原结合结构域是Fab分子,其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VH和VL彼此替换或恒定结构域CL和CH1彼此替换,并且包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含SEQIDNO:73的重链互补决定区(HCDR)1、SEQIDNO:104的HCDR2、以及SEQIDNO:75的HCDR3,所述轻链可变区包含SEQIDNO:76的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQIDNO:77的LCDR2和SEQIDNO:78的LCDR3;b)与第二抗原,特别是靶细胞抗原,更特别是肿瘤细胞抗原结合的第二抗原结合结构域,其中所述第二抗原结合结构域是(常规)Fab分子;c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域;其中(i)所述第一抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的第一亚基的N端,并且所述第二抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的第二亚基的N端,或(ii)所述第一抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的第二亚基的N端,并且所述第一抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的第一亚基的N端。在根据本发明的(多特异性)抗体的所有不同构型中,本文所述的氨基酸取代(“荷电改性”)(如果存在的话)可以在第二抗原结合结构域/Fab分子的CH1和CL结构域中,或者在第一抗原结合结构域/Fab分子的CH1和CL结构域中。优选地,它们在第二抗原结合结构域/Fab分子的CH1和CL结构域中。根据本发明的概念,如果在第二抗原结合结构域/Fab分子中进行如本文所述的氨基酸取代,则在第一抗原结合结构域/Fab分子中不进行此类氨基酸取代。相反地,如果在第一抗原结合结构域/Fab分子中进行如本文所述的氨基酸取代,则在第二抗原结合结构域/Fab分子中不进行此类氨基酸取代。氨基酸取代优选地在包含这样的Fab分子的(多特异性)抗体中进行,在所述Fab分子中,Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH1彼此替换。在根据本发明的(多特异性)抗体的优选的方面,特别地其中如本文所述的氨基酸取代是在第二抗原结合结构域/Fab分子中进行的,第二Fab分子的恒定结构域CL为κ同种型的。在根据本发明的(多特异性)抗体的其他方面,特别地其中如本文所述的氨基酸取代是在第一抗原结合结构域/Fab分子中进行的,并且第一抗原结合结构域/Fab分子的恒定结构域CL为κ同种型的。在一些方面,第二抗原结合结构域/Fab分子的恒定结构域CL和第一抗原结合结构域/Fab分子的恒定结构域CL为κ同种型的。在一个方面,本发明提供了一种(多特异性)抗体,所述(多特异性)抗体包含a)与NKG2D结合的第一抗原结合结构域,其中所述第一抗原结合结构域是Fab分子,其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VH和VL彼此替换,并且包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区包含SEQIDNO:73的重链互补决定区(HCDR)1、SEQIDNO:104的HCDR2、以及SEQIDNO:75的HCDR3,所述轻链可变区包含SEQIDNO:76的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQIDNO:77的LCDR2和SEQIDNO:78的LCDR3;b)与第二抗原,特别是靶细胞抗原,更特别是肿瘤细胞抗原结合的第二抗原结合结构域,其中所述第二抗原结合结构域是(常规)Fab分子;c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域;其中在b)中的第二抗原结合结构域的恒定结构域CL中,124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)(最优选地被精氨酸(R)取代);并且其中在b)中的第二抗原结合结构域的恒定结构域CH1中,147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据KabatEU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据KabatEU索引编号);并且其中(i)所述第一抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的第一亚基的N端,并且所述第二抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的第二亚基的N端,或(ii)所述第一抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的第二亚基的N端,并且所述第一抗原结合结构域在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的第一亚基的N端。根据上述任一方面,(多特异性)抗体的组分(例如Fab分子、Fc结构域)可以直接融合或通过各种连接基,特别是包含一个或多个氨基酸、通常约2-20个氨基酸的肽连接基融合,这些连接基在本文中描述或在本领域中是已知的。合适的非免疫原性肽连接基包括例如(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n或G4(SG4)n肽连接基,其中n通常是1至10的整数,通常是2至4。在根据本发明的这些方面的一个方面,所述第一抗原结合结构域包含VH和/或VL,所述VH包含与SEQIDNO:112的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列,所述VL包含与SEQIDNO:80的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。在根据本发明的这些方面的一个方面,在所述Fc结构域的所述第一亚基中,366位的苏氨酸残基被替换为色氨酸残基(T366W);而在所述Fc结构域的所述第二亚基中,407位的酪氨酸残基被缬氨酸残基(Y407V)替换,并且任选地,366位的苏氨酸残基被丝氨酸残基(T366S)替换并且368位的亮氨酸残基被丙氨酸残基(L368A)替换(根据KabatEU索引编号)。在根据本发明的这些方面的另一个方面,在所述Fc结构域的第一亚基中,另外地,位置354处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基替换(S354C)或位置356处的谷氨酸残基被半胱氨酸残基替换(E356C)(特别是位置354处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基替换),并且在所述Fc结构域的第二亚基中,另外地,位置349处的酪氨酸残基被半胱氨酸残基替换(Y349C)(根据KabatEU索引编号)。在根据本发明的这些方面的又另一个方面,在Fc结构域的第一亚基和第二亚基中的每一者中,234位的亮氨酸残基被用丙氨酸残基替换(L234A),235位的亮氨酸残基被用丙氨酸残基替换(L235A),并且329位的脯氨酸残基被用甘氨酸残基替换(P329G)(根据KabatEU索引编号)。在根据本发明的这些方面的又另一个方面,Fc结构域是人IgG1Fc结构域。在一个方面,本发明提供了与NKG2D和CEA结合的(多特异性)抗体,所述抗体包含:包含与SEQIDNO:209的序列至少有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的多肽,包含与SEQIDNO:210的序列至少有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的多肽,包含与SEQIDNO:211的序列至少有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的多肽,以及包含与SEQIDNO:212的序列至少有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的多肽。在一个方面,本发明提供了与NKG2D和CEA结合的(多特异性)抗体,所述抗体包含:包含SEQIDNO:209的氨基酸序列的多肽、包含SEQIDNO:210的氨基酸序列的多肽、包含SEQIDNO:211的氨基酸序列的多肽和包含SEQIDNO:212的氨基酸序列的多肽。在另一方面,本发明提供了与NKG2D和CEA结合的(多特异性)抗体,所述抗体包含:包含与SEQIDNO:213的序列至少有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的多肽,包含与SEQIDNO:214的序列至少有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的多肽,包含与SEQIDNO:215的序列至少有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的多肽,以及包含与SEQIDNO:216的序列至少有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的多肽。在一个方面,本发明提供了与NKG2D和CEA结合的(多特异性)抗体,所述抗体包含:包含SEQIDNO:213的氨基酸序列的多肽、包含SEQIDNO:214的氨基酸序列的多肽、包含SEQIDNO:215的氨基酸序列的多肽和包含SEQIDNO:216的氨基酸序列的多肽。在另外的方面,本发明提供了与NKG2D和CEA结合的(多特异性)抗体,所述抗体包含:包含与SEQIDNO:213的序列至少有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的多肽,包含与SEQIDNO:214的序列至少有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的多肽,其中VL区序列(SEQIDNO:193)被选自由以下项组成的组的VL区序列替换:SEQIDNO:185、187、189、191、195、197、199、201、203、205和207,包含与SEQIDNO:215的序列至少有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的多肽,以及包含与SEQIDNO:216的序列至少有95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的多肽,其中VH区序列(SEQIDNO:192)被选自由以下项组成的组的VH区序列替换:SEQIDNO:184、186、188、190、194、196、198、200、202、204和206。在一个方面,本发明提供了与NKG2D和CEA结合的(多特异性)抗体,所述抗体包含:包含SEQIDNO:213的氨基酸序列的多肽;包含SEQIDNO:214的氨基酸序列的多肽,其中VL区序列(SEQIDNO:193)被选自由以下项组成的组的VL区序列替换:SEQIDNO:185、187、189、191、195、197、199、201、203、205和207;包含SEQIDNO:215的氨基酸序列的多肽;以及包含SEQIDNO:216的氨基酸序列的多肽,其中VH区序列(SEQIDNO:192)被选自由以下项组成的组的VH区序列替换:SEQIDNO:184、186、188、190、194、196、198、200、202、204和206。优选地,在上述方面,VH区和VL区(SEQIDNO192和193)被对应于表16中鉴定的结合物的VH区和VL区对替换。2.Fc结构域变体在优选的方面,本发明的(多特异性)抗体包含由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域。(多特异性)抗体的Fc结构域由包含免疫球蛋白分子的重链结构域的一对多肽链组成。例如,免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc结构域是二聚体,该二聚体的每个亚基包含CH2和CH3IgG重链恒定结构域。Fc结构域的两个亚基能够彼此稳定缔合。在一个方面,本发明的(多特异性)抗体包含不超过一个Fc结构域。在一个方面,(多特异性)抗体的Fc结构域是IgGFc结构域。在一个优选的方面,所述Fc结构域是IgG1Fc结构域。在另一个方面,所述Fc结构域是IgG4Fc结构域。在一个更具体的方面,所述Fc结构域是在位置S228(KabatEU索引编号)处包含氨基酸取代(特别是氨基酸取代S228P)的IgG4Fc结构域。该氨基酸取代减少了IgG4抗体的体内Fab臂交换(参见Stubenrauch等人,DrugMetabolismandDisposition38,84-91(2010))。在另一个优选的方面,所述Fc结构域是人Fc结构域。在甚至更优选的方面,Fc结构域是人IgG1Fc结构域。人IgG1Fc区的示例性序列以SEQIDNO:86给出。a)促进异源二聚化的Fc结构域修饰根据本发明的(多特异性)抗体包含可以与Fc结构域的两个亚基中的一个或另一个融合的不同抗原结合结构域,因此所述Fc结构域的两个亚基通常包含在两个不相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后的二聚化导致了两种多肽的几种可能的组合。为了在重组生产中提高(多特异性)抗体的产率和纯度,因此将有利的是在(多特异性)抗体子的Fc结构域中引入促进所需多肽的缔合的修饰。因此,在优选的方面,根据本发明的(多特异性)抗体的Fc结构域包含促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰。人IgGFc结构域的两个亚基之间最广泛的蛋白质间相互作用位点在Fc结构域的CH3结构域中。因此,在一个方面,所述修饰在所述Fc结构域的CH3结构域中。存在几种对Fc结构域的CH3结构域进行修饰以实施异二聚化的方法,这些方法例如在WO96/27011、WO98/050431、EP1870459、WO2007/110205、WO2007/147901、WO2009/089004、WO2010/129304、WO2011/90754、WO2011/143545、WO2012058768、WO2013157954、WO2013096291中详细描述。通常,在所有此类方法中,Fc结构域的第一亚基的CH3结构域和Fc结构域的第二亚基的CH3结构域都以互补的方式工程化,使得每个CH3结构域(或包含其的重链)可以不再与其自身同源二聚化,而是被迫与互补工程化的其他CH3结构域异源二聚化(使得第一和第二CH3结构域异源二聚化并且在两个第一或两个第二CH3结构域之间不形成同源二聚体)。这些用于实现改善的重链异源二聚化的不同方法被认为是与(多特异性)抗体中的重-轻链修饰(例如在一个结合臂中进行VH和VL交换/替换并且在CH1/CL界面中引入带有相反电荷的荷电氨基酸的取代)组合的不同替换方案,所述不同替换方案减少重链/轻链错配和BenceJones型副产物。在一个具体方面,所述促进所述Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰是所谓的“杵臼结构”修饰,其包括所述Fc结构域的两个亚基中的一个亚基中的“杵”修饰和所述Fc结构域的两个亚基中的另一个亚基中的“臼”修饰。杵臼结构技术描述于例如以下文献中:US5,731,168;US7,695,936;Ridgway等人,ProtEng9,617-621(1996),以及Carter,JImmunolMeth248,7-15(2001)。一般来讲,该方法涉及在第一多肽的界面处引入凸起(“杵”)并且在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“臼”),使得所述凸起可以定位在所述空腔中,以便促进异源二聚体的形成并且阻碍同源二聚体的形成。凸起是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建的。具有与凸起相同或相似大小的补偿空腔是通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链而在第二多肽的界面中创建的。因此,在一个优选的方面,在(多特异性)抗体的Fc结构域的所述第一亚基的所述CH3结构域中,氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基取代,从而在所述第一亚基的所述CH3结构域内产生突起,所述突起可定位在所述第二亚基的所述CH3结构域内的空腔中,并且在所述Fc结构域的所述第二亚基的所述CH3结构域中,氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基取代,从而在所述第二亚基的所述CH3结构域内产生空腔,所述第一亚基的所述CH3结构域内的所述突起可定位在所述空腔内。优选地,所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自由精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)组成的组。优选地,所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自由丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)组成的组。所述凸起和空腔可以通过改变编码所述多肽的核酸(例如通过位点特异性诱变或通过肽合成)来制备。在一个具体方面,在Fc结构域的第一亚基(“杵”亚基)(的CH3结构域)中,366位的苏氨酸残基被色氨酸残基(T366W)替换,并且在Fc结构域的第二亚基(“臼”亚基)(的CH3结构域)中,407位的酪氨酸残基被缬氨酸残基(Y407V)替换。在一个方面,在Fc结构域的第二亚基中,另外地366位的苏氨酸残基被丝氨酸残基(T366S)替换,并且368位的亮氨酸残基被丙氨酸残基(L368A)替换(根据KabatEU索引编号)。在又另一个方面,在所述Fc结构域的第一亚基中,另外地,位置354处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基替换(S354C)或位置356处的谷氨酸残基被半胱氨酸残基替换(E356C)(特别是位置354处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基替换),并且在所述Fc结构域的第二亚基中,另外地,位置349处的酪氨酸残基被半胱氨酸残基替换(Y349C)(根据KabatEU索引编号)。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc结构域的两个亚基之间形成二硫桥,从而进一步稳定所述二聚体(Carter,JImmunolMethods248,7-15(2001))。在一个优选方面,所述Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W,并且所述Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S、L368A和Y407V(根据KabatEU索引编号)。在一个优选的方面,与CD3结合的抗原结合结构域与(任选地经由与第二抗原结合的第二抗原结合结构域和/或肽连接基)Fc结构域的第一亚基(包含“杵”修饰)融合。不希望受理论束缚,与CD3结合的抗原结合结构域与Fc结构域的含有杵的亚基的融合将(进一步)最小化包含两个与CD3结合的抗原结合结构域的抗体的产生(两个含有杵的多肽的空间位阻)。用于实施异源二聚化的其他CH3修饰技术被设想为根据本发明的替换方案,并且描述于例如WO96/27011、WO98/050431、EP1870459、WO2007/110205、WO2007/147901、WO2009/089004、WO2010/129304、WO2011/90754、WO2011/143545、WO2012/058768、WO2013/157954、WO2013/096291中。在一个方面,可替代地使用EP1870459中描述的异源二聚化方法。该方法基于在Fc结构域的两个亚基之间的CH3/CH3结构域界面中的特定氨基酸位置处引入带有相反电荷的荷电氨基酸。本发明的(多特异性)抗体的一个特定方面是氨基酸突变R409D;在(Fc结构域的)两个CH3结构域中的一个CH3结构域中的K370E,以及氨基酸突变D399K;在Fc结构域的CH3结构域中的另一个CH3结构域中的E357K(编号根据KabatEU索引)。在另一方面,本发明的(多特异性)抗体包含Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸突变T366W和Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸突变T366S、L368A、Y407V,以及另外地氨基酸突变R409D;在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的K370E,以及氨基酸突变D399K;在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的E357K(编号根据KabatEU索引)。在另一方面,本发明的(多特异性)抗体包含Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸突变S354C、T366W和Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸突变Y349C、T366S、L368A、Y407V,或者所述(多特异性)抗体包含Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸突变Y349C、T366W和Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸突变S354C、T366S、L368A、Y407V,以及另外地氨基酸突变R409D;在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的K370E,以及氨基酸突变D399K;在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的E357K(所有根据KabatEU索引编号)。在一个方面,可替代地使用WO2013/157953中描述的异源二聚化方法。在一个方面,第一CH3结构域包含氨基酸突变T366K,并且第二CH3结构域包含氨基酸突变L351D(编号根据KabatEU索引)。在另一个方面,第一CH3结构域包含另外的氨基酸突变L351K。在另一个方面,第二CH3结构域还包含选自由Y349E、Y349D和L368E(特别是L368E)组成的组的氨基酸突变(编号根据KabatEU索引)。在一个方面,可替代地使用WO2012/058768中描述的异源二聚化方法。在一个方面,第一CH3结构域包含氨基酸突变L351Y、Y407A,并且第二CH3结构域包含氨基酸突变T366A、K409F。在另一个方面,第二CH3结构域包含在T411、D399、S400、F405、N390或K392位的进一步氨基酸突变,例如选自由以下项组成的组:a)T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411E或T411W,b)D399R、D399W、D399Y或D399K,c)S400E、S400D、S400R或S400K,d)F405I、F405M、F405T、F405S、F405V或F405W,e)N390R、N390K或N390D,f)K392V、K392M、K392R、K392L、K392F或K392E(编号根据KabatEU索引)。在另一个方面,第一CH3结构域包含氨基酸突变L351Y、Y407A,并且第二CH3结构域包含氨基酸突变T366V、K409F。在另一个方面,第一CH3结构域包含氨基酸突变Y407A,并且第二CH3结构域包含氨基酸突变T366A、K409F。在另一个方面,第二CH3结构域还包含氨基酸突变K392E、T411E、D399R和S400R(根据KabatEU索引编号)。在一个方面,可替代地使用WO2011/143545中描述的异源二聚化方法,例如在选自由368和409组成的组的位置处进行氨基酸修饰(根据KabatEU索引编号)。在一个方面,可替代地使用WO2011/090762中描述的异源二聚化方法,该异源二聚化方法也使用上述杵臼结构技术。在一个方面,第一CH3结构域包含氨基酸突变T366W,并且第二CH3结构域包含氨基酸突变Y407A。在一个方面,第一CH3结构域包含氨基酸突变T366Y,并且第二CH3结构域包含氨基酸突变Y407T(编号根据KabatEU索引)。在一个方面,(多特异性)抗体或其Fc结构域为IgG2亚类,并且可替代地使用在WO2010/129304中描述的异源二聚化方法。在一个替代方面,促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰包括介导静电转向效应的修饰,例如如在PCT公开WO2009/089004中所述。通常,该方法涉及用带电荷的氨基酸残基取代两个Fc结构域亚基的界面处的一个或多个氨基酸残基,使得同源二聚体形成变得在静电上不利,但异源二聚化在静电上有利。在一个这样的方面,第一CH3结构域包含用带负电荷的氨基酸对K392或N392进行的氨基酸取代(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D),特别是K392D或N392D),并且第二CH3结构域包含用带正电荷的氨基酸对D399、E356、D356或E357进行的氨基酸取代(例如赖氨酸(K)或精氨酸(R),特别是D399K、E356K、D356K或E357K,更特别是D399K和E356K)。在另一个方面,第一CH3结构域还包含用带负电荷的氨基酸对K409或R409进行的氨基酸取代(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D),特别是K409D或R409D)。在另一个方面,第一CH3结构域进一步或可替代地包含用带负电荷的氨基酸对K439和/或K370进行的氨基酸取代,(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D))(所有根据KabatEU索引编号)。在又另一个方面,可替代地使用WO2007/147901中描述的异源二聚化方法。在一个方面,第一CH3结构域包含氨基酸突变K253E、D282K和K322D,并且第二CH3结构域包含氨基酸突变D239K、E240K和K292D(根据KabatEU索引编号)。在又一方面,可替代地使用WO2007/110205中描述的异源二聚化方法。在一个方面,Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代K392D和K409D,并且Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代D356K和D399K(根据KabatEU索引编号)。b)降低Fc受体结合和/或效应子功能的Fc结构域修饰Fc结构域赋予(多特异性)抗体有利的药代动力学性质,包括有助于在靶组织中良好积累的长血清半衰期和有利的组织-血液分配比。同时,(多特异性)抗体经由其Fc结构域与表达Fc受体的细胞结合可能导致表达Fc受体的细胞(例如NK细胞)与其他表达NKG2D的细胞(例如CD8T细胞)的交联,从而在全身施用时产生非预期毒性。此外,Fc受体信号传导通路的共活化可导致细胞因子释放,所述细胞因子释放与T细胞活化特性和(多特异性)抗体的长半衰期组合,在全身施用后导致对细胞因子受体的过度活化和严重的副作用。由于对T细胞的潜在破坏(例如被NK细胞),T细胞以外的(带有Fc受体的)免疫细胞的活化甚至可能降低(多特异性)抗体的功效。因此,在优选的方面,与天然IgG1Fc结构域相比,根据本发明的(多特异性)抗体的Fc结构域表现出降低的与Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在一个这样的方面,Fc结构域(或包含所述Fc结构域的(多特异性)抗体)表现出与天然IgG1Fc结构域(或包含天然IgG1Fc结构域的(多特异性)抗体)相比小于50%,特别是小于20%,更特别是小于10%并且最特别是小于5%的结合亲和力,和/或与天然IgG1Fc结构域结构域(或包含天然IgG1Fc结构域的(多特异性)抗体)相比小于50%,特别是小于20%,更特别是小于10%并且最特别是小于5%的效应子功能。在一个方面,Fc结构域(或包含所述Fc结构域的(多特异性)抗体)基本上不结合Fc受体和/或诱导效应子功能。在一个优选的方面,Fc受体是Fcγ受体。在一个方面,所述Fc受体是人Fc受体。在一个方面,所述Fc受体是活化性Fc受体。在一个具体方面,Fc受体是活化性人Fcγ受体,更具体地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa,最具体地是人FcγRIIIa(CD16a)。在一个方面,效应子功能是选自CDC、ADCC、ADCP和细胞因子分泌的组的一种或多种效应子功能。在一个优选的方面,效应子功能是ADCC。在一个方面,与天然IgG1Fc结构域相比,Fc结构域结构域对新生Fc受体(FcRn)表现出基本相似的结合亲和力。当Fc结构域(或包含所述Fc结构域的(多特异性)抗体)表现出天然IgG1Fc结构域(或包含天然IgG1Fc结构域的(多特异性)抗体)对FcRn的结合亲和力的大于约70%,特别地大于约80%,更特别地大于约90%时,实现了基本上相似的与FcRn的结合。在某些方面,Fc结构域经工程化以与非工程化的Fc结构域相比具有降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在优选的方面,(多特异性)抗体的Fc结构域包含降低Fc结构域与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸突变。典型地,相同的一个或多个氨基酸突变存在于Fc结构域的两个亚基中的每一个中。在一个方面,氨基酸突变降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力。在一个方面,氨基酸突变将Fc结构域对Fc受体的结合亲和力降低至少2倍、至少5倍或至少10倍。在存在多于一个降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力的氨基酸突变的方面,这些氨基酸突变的组合可以将Fc结构域对Fc受体的结合亲和力降低至少10倍、至少20倍,或甚至至少50倍。在一个方面,与包含非工程化的Fc结构域的(多特异性)抗体相比,包含工程化的Fc结构域的(多特异性)抗体表现出对Fc受体的结合亲和力的小于20%,特别地小于10%,更特别地小于5%。在一个优选的方面,Fc受体是Fcγ受体。在一些方面,Fc受体是人Fc受体。在一些方面,Fc受体是活化性Fc受体。在一个具体方面,Fc受体是活化性人Fcγ受体,更具体地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa,最具体地是人FcγRIIIa(CD16a)。优选地,与这些受体中的每一个的结合力降低。在一些方面,对互补组分的结合亲和力,对C1q的特异性结合亲和力也降低。在一个方面,对新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力不降低。当所述Fc结构域(或包含所述Fc结构域的(多特异性)抗体)表现出非工程化形式的所述Fc结构域(或包含非工程化形式的所述Fc结构域的(多特异性)抗体)对FcRn的结合亲和力的大于约70%时,实现了基本上相似的与FcRn的结合,即保持了Fc结构域对所述受体的结合亲和力。Fc结构域或包含所述Fc结构域的本发明的(多特异性)抗体可表现出这种亲和力的大于约80%,以及甚至大于约90%。在某些方面,(多特异性)抗体的Fc结构域经工程化以与非工程化的Fc结构域相比具有降低的效应子功能。降低的效应子功能可包括但不限于以下项中的一种或多种:降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)、降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、降低的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、减少的细胞因子分泌、减少的免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的摄取、减少的与NK细胞的结合、减少的与巨噬细胞的结合、减少的与单核细胞的结合、减少的与多形核细胞的结合、减少的直接信号传导诱导的细胞凋亡、减少的靶结合抗体的交联、减少的树突细胞成熟,或减少的T细胞致敏。在一个方面,降低的效应子功能是选自降低的CDC、降低的ADCC、降低的ADCP和减少的细胞因子分泌的组的一种或多种降低的效应子功能。在一个优选的方面,降低的效应子功能是降低的ADCC。在一个方面,降低的ADCC小于由非工程化的Fc结构域(或包含所述非工程化的Fc结构域的(多特异性)抗体)诱导的ADCC的20%。在一个方面,降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的氨基酸突变是氨基酸取代。在一个方面,所述Fc结构域在选自包括E233、L234、L235、N297、P331和P329(根据KabatEU索引编号)的组的位置处包含氨基酸取代。在一个更具体的方面,所述Fc结构域在选自包括L234、L235和P329(根据KabatEU索引编号)的组的位置处包含氨基酸取代。在一些方面,所述Fc结构域包含氨基酸取代L234A和L235A(根据KabatEU索引编号)。在一个这样的方面,所述Fc结构域是IgG1Fc结构域,特别是人IgG1Fc结构域。在一个方面,所述Fc结构域在位置P329处包含氨基酸取代。在一个更具体的方面,所述氨基酸取代是P329A或P329G,特别是P329G(根据KabatEU索引编号)。在一个方面,所述Fc结构域在位置P329处包含氨基酸取代,并且在选自E233、L234、L235、N297和P331(根据KabatEU索引编号)的位置处包含另外的氨基酸取代。在一个更具体的方面,所述另外的氨基酸取代是E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在优选的方面,所述Fc结构域在位置P329、L234和L235(根据KabatEU索引编号)处包含氨基酸取代。在更优选的方面,所述Fc结构域包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G(“P329GLALA”、“PGLALA”或“LALAPG”)。具体地讲,在优选的方面,所述Fc结构域的每个亚基包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(KabatEU索引编号),即在所述Fc结构域的第一亚基和第二亚基中的每一者中,位置234处的亮氨酸残基被丙氨酸残基替换(L234A),位置235处的亮氨酸残基被丙氨酸残基替换(L235A),并且位置329处的脯氨酸残基被甘氨酸残基替换(P329G)(根据KabatEU索引编号)。在一个这样的方面,所述Fc结构域是IgG1Fc结构域,特别是人IgG1Fc结构域。氨基酸取代的“P329GLALA”组合几乎完全消除了人IgG1Fc结构域的Fcγ受体(以及补体)结合,如在PCT公开号WO2012/130831中所述,该PCT公开的全部内容以引用方式并入本文。WO2012/130831还描述了制备此类突变Fc结构域的方法和确定其性质(诸如Fc受体结合或效应子功能)的方法。与IgG1抗体相比,IgG4抗体表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和降低的效应子功能。因此,在一些方面,本发明的(多特异性)抗体的Fc结构域是IgG4Fc结构域,特别地是人IgG4Fc结构域。在一个方面,IgG4Fc结构域包含在S228位的氨基酸取代,特别地是氨基酸取代S228P(根据KabatEU索引编号)。为了进一步降低其对Fc受体的结合亲和力和/或其效应子功能,在一个方面,IgG4Fc结构域包含L235位的氨基酸取代,特别地是氨基酸取代L235E(根据KabatEU索引编号)。在另一方面,IgG4Fc结构域包含P329位的氨基酸取代,特别地是氨基酸取代P329G(根据KabatEU索引编号)。在一个优选的方面,IgG4Fc结构域包含S228、L235和P329位的氨基酸取代,特别地是氨基酸取代S228P、L235E和P329G(根据KabatEU索引编号)。这种IgG4Fc结构域突变体以及它们的Fcγ受体结合性质描述于PCT公开号WO2012/130831中,该PCT公开的全部内容以引用方式并入本文。在一个优选的方面,与天然IgG1Fc结构域相比表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能的Fc结构域是包含氨基酸取代L234A、L235A和任选地P329G的人IgG1Fc结构域,或者是包含氨基酸取代S228P、L235E和任选地P329G的人IgG4Fc结构域(根据KabatEU索引编号)。在某些方面,已消除了Fc结构域的N糖基化。在一个这样的方面,Fc结构域包含N297位的氨基酸突变,特别地是用丙氨酸(N297A)或天冬氨酸(N297D)替换天冬酰胺的氨基酸取代(根据KabatEU索引编号)。除了上文和PCT公开号WO2012/130831中所述的Fc结构域外,具有减少的Fc受体结合和/或降低的效应子功能的Fc结构域还包括具有对Fc结构域残基238、265、269、270、297、327和329中的一者或多者的取代的那些Fc结构域(美国专利号6,737,056)(根据Kabat的EU索引编号)。此类Fc突变体包括在第265、269、270、297和327位氨基酸的两个或多个处具有取代的Fc突变体,包括所谓的“DANA”Fc突变体,其残基265和297被取代为丙氨酸(美国专利号7,332,581)。可以使用本领域熟知的遗传或化学方法,通过氨基酸缺失、取代、插入或修饰来制备突变体Fc结构域。遗传方法可包括对编码DNA序列的位点特异性诱变、PCR、基因合成等。可以例如通过测序来验证正确的核苷酸变化。与Fc受体的结合可以例如通过ELISA或通过表面等离子体共振(SPR)使用标准仪器(诸如BIAcore仪器(GEHealthcare))容易地确定,并且Fc受体诸如可以通过重组表达获得。可替代地,可以使用已知表达特定Fc受体的细胞系(例如表达FcγIIIa受体的人NK细胞),来评估Fc结构域或包含Fc结构域的(多特异性)抗体对Fc受体的结合亲和力。Fc结构域或包含Fc结构域的(多特异性)抗体的效应子功能可通过本领域已知的方法测量。用于评定目标分子的ADCC活性的体外测定的示例描述于美国专利号5,500,362;Hellstrom等人,ProcNatlAcadSciUSA83,7059-7063(1986)和Hellstrom等人,ProcNatlAcadSciUSA82,1499-1502(1985);美国专利号5,821,337;Bruggemann等人,JExpMed166,1351-1361(1987)中。可替代地,可以使用非放射性测定(参见例如,用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.MountainView,CA);以及CytoTox非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI))。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外地,可例如在诸如在Clynes等人,ProcNatlAcadSciUSA95,652-656(1998)中公开的动物模型中体内评定目标分子的ADCC活性。在一些方面,Fc结构域与补体组分,特别是C1q的结合减少。因此,在一些方面,其中Fc结构域经工程化以具有降低的效应子功能,所述降低的效应子功能包括降低的CDC。可以进行C1q结合测定以确定Fc结构域或包含所述Fc结构域的(多特异性)抗体是否能够结合C1q并因此具有CDC活性。参见例如WO2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化,可以执行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人,JImmunolMethods202,163(1996);Cragg等人,Blood101,1045-1052(2003);以及Cragg和Glennie,Blood103,2738-2743(2004))。FcRn结合和体内清除率/半衰期测定也可以使用本领域已知的方法执行(参见例如Petkova,S.B.等人,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006);WO2013/120929)。B.多核苷酸本发明进一步提供了编码本发明的抗体的分离的多核苷酸。这种分离的多核苷酸可以是单个多核苷酸或多个多核苷酸。编码本发明的(多特异性)抗体的多核苷酸可以表达为编码完整抗体的单个多核苷酸,或表达为共表达的多个(例如,两个或更多个)多核苷酸。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以经由例如二硫键或其他方式缔合以形成功能性抗体。例如,抗体的轻链部分可以由与包含抗体的重链的抗体的部分分开的多核苷酸编码。当共表达时,重链多肽将与轻链多肽缔合以形成抗体。在另一个实例中,包含两个Fc结构域亚基中的一个亚基和任选地一个或多个Fab分子的一部分的抗体可以由与包含所述两个Fc结构域亚基中的另一个亚基和任选地Fab分子的一部分的抗体分开的多核苷酸编码。当共表达时,Fc结构域亚基将缔合以形成Fc结构域。在一些方面,分离的多核苷酸编码如本文所述的根据本发明的完整抗体分子。在其他方面,分离的多核苷酸编码包含在如本文所述的根据本发明的抗体中的多肽。在某些方面,多核苷酸或核酸是DNA。在其他方面,本发明的多核苷酸是RNA,例如以信使RNA(mRNA)的形式。本发明的RNA可以是单链或双链的。C.重组方法本发明的抗体可以例如通过固态肽合成(例如Merrifield固相合成)或重组生产获得。对于重组生产,将例如如上所述的编码抗体的一种或多种多核苷酸分离并插入至一个或多个载体中以用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类多核苷酸可使用常规方法容易地分离并且测序。在一个方面,提供了包含本发明的多核苷酸(即单个多核苷酸或多个多核苷酸)的载体,特别是表达载体。可以使用本领域技术人员熟知的方法来构建含有抗体的编码序列以及适当转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。参见,例如在Maniatis等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,N.Y.(1989);和Ausubel等人,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssociatesandWileyInterscience,N.Y(1989)中描述的技术。表达载体可以是质粒、病毒的一部分,或者可以是核酸片段。表达载体包括表达盒,编码抗体的多核苷酸(即编码区)与启动子和/或其他转录或翻译控制元件可操作缔合地克隆至所述表达盒中。如本文所用,“编码区”是核酸的一部分,该部分由翻译成氨基酸的密码子组成。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)未被翻译成氨基酸,但其(如果存在的话)可被认为是编码区的一部分,而任何侧翼序列,例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5'和3'非翻译区等不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可存在于单个多核苷酸构建体中(例如在单个载体上),或在单独的多核苷酸构建体中(例如在单独的(不同的)载体上)。此外,任何载体可含有单一编码区,或可包含两个或更多个编码区,例如本发明的载体可以编码一种或多种多肽,该一种或多种多肽在翻译后或翻译时通过蛋白水解切割分离成最终的蛋白质。此外,本发明的载体、多核苷酸或核酸可编码异源编码区,该异源编码区与编码本发明的抗体的多核苷酸或其变体或衍生物融合或不融合。异源编码区包括但不限于特化元件或基序,诸如分泌信号肽或异源功能结构域。可操作缔合是当基因产物(例如多肽)的编码区以某种方式与一个或多个调控序列缔合,以使基因产物的表达处于调控序列的影响或控制下。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mRNA的转录,并且如果两个DNA片段之间的连接性质不干扰表达调控序列指导基因产物表达的能力或干扰待转录的基因模板的能力,则该两个DNA片段(诸如多肽编码区和与其相关的启动子)是“可操作地缔合的”。因此,如果启动子能够影响该核酸的转录,则启动子区域将与编码多肽的核酸可操作地缔合。启动子可以是细胞特异性启动子,该细胞特异性启动子仅在预定细胞中指导DNA的实质转录。除启动子外,其他转录控制元件,例如增强子、操纵子、阻遏物和转录终止信号,可以与多核苷酸可操作地缔合以指导细胞特异性转录。本文公开了合适的启动子和其他转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些转录控制区包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区,诸如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子区段(例如立即早期启动子结合内含子-A)、猿猴病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(诸如例如劳氏肉瘤病毒)。其他转录控制区包括来源于脊椎动物基因(诸如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔β珠蛋白)的那些转录控制区,以及能够控制真核细胞中基因表达的其他序列。其他合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素可诱导启动子)。类似地,各种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些翻译控制元件包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子,以及来源于病毒系统的元件(特别是内部核糖体进入位点,或IRES,也称为CITE序列)。表达盒还可以包括其他特征,诸如复制起点,和/或染色体整合元件,诸如逆转录病毒长末端重复序列(LTR),或腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)。本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌肽或信号肽的附加编码区缔合,所述附加编码区指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如,如果需要分泌抗体,可以将编码信号序列的DNA置于本发明的抗体或其片段的核酸的上游。根据信号假设,由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列,一旦已经起始跨粗面内质网输出生长的蛋白质链,该信号肽或分泌前导序列就被从成熟蛋白质上切割下来。本领域普通技术人员知道由脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有与所述多肽的N末端融合的信号肽,所述信号肽被从翻译的多肽上切割下来以产生所述多肽的分泌或“成熟”形式。在某些方面,使用天然信号肽(例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽),或保留引导与其可操作地缔合的多肽的分泌的能力的该序列的功能性衍生物。可替代地,可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如,野生型前导序列可以被人组织纤溶酶原活化剂(TPA)或小鼠β葡糖醛酸酶的前导序列取代。编码短蛋白质序列(其可用于促进后续纯化(例如组氨酸标签)或帮助标记抗体)的DNA可包含在抗体(片段)编码多核苷酸的内部或末端。在另一个方面,提供了包含本发明的多核苷酸(即单个多核苷酸或多个多核苷酸)的宿主细胞。在某些方面,提供了包含本发明的载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可以单独或组合地渗入本文中分别关于多核苷酸和载体描述的任何特征。在一个这样的方面,宿主细胞包含一种或多种载体(例如已经用一种或多种载体转化或转染),该一种或多种载体包含编码本发明的抗体的(一部分)的一种或多种多核苷酸。如本文所用,术语“宿主细胞”是指可以被工程化以产生本发明的抗体或其片段的任何种类的细胞系统。适于复制和支持抗体表达的宿主细胞是本领域中熟知的。此类细胞可以用特定的表达载体适当地转染或转导,并且可以培养大量含有载体的细胞以用于接种大规模发酵罐来获得足够量的抗体用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物,例如大肠杆菌,或各种真核细胞,诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。例如,多肽可以在细菌中产生,特别是当不需要糖基化时。多肽在表达后可以在可溶性级分中从细菌细胞糊状物中分离,并可以进一步纯化。除原核生物外,诸如丝状真菌或酵母之类的真核微生物也是用于编码多肽的载体的合适克隆或表达宿主,包括这样的真菌和酵母菌株,该真菌和酵母菌株的糖基化途径已经被“人源化”,从而导致产生具有部分或完全人糖基化模式的多肽。参见Gerngross,NatBiotech22,1409-1414(2004)和Li等人,NatBiotech24,210-215(2006)。用于表达(糖基化)多肽的合适宿主细胞还来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的示例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定出了许多可以与昆虫细胞一起使用的杆状病毒株,特别是用于转染草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞。植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可用作宿主。例如,适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例为由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7);人胚肾系(293或293T细胞,如例如在Graham等人,JGenVirol36,59(1977)中所述)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠塞尔托利氏细胞(TM4细胞,如例如在Mather,BiolReprod23,243-251(1980)中所述)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、布法罗大鼠肝细胞(BRL3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(HepG2)、小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT060562)、TRI细胞(如例如在Mather等人,AnnalsN.Y.AcadSci383,44-68(1982)中所述)、MRC5细胞,以及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,包括dhfr-CHO细胞(Urlaub等人,ProcNatlAcadSciUSA77,4216(1980));以及骨髓瘤细胞系,诸如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。关于适用于蛋白质生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述,请参见例如Yazaki和Wu,MethodsinMolecularBiology,第248卷(B.K.C.Lo编辑,HumanaPress,Totowa,NJ),第255-268页(2003)。宿主细胞包括培养细胞,例如仅举几个例子而言哺乳动物培养细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞,还包括转基因动物、转基因植物或培养植物或动物组织中所包含的细胞。在一个方面,宿主细胞是真核细胞,特别是哺乳动物细胞,诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞或淋巴细胞(例如,Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个方面,宿主细胞不是人体内的细胞。用于在这些系统中表达外源基因的标准技术是本领域已知的。可以对表达包含抗原结合结构域的重链和轻链的多肽(例如抗体)的细胞进行工程化改造,以便也表达另一条抗体链,使得表达的产物为具有重链和轻链的抗体。在一个方面,提供了产生根据本发明的抗体的方法,其中所述方法包括在适于表达抗体的条件下培养包含编码如本文所提供的抗体的多核苷酸的宿主细胞,以及任选地从该宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。本发明的(多特异性)抗体的组分可以彼此遗传融合。(多特异性)抗体可以被设计成使得其组分直接或通过连接基序列彼此间接融合。连接基的组成和长度可以根据本领域熟知的方法测定,并且可以测试连接基的功效。本文提供了(多特异性)抗体的不同组分之间的连接基序列的实例。如果需要的话,还可包括另外的序列(例如内肽酶识别序列)以掺入切割位点来分离融合的各个组分。如本文所述制备的抗体可通过本领域已知的技术纯化,所述技术为诸如高效液相色谱、离子交换色谱、凝胶电泳、亲和色谱、尺寸排阻色谱等。用于纯化特定蛋白质的实际条件将部分取决于诸如净电荷、疏水性、亲水性等因素,并且对于本领域技术人员而言将是显而易见的。对于亲和色谱纯化,可以使用与抗体结合的抗体、配体、受体或抗原。例如,对于本发明的抗体的亲和色谱纯化,可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。基本上如实例中所述,可使用顺序蛋白A或G亲和色谱和尺寸排阻色谱来分离抗体。抗体的纯度可以通过各种熟知的分析方法中的任何一种来确定,所述各种熟知的分析方法包括凝胶电泳、高压液相色谱等。D.测定可通过本
技术领域
中已知的各种测定,对本文所提供的抗体的物理/化学特性和/或生物活性来进行鉴别、筛选或表征。1.结合测定抗体对靶抗原或Fc受体的结合(亲和力)可以例如使用标准仪器例如BIAcore仪器(GEHealthcare)以及可通过重组表达获得的受体或靶蛋白,通过表面等离子体共振(SPR)来确定。可替代地,可以使用表达特定受体或靶抗原的细胞系,例如通过流式细胞术(FACS)评估抗体与不同受体或靶抗原的结合。下文描述了用于测量与人或食蟹猴NKG2D的结合活性的特定说明性和示例性方面。在一个方面,对NKG2D的结合活性由SPR确定如下:SPR在BiacoreB4000仪器(GEHealthcare)上进行。使用标准的胺偶联化学将抗Fab捕获抗体(GEHealthcare#28958325)固定在S系列传感器芯片CM5(GEHealthcare)上,按约1500个共振单位(RU)的表面密度。作为运行和稀释缓冲液,使用了PBS-T(10mM磷酸盐缓冲盐水,其包括0.05%Tween20,pH7.4)。流动槽设置为25℃,并且用运行缓冲液灌注两次。通过以10μl/min的流速注射约10μg/ml溶液60sec来捕获抗体。按照1:3稀释,用600nM、300nM、150nM开始,通过在溶液中以30μl/min的流速注射不同浓度的dihuNKG2DECDFcavi(SEQIDNO:96)或dicyNKG2DECDFcavi(SEQIDNO:97)180s,来测量缔合。监测解离阶段长达450s,并通过从样品溶液切换到运行缓冲液来触发。通过用10mM甘氨酸pH2.1以30μl/min的流速洗涤2x90s和180s的额外稳定期来再生表面。通过减去单独使用捕获抗体从表面获得的响应来校正整体折射率差异。还减去空白注射(=双重参照)。对于Kd、kaD、ka和kd的计算,使用Biacore4000评估软件1.1(GEHealthcare)或TraceDrawer1.6.1(RidgeviewInstrumentsAB)中的Langmuir1:1模型。2.活性测定本发明的(多特异性)抗体的生物活性可以通过如实例中所述的各种测定来测量。生物活性可以例如包括表达NKG2D的细胞的增殖的诱导、表达NKG2D的细胞中的信号传导的诱导、表达NKG2D的细胞中活化标记的表达的诱导、表达NKG2D的细胞的细胞因子分泌的诱导、靶细胞(例如肿瘤细胞)的裂解的诱导、肿瘤消退的诱导和/或存活的提高。E.组合物、配方和施用途径在另一个方面,本发明提供了包含本文提供的任一种抗体的药物组合物,其例如用于以下任一种治疗方法中。在一个方面,药物组合物包含根据本发明的抗体,以及药学上可接受的载体。在另一方面,药物组合物包含根据本发明的抗体以及如下文所述的至少一种附加治疗剂。还提供了一种以适于体内施用的形式产生本发明的抗体的方法,该方法包括(a)获得根据本发明的抗体,以及(b)用至少一种药学上可接受的载体配制该抗体,由此配制抗体制剂以用于体内施用。本发明的药物组合物包含溶解或分散在药学上可接受的载体中的有效量的抗体。术语“药学上可接受的”是指分子实体和组合物在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒,即当视情况而定施用于动物(例如人)时不产生不利的、过敏的或其他不良反应。根据本公开内容,含有抗体和任选地另外的活性成分的药物组合物的制备将对本领域技术人员而言是已知的,如由Remington'sPharmaceuticalSciences,第18版,MackPrintingCompany,1990例示的,该文献以引用方式并入本文。此外,对于动物(例如,人)施用,应理解制备物应满足FDA生物标准办公室或其他国家/地区相应当局所要求的无菌性、产热原性、一般安全性和纯度标准。优选的组合物是冻干制剂或水溶液。如本文所使用的,“药学上可接受的载体”包括任何和所有的溶剂、缓冲液、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、抗氧化剂、蛋白质、药物、药物稳定剂、聚合物、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料,类似物质以及它们的组合,如本领域普通技术人员应已知的(参见例如Remington'sPharmaceuticalSciences,第18版,MackPrintingCompany,1990,第1289-1329页,该文献以引用方式并入本文)。除了任何常规载体与活性成分不相容的情况之外,所述载体在药物组合物中的用途是可预期的。本发明的抗体(和任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的方式施用,包括肠胃外、肺内和鼻内,并且如果需要的话用于局部治疗、病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可以通过任何合适的途径进行,例如通过注射,诸如静脉内或皮下注射,部分取决于施用是短暂的还是长期的。肠胃外组合物包括设计用于注射施用(例如,皮下、皮内、病灶内、静脉内、动脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射)的那些组合物。对于注射,本发明的抗体可以在水溶液中配制,特别是在生理上相容的缓冲液(例如Hanks溶液、Ringer溶液或生理盐水缓冲液)中配制。溶液可含有配制剂(formulatoryagent),诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可替代地,抗体可以是粉末形式,用于在使用前用合适的媒介物(例如无菌无热原水)构建。通过根据需要将本发明的抗体以所需的量与下面列举的各种其他成分一起掺入适当的溶剂中来制备无菌可注射溶液。例如,无菌可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。通常,通过将各种灭菌的活性成分掺入含有基础分散介质和/或其他成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液、悬浮液或乳液的无菌粉末的情况下,优选的制备方法是真空干燥或冻干技术,所述真空干燥或冻干技术产生来自先前无菌过滤的液体介质的活性成分加上任何附加所需成分的粉末。如果需要的话,液体介质应适当缓冲,并且在注射之前应首先使用足够的盐水或葡萄糖来使液体稀释剂等渗。该组合物必须是在制造和贮存条件下稳定的,并且保存为抗诸如细菌和真菌等微生物的污染作用。应当理解,内毒素污染应以例如低于0.5ng/mg蛋白的安全水平保持最低。合适的药学上可接受的载体包括但不限于:缓冲剂,例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸;抗氧化剂,包括抗坏血酸和蛋氨酸;防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵;氯化六烃季铵;苯扎氯铵;苄索氯铵;苯酚、丁醇或苄醇;对羟基苯甲酸烷基酯,诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯;儿茶酚;间苯二酚;环己醇;3-戊醇;和间甲酚);低分子量(少于约10个残基)多肽;蛋白质,诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水性聚合物,诸如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸,诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸;单糖、二糖和其他碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合剂,诸如EDTA;糖类,诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇;成盐抗衡离子,诸如钠;金属络合物(例如锌蛋白络合物);和/或非离子表面活性剂,诸如聚乙二醇(PEG)。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的化合物,诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、葡聚糖等。任选地,悬浮液还可含有合适的稳定剂或增大化合物溶解度的试剂,以允许制备高浓度溶液。另外,活性化合物的悬浮液可以制备成适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油,诸如芝麻油;或合成脂肪酸酯,诸如油酸乙酯或甘油三酯;或脂质体。活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中;包埋在胶体药物递送系统(例如,脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中;或包埋在粗乳液中。此类技术在Remington'sPharmaceuticalSciences(第18版,MackPrintingCompany,1990)中公开。可以制备缓释制备物。缓释制备物的合适示例包括含有多肽的固态疏水聚合物的半透性基质,所述基质是例如膜或微胶囊等成型制品的形式。在特定方面,可注射组合物的延长吸收可以通过在所述组合物中使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝、明胶或它们的组合)来实现。除了先前描述的组合物之外,抗体还可以配制成贮库制剂。此类长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内植入)或通过肌内注射施用。因此,例如,抗体可以用合适的聚合或疏水材料配制(例如作为可接受油中的乳液)或用离子交换树脂配制,或配制为微溶的衍生物,例如配制为微溶盐。包含本发明的抗体的药物组合物可借助于常规混合、溶解、乳化、包封、包埋或冻干的手段制备。药物组合物可以使用一种或多种生理上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂以常规方式配制,所述载体、稀释剂、赋形剂或助剂有助于将蛋白质加工成可以在药学上使用的制备物。合适的制剂取决于所选择的施用途径。抗体可以配制成游离酸或碱、中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐是基本上保留游离酸或游离碱的生物活性的盐。这些药学上可接受的盐包括酸加成盐,例如与蛋白质组合物的游离氨基形成的酸加成盐,或与无机酸(诸如盐酸或磷酸)或有机酸(如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸)形成的酸加成盐。用游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱,诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁;或者有机碱,诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因。与相应的游离碱形式相比,药用盐倾向于更易溶于水性和其他质子溶剂中。F.治疗方法和组合物本文提供的任何抗体可用于治疗方法。本发明的抗体可用作免疫治疗剂,例如用于治疗癌症。为了用于治疗方法中,本发明的抗体将以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在该背景下需要考虑的因素包括所治疗的特定疾患、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、疾患的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用的时间安排,以及执业医师已知的其他因素。在一个方面,将本发明的抗体提供为用作药物。在另外的方面,将本发明的抗体提供为用于治疗疾病。在某些方面,提供了用于治疗方法的本发明的抗体。在一个方面,本发明提供了本发明的抗体以用于治疗有需要的个体的疾病。在某些方面,本发明提供了抗体以用于治疗患有疾病的个体的方法中,该方法包括向所述个体施用有效量的所述抗体。在某些方面,待治疗的疾病是增殖性疾患。在一个优选的方面,疾病是癌症。在某些方面,如果待治疗的疾病是癌症,则所述方法还包括向所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂,例如抗癌剂。在另外的方面,本发明提供了用于诱导靶细胞,特别是肿瘤细胞的裂解的本发明的抗体。在某些方面,本发明提供了用于在个体中诱导靶细胞、特别是肿瘤细胞的裂解的方法中使用的本发明的抗体,所述方法包括向所述个体施用有效量的抗体以诱导靶细胞的裂解。在某些方面,所述方法进一步包括施用T细胞活化剂,例如与CD3结合的抗体,特别是与CD3和靶细胞抗原、特别是肿瘤细胞抗原结合的双特异性抗体。在某些方面,所述使用与以下项组合:T细胞活化剂,例如与CD3结合的抗体,特别是与以下项结合的双特异性抗体:CD3和靶抗原,特别是肿瘤细胞抗原。根据任何上述方面的“个体”是哺乳动物,优选人。在另一个方面,本发明提供了本发明的抗体在制造或制备药物中的用途。在一个方面,所述药物用于治疗有此需要的个体的疾病。在另一个方面,所述药物用于治疗疾病的方法,所述方法包括向患有疾病的个体施用有效量的药物。在某些方面,待治疗的疾病是增殖性疾患。在一个优选的方面,疾病是癌症。在一个方面,该方法还包括向个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂,例如如果待治疗的疾病是癌症,则使用抗癌剂。在另一个方面,所述药物用于诱导靶细胞、特别是肿瘤细胞的裂解。在又另一个方面,所述药物用于在个体中诱导靶细胞、特别是肿瘤细胞的裂解的方法中,所述方法包括向所述个体施用有效量的药物以诱导靶细胞的裂解。在某些方面,所述方法进一步包括施用T细胞活化剂,例如与CD3结合的抗体,特别是与CD3和靶细胞抗原、特别是肿瘤细胞抗原结合的双特异性抗体。在某些方面,所述治疗与以下项组合:T细胞活化剂,例如与CD3结合的抗体,特别是与以下项结合的双特异性抗体:CD3和靶抗原,特别是肿瘤细胞抗原。根据上述方面中的任一方面的“个体”可以是哺乳动物,优选地是人。在另一个方面,本发明提供了治疗疾病的方法。在一个方面,所述方法包括向患有这种疾病的个体施用有效量的本发明的抗体。在一个方面,向所述个体施用组合物,所述组合物包含药学上可接受形式的本发明的抗体。在某些方面,待治疗的疾病是增殖性疾患。在一个优选的方面,疾病是癌症。在某些方面,如果待治疗的疾病是癌症,则所述方法还包括向所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂,例如抗癌剂。在某些方面,所述方法进一步包括施用T细胞活化剂,例如与CD3结合的抗体,特别是与CD3和靶细胞抗原、特别是肿瘤细胞抗原结合的双特异性抗体。根据上述方面中的任一方面的“个体”可以是哺乳动物,优选地是人。在另一个方面,本发明提供了一种诱导靶细胞、特别是肿瘤细胞的裂解的方法。在一个方面,所述方法包括在存在T细胞、特别是细胞毒性T细胞的情况下,使靶细胞与本发明的抗体接触。在另一个方面,提供了一种用于在个体中诱导靶细胞、特别是肿瘤细胞的裂解的方法。在一个这样的方面,所述方法包括向个体施用有效量的本发明的抗体以诱导靶细胞的裂解。在某些方面,所述方法进一步包括施用T细胞活化剂,例如与CD3结合的抗体,特别是与CD3和靶细胞抗原、特别是肿瘤细胞抗原结合的双特异性抗体。在一个方面,“个体”是人。在某些方面中,待治疗的疾病是增殖性疾患,特别是癌症。癌症的非限制性实例包括膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、结肠癌、结直肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、血癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、骨癌,以及肾癌。可以使用本发明的抗体治疗的其他细胞增殖疾患包括但不限于位于以下部位中的肿瘤:腹部、骨骼、乳房、消化系统、肝脏、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼睛、头颈部、神经系统(中枢和外周神经系统)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾脏、胸部,以及泌尿生殖系统。还包括癌前病症或病变和癌症转移。在某些方面,癌症选自由以下项组成的组:肾癌、膀胱癌、皮肤癌、肺癌、结直肠癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌和前列腺癌。在一个方面,所述癌症是表达第二抗原的癌症。技术人员容易认识到,在许多情况下,抗体可能不提供治愈,而可能仅提供部分益处。在一些方面,具有某些益处的生理变化也被视为具有治疗益处。因此,在一些方面,提供生理变化的抗体的量被认为是“有效量”。需要治疗的受试者、患者或个体通常是哺乳动物,更特别地是人。在一些方面,将有效量的本发明的抗体施用于个体以治疗疾病。为了预防或治疗疾病,本发明的抗体的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病类型、施用途径、患者的体重、抗体的类型、疾病的严重程度和病程、抗体是施用用于预防目的还是治疗目的、既往或同时进行的治疗干预、患者的临床病史和对抗体的反应,以及主治医师的判断。在任何情况下,负责施用的执业者将针对个体受试者来确定组合物中活性成分的浓度和适当剂量。本文考虑了各种给药时间安排,包括但不限于在各个时间点处的单次或多次施用、推注施用,以及脉冲输注。抗体适当地一次或在一系列治疗中施用于患者。取决于疾病的类型和严重性,约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体可以是例如通过一次或多次单独施用或通过连续输注而施用于患者的初始候选剂量。取决于上述因素,一种典型的日剂量的范围可以为约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于数天或更长时间的重复施用,取决于病症,治疗通常会持续直至发生期望的疾病症状抑制。抗体的一种示例性剂量的范围为约0.005mg/kg至约10mg/kg。在其他非限制性实例中,剂量还可包括每次施用约1微克/kg体重、约5微克/kg体重、约10微克/kg体重、约50微克/kg体重、约100微克/kg体重、约200微克/kg体重、约350微克/kg体重、约500微克/kg体重、约1毫克/kg体重、约5毫克/kg体重、约10毫克/kg体重、约50毫克/kg体重、约100毫克/kg体重、约200毫克/kg体重、约350毫克/kg体重、约500毫克/kg体重,至约1000mg/kg体重或更多,以及从其中推导出的任何范围。在从本文所列数字可推导出的范围的非限制性实例中,约5mg/kg体重至约100mg/kg体重、约5微克/kg体重至约500毫克/kg体重等的范围可以基于上述数值施用。因此,可以将约0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg或10mg/kg(或它们的任何组合)的一种或多种剂量施用于患者。此类剂量可以间歇施用,例如每周或每三周施用(例如,使得患者接受约两次至约二十次,或例如约六次剂量的抗体)。可以施用初始较高的负荷剂量,之后施用一次或多次较低剂量。然而,其他剂量方案可能有用。这种疗法的进展易于通过常规的技术和测定法来监测。本发明的抗体将通常以有效实现预期目的的量使用。为用于治疗或预防病症,将本发明的抗体或其药物组合物以有效量施用或施加。对于全身施用,有效剂量可以最初根据体外测定(诸如细胞培养物测定)来进行估计。可以随后在动物模型中配制剂量,以实现包括如在细胞培养中测定的IC50循环浓度范围。此类信息可用于更准确地确定对人类的有用剂量。初始剂量也可以使用本领域公知的技术,根据体内数据(例如动物模型)来估计。可以单独地调整剂量的量和间隔,以提供足以维持治疗效果的抗体的血浆水平。通过注射施用的常用患者剂量的范围是约0.1至50mg/kg/天,通常约0.5至1mg/kg/天。通过每天施用多个剂量可以实现治疗有效的血浆水平。可以例如通过HPLC来测量血浆中的水平。有效剂量的本发明的抗体通常将在不会引起显著毒性的情况下提供治疗益处。抗体的毒性和治疗功效可通过标准药学方法在细胞培养或实验动物中测定。细胞培养测定和动物研究可以用于测定LD50(致死群体的50%的剂量)和ED50(在群体的50%中治疗有效的剂量)。毒性和疗效之间的剂量比是治疗指数,所述治疗指数可以表示为比率LD50/ED50。表现出大治疗指数的抗体是优选的。在一个方面,根据本发明的抗体表现出高治疗指数。从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制适用于人类的一系列剂量。剂量优选在包括几乎没有毒性或没有毒性的ED50的循环浓度的范围内。剂量可以取决于多种因素而在该范围内变化,所述多种因素为例如所采用的剂型、所利用的施用途径、受试者的病症等。确切的配方、施用途径和剂量可以由个别医生根据患者的病症来选择(参见例如Fingl等人,1975,在:ThePharmacologicalBasisofTherapeutics,第1章,第1页中,该文献的全部内容以引用方式并入本文中)。用本发明的抗体治疗的患者的主治医师将知道如何以及何时由于毒性、器官功能障碍等终止、中断或调整施用。相反地,如果临床应答不充分(排除毒性),则主治医师也会知道将治疗调整到更高水平。在目标病症的管理中施用的剂量的大小将随着待治疗病症的严重程度、施用途径等而变化。例如,可以部分地通过标准预后评估方法来评估病症的严重性。此外,剂量和可能的剂量频率也将根据个体患者的年龄、体重和应答而变化。本发明的抗体可以与治疗中的一种或多种其他药剂组合施用。例如,本发明的抗体可与至少一种另外的治疗剂共同施用。术语“治疗剂”包括被施用以治疗需要这种治疗的个体的症状或疾病的任何药剂。此类附加治疗剂可包含适合于所治疗的具体疾病的任何活性成分,优选地是具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性成分。在某些方面,另外的治疗剂是免疫调节剂、细胞生长抑制剂、细胞粘附抑制剂、细胞毒性剂、细胞凋亡活化剂,或增加细胞对凋亡诱导剂的敏感性的试剂。在一个方面,另外的治疗剂是抗癌剂,例如微管破坏剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、DNA嵌入剂、烷化剂、激素疗法、激酶抑制剂、受体拮抗剂、肿瘤细胞凋亡活化剂,或抗血管生成剂。在优选的方面,另外的治疗剂是T细胞活化剂。在一个这样的方面,另外的治疗剂是与CD3结合的抗体,特别是与CD3和靶细胞抗原、特别是肿瘤细胞抗原结合的双特异性抗体。在一个方面,与另外的治疗剂结合的靶细胞抗原与第二抗原相同,和/或像第二抗原一样共表达(例如在同一靶细胞上)。在一个方面,另外的治疗剂是CD3xCEA双特异性抗体。可与本发明的抗-NKG2D(多特异性)抗体组合使用的CD3xCEA双特异性抗体的其他方面在下文中描述。在一个具体方面,另外的治疗剂是CEA-TCB(SEQIDNO130-135(CD3)和138-143(CEA)的CDR序列、SEQIDNO136和137(CD3)以及144和145(CEA)的可变区序列、SEQIDNO154-157的全序列)或CEA-TCB(2)(SEQIDNO130-135(CD3)和146-151(CEA)的CDR序列、SEQIDNO136和137(CD3)以及152和153(CEA)的可变区序列、SEQIDNO158-161的全序列)。此类其他药剂适当地以对预期目的有效的量组合存在。此类其他药剂的有效量取决于所用抗体的量、疾患或治疗的类型,以及上面讨论的其他因素。抗体通常以与本文所述相同的剂量和施用途径使用,或以本文所述剂量的约1%至99%使用,或以经验地/临床上确定为合适的任何剂量和任何途径使用。上述此类组合疗法包括联合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在相同或不同的组合物中)和单独施用,在单独施用的情况下,本发明的抗体的施用可以在施用另外的治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后进行。本发明的抗体也可以与放射疗法组合使用。用于与本发明的抗体组合的CD3xCEA双特异性抗体CD3xCEA双特异性抗体包含与CD3特异性地结合的第一抗原结合部分,以及与CEA特异性地结合的第二抗原结合部分。在一个方面,所述第一抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包含SEQIDNO:130的重链CDR(HCDR)1、SEQIDNO:131的HCDR2和SEQIDNO:132的HCDR3;所述轻链可变区包含SEQIDNO:133的轻链CDR(LCDR)1、SEQIDNO:134的LCDR2和SEQIDNO:135的LCDR3。在一个方面,所述第二抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包含SEQIDNO:138的重链CDR(HCDR)1、SEQIDNO:139的HCDR2和SEQIDNO:140的HCDR3;所述轻链可变区包含SEQIDNO:141的轻链CDR(LCDR)1、SEQIDNO:142的LCDR2和SEQIDNO:143的LCDR3;或(ii)包含重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包含SEQIDNO:146的重链CDR(HCDR)1、SEQIDNO:147的HCDR2和SEQIDNO:148的HCDR3;所述轻链可变区包含SEQIDNO:149的轻链CDR(LCDR)1、SEQIDNO:150的LCDR2和SEQIDNO:151的LCDR3。在一个特定方面,所述CD3xCEA双特异性抗体包含(i)第一抗原结合部分,所述第一抗原结合部分与CD3特异性地结合并且包含重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包含SEQIDNO:130的重链CDR(HCDR)1、SEQIDNO:131的HCDR2和SEQIDNO:132的HCDR3;所述轻链可变区包含SEQIDNO:133的轻链CDR(LCDR)1、SEQIDNO:134的LCDR2和SEQIDNO:135的LCDR3;以及(i)第二抗原结合部分,所述第二抗原结合部分与CEA特异性地结合并且包含重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包含SEQIDNO:138的重链CDR(HCDR)1、SEQIDNO:139的HCDR2和SEQIDNO:140的HCDR3;所述轻链可变区包含SEQIDNO:141的轻链CDR(LCDR)1、SEQIDNO:142的LCDR2和SEQIDNO:143的LCDR3;或(ii)包含重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包含SEQIDNO:146的重链CDR(HCDR)1、SEQIDNO:147的HCDR2和SEQIDNO:148的HCDR3;所述轻链可变区包含SEQIDNO:149的轻链CDR(LCDR)1、SEQIDNO:150的LCDR2和SEQIDNO:151的LCDR3。在一个方面,所述第一抗原结合部分包含下述重链可变区序列和轻链可变区序列:所述重链可变区序列与SEQIDNO:136的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性,所述轻链可变区序列与SEQIDNO:137的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性。在一个方面,所述第一抗原结合部分包含SEQIDNO:136的重链可变区序列和SEQIDNO:137的轻链可变区序列。在一个方面,所述第二抗原结合部分包含下述重链可变区序列和轻链可变区序列:所述重链可变区序列与SEQIDNO:144的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性,并且所述轻链可变区序列与SEQIDNO:145的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性,或(ii)下述重链可变区序列和轻链可变区序列,所述重链可变区序列与SEQIDNO:152的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性,并且所述轻链可变区序列与SEQIDNO:153的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性。在一个方面,所述第二抗原结合部分包含SEQIDNO:144的重链可变区序列和SEQIDNO:145的轻链可变区序列;或(ii)包含SEQIDNO:152的重链可变区序列和SEQIDNO:153的轻链可变区序列。在一些方面,所述第一抗原结合部分和/或所述第二抗原结合部分是Fab分子。在一些方面,所述第一抗原结合部分是交叉Fab分子,其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区发生交换。在此类方面,第二抗原结合部分优选地是常规的Fab分子。在其中所述双特异性抗体的第一抗原结合部分和第二抗原结合部分都是Fab分子的一些方面,并且在所述抗原结合部分之一(特别是第一抗原结合部分)中,Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH互相替换,i)在所述第一抗原结合部分的恒定结构域CL中,位置124处的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代(根据Kabat编号),并且其中在所述第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中,位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸被带负电荷的氨基酸取代(根据KabatEU索引编号);或者ii)在所述第二抗原结合部分的恒定结构域CL中,位置124处的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代(根据Kabat编号),并且其中在所述第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中,位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸被带负电荷的氨基酸取代(根据KabatEU索引编号)。所述双特异性抗体不包含在i)和ii)中提及的两种修饰。具有VH/VL交换的抗原结合部分的恒定结构域CL和CH1不互相替换(即保持未交换)。在一个更具体的方面,i)在所述第一抗原结合部分的恒定结构域CL中,位置124处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号),并且在所述第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中,位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据KabatEU索引编号);或者ii)在所述第二抗原结合部分的恒定结构域CL中,位置124处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号),并且在所述第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中,位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据KabatEU索引编号)。在一个这样的方面,在所述第二抗原结合部分的恒定结构域CL中,位置124处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号),并且在所述第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中,位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据KabatEU索引编号)。在另一个方面,在所述第二抗原结合部分的恒定结构域CL中,位置124处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号),并且在所述第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中,位置147处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据KabatEU索引编号)。在一个特定方面,在所述第二抗原结合部分的恒定结构域CL中,位置124处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)并且位置123处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号),并且在所述第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中,位置147处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据KabatEU索引编号)并且位置213处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据KabatEU索引编号)。在一个更特定的方面,在所述第二抗原结合部分的恒定结构域CL中,位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号),并且在所述第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中,位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据KabatEU索引编号)并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据KabatEU索引编号)。在一个甚至更特定的方面,在所述第二抗原结合部分的恒定结构域CL中,位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且位置123处的氨基酸被精氨酸(R)取代(根据Kabat编号),并且在所述第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中,位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据KabatEU索引编号)并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据KabatEU索引编号)。在特定方面,如果根据上述方面的氨基酸取代在所述第二抗原结合部分的恒定结构域CL和恒定结构域CH1中进行,则所述第二抗原结合部分的恒定结构域CL是κ同种型。在一些方面,所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合,任选地经由肽连接基融合。在一些方面,所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分各自是Fab分子并且(i)所述第二抗原结合部分在所述Fab重链的C端处融合至所述第一抗原结合部分的所述Fab重链的N端,或(ii)所述第一抗原结合部分在所述Fab重链的C端处融合至所述第二抗原结合部分的所述Fab重链的N端。在一些方面,CD3xCEA双特异性抗体提供了与CD3的单价结合。在特定方面,CD3xCEA双特异性抗体包含与CD3特异性地结合的单个抗原结合部分,以及与CEA特异性地结合的两个抗原结合部分。因此,在一些方面,CD3xCEA双特异性抗体包含与CEA特异性地结合的第三抗原结合部分。在一些方面,所述第三抗原部分与所述第一抗原结合部分相同(例如也是Fab分子并且包含相同的氨基酸序列)。在特定方面,CD3xCEA双特异性抗体还包含由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域。在一个方面,所述Fc结构域是IgGFc结构域。在一个特定方面,所述Fc结构域是IgG1Fc结构域。在另一个方面,所述Fc结构域是IgG4Fc结构域。在一个更具体的方面,所述Fc结构域是在位置S228(KabatEU索引编号)处包含氨基酸取代(特别是氨基酸取代S228P)的IgG4Fc结构域。该氨基酸取代减少了IgG4抗体的体内Fab臂交换(参见Stubenrauch等人,DrugMetabolismandDisposition38,84-91(2010))。在另一个特定方面,所述Fc结构域是人Fc结构域。在一个特别优选的方面,所述Fc结构域是人IgG1Fc结构域。人IgG1Fc区的示例性序列以SEQIDNO:86给出。在其中所述第一抗原结合部分、所述第二抗原结合部分和(如果存在的话)所述第三抗原结合部分各自是Fab分子的一些方面,(a)(i)所述第二抗原结合部分在所述Fab重链的C端处融合至所述第一抗原结合部分的所述Fab重链的N端,并且所述第一抗原结合部分在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的第一亚基的N端,或(ii)所述第一抗原结合部分在所述Fab重链的C端处融合至所述第二抗原结合部分的所述Fab重链的N端,并且所述第二抗原结合部分在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的第一亚基的N端;并且(b)所述第三抗原结合部分(如果存在的话)在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的第二亚基的N端。在特定方面,所述Fc结构域包含促进所述Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰。人IgGFc结构域的两个亚基之间最广泛的蛋白质间相互作用位点在CH3结构域中。因此,在一个方面,所述修饰在所述Fc结构域的CH3结构域中。在一个具体方面,所述促进所述Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰是所谓的“杵臼结构”修饰,其包括所述Fc结构域的两个亚基中的一个亚基中的“杵”修饰和所述Fc结构域的两个亚基中的另一个亚基中的“臼”修饰。杵臼结构技术描述于例如以下文献中:US5,731,168;US7,695,936;Ridgway等人,ProtEng9,617-621(1996),以及Carter,JImmunolMeth248,7-15(2001)。一般来讲,该方法涉及在第一多肽的界面处引入凸起(“杵”)并且在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“臼”),使得所述凸起可以定位在所述空腔中,以便促进异源二聚体的形成并且阻碍同源二聚体的形成。凸起是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建的。具有与凸起相同或相似大小的补偿空腔是通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链而在第二多肽的界面中创建的。因此,在一些方面,所述Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替换,从而在第一亚基的CH3结构域内产生凸起,所述凸起可定位在第二亚基的CH3结构域内的空腔中,并且所述Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替换,从而在第二亚基的CH3结构域内产生空腔,第一亚基的CH3结构域内的所述凸起可定位在所述空腔内。优选地,所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自由精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)组成的组。优选地,所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自由丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)组成的组。所述凸起和空腔可以通过改变编码所述多肽的核酸(例如通过位点特异性诱变或通过肽合成)来制备。在一个具体的这种方面,在所述Fc结构域的第一亚基中,位置366处的苏氨酸残基被色氨酸残基取代(T366W)替换,并且在所述Fc结构域的第二亚基中,位置407处的酪氨酸残基被缬氨酸残基替换(Y407V)并且任选地,位置366处的苏氨酸残基被丝氨酸残基替换(T366S),并且位置368处的亮氨酸残基被丙氨酸残基替换(L368A)(根据KabatEU索引编号)。在另一个方面,在所述Fc结构域的第一亚基中,除此之外,位置354处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基替换(S354C)或位置356处的谷氨酸残基被半胱氨酸残基替换(E356C)(特别是位置354处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基替换),并且在所述Fc结构域的第二亚基中,除此之外,位置349处的酪氨酸残基被半胱氨酸残基替换(Y349C)(根据KabatEU索引编号)。在一个优选方面,所述Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W,并且所述Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S、L368A和Y407V(根据KabatEU索引编号)。在一些方面,所述Fc结构域包含降低与Fc受体的结合和/或效应子功能的一个或更多个氨基酸取代。在一个特定方面,所述Fc受体是Fcγ受体。在一个方面,所述Fc受体是人Fc受体。在一个方面,所述Fc受体是活化性Fc受体。在一个具体方面,Fc受体是活化性人Fcγ受体,更具体地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa,最具体地是人FcγRIIIa(CD16a)。在一个方面,所述效应子功能是选自由以下项组成的组中的一种或多种:补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和细胞因子分泌。在一个特定方面,效应子功能是ADCC。典型地,相同的一个或更多个氨基酸取代存在于所述Fc结构域的两个亚基中的每个亚基中。在一个方面,所述一个或更多个氨基酸取代降低了所述Fc结构域对Fc受体的结合亲和力。在一个方面,所述一个或更多个氨基酸取代将所述Fc结构域对Fc受体的结合亲和力降低至少2倍、至少5倍或至少10倍。在一个方面,所述Fc结构域在选自包括E233、L234、L235、N297、P331和P329(根据KabatEU索引编号)的组的位置处包含氨基酸取代。在一个更具体的方面,所述Fc结构域在选自包括L234、L235和P329(根据KabatEU索引编号)的组的位置处包含氨基酸取代。在一些方面,所述Fc结构域包含氨基酸取代L234A和L235A(根据KabatEU索引编号)。在一个这样的方面,所述Fc结构域是IgG1Fc结构域,特别是人IgG1Fc结构域。在一个方面,所述Fc结构域在位置P329处包含氨基酸取代。在一个更具体的方面,所述氨基酸取代是P329A或P329G,特别是P329G(根据KabatEU索引编号)。在一个方面,所述Fc结构域在位置P329处包含氨基酸取代,并且在选自E233、L234、L235、N297和P331(根据KabatEU索引编号)的位置处包含另外的氨基酸取代。在一个更具体的方面,所述另外的氨基酸取代是E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在特定方面,所述Fc结构域在位置P329、L234和L235(根据KabatEU索引编号)处包含氨基酸取代。在更特定的方面,所述Fc结构域包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G(“P329GLALA”、“PGLALA”或“LALAPG”)。具体地讲,在优选的方面,所述Fc结构域的每个亚基包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(KabatEU索引编号),即在所述Fc结构域的第一亚基和第二亚基中的每一者中,位置234处的亮氨酸残基被丙氨酸残基替换(L234A),位置235处的亮氨酸残基被丙氨酸残基替换(L235A),并且位置329处的脯氨酸残基被甘氨酸残基替换(P329G)(根据KabatEU索引编号)。在一个这样的方面,所述Fc结构域是IgG1Fc结构域,特别是人IgG1Fc结构域。在一个优选的方面,所述CD3xCEA双特异性抗体包含(i)第一抗原结合部分,所述第一抗原结合部分与CD3特异性地结合并且包含重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包含SEQIDNO:130的重链CDR(HCDR)1、SEQIDNO:131的HCDR2和SEQIDNO:132的HCDR3;所述轻链可变区包含SEQIDNO:133的轻链CDR(LCDR)1、SEQIDNO:134的LCDR2和SEQIDNO:135的LCDR3,其中所述第一抗原结合部分是交叉Fab分子,其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区(特别是恒定区)发生交换;(ii)第二抗原结合部分和第三抗原结合部分,所述第二抗原结合部分和所述第三抗原结合部分与CEA特异性地结合并且包含重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包含SEQIDNO:138的重链CDR(HCDR)1、SEQIDNO:139的HCDR2和SEQIDNO:140的HCDR3;所述轻链可变区包含SEQIDNO:141的轻链CDR(LCDR)1、SEQIDNO:142的LCDR2和SEQIDNO:143的LCDR3,其中所述第二抗原结合部分和所述第三抗原结合部分各自是Fab分子,特别是常规Fab分子;(iii)Fc结构域,所述Fc结构域包含第一亚基和第二亚基,其中所述第二抗原结合部分在所述Fab重链的C端处融合至所述第一抗原结合部分的所述Fab重链的N端,并且所述第一抗原结合部分在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的所述第一亚基的N端,并且其中所述第三抗原结合部分在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的所述第二亚基的N端。在一个方面,所述第一抗原结合部分包含下述重链可变区序列和轻链可变区序列:所述重链可变区序列与SEQIDNO:136的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性,所述轻链可变区序列与SEQIDNO:137的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性。在一个方面,所述第一抗原结合部分包含SEQIDNO:136的重链可变区序列和SEQIDNO:137的轻链可变区序列。在一个方面,所述第二抗原结合部分和所述第三抗原结合部分包含下述重链可变区序列和轻链可变区序列:所述重链可变区序列与SEQIDNO:144的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性,所述轻链可变区序列与SEQIDNO:145的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性。在一个方面,所述第二抗原结合部分和所述第三抗原结合部分包含SEQIDNO:144的重链可变区和SEQIDNO:145的轻链可变区。根据上述方面的Fc结构域可以单独地或组合地结合上文关于Fc结构域描述的所有特征。在一个方面,所述抗原结合部分和所述Fc区通过肽连接基(特别是通过如以SEQIDNO:154和SEQIDNO:155所示的肽连接基)彼此融合。在一个方面,CD3xCEA双特异性抗体包含:包含与SEQIDNO:154的序列至少有80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的序列的多肽,包含与SEQIDNO:155的序列至少有80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的序列的多肽,包含与SEQIDNO:156的序列至少有80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的序列的多肽,以及包含与SEQIDNO:157的序列至少有80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的序列的多肽(特别是两种多肽)。在一个方面,CD3xCEA双特异性抗体包含:包含SEQIDNO:154的序列的多肽、包含SEQIDNO:155的序列的多肽、包含SEQIDNO:156的序列的多肽,以及包含SEQIDNO:157的序列的多肽(特别是两种多肽)。在一个特定方面,CD3xCEA双特异性抗体是cibisatamab(WHO药物信息(药物的国际非专属名称),推荐INN:清单80,2018,第32卷,第3期,第438页)。在一个方面,CD3xCEA双特异性抗体包含(i)第一抗原结合部分,所述第一抗原结合部分与CD3特异性地结合并且包含重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包含SEQIDNO:130的重链CDR(HCDR)1、SEQIDNO:131的HCDR2和SEQIDNO:132的HCDR3;所述轻链可变区包含SEQIDNO:133的轻链CDR(LCDR)1、SEQIDNO:134的LCDR2和SEQIDNO:135的LCDR3,其中所述第一抗原结合部分是交叉Fab分子,其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区(特别是可变区)发生交换;(ii)第二抗原结合部分和第三抗原结合部分,所述第二抗原结合部分和所述第三抗原结合部分与CEA特异性地结合并且包含重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包含SEQIDNO:146的重链CDR(HCDR)1、SEQIDNO:147的HCDR2和SEQIDNO:148的HCDR3;所述轻链可变区包含SEQIDNO:149的轻链CDR(LCDR)1、SEQIDNO:150的LCDR2和SEQIDNO:151的LCDR3,其中所述第二抗原结合部分和所述第三抗原结合部分各自是Fab分子,特别是常规Fab分子;(iii)Fc结构域,所述Fc结构域由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基组成,其中所述第二抗原结合部分在所述Fab重链的C端处融合至所述第一抗原结合部分的所述Fab重链的N端,并且所述第一抗原结合部分在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的所述第一亚基的N端,并且其中所述第三抗原结合部分在所述Fab重链的C端处融合至所述Fc结构域的所述第二亚基的N端。在一个方面,所述第一抗原结合部分包含下述重链可变区序列和轻链可变区序列:所述重链可变区序列与SEQIDNO:136的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性,所述轻链可变区序列与SEQIDNO:137的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性。在一个方面,所述第一抗原结合部分包含SEQIDNO:136的重链可变区序列和SEQIDNO:137的轻链可变区序列。在一个方面,所述第二抗原结合部分和所述第三抗原结合部分包含下述重链可变区序列和轻链可变区序列:所述重链可变区序列与SEQIDNO:152的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性,所述轻链可变区序列与SEQIDNO:153的氨基酸序列具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性。在一个方面,所述第二抗原结合部分和所述第三抗原结合部分包含SEQIDNO:152的重链可变区和SEQIDNO:153的轻链可变区。根据上述方面的Fc结构域可以单独地或组合地结合上文关于Fc结构域描述的所有特征。在一个方面,所述抗原结合部分和所述Fc区通过肽连接基(特别是通过如以SEQIDNO:158和SEQIDNO:159所示的肽连接基)彼此融合。在一个方面,在(ii)下的所述第二Fab分子和所述第三Fab分子的恒定结构域CL中,位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)(特别是被精氨酸(R))取代(根据Kabat编号),并且在(ii)下的所述第二Fab分子和所述第三Fab分子的恒定结构域CH1中,位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据KabatEU索引编号)并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据KabatEU索引编号)。在一个方面,所述双特异性抗体包含以下多肽:包含的序列与SEQIDNO:158的序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的多肽;包含的序列与SEQIDNO:159的序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的多肽;包含的序列与SEQIDNO:160的序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的多肽;以及包含的序列与SEQIDNO:161的序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的多肽(特别是两种多肽)。在一个方面,所述双特异性抗体包含以下多肽:包含SEQIDNO:158的序列的多肽、包含SEQIDNO:159的序列的多肽、包含SEQIDNO:160的序列的多肽,以及包含SEQIDNO:161的序列的多肽(特别是两种多肽)。技术人员将获知的其他CD3xCEA双特异性抗体也被考虑用于本发明。在一个方面,所述CD3xCEA双特异性抗体是MEDI565(AMG211,MT111)。G.制品在本发明的另一个方面中,提供了一种制品,其含有可用于治疗、预防和/或诊断上述病症的物质。该制品包括容器和在所述容器上或与所述容器相关的标签或包装插页(packageinsert)。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、静脉注射(IV)溶液袋,等等。所述容器可以由多种材料(诸如玻璃或塑料)形成。所述容器容纳组合物,该组合物本身或与另一种组合物组合能够有效地用于治疗、预防和/或诊断病症,并且所述容器可以具有无菌进入口(例如,所述容器可以是具有能够被皮下注射针刺穿的塞子的静脉注射溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装说明书指示该组合物用于治疗所选择的病症。此外,所述制品可包括(a)第一容器,所述第一容器中含有包含本发明的抗体的组合物;以及(b)第二容器,所述第二容器中含有包含另外的细胞毒性剂或其他治疗剂组合物。本发明该方面中的制品还可包含包装插页,所述包装插页指示所述组合物可用于治疗特定病症。可替代地或另外地,制品还可包括第二(或第三)容器,该二(或第三)容器包括药学上可接受的缓冲液,诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。所述药盒可以还包括从商业和用户的角度所需的其他物质,包括其他缓冲液、稀释剂、滤器、针头和注射器。H.用于诊断和检测的方法和组合物在某些方面,本文提供的抗体中的任一种可用于检测生物样品中其靶标(例如NKG2D)的存在。如本文所用的术语“检测”涵盖了定量检测或定性检测。在某些方面,生物样品包括细胞或组织,例如前列腺组织。在一个方面,提供了用于诊断或检测的方法的根据本发明的抗体。在另一方面,提供了检测生物样品中的NKG2D的存在的方法。在某些方面,所述方法包括在允许抗体与NKG2D结合的条件下使生物样品与本发明的抗体接触,并且检测抗体和NKG2D之间是否形成复合物。这种方法可以是体外或体内方法。在一个方面,本发明的抗体用于选择适合用与NKG2D结合的抗体治疗的受试者,例如,其中NKG2D是用于选择患者的生物标志物。可以使用本发明的抗体诊断的示例性疾患包括癌症。在某些方面,提供了根据本发明的抗体,其中所述抗体被标记。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(诸如荧光标记、发色标记、电子致密标记、化学发光标记,以及放射性标记),以及间接(例如通过酶促反应或分子相互作用)检测的部分(诸如酶或配体)。示例性标记包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I;荧光团,诸如稀土螯合物或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、伞形酮;荧光素酶(luceriferase),例如萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利号4,737,456);虫荧光素、2,3-二氢二氮杂萘二酮、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶;糖氧化酶,例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶;杂环氧化酶,诸如尿酸氧化酶和黄嘌呤氧化酶;与采用过氧化氢来氧化染料前体的酶(诸如HRP、乳过氧化物酶,或微过氧化物酶)偶联;生物素/抗生物素蛋白、纺丝标记、噬菌体标记、稳定自由基,等等。III.序列IV.实例以下是本发明的方法和组合物的实施例。应当理解,在给出以上提供的一般描述的情况下,可以实践各种其他方面。实例1.一般方法和工具重组DNA技术使用标准方法来操纵DNA,如在Sambrook,J.,etal.,Molecularcloning:Alaboratorymanual;ColdSpringHarborLaboratorypress,ColdspringHarbor,NewYork,1989中所述。根据制造商的说明来使用分子生物学试剂。关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息在以下参考文献中给出:Kabat,E.A.等人,(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五版,NIHPublicationNo91-3242。DNA测序通过双链测序确定DNA序列。基因合成在需要时,通过使用适当模板进行PCR生成所需的基因区段,或在GeneartAG(Regensburg,Germany)处通过自动化基因合成从合成寡核苷酸和PCR产物合成所需的基因区段。将侧接有单个限制性内切酶切割位点的基因区段克隆到标准克隆/测序载体中。从转化的细菌中纯化出质粒DNA,并通过紫外光谱法确定浓度。通过DNA测序来确认亚克隆基因片段的DNA序列。设计具有合适限制性位点的基因区段,以允许亚克隆到相应的表达载体中。所有构建体均设计有5’端DNA序列,该序列编码前导肽,该前导肽靶向真核细胞分泌的蛋白。NKG2D受体和MIC-B配体的产生产生了NKG2D受体以及MIC-B配体的若干种构建体,用作噬菌体展示的抗原、转基因兔的蛋白质免疫的免疫原,以及用作筛选和表征工具。人NKG2D的细胞外结构域(ECD)被克隆为4种不同的构建体:1.使用N端H6–avi–标签形成非共价二聚体(hisavihuNKG2DECD)(SEQIDNO:93),2.作为与avi标记的人IgG1Fc杵链(其与“空”人IgG1Fc臼链配对)的C端的单价Fc融合(monohuNKG2DECDFckhavi)(SEQIDNO:94和95),3.作为与由完整铰链区二聚化的avi标记的人IgG1Fc的C端的二聚体Fc融合(dihuNKG2DECDFcavi)(SEQIDNO:96),以及4.作为与由完整铰链区二聚化的鼠IgG1Fc的C端的二聚体Fc融合(dihuNKG2DECDmuIgG1Fc)(SEQIDNO:99)。这种鼠Fc融合用于增加转基因兔的免疫原性。将食蟹猴和鼠NKG2D的ECD(分别为dicyNKG2DECDFcavi和dimuNKG2DECDFcavi)以与人二聚体Fc融合类似的方式克隆到avi标记的人IgG1Fc的C端,如上所述(分别为SEQIDNO97和98)。此外,NKG2D配体MIC-B(ECDFLMIC-BFcavi)的ECD被克隆为与携带C端avi标签并且与“空”人IgG1Fc臼链配对的人IgG1Fc杵链的单价N端融合(SEQIDNO100和101)。图1中描绘了上述受体和MIC-B配体。除了dihuNKG2DECDmuIgG1Fc,它们包含N端avi标签,允许在共表达BirA生物素连接酶时进行位点特异性生物素化。除表达盒外,每个载体还包含EBVoriP序列以在表达EBV-EBNA的细胞系中进行自主复制。它们被瞬时转染到稳定表达EBV衍生蛋白EBNA的HEK293细胞中。同时共转染的编码生物素连接酶BirA的质粒允许在体内进行avi标签特异性生物素化。然后使用蛋白AMabSelectSure柱,然后凝胶过滤,纯化Fc标记的蛋白质,而通过Ni-NTA亲和色谱,然后凝胶过滤,纯化H6标记的NKG2D构建体。NKG2D/DAP10表达细胞系的产生将编码人NKG2D和DAP10的全长cDNA亚克隆到哺乳动物表达载体中。使用LipofectamineLTX试剂(Invitrogen,#15338100),按照生产商的方案,将质粒转染到CHO-K1M(Roche)和293T(ATCC,CRL-3216)细胞中。稳定转染的NKG2D/DAP10阳性CHO细胞维持在补充有10nML-谷氨酰胺(Gibco,#25030081)的CDM2Opt.1.1培养基(GIBCO,#08-0059)中。293T细胞维持在补充10%胎牛血清(Gibco,#16140063)和1%GlutaMAX补充剂(Gibco;#31331-028)的DMEM(Gibco,#11965092)中。转染后两天,添加嘌呤霉素(Invivogen;#ant-pr-1),对于CHO细胞,至6μg/mL,并且对于293T细胞,至1μg/mL。初始筛选后,通过BDFACSAriaIII细胞分选仪(BDBiosciences)对NKG2D细胞表面表达最高的细胞进行分选,并培养以建立稳定的细胞克隆。表达水平和稳定性通过使用抗NKG2D抗体KYK-2.0(Kwong等人,(2008)JMolBiol384,1143-1156)和PerCP缀合的Fcγ特异性山羊抗人IgG(JacksonImmunoResearch,#109-126-097)作为二抗进行FACS分析来确认,为期4周。实例2.通过噬菌体展示产生抗NKG2D抗体生成通用Fab文库在人种系基因的基础上生成了两个Fab形式的通用噬菌体展示抗体文库。使用跨越这些CDR的不同长度的随机引物将文库随机分配在轻链(L3)的CDR3和重链(H3)的CDR3中,并且通过“重叠延伸剪接”(SOE)PCR从3个片段组装而成。在装配足量的全长随机化Fab片段后,将它们与经类似处理的受体噬菌粒载体一起用NcoI/NheI消化。Fab文库插入片段与噬菌粒载体连接,并且纯化的连接物用于转化到大肠杆菌TG1中。使用辅助噬菌体VCSM13拯救展示Fab文库的噬菌粒颗粒,并且通过PEG/NaCl纯化进行纯化以供用于选择。通过噬菌体展示从通用Fab文库中选择抗NKG2D结合物NKG2D结合物选自针对dimuNKG2DECDFcavi(SEQIDNO:98)和dihuNKG2DECDFcavi(SEQIDNO:96)或dihuNKG2DECDFcavi(SEQIDNO:96)和hisavihuNKG2DECD(SEQIDNO:93)的文库,以交替方式进行4轮淘选。如下通过ELISA鉴定特异性结合物:将100μl的50nM生物素化的dihuNKG2DECDFcavi(SEQIDNO:96)或hisavihuNKG2DECD(SEQIDNO:93)包被在中性抗生物素蛋白板上。加入含Fab的细菌上清液,并通过使用抗Flag/HRP二抗经由Flag标签检测结合的Fab。在背景中表现出显著信号的克隆,如克隆5C5和克隆13C6,被列入测序和进一步分析的候选名单。Fab的纯化纯化来自细菌培养物的Fab以确定动力学参数。对于每个克隆,用具有对应噬菌粒的细菌接种500ml培养物,并用OD600为0.9的1mMIPTG诱导。之后,将培养物在25℃下温育过夜,并通过离心收获。在将重新悬浮的沉淀物在25mlPPB缓冲液(30mMTris-HClpH8、1mMEDTA、20%蔗糖)中温育20min后,将细菌再次离心并收获上清液。用25ml的5mMMgSO4溶液重复该温育步骤一次。将两个温育步骤的上清液合并,过滤并上样至IMAC柱(Hisgravitrap,GEHealthcare)。随后,用40ml洗涤缓冲液(500mMNaCl、20mM咪唑、20mMNaH2PO4pH7.4)洗涤该柱。在洗脱(500mMNaCl、500mM咪唑、20mMNaH2PO4pH7.4)后,将洗脱液使用PD10柱(GEHealthcare)重新缓冲。然后通过SPR分析(ProteOnXPR36,Biorad)研究纯化的Fab的动力学参数,对于克隆5C5(SEQIDNO:7(VH)和SEQIDNO:8(VL)),稀释系列的范围为100nM至6.25nM,并且对于克隆13C6(SEQIDNO:15(VH)和SEQIDNO:16(Vl)),稀释系列的范围为200nM至12.5nM。通过表面等离子体共振(SPR)的亲和力测定使用ProteOnXPR36仪器(Biorad)在25℃下,使用通过中性抗生物素蛋白捕获固定在NLC芯片上的生物素化monohuNKG2DECDFckhavi(SEQIDNO:94和SEQIDNO:95)和dihuNKG2DECDFcavi(SEQIDNO:96),通过表面等离子体共振测量选择的Fab克隆的亲和力(KD)。固定化重组抗原(配体):将抗原用PBST(10mM磷酸盐、150mM氯化钠pH7.4、0.005%Tween20)稀释至10μg/ml,然后以不同的接触时间以30μl/分钟的速度在竖直取向上注射,以实现固定。注入分析物:对于一次性动力学测量,注射方向更改为水平取向,将纯化的Fab的两倍稀释系列(浓度范围在200和6.25nM之间变化)沿单独的通道1-5以60μl/min同时注射,并且缔合时间分别为200s或300s,并且解离时间为360s。将缓冲液(PBST)沿第六个通道注射,以提供“在线”空白供参考。在ProteOnManagerv3.1软件中使用简单的一对一Langmuir结合模型,通过同时拟合缔合传感图和解离传感图来计算缔合速率常数(kon)和解离速率常数(koff)。将平衡解离常数(KD)计算为比率koff/kon。表1中总结了所有测量的动力学和热力学数据。在IgG水平上评估了克隆5C5和13C6与食蟹猴NKG2D的交叉反应性,即与dicyNKG2DECDFcavi的结合(参见实例9)。表1.如通过SPR确定的抗NKG2DFab对人NKG2D的亲和力。将可变抗体结构域克隆到IgG表达载体中(IgG转化)噬菌体展示衍生抗体5C5和13C6的Fab分别转化为IgG1/λ或κ抗体。为此,将重链和轻链V结构域的PCR扩增DNA片段按读框插入含有人IgG1恒定重链或人恒定λ或恒定κ轻链的相应的受体哺乳动物表达载体中。抗体表达由MPSV启动子驱动,并且转录由位于CDS下游的合成polyA信号序列终止。除表达盒外,每个载体还包含EBVoriP序列以在表达EBV-EBNA的细胞系中进行自主复制。实例3.通过免疫转基因兔产生抗NKG2D抗体动物护理、兔免疫和器官切除除了上述噬菌体展示产生的抗体外,其他抗体还源自在用NKG2D抗原免疫后,表达人源化抗体库的转基因兔(参见,例如WO2000/46251、WO2002/12437、WO2005/007696、WO2006/047367、WO2007/019223和WO2008/027986,其所有通过引用整体并入本文)。根据附录A“动物的住宿和照料指南”将动物圈养在AAALAC认可的动物设施中。所有动物免疫接种方案和实验均已获得上巴伐利亚行政区政府批准(许可号55.2-1-54-2532-90-14),并根据德国动物福利法和欧洲议会和理事会指令2010/63进行。用重组人NKG2DECD蛋白(hisavihuNKG2DECD(SEQIDNO:93))或与鼠IgG1Fc的C端融合的重组人NKG2DECD(dihuNKG2DECDmuIgG1Fc(SEQIDNO:99))将兔免疫,或使用编码全长人NKG2D和DAP10的质粒表达载体,与重组表达全长人NKG2D和DAP10的CHO细胞交替将兔遗传免疫。通过ELISA在来自免疫动物的血清中确定抗原特异性滴度(参见下文)。B细胞克隆分离兔外周血单核细胞(PBMC)用于B细胞克隆。巨噬细胞和单核细胞通过非特异性粘附到一层HEK293细胞而耗尽。上清液中的细胞(外周血淋巴细胞(PBL))用于抗原淘筛步骤。通过与抗原包被的板结合,富集抗原特异性B细胞(hisavihuNKG2DECD(SEQIDNO:93)或重组表达全长人NKG2D和DAP10的HEK293T细胞)。通过流式细胞术对富集的细胞进行单细胞分选。按照Seeber等人的描述培养兔B细胞(Seeber等人,(2014)PLoSOne4;9(2)),并且上清液用于通过ELISA进行的1级筛选(参见下文)。用于重组表达IgG抗体的V结构域的PCR扩增和亚克隆从B细胞裂解物中制备总RNA,并且用于通过逆转录酶反应生成cDNA。使用适当的引物,通过PCR将cDNA用于扩增免疫球蛋白重链和轻链可变区(VH和VL)。为了重组表达家兔单克隆二价抗体,通过突出端克隆法(Haun等人,(1992)Biotechniques13,515-518;Li等人,(2007)NatureMethods4,251-256)将编码VH或VL的PCR产物作为cDNA克隆到表达载体中。表达载体含有表达盒,所述表达盒由包括内含子A的5'CMV启动子和3'BGH聚腺苷酸化序列组成。除了表达盒之外,质粒还含有源于pUC18的复制起点和赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因,以用于在大肠杆菌(E.coli)中进行质粒扩增。使用了基本质粒的三种变体,一种质粒含有设计用以接受VH区的家兔IgG恒定区,并且两种另外的质粒含有用以接受VL区的兔或人κLC恒定区。使用重叠引物通过PCR扩增编码κ或γ恒定区和VL/VH插入序列的线性化表达质粒。将纯化的PCR产物与T4DNA聚合酶一起孵育,这生成单链突出端。通过添加dCTP停止反应。在下一步骤中,将质粒和插入序列合并并且与诱导位点特异性重组的recA一起温育。将重组质粒转化到大肠杆菌中。第二天,挑取生长菌落并且通过质粒制备、限制性酶切分析和DNA测序测试正确重组的质粒。对于通过ELISA进行的2级筛选(参见下文),将分离的重链(HC)和轻链(LC)质粒瞬时共转染到HEK293细胞中,并且1周后收获上清液,随后进行微纯化。实例4.通过ELISA筛选用于NKG2D结合的抗NKG2D抗体为了筛选源自转基因兔的免疫的克隆,使用B细胞培养的上清液(1级筛选,参见上文)或亚克隆和微纯化的IgG(2级筛选,参见上文)。人NKG2D的蛋白质结合ELISA将Nunc链霉亲和素包被的板(MicroCoat,#11974998001)用25μl/孔生物素化的hisavihuNKG2DECD(SEQIDNO:93)以0.5μg/ml的浓度包被,并且在室温(RT)下孵育1小时。用3x90μl/孔PBST缓冲液(10xPBS,Roche#11666789001 0.1%Tween20)洗涤后,以3μg/ml的浓度开始以1:3稀释,或可替代地以原始样品的1:30稀释添加25μl抗NKG2D抗体,并且在RT下孵育1h。洗涤(3x90μl/孔PBST缓冲液)后,添加25μl/孔抗huκ链HRP(辣根过氧化物酶)-缀合物(Millipore,#AP502P,1:2000),并且在RT下孵育1h。洗涤(3x90μl/孔PBST缓冲液)后,添加25μl/孔TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)底物(Roche,#11835033001)。在OD370/492nm下进行测量,结果总结在下表2中。所有抗体都以剂量依赖性方式与固定的hisavihuNKG2DECD特异性地结合。表2.通过ELISA确定抗NKG2D抗体与重组人NKG2D的结合。EC50和OD最大值(n.d.=未测定)食蟹猴NKG2D的蛋白质结合ELISA将Nunc链霉亲和素包被的板(MicroCoat,#11974998001)用25μl/孔生物素化的dicyNKG2DECDFcavi(SEQIDNO:97)以0.25μg/ml的浓度包被,并且在室温(RT)下孵育1小时。测定如上文对人NKG2D所述进行。结果汇总于表3中。所有抗体都与食蟹猴NKG2D交叉反应,并且这也已通过表面等离子共振得到确认(参见实例9)。表3.通过ELISA确定抗NKG2D抗体与重组食蟹猴NKG2D的结合。EC50和OD最大值(n.d.=未测定)抗体EC50[nM]OD最大值克隆0010.31.7克隆0130.41.5克隆014n.d.0.4克隆0180.41.3克隆2301.31.6克隆2960.70.9克隆3200.40.9克隆3950.61.4鼠NKG2D的蛋白质结合ELISA将Nunc链霉亲和素包被的板(MicroCoat,#11974998001)用25μl/孔生物素化的dimuNKG2DECDFcavi(SEQIDNO:98)以1μg/ml的浓度包被,并且在室温(RT)下孵育1小时。测定如上文对人NKG2D所述进行。结果汇总于表4中。这些抗体与鼠NKG2D没有交叉反应或只有非常弱的交叉反应。表4.通过ELISA确定抗NKG2D抗体与重组鼠NKG2D的结合。EC50和OD最大值(n.d.=未测定)抗体EC50[nM]OD最大值克隆001n.d.0.2克隆013n.d.0.4克隆014n.d.0.1克隆018n.d.0.1克隆230n.d.0.3克隆296n.d.0.3克隆320n.d.0.1克隆395n.d.0.3人NKG2D细胞表面结合ELISA将25μl/孔的重组表达全长人NKG2D和DAP10的HEK293T细胞(15000个细胞/孔)或未修饰的HEK293T接种到384孔聚D-赖氨酸板(Corning,#356662)中,并且在37℃下,在细胞培养基(Gibco,#42430-25 10%FCS(PAN,#P30-2006) 1μg/ml嘌呤霉素 1x青霉素/链霉素(Roche,#11074440001,500x))中,孵育过夜。第二天,在移除培养基之后,以3μg/ml的浓度开始以1:3稀释,或可替代地以原始样品的1:20稀释添加25μl抗NKG2D抗体,并且在4℃下孵育2h。洗涤(1×90μl,在PBST中)后,通过添加30μl/孔的戊二醛至0.05%的最终浓度(Sigma,目录号:G5882)将细胞在室温下固定10min。洗涤(2x90μl/孔PBST缓冲液)后,添加25μl/孔抗huκPOD(Millipore,#AP502P,1:2000),并且在RT下孵育1h。洗涤(3x90μl/孔,使用PBST缓冲液)后,添加25μl/孔的TMB底物(罗氏,#11835033001),并温育6-10min。在TecanSafire2仪器上,在OD370/492nm处进行测量。结果汇总于表5中。所有抗体均以剂量依赖性方式与重组表达全长人NKG2D和DAP10的HEK293T细胞特异性地结合,但弱结合物克隆013和014除外,在该测定中无法检测到其结合。这些抗体均未与未转染的HEK293T参考细胞结合。表5.通过细胞ELISA确定抗NKG2D抗体的细胞结合。EC50和OD最大值(n.d.=未测定)实例5.通过ELISA筛选MIC-B竞争的抗NKG2D抗体384孔Maxisorp板(Nunc,#464718)包被有25μl/孔2μg/ml的浓度的重组人MIC-B(ECDFLMIC-BFcavi,SEQIDNO100和101)),并且在室温(RT)下孵育1小时。用3x90μl/孔PBST缓冲液(10xPBS(Roche,#11666789001) 0.1%Tween20)洗涤后,将每个孔与90μl封闭缓冲液(10xPBS(Roche,#11666789001) 2%牛血清白蛋白级分V,无脂肪酸(Roche,#10735086001) 0.05%Tween20)在RT下保持1h。同时,将重组生物素化人NKG2D与抗NKG2D抗体(2μg/mlNKG2D,以3μg/ml的浓度开始以1:3稀释的抗体)在聚丙烯板(Weidman,#23490-101)上,在RT下孵育1h。洗涤(3x90μl/孔PBST缓冲液)后,将25μl/孔的NKG2D抗体混合物转移到测定板上,并且在RT下孵育1h。洗涤(3x90μl/孔PBST缓冲液)后,以1:2000稀释添加25μl/孔的聚-HRP40-链霉亲和素(Fitzgerald,#65R-S104PHRPx),并且在RT下孵育1h。在另外的洗涤步骤(3x90μl/孔PBST缓冲液)后,将25μlTMB底物(Roche,#11835033001)添加到每个孔中。测量在OD370/492nm处进行。结果在图2和表6中示出。克隆013和014的“负”抑制曲线可以通过由抗体交联的NKG2D与板上固定的MIC-B更强的再结合来解释(零值是重组生物素化人NKG2D与板固定的MIC-B在不含抗NKG2D抗体的情况下的结合)。因此,具有这种特征的抗体对NKG2D:MIC-B相互作用是非抑制性的。其他8种抗体以不同的效力抑制NKG2D与其配体MIC-B的结合。表6.抗NKG2D抗体对NKG2D:MIC-B的抑制作用的EC50(*在未达到完全的上或下平台时估计)。抗体EC50[ng/ml]*克隆13C6111克隆5C5717克隆001560克隆013无抑制克隆014无抑制克隆018332克隆2301065克隆29620克隆32067克隆3951636实例6.IgG的大规模表达、纯化和分析在F17培养基(Invitrogen)中培养的瞬时转染的HEK293细胞(人胚胎肾细胞系293衍生)中产生抗体分子。对于转染,使用“没有293的”转染试剂(Novagen)。如上所述的相应抗体重链和轻链分子是从单个表达质粒表达的。按照制造商的说明进行转染。转染后3-7天收获含有免疫球蛋白的细胞培养上清液,并且在-80℃下冷冻直至纯化。关于在例如HEK293细胞中的人免疫球蛋白的重组表达的一般信息给出于:Meissner等人,(2001)BiotechnolBioeng75,197-203(通过引用并入本文)。使用蛋白A-SepharoseTM亲和色谱(GEHealthcare)和Superdex200(GEHealthcare)尺寸排阻色谱,通过亲和色谱分两步从上清液中纯化重组抗体。简言之,将含有抗体的澄清培养上清液加载到用PBS缓冲液(10mMNa2HPO4、1mMKH2PO4、137mMNaCl和2.7mMKCl,pH7.4)平衡的MabSelectSuRe蛋白质A(5-50ml)柱上。用平衡缓冲液洗掉未结合的蛋白质。用pH2.8的100mM柠檬酸盐缓冲液洗脱抗体。用pH9.0的2MTris缓冲液的1/10洗脱物体积中和含蛋白级分。在随后的步骤中,根据以下三个选项之一合并和处理洗脱的蛋白质级分:a)用AmiconUltra离心过滤装置(MWCO:30K,Millipore)浓缩,并且加载到Superdex200HiLoad16/60凝胶过滤柱(GEHealthcare)上,所述柱用20mM组氨酸、140mMNaCl,pH6.0平衡,或b)加载到Superdex200HiLoad16/60凝胶过滤柱(GEHealthcare)上,所述柱用20mM组氨酸、140mMNaCl(pH6.0)平衡,或c)用10KSlide-A-Lyzer(ThermoFisherScientific)透析。合并单体抗体级分。通过使用根据Pace等人,(1995)ProteinScience4,2411-2423(通过引用并入本文)的基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数确定280nm处的光密度(OD),来确定纯化的抗体和衍生物的蛋白质浓度,其中320nm处的OD作为本底校正。将抗体样品速冻并储存在-80℃。在还原剂存在或不存在的情况下,通过CE-SDSLabChipGX(PerkinElmer)确认抗体的均质性。在还原条件下,在CE-SDS后鉴定IgG的轻链和重链多肽链,其表观分子大小类似于计算的分子量。使用BioSuiteHighResolutionSEC,5μm,在UltiMate3000HPLC系统(ThermoFisherScientific)上运行,通过分析SEC(尺寸排阻色谱)确认抗体的质量。通过施加200mMK2HPO4/KH2PO4,250mMKCl,pH6.2,从色谱材料中洗脱。分析SEC的主峰导致所有分析样品的>91%。实例7.通过FACS筛选NKG2D结合的抗NKG2D抗体(IgG)对于与NK-92细胞结合的EC50测定,用ZenonTM人IgG标记试剂盒(ThermoFisherScientific)预先标记抗体。用5倍过量的Zenon试剂A将IgG染色,并且用等量的Zenon试剂B封闭未结合的染色试剂。按1:3的步骤制备稀释系列后,将96孔板中的5.0x104个NK-92细胞每孔与50μL预先标记的抗体溶液一起在4℃下孵育1h。用FACS缓冲液(PBS中的2.5%FCS)洗涤细胞两次,并且重新悬浮在70μL缓冲液中。使用BDFACSCanto装置测量荧光,并且确定EC50(表7)。抗体表现出与NK92细胞的特异性和剂量依赖性结合,EC50值范围为0.988至0.031μg/mL。对于作为弱细胞结合物的克隆013、014和5C5,无法确定EC50值。表7.如通过FACS确定NKG2D抗体与NK92细胞结合的EC50(n.d.=未测定)。抗体EC50[μg/mL]克隆0180.758克隆13C60.058克隆5C5n.d.克隆2300.988克隆013n.d.克隆3200.734克隆0010.729克隆3950.203克隆2960.031克隆014n.d.实例8.通过抗NKG2D抗体(IgG)重新定向裂解靶细胞靶细胞的钙黄绿素标记通过在50mLFalcon管(300xg,5min)中离心收获P815细胞(表达鼠FcγR的肥大细胞系),然后在P815生长培养基中重新悬浮至1.0x106个细胞/mL。每5.0x106个细胞添加50μL钙黄绿素-AM,并且将标记反应在37℃下孵育30min。将细胞用AIM-V测定培养基洗涤3x,并且重新悬浮至6.0x105个细胞/mL抗体处理在测定培养基中将抗体调整为80μg/mL。随后,根据板方案,通过将40μL预稀释液与80μLAIM-V培养基混合,在V型底板中的AIM-V培养基中制备1:3稀释液。将P815细胞调整为6.0x105个细胞/mL,并且将50μL/孔细胞悬浮添加到抗体稀释液中,得到3.0x104个细胞/孔,并且在37℃下孵育30min,以允许抗体与细胞的Fc受体结合。然后,将板以400xg离心3min,并且弃去上清液。将NK-92细胞在测定培养基中重新悬浮至7.5x105个细胞/mL。将P815细胞重新悬浮在200μLNK-92细胞悬浮液中(=1.5x105个细胞/孔=E:T比1:5)。将板在37℃下孵育4h。钙黄绿素释放将板以420xg离心4min后,弃去上清液,并且用200μLPBS洗涤细胞一次(最终离心420xg,4min)。然后将细胞重新悬浮在200μL/孔的1%TritonX-100PBS中,并且将180μL的裂解的细胞转移到测定板中,96孔,黑色,底部透明,并且测量荧光(激发滤光片485nm,带通滤波器530nm)。“%细胞杀伤”被确定为测量值与最大释放的商,其中细胞重新悬浮在200μL的测定培养基中的1%TritonX-100中。结果在图3中示出。测试的抗体表现出不同程度的细胞杀伤。特别是对于克隆395和5C5,可以观察到活化的NK92细胞的剂量依赖性细胞杀伤。实例9.通过表面等离子体共振(SPR)确定抗NKG2D抗体(IgG)对人和食蟹猴NKG2D的动力学速率常数和亲和力使用BIACOREB4000仪器(GEHealthcare),在pH5.0下通过使用GEHealthcare提供的胺偶联试剂盒,将大约1500个共振单位(RU)的捕获抗体(10μg/ml人Fab捕获试剂盒,GEHealthcareLifeSciences,#28958325)偶联到CM5芯片(GEHealthcare,#BR-1005-30)上。样品和系统缓冲液是PBS-T(10mM磷酸盐缓冲盐水,其包括0.05%Tween20)pH7.4。流动池设置为25℃-并且样品块设置为12℃-并且用运行缓冲液灌注两次。通过以10μl/min的流速注射约10μg/ml溶液60sec来捕获抗体。按照1:3稀释,用600nM、300nM、150nM开始,通过在溶液中以30μl/min的流速注射不同浓度的dihuNKG2DECDFcavi(SEQIDNO:96)或dicyNKG2DECDFcavi(SEQIDNO:97)180s,来测量缔合。监测解离阶段长达450s,并通过从样品溶液切换到运行缓冲液来触发。通过用甘氨酸pH2.1溶液以30μl/min的流速洗涤2x90s和180s的另外稳定期来再生表面。通过减去从抗人Fab表面获得的应答来校正大折射率偏差。还减去空白注射(=双重参照)。对于KD、ka和kd的计算(参见表8),使用Biacore4000评估软件1.1(GEHealthcare)或TraceDrawer1.6.1(RidgeviewInstrumentsAB)中的Langmuir1:1模型。这些激动性抗NKG2D抗体的亲和力范围从亚纳摩尔(克隆395)到微摩尔(克隆014)亲和力。它们都与食蟹猴NKG2D发生交叉反应,而对于克隆296,与人NKG2D(3.8nM)与食蟹猴NKG2D(710nM)的结合之间存在187倍的差异。在所有抗体中,Clone395表现出对人和食蟹猴NKG2D的最高亲和力,在3位数皮摩尔范围内。表8.动力学速率常数和对人和食蟹猴NKG2D的亲和力。*已由TraceDrawer1.6.1(RidgeviewInstrumentsAB)计算实例10.通过SPR对人NKG2D上的抗NKG2D抗体(IgG)进行表位分仓(Epitopebinning)在固定配体之前,将SA芯片(GEHealthcare,#BR-1005-31)的传感器表面用50mMNaOH中的1MNaCl的三次1分钟注射进行调节。使用BIACORET200仪器(GEHealthcare),将大约200-300个共振单位(RU)的monohuNKG2DECDFckhavi(SEQIDNO94和95)偶联到传感器芯片表面上。配体注射后,使用1MNaCl和50mMNaOH中的50%异丙醇进行额外洗涤。样品和系统缓冲液是PBS-T(10mM磷酸盐缓冲盐水,其包括0.05%Tween20)pH7.4。流通池设置为25℃,并且样品块设置为12℃,并且用运行缓冲液灌注传感器芯片表面两次。第一抗体和第二抗体通过“双”注射,每次以200nM的浓度,以30μl/min的流速注射180s。固定抗原与第一抗体的饱和是必不可少的。监测解离阶段长达120s,并通过从样品溶液切换到运行缓冲液来触发。通过用甘氨酸pH2.1溶液以30μl/min的流速洗涤40s和180s的另外稳定期来再生表面。通过减去从空白表面获得的应答来校正大折射率偏差。还减去空白注射(=双重参照)。通过BiacoreT200评估软件3.0(GEHealthcare)分析结合反应。如果其表位与第一抗体的表位不同或不重叠,则第二抗体只能与被第一抗体饱和的抗原结合。示例性传感图在图4中示出。如果两种抗体的表位相同或重叠,则将会发生完全或部分阻断。阻断被计算为与第一抗体的结合水平(将第一抗体的结合水平的值设置为100%)相关的第二抗体的结合%(表9)。表9.针对彼此进行测试的不同组的抗体包括相应自阻断对照。数值代表与第一抗体的结合反应相关的第二抗体的结合百分比。粗体数字表示同时结合,下划线数字表示相互阻断。同时结合和阻断之间的截止值定义为30%。表9A表9B表9C通过这种基于SPR的竞争测定可以建立三个不同的表位仓(表10)。大多数抗体属于表位仓1,其中两种抗体代表表位仓2(克隆5C5和132),并且三种抗体代表表位仓3(克隆013、014和366)。表10.抗NKG2D抗体的表位仓。表位仓1表位仓2表位仓3克隆13C6克隆5C5克隆013克隆018克隆132克隆014克隆230克隆366克隆296克隆001克隆306克隆395克隆002克隆320选择抗NKG2D抗体克隆5C5、320、230、013、296和395用于进一步分析。实例11.抗NKG2D抗体(IgG)与免疫细胞上的人NKG2D的特异性结合使用NKG2D阳性免疫细胞,即NK细胞、γδT细胞和CD8T细胞,证实了所选抗体克隆与人NKG2D的结合。通过流式细胞术评估抗体与人NKG2D阳性NK细胞系NK92、与人CD8T细胞、扩增的人NK细胞和扩增的人γδT细胞的结合。实验中包括非结合对照(在Fc区具有L234AL235AP329G(“PGLALA”)突变的非靶向IgG(SEQIDNO81和82的VH和VL序列)。方法与人NK细胞系NK92的结合检查NK92细胞的活力,并且细胞重新悬浮并调整至密度为1mio细胞/ml。将100μl该细胞悬浮液(含0.1mio细胞)接种到96孔圆底板中。在400xg下将孔板离心4min,并且除去上清液。然后将40μl稀释的抗体或FACS缓冲液加入细胞中,并且在4℃下孵育30分钟。孵育后,用FACS缓冲液(每孔150μl)洗涤细胞两次。然后将20μl的稀释的APC抗人Fc特异性二抗(JacksonImmunoResearch,#109-116-170)添加到细胞中。将细胞在4℃下再孵育30分钟。为去除未结合的抗体,用FACS缓冲液(每孔150μl)将细胞再洗涤两次。为固定细胞,将100μlFACS缓冲液(含1%PFA)加入孔中。测量前,将细胞重悬于150μlFACS缓冲液中。使用BDCantoII流式细胞仪测量荧光。与CD8T细胞结合检查新鲜分离的PBMC的活力,并且将细胞在FACS缓冲液中调整至1mio细胞/ml的密度。将100μl的PBMC(含有0.1Mio细胞)接种到96孔圆底板中。在400xg下将孔板离心4min,并且除去上清液。然后每孔添加0.5μlFcBlock(BDBioscience),每孔总体积为20μl,并且将板在4℃下孵育30min。去除上清液,并且然后将40μl稀释的NKG2D抗体添加到细胞中,并且在4℃下再孵育30min。孵育后,用每孔150μl的FACS缓冲液洗涤细胞两次。然后将20μl的稀释的FITC抗人Fc特异性二抗(JacksonImmunoResearch,#109-096-098)连同CD8APC(克隆SK1,BioLegend)和CD3PE/Cy7(克隆UCHT1,BioLegend)添加到细胞中,从而检测NKG2D抗体,并且将CD8T细胞鉴定为PBMC内的CD8和CD3阳性细胞。将细胞在4℃下再孵育30分钟。为去除未结合的抗体,用FACS缓冲液(每孔150μl)将细胞再洗涤两次。为固定细胞,将100μlFACS缓冲液(含1%PFA)加入孔中。测量前,将细胞重悬于150μlFACS缓冲液中。使用BDCantoII流式细胞仪测量荧光。与扩增的NK细胞结合检查扩增的NK细胞的活力,并且将细胞在FACS缓冲液中调整至1mio细胞/ml的密度。将100μl的这些细胞悬浮液(含有0.1mio细胞)接种到96孔圆底板中。在400xg下将孔板离心4min,并且除去上清液。然后每孔添加0.5μlFcBlock(BDBioscience),每孔总体积为20μl,并且将板在4℃下孵育30min。去除上清液,并且然后将40μl稀释的NKG2D抗体添加到细胞中,并且在4℃下再孵育30min。孵育后,用每孔150μl的FACS缓冲液洗涤细胞两次。然后将20μl的稀释的FITC抗人Fc特异性二抗(JacksonImmunoResearch,#109-096-098)添加到细胞中。将细胞在4℃下再孵育30min。为去除未结合的抗体,用每孔150μl的FACS缓冲液将细胞再洗涤两次。为固定细胞,将100μlFACS缓冲液(含1%PFA)加入孔中。测量前,将细胞重悬于150μlFACS缓冲液中。使用BDCantoII流式细胞仪测量荧光。与扩增的γδT细胞结合检查扩增的γδT细胞的活力,并且将细胞在FACS缓冲液中调整至1mio细胞/ml的密度。将100μl的这些细胞悬浮液(含有0.1mio细胞)接种到96孔圆底板中。在400xg下将孔板离心4min,并且除去上清液。然后将40μl稀释的NKG2D抗体添加到细胞中,并且在4℃下再孵育30min。孵育后,用每孔150μl的FACS缓冲液洗涤细胞两次。然后将20μl的稀释的二级FITC抗人Fc特异性二抗(JacksonImmunoResearch,#109-096-098)添加到细胞中。将细胞在4℃下再孵育30分钟。为去除未结合的抗体,用FACS缓冲液(每孔150μl)将细胞再洗涤两次。为固定细胞,将100μlFACS缓冲液(含1%PFA)加入孔中。测量前,将细胞重悬于150μlFACS缓冲液中。使用BDCantoII流式细胞仪测量荧光。扩增的人NK细胞的产生使用NK细胞分离试剂盒(MiltenyiBiotec,#130-092-657),从PBMC中分离NK细胞。为此,非NK细胞被间接磁性标记,然后使用MACS分离器进行磁性分离。然后未标记的NK细胞通过MACS柱,而非NK细胞保留在柱中。细胞分离后,然后使用NK细胞活化/扩增试剂盒(MiltenyiBiotec,#130-094-483)培养NK细胞。当从NK扩增培养开始时,抗生物素珠粒装载有针对CD335和CD2的生物素化抗体。然后将这些颗粒以1:2的珠粒与细胞比一次性添加到细胞培养物中。将细胞以每ml1百万个细胞的细胞密度放入24孔细胞培养板中。将NK细胞孵育6天并且每天检查。必要时添加新鲜培养基。在第6天,重新悬浮细胞并且计数。然后将NK细胞保持在每ml100万-150万个细胞以供进一步培养。NK细胞的扩增培养基包含NKMACS培养基(NKMACS基础培养基(MiltenyiBiote,#130-107-879),含有2%NKMACS补充剂(#130-107-210)、5%人AB血清和500IU/mlIL2(Proleukin,Novartis)。扩增的人γδT细胞的产生用于产生扩增的人γδT细胞的方案改编自Rincon-Orozco等人,(2005)JImmunol175,2144-2151(通过引用并入本文)。简言之,将新鲜分离的PBMC以1mio细胞/ml重新悬浮在γδT细胞扩增培养基(RPMI1640、10%FBS、1%Glutamax、100mM丙酮酸钠、10mMMEMNEAA、100μMβ-巯基乙醇、1μg/mlIPP(Sigma-Aldrich)和100U/mlIL-2(Proleukin,Novartis))中,并且铺板于24孔细胞培养板中。在第3天和第7天更换一半的培养基。在分离后第10天,使用人TCRγδT细胞分离试剂盒(MiltenyiBiotec,#130-092-892)分离γδT细胞。将γδT细胞以1-2mio细胞/ml保存在24孔细胞培养板中,在γδT细胞扩增培养基中,以进一步扩增它们。结果所选抗体5C5、320、230、013、296和395以浓度依赖性方式与测试的免疫细胞结合(图5)。NKG2D的表达水平在每个免疫细胞亚组上是不同的,但EC50值(表11)表明的结合强度对于所有NKG2D阳性免疫细胞上的每个克隆都是可比的。有趣的是,NKG2D抗体根据其结合行为分为两组;A组具有更高的总体结合,而B组与NKG2D的结合更低(与A相比,约是一半)(图5)。在所有测试的NKG2D阳性免疫细胞(NK细胞、CD8T细胞和γδT细胞)上观察到这种模式,并且表明两组激动性NKG2D抗体之间的结合模式存在差异。表11.NKG2D抗体与NKG2D阳性免疫细胞的EC50值结合抗NKG2D抗体与被描述为表达NKG2D的免疫细胞特异性地结合。大多数抗体具有低EC50值(0.28–13.5nM),表明与NKG2D的高亲和力结合,这与作为NK细胞、γδT细胞和CD8T细胞的不同测试免疫细胞亚组相当。实例12.用交联的抗NKG2D抗体(IgG)活化NKG2D阳性免疫细胞接下来,确认了人NKG2DIgG1抗体的激动活性。抗NKG2D抗体对NK92细胞的活性我们通过将指定浓度的抗体包被到蛋白A珠粒上,测试了在交联时,人NK细胞系NK92上的NKG2D的活化。将呈递抗NKG2D抗体的蛋白A珠粒与NK92细胞共孵育24h。随后通过流式细胞术珠粒阵列(CBA)确定NK92细胞释放到上清液中的IFNγ,作为由NKG2D活化诱导的NK92细胞活化的标记。测试所有抗NKG2D抗体的激动活性,并随后选择最佳激动克隆用于进一步表征。在图6中,测试了一系列抗NKG2D抗体的IFNγ释放,并且将其活性与基准激动性抗NKG2D抗体KYK-2.0(其在诱导NK92细胞的IFNγ释放方面只有很小的活性)进行比较(Kwong等人.(2008)JMolBiol384,1143-1156)。选择最佳激动性抗NKG2D抗体以更详细地重新测试其功能活性。所选抗-NKG2D抗体在交联时以浓度依赖性方式诱导NK92细胞的IFNγ释放,但效力不同(图7A)。激动性抗NKG2D抗体活化NKG2D只能由交联抗体诱导;在这种情况下,溶液中的抗NKG2D抗体没有诱导IFNγ释放的激动潜力(图7B)。这表明我们的激动性抗NKG2D抗体在没有任何交联剂的情况下将不会诱导免疫细胞活化,因此预计这些抗体不会引起全身性活化。抗NKG2D抗体对原代人NK细胞的活性对人NK92细胞系显示激动活性的抗NKG2D抗体随后在扩增的原代人NK细胞上作为更具生理性的细胞群体进行测试。相同的设置用于评估抗体对这种细胞类型的功能活性。如在NK92细胞上所见,与由IFNγ和TNFα释放到上清液中表明的非结合同种型对照IgG1相比,所有测试的抗NKG2D抗体诱导的人NK细胞的活化(图8)。由于IgG1抗体与NK细胞上的Fc受体结合并且交联的能力,非结合同种型对照IgG1(参见上文)诱导了一些背景活性。这意味着在此设置中测量的激动性NKG2D抗体的效果是活化性Fc受体和NKG2D的组合,与单独活化Fc受体相比(与对照一起看到)效果更好。抗NKG2D抗体对人γδT细胞的活性在NK细胞上测试了激动性抗NKG2D抗体后,还测试了它们是否可以活化γδT细胞。γδT细胞是据报道在NKG2D触发时直接响应的第二个细胞群体。为了获得足够数量的γδT细胞,将新鲜分离的PBMC用IPP(焦磷酸异戊烯酯)和IL-2活化,以优先扩增γδT细胞。分离扩增的γδT细胞,随后与蛋白A珠粒结合的激动性NKG2DIgG1抗体共培养。同样,非结合同种型对照(参见上文)也包括在实验中。24h后,收集上清液,并且通过CBA确定到上清液中的TNFα释放。测试的NKG2D抗体诱导TNFαγδT细胞释放到上清液中,表明抗体对NKG2D的活化(图9),如对于其他测试的细胞亚组所见。方法重新悬浮蛋白ADynabeads(Invitrogen,#10001D),并且将10μl的珠溶液稀释在5mlPBS中。随后,将50μl的稀释的珠粒溶液转移到96孔圆底板的每个孔中,这对应于每孔约200’000个珠粒。计算是通过假设1μl的储备珠粒溶液含有约2百万个珠粒来完成的。将板以400xg离心3min,并且去除上清液。然后将在PBS中稀释的50μl的抗NKG2D抗体添加到珠粒中,并且在冰箱中孵育1h,以允许抗体与珠粒结合。孵育后,将板再次以400xg离心3min,并且每孔用150μlPBS洗涤两次,以去除未被蛋白A珠粒捕获的抗体。对可能是NK92、扩增的人NK细胞或扩增的人γδT细胞的效应细胞进行计数并检查其活力。将NK92和扩增的NK细胞重新悬浮在含有10%FCS、1%谷氨酰胺和10ng/mlProleukin的RPMI1640中,并且将γδT细胞重新悬浮在含有10%FBS、1%GlutaMax和100U/mlIL-2的RPMI1640中(Proleukin,Novartis)。将100μl的浓度为1mio细胞/ml的细胞悬浮液接种在含有蛋白A珠粒的96孔圆底板的每个孔中,并在37℃下孵育24h。孵育24h后,收获含有释放的细胞因子的上清液,并且储存在-20℃下或直接用于CBA(BDBioscience)分析。取决于效应细胞,分析不同的细胞因子。CBA分析是根据制造商的说明进行的,但仅使用25μl珠粒和样品体积而不是50μl珠和样品体积,并且所有其他试剂量也相应调整。使用BDFACSCantoII流式细胞仪进行分析。实例13.CD8T细胞克隆与交联抗NKG2D抗体的共刺激将NLV特异性CD8T细胞克隆和MART1特异性CD8T细胞克隆用于评估抗NKG2D抗体的共刺激潜力。使用的CD8T细胞克隆是NKG2D阳性的。为了解决抗NKG2D抗体的共刺激潜力(CD3抗体提供主要刺激(“信号1”),将96孔板包被有抗人抗体以固定抗NKG2D抗体,并且包被有抗小鼠抗体以捕获CD3抗体。随后,将CD8T细胞添加到平板中,并且孵育24h。刺激后,收获CD8T细胞克隆,并且通过测量CD25上调来分析活化。此外,在没有CD3抗体的情况下对NLV特异性CD8T细胞克隆进行了相同的实验,以评估抗NKG2D抗体在没有信号1的情况下直接活化CD8T细胞的潜力。同样,非结合同种型对照(参见上文)也包括在实验中。更详细地,为了测试CD8T细胞克隆与抗NKG2D抗体的共刺激,将96孔圆形底板包被有每孔50μlPBS中的2μg/ml抗人IgG(JacksonImmunoResearch,#109-006-098)和2μg/ml抗小鼠IgG(JacksonImmunoResearch,#115-005-071),在4℃下过夜。第二天,将板用200μl含有1%BSA的PBS洗涤三次。然后将200μl含有1%BSA的PBS添加到每个孔中,并且在37℃下孵育90min以用BSA封闭空的塑料表面。去除上清液后,每孔添加50μl中的0.25μg/mlCD3抗体(BioLegend,#317304)和相应的抗NKG2D人IgG1抗体或对照。将板在37℃下孵育90min。之后,用200μl每孔含有1%BSA的PBS将板洗涤三次,并且储存在冰箱中,直到晚上添加CD8T细胞克隆的100’000个细胞。细胞在37℃下孵育过夜。第二天收获CD8T细胞克隆,用FACS缓冲液洗涤两次,并且用CD8FITC(克隆SK-1,BioLegend)、CD25PE(克隆M-A251,BioLegend)和CD69BV421或CD69APC(克隆FN50,BioLegend)在4℃下染色30min。为去除未结合的抗体,用每孔150μl的FACS缓冲液将细胞再洗涤两次。为固定细胞,将100μlFACS缓冲液(含1%PFA)加入孔中。测量前,将细胞重新悬浮在150μlFACS缓冲液中。使用BDCantoII或Fortessa流式细胞仪测量荧光。结果在图10中示出。我们可以确认我们的激动性NKG2D抗体对CD8T细胞具有唯一的共刺激潜力,并且依赖于“信号1”,这里由诱导CD8T细胞活化的CD3抗体传递。实例14.激动性抗NKG2D抗体395的人源化激动性抗NKG2D抗体395是通过将转基因兔免疫获得的。虽然VL结构域已经是人的,但VH结构域是兔序列,并且必须进行人源化。更准确地说,VL结构域是人种系IGKV1D-39#01,其中3个氨基酸在CDRL1中成熟(S28D、S31G和Y32A),并且3个氨基酸在CDRL3中成熟(S91A、Y92N和T94F)。CDRL2中没有进行任何更改。此外,在FR2L和FR3L中观察到两个体细胞突变:分别为K45N和F71Y。此人可变结构域没有被修饰。抗体395的可变重链是从种系RABBIT_IGHV1S7#01成熟的兔VH,其中在框架区和CDR中有若干个体细胞突变:FRH1中8个,HCDR1中4个,FRH2中没有,HCDR2中4个,并且FRH3中6个。此外,克隆395的免疫球蛋白VH结构域在Kabat位置21、50和79处包含3个另外的半胱氨酸。根据其种系,位置21和79形成二硫键。位置50的半胱氨酸没有配偶体,因为种系的配偶体C35已成熟为苏氨酸。人源化消除了另外的二硫键,因为没有人种系具有这样的特征。出于可开发性的原因,C50被突变为它的关系紧密的类似物丝氨酸,以避免对克隆395与其靶标NKG2D的结合产生太大影响。选择作为受体框架的人种系在Kabat位置50没有丝氨酸。hVH5_51、hVH3_23和hVH4_59被选择为受体框架。它们代表了经常使用的人种系,与抗体395的VH结构域具有高度的序列相似性,并且没有或只有很小的预测Abangle偏差(表示与原始兔可变重链结构相比,相应的人源化可变重链结构域的取向变化,两者都与未修饰的人轻链可变结构配对)。此外,抗体395的VH结构域的CDR被移植到曲妥珠单抗的VH框架上,所述框架基于VH3_23并且被很好地表征为稳定的抗体。图11中显示的人源化序列被选择进行表达并且测试它们的结合和功能。序列也在SEQIDNO107、108、109、110、111、112和113中给出(分别为序列P1AE4973、P1AE4975、P1AE4977、P1AE4978、P1AE4979、P1AE4980和P1AE4981)。序列P1AE4972(SEQIDNO:106)对应于具有C50S突变的抗体395(SEQIDNO:79)的亲本VH序列。在HCDR2的末端处考虑了一些正向突变,因为这些残基应该远离抗原NKG2D的结合位点。另一方面,为了更接近克隆395的原始氨基酸,还考虑了一些回复突变。一个突出的实例是hVH3_23上的S49G回复突变。在一些变体中,N端QE基序也被认为是因为这些氨基酸位于HCDR3的背面。“CDR4”环的特征在于序列IDQS已在一些变体中重新引入,因为此环有时作为可变重结构域的第四个CDR与抗原接触。抗体395的人源化VH结构域变体及其原始人VL结构域已用于产生双特异性NKG2DxCEA抗体,然后测试其结合和功能性(参见实例17和18)。实例15.双特异性NKG2D抗体的生成生成并且测试了若干种形式的双特异性NKG2D抗体,使用CEA作为示例性第二特异性。双特异性抗体形式被称为D、J、K、I、L和M,并且在图12中示意性描绘。D形式是NKG2D和CEA的二价形式,J形式是NKG2D的四价形式和CEA的一价形式,K、I和L形式是NKG2D的二价形式和CEA的一价形式,而M形式是NKG2D和CEA的一价形式。在不同重链的情况下,通过应用杵臼结构技术实现异二聚化。为了避免轻链错配,应用了CrossMab(Fab结构域交叉)技术,除了对于I形式,这不是必需的。在双特异性抗体的交联(在这些实例中为NKG2D结合)Fab部分中,VH和VL结构域彼此替换,而特定电荷突变(在这些实例中分别为147E/213E(KabatEU索引)和123R/124K(Kabat))被引入非交联(在这些实例中为CEA结合)Fab的恒定域CH1和CL。选择显示作为IgG的良好激动活性的激动性抗NKG2D抗体5C5、013、230、320和395用于不同双特异性抗体形式的功能评估。在包含兔VH结构域的抗体395中,CDRH2中未配对的半胱氨酸C50被丝氨酸替换,而不影响结合或功能。抗体B9(CDR和VH以及VL序列SEQIDNO114-119、120和121;也参见WO2007/071422(SEQIDNO27-29、32-34、22和26);该PCT公开的全部内容以引用方式并入本文)和huA5B7(CDR和VH和VL序列SEQIDNO122-127、128和129;也参见EP申请号19182505.8和要求其优先权的PCT申请,将其全部内容以引用方式并入本文)用作第二特异性的示例性抗CEA抗体。表13.双特异性NKG2DxCEA抗体形式概述。克隆D形式J形式K形式I形式L形式M形式5C5B9B9B9B9--013B9-B9B9--230--B9--320B9B9B9B9B9-395---B9-B9双特异性抗体的生产双特异性抗体是通过瞬时转染HEK293EBNA细胞产生的。对细胞进行离心,然后用经过预热的CDCHO培养基(ThermoFisher,#10743029)代替原培养基。将表达载体在CDCHO培养基中混合,添加聚乙烯亚胺(PEI;Polysciences,#23966-1),将溶液涡旋混合,并且在室温下孵育10分钟。然后,将细胞(2mio/ml)与载体/PEI溶液混合,将其转移至烧瓶中,并且置于振荡培养箱中,在5%CO2的气氛下于37℃下孵育3小时。孵育后,加入含有补充剂(占总体积的80%)的Excell培养基(MammalianCellCulturesforBiologicsManufacturing,Eds.W.Zhou和A.Kantardjieff,SpringerVerlag2014)。转染后1天,加入补充剂(饲料,占总体积的12%)。7天后,通过离心和随后的过滤(0.2μm过滤器)收获细胞上清液,并且使用如下所示的标准方法从收获的上清液中纯化蛋白质。双特异性抗体的纯化和分析参照标准方案从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白质。简言之,利用ProteinA亲和色谱法(平衡缓冲液:20mM柠檬酸钠,20mM磷酸钠,pH7.5;洗脱缓冲液:20mM柠檬酸钠,pH3.0)从细胞培养上清液中纯化含Fc的蛋白质。在pH3.0下实现洗脱,随后立即中和样品的pH。通过离心(MilliporeULTRA-15,#UFC903096)浓缩蛋白质,并且通过尺寸排阻色谱法在20mM组氨酸、140mM氯化钠(pH6.0)中将聚集蛋白质与单体蛋白质分离。通过测量280nm处的吸光度来测定纯化的蛋白质的浓度,其中根据Pace等人(ProteinScience,4,2411-2423(1995))所述的方法,使用基于氨基酸序列计算得出的质量消光系数。在存在和不存在还原剂的情况下,使用LabChipGXII(PerkinElmer),通过CE-SDS分析蛋白质的纯度和分子量。利用HPLC色谱法在25℃下测定聚集体含量,该系统使用分析型尺寸排阻色谱柱(TSKgelG3000SWXL或UP-SW3000),并且在运行缓冲液(分别为25mMK2HPO4、125mMNaCl、200mML-精氨酸盐酸盐(pH6.7)或200mMKH2PO4、250mMKCl(pH6.2))中平衡。实例16.不同双特异性抗体形式与不同激动性抗NKG2D抗体的比较具有良好激动活性的所选抗NKG2D抗体(5C5、013、230和320)被转化为I形式的双特异性抗体,使用抗CEA抗体B9作为示例性第二特异性。双特异性抗体应通过肿瘤细胞上的经由CEA的交联来诱导免疫细胞上NKG2D的活化。在JurkatNFATNKG2D报告细胞测定中,结合次优固定浓度的CEAxCD3双特异性抗体(CEA-T细胞双特异性抗体(TCB),SEQIDNO130-137(CD3CDR和VH/VL),138-145(CEACDR和VH/VL)和154-157;用来提供“信号1”),测试双特异性抗体的功能活性。在此测定中,在存在通过CEA-TCB经由CD3活化传递的信号1的情况下,NKG2D的参与导致NFAT的活化增加。这种活化导致添加荧光素酶底物后发光增加。如图13所示,所有四种测试的CEA-NKG2D构建体都能够以浓度依赖性方式在固定浓度的CEA-TCB顶部上诱导活化。含有抗NKG2D克隆320和230的构建体具有最高活性,其次是含有抗NKG2D克隆013和5C5的构建体。这些结果证明,在本实例中通过CEA-TCB,借助CD3参与传递的“信号1”存在的情况下,我们选择的激动性抗NKG2D抗体能够在肿瘤细胞上经由CEA的交联后增加T细胞活化。选择抗NKG2D抗体320以进一步评估不同的双特异性抗体形式。它是测试的I形式中最有效的一种,并且因此被认为是进一步评估不同双特异性形式的良好候选者。为NKG2D和CEA设计了四种具有不同价态的另外的双特异性形式,以便能够识别一种对于激动NKG2D而言具有理想的特性的形式。产生双特异性形式D、J、K和L,再次使用抗CEA抗体B9作为示例性第二特异性,并且在JurkatNFATNKG2D报告细胞测定中,联合CEA-TCB测试它们的功能活性。将新形式的活性与先前测试的I形式进行比较,随后选择具有最高诱导NKG2D活化效力的形式。形式D和L具有最高效力,类似于先前测试的I形式的活性。与其他测试形式相比,形式K和J的活性要弱得多,因此不考虑对其进一步表征(图14)。通过流式细胞术测量,进一步测试了双特异性抗体形式D、J、K、L和I中的抗体320与表达NKG2D的NK92细胞和表达CEA的LS180细胞的结合。在NK92细胞上,四价构建体J具有最低的EC50值,其次是320IgG和I形式,它们的结合相似,并且形式K、L和D具有最弱的结合(图15A)。在表达CEA的LS180细胞上,与形式L相比,形式D、J、K和I与CEA的结合降低。形式L具有与相应的B9IgG相当的EC50,但具有更高的整体结合(图15B)。在下一步中,针对两种另外的强效激动性抗NKG2D抗体5C5和013测试了所选形式。抗NKG2D抗体5C5被转化为形式D、J和K,抗体013被转化为形式D和K。在JurkatNFATNKG2D报告细胞测定中,联合CEA-TCB,测试功能活性,并且与各自的I形式的活性进行比较。正如抗体320以及抗体5C5(图16A)和抗体013(图16B)所见,先前测试的形式I是最有效的形式之一,而二价形式K具有最低的活性。另一个有效的激动性抗NKG2D抗体,抗体395,然后将其转化为双特异性I形式,这是迄今为止最有效的双特异性形式。此外,使用抗体395生成了IgG样1 1形式(M形式)。在JurkatNFATNKG2D报告细胞测定中,联合CEA-TCB,测试了这些构建体的功能活性,并且与具有抗体320的I形式(其是迄今为止测试过的最有效的形式之一)的功能活性进行了比较。如图17中所见,具有抗NKG2D抗体395的两种双特异性形式比具有抗体320的双特异性形式显著更有效。将两种形式与抗体395进行比较,M形式比I形式具有更高的总体活性,因此被选择用于进一步表征(图17)。通过流式血细胞计数,评估抗NKG2D抗体395的两种双特异性形式I和M与NK92上的NKG2D(图18A)和L180细胞上的CEA(图18B)的结合。二价I形式与NKG2D的结合与相应的395IgG相当。由于单价结合,单价形式M具有更高的整体结合(即更多的结合的分子),但EC50值仍然与用相应的395IgG观察到的值相似。在CEA阳性LS180细胞上,与相应的B9IgG相比,M形式具有更高的整体结合和也更高的EC50值。I形式与CEA仅具有弱结合,表明CEA结合物B9的C端融合对与CEA的结合具有负面影响。为了进一步表征具有抗体395的双特异性M形式和具有抗体320的I形式,在JurkatNFATNKG2D报告细胞测定中,在CEA高MKN-45细胞、CEA中度LS-180细胞和CEA低HT-29细胞上,测试了这两种构建体。具有抗体320的I形式对CEA高MKN-45细胞和CEA中度LS-180具有良好的活性,但对CEA低HT-29细胞的活性非常弱(图19A),而具有抗体395的M形式对所有三种测试的CEA细胞系都具有良好的活性(图19B),并且在CEA低细胞系上活性仅略微降低。随后选择形式M用于进一步表征,因为与所有其他测试的双特异性构建体相比,M形式的激动性抗NKG2D抗体395具有最高效力。作为下一步,使用来自健康供体的新鲜分离的PBMC,通过流式细胞术测试双特异性形式M与在CD8T细胞和NK细胞上表达的NKG2D的结合。作为阴性对照,测试了与NKG2D阴性CD4T细胞的结合,并且在实验中包括了非结合对照(在Fc区中的具有L234AL235AP329G(“PGLALA”)突变的非靶向IgG(SEQIDNO81和82的VH和VL序列)-也参见上文)。正如预期的那样,双特异性构建体显示出与CD8T细胞(图20A)和NK细胞(图20B)的强结合,但不与CD4T细胞(图20C)结合,而非结合对照显示与任何测试细胞类型均无结合。然后在表达CEA的肿瘤细胞与新鲜分离的PBMC的共培养测定中,测试所选双特异性抗体(M形式的抗体395)的功能活性,从而与TCB联合,评估NKG2D接合时CD8T细胞的活化。测量早期活化标记CD69和晚期活化标记CD25的上调作为CD8T细胞活化的标记。与单独用CEA-TCB(2)处理相比,NKG2DxCEA双特异性抗体与CD3xCEA双特异性抗体(CEA-TCB(2)、SEQIDNO130-137(CD3CDR和VH/VL)、146-153(CEACDR和VH/VL)、和158-161))组合的处理,在结直肠腺癌细胞系LS-180存在下,诱导CD8T细胞上CD25和CD69的上调增加(图21A和B)。在MKN-45细胞存在的情况下,NKG2DxCEA双特异性抗体还促进了由CEA-TCB介导的CD8T细胞的活化,这可以通过与单独的CEA-TCB相比,NKG2DxCEA双特异性抗体与CEA-TCB的组合增加CD8T细胞上的CD25和CD69上调来看出(图21C和D)。方法JurkatNFATNKG2D报告细胞测定通过稳定转染JurkatNFATFluc细胞(Promega),产生表达NKG2D的JurkatNFAT细胞(JurkatNFATNKG2D)。细胞在含有2%FBS、1%GlutaMax(Gibco)和200μg/ml潮霉素的高级RPMI1640(Gibco)培养基中培养。将JurkatNFATNKG2D报告细胞与肿瘤细胞系MKN45(DSMZACC409)、LS180(ATCCCL-187)、HT-29(ATCCHTB-38)或HeLa(ATCCCRM-CCL-2)共培养。所述测定在测定培养基(含有2%FCS和1%GlutaMax(Gibco)的高级RPMI1640(Gibco))中进行。使用胰蛋白酶分离肿瘤细胞。对细胞进行计数并且检查活力。将靶细胞重新悬浮在测定培养基中,并且在白色平底96孔板中,每孔接种60000个细胞。然后添加指定浓度的T细胞双特异性抗体(TCB)、NKG2D双特异性抗体。对JurkatNFATNKG2D报告细胞进行计数,检查活力,并且每孔接种0.1mio细胞,对应于1.6:1的效应物与靶标(E:T)比。此外,将2%终体积的GloSensorcAMP试剂(E1291,Promega)添加到每个孔中。在指定的孵育时间后,使用TecanSpark10M装置测量发光。与NK92和肿瘤细胞系结合检查NK92细胞或肿瘤细胞(MKN-45,LS180)的活力,并且将细胞重新悬浮并且调整至密度为1Mio细胞/ml。将每孔100μl的所述细胞悬浮液(含有0.1Mio细胞)接种到96孔圆底板中。在400xg下将孔板离心4min,并且除去上清液。然后将40μl稀释的抗体或FACS缓冲液加入细胞中,并且在4℃下孵育30分钟。孵育后,用FACS缓冲液(每孔150μl)洗涤细胞两次。然后将20μl的稀释的APC抗人Fc特异性二抗(JacksonImmunoResearch,#109-116-170)添加到细胞中。将细胞在4℃下再孵育30分钟。为去除未结合的抗体,用FACS缓冲液(每孔150μl)将细胞再洗涤两次。为固定细胞,将100μlFACS缓冲液(含1%PFA)加入孔中。测量前,将细胞重新悬浮在150μlFACS缓冲液中。使用BD流式细胞仪测量荧光。与PBMC结合检查新鲜分离的外周血单核细胞(PBMC)的活力,并且将细胞在FACS缓冲液中调整至1mio细胞/ml的密度。将每孔100μl的PBMC(含有0.1Mio细胞)接种到96孔圆底板中。在400xg下将孔板离心4min,并且除去上清液。然后每孔添加0.5μlFcBlock(BDBioscience),每孔总体积为20μl,并且将板在4℃下孵育30min。去除上清液,并且然后将40μl稀释的抗NKG2D抗体添加到细胞中,并且在4℃下再孵育30min。孵育后,用每孔150μl的FACS缓冲液洗涤细胞两次。然后将20μl的稀释的PE抗人Fc特异性二抗(JacksonImmunoResearch,#109-116-170)连同CD3FITC(克隆UCHT1,BioLegend)、CD8APC/Cy7(克隆SK1、BioLegend)、CD4APC(将克隆RPA-T4,BioLegend)和CD56BV421(cloneHCD56,BioLegend)添加到细胞中,以检测抗NKG2D抗体,并且在PBMC内,将CD8T细胞鉴定为CD8和CD3双阳性细胞,CD4T细胞鉴定为CD4和CD3双阳性细胞,并且NK细胞鉴定为CD3阴性和CD56阳性细胞。将细胞在4℃下再孵育30分钟。为去除未结合的抗体,用FACS缓冲液(每孔150μl)将细胞再洗涤两次。为固定细胞,将100μlFACS缓冲液(含1%PFA)加入孔中。测量前,将细胞重悬于150μlFACS缓冲液中。使用BD流式细胞仪测量荧光。联合T细胞双特异性抗体(TCB),活化CD8T细胞从健康供体的血液中分离PBMC,并且在测定开始前检查其活力。使用胰蛋白酶(Gibco)分离靶细胞(MKN-45或LS180),并且检查其活力。将靶细胞以0.6mio细胞/ml的密度重新悬浮在测定培养基(含有2%FBS和1%GlutaMax(Gibco)的高级RPMI1640(Gibco))中。将细胞以30000个细胞/孔接种到96孔板中。在测定培养基中稀释抗体,并且将指定浓度的稀释的抗NKG2D抗体或TCB添加到靶细胞中。然后添加细胞密度为6mio细胞/ml(E:T10:1)的分离的PBMC,得到300000个细胞/孔,并且最终体积为200μl/孔。将所述测定在培养箱中在37℃孵育48h。然后收获PBMC并且通过流式细胞术进行分析。将细胞以400xg离心4min,并且用PBS洗涤一次。将AquaLive染色剂(L34957,ThermoFisherScientific)添加到50μlPBS中(在PBS中以1:1000稀释),并且在室温下孵育20min。然后添加100μlFACS缓冲液,并且将板以400xg离心4min。去除上清液,并且用150μlFACS缓冲液再次洗涤细胞。然后将每孔30μl含有CD3FITC(克隆UCHT1,BioLegend)、CD8APC/Cy7(克隆SK1、BioLegend)、CD56BV421(克隆HCD56、BioLegend)、CD25PE(克隆M-A251、BioLegend)、CD69APC(克隆FN50,BioLegend)和CD44AF700(克隆IM7,BioLegend)的抗体混合物添加到细胞中。将细胞在冰箱中孵育30min。然后将细胞用FACS缓冲液洗涤两次,并每孔重悬于含有1%PFA的100μlFACS缓冲液中。测量前,将细胞重新悬浮在150μlFACS缓冲液中。使用BDLSRFortessa装置进行分析。实例17.使用表面等离子体共振(BIACORE)确定M形式的双特异性NKG2DxCEA抗体与人NKG2D和人CEA的亲和力,所述双特异性抗体包含抗体395的人源化变体使用BIACORET200仪器,通过表面等离子共振评估M形式的双特异性NKG2DxCEA抗体的亲和力,所述双特异性抗体包含抗体395的人源化变体。在CM5芯片上,通过标准胺偶联,在流通池2和3上以大约12’000RU固定了抗五-His捕获抗体(QiagenPenta·His抗体,不含BSA;#34660)。作为相应的配体,hisavihuNKG2DECD(SEQIDNO:93)被捕获在流通池2上,并且含有人CEAA2结构域的huN(A2B2)A-avi-His(SEQIDNO:208)被捕获在大约20RU的流通池3上。随后将M形式的双特异性NKG2DxCEA抗体作为分析物以范围从800至0.366nM的3倍稀释液注射,接触时间为120s,解离时间为250或1000s,并且流速为30μl/min,所述双特异性抗体包含抗体395的人源化变体。在抗H6标签捕获抗体水平下的再生通过10mM甘氨酸/HClpH2.0的2次脉冲60s实现。数据针对未固定化的流通池1和零浓度分析物进行双重参考。将分析物的传感图拟合到简单的1:1Langmuir相互作用模型。两种靶标的亲和力常数[KD]汇总于下表14中。表14.M形式的双特异性NKG2DxCEA抗体与人NKG2D和人CEA(A2结构域)结合的亲和力常数。这些双特异性抗体包含激动性抗NKG2D抗体395的不同人源化VH结构域变体。双特异性NKG2DxCEA抗体(所述双特异性抗体包含激动性抗NKG2D抗体395的人源化VH结构域变体)的亲和力略低于具有非人源化亲本兔VH结构域的构建体(P1AE4972)。然而,P1AE4980与人NKG2D的亲和力与P1AE4972非常相似(13nM与11nM)。这些双特异性抗体与人CEA(A2结构域)的亲和力没有显著差异,因为它们都包含相同的CEA结合物(huA5B7)。选择人源化变体P1AE4980(M形式,联合CEA结合物huA5B7)进行进一步详细的功能表征。此外,如通过动态光散射(DLS)测定,这种双特异性分子具有热稳定性(Tagg63℃),并且适合细胞系开发。为了进一步增加此优选分子P1AE4980(M形式,联合CEA结合物huA5B7)的效力,CEA结合物huA5B7被亲和力成熟的结合物替换(参见实例19)。实例18.双特异性M形式的抗NKG2D抗体395的人源化变体的功能表征使用CEA结合物huA5B7作为第二特异性,将亲本(具有C50S突变)和激动性抗NKG2D抗体395的七个人源化变体转化为M形式的NKG2DxCEA双特异性抗体。将双特异性形式的人源化变体与NK92上的NKG2D的结合与亲本抗体395(P1AE4972,包括C50S突变)的结合进行比较。变体P1AE4980显示出与亲本抗体相当的与NKG2D的结合,变体P1AE4973、P1AE4975、P1AE4977和P1AE4979的结合略有降低,变体P1AE4978的结合减弱更强,并且变体P1AE4981与NKG2D的结合仅微弱((图22,表15)。表15.双特异性M形式的抗NKG2D抗体395的人源化变体与NK92细胞结合的EC50值。此外,在JurkatNFATNKG2D报告细胞测定中,联合CEA-TCB,在CEA高表达肿瘤细胞系MKN-45上(图23A和B),和在CEA低表达肿瘤细胞系HT-29上(图23C和D),测试了七种人源化变体的功能活性,并且与亲本抗体395(具有C50S突变)的功能活性进行了比较。在两个测试的肿瘤细胞系中,双特异性形式的所有395种人源化变体都具有良好的活性。变体P1AE4980的活性总是非常接近于与结合数据一致的亲本抗体之一。然后选择人源化变体P1AE4980进行进一步表征,因为它显示出与NKG2D的良好结合,并且在人源化变体中具有最高功能活性,并且在活性上与亲本抗体395相当。在下一步中,我们测试了经由NKG2D接合增强CEA-TCB活性是否依赖于NKG2D经由在肿瘤细胞上表达的CEA的交联。在JurkatNFATNKG2D报告细胞测定中,在CEA阴性、FolR1阳性HeLa细胞上,测试了FolR1xCD3双特异性抗体(FolR1-TCB)与CEA-TCB的组合。在此设置中,信号1可以经由FolR1-TCB传递,但由于HeLa细胞上缺少CEA表达,NKG2DxCEA双特异性抗体无法交联。FolR1-TCB能够活化JurkatNFATNKG2D报告细胞测定,但不能通过添加NKG2DxCEA双特异性抗体来增强活化(图24A)。作为阳性对照,在表达CEA的HT-29和MKN-45细胞上,测试了NKG2DxCEA双特异性抗体和CEA-TCB的组合。在此,通过与单独的CEA-TCB相比发光的强烈增加来测量,NKG2DxCEA双特异性抗体可以交联并且增加JurkatNFATNKG2D细胞的活化(图24B和C)。然后在脱落的CEA(sCEA)存在下,测试NKG2DxCEA双特异性抗体的功能活性。在存在增加浓度的sCEA的情况下,在JurkatNFATNKG2D报告细胞测定中,测试了MKN-45上,NKG2DxCEA双特异性抗体与CEA-TCB的组合。仅在高浓度(>5μg/ml)下,sCEA对NKG2DxCEA双特异性抗体的活性有负面影响(图25)。在下一步中,还测试了可溶性NKG2D配体的存在是否会干扰与CEA-TCB组合的NKG2DxCEA双特异性抗体的活性。将可溶性MICA(sMICA;R&DSystems,#1300-MA-050)和可溶性ULBP2(sULBP2;R&DSystems,#1298-UL-050)添加到NKG2DxCEA双特异性抗体与CEA-TCB的组合中,并且测试了JurkatNFATNKG2D细胞的活化,并且将其与不存在可溶性NKG2D配体时的活化情况进行比较。在JurkatNFATNKG2D报告细胞测定中,添加nM的可溶性MICA或可溶性ULBP2不改变与CEA-TCB组合的NKG2DxCEA双特异性抗体的活性(图26)。这些结果表明NKG2DxCEA双特异性抗体的活性不受可溶性NKG2D配体的存在的影响/抑制。实例19.使用抗体huA5B7的亲和力成熟变体,生成NKG2DxCEA双特异性抗体CEA结合物huA5B7是抗体A5B7的人源化形式。抗体A5B7由例如M.J.Banfield等人(Proteins1997,29(2),161-171)公开,并且其结构可参见蛋白质结构数据库(PDB)中的PDBID:1CLO(www.rcsb.org,H.M.Berman等人,TheProteinDataBank,NucleicAcidsResearch,2000,28,235-242)。A5B7的CDR和可变区序列在SEQIDNO122(HCDR1)、162(HCDR2)、124(HCDR3)、125(LCDR1)、126(LCDR2)、127(LCDR3)、163(VH)和164(VL)中给出。huA5B7的产生在欧洲专利申请号19182505.8和要求其优先权的PCT申请中有所描述。huA5B7的CDR和可变区序列在SEQIDNO122(HCDR1)、123(HCDR2)、124(HCDR3)、125(LCDR1)、126(LCDR2)、127(LCDR3)、128(VH)和129(VL)中给出。为了进一步增加优选分子P1AE4980的效力(参见上文实例17),CEA结合物huA5B7被其亲和力成熟的变体替换。huA5B7的亲和力成熟在欧洲专利申请号19182505.8和要求其优先权的PCT申请中有所描述。huA5B7的所选亲和力成熟变体的CDR和可变区序列在序列表中给出,并且相应的SEQIDNO总结在表16中。表16.抗体huA5B7的亲和力成熟变体的CDR和可变区序列(SEQIDNO)。基于杵臼结构技术和CrossMab技术(分别用于正确的重/重和重/轻链配对),与PGLALAFc结构域突变组合,将所有亲和力成熟变体的可变结构域都合成并且克隆到编码IgG样NKG2DxCEA双特异性抗体的质粒中。本实例中制备的双特异性分子的示意图示出于图27中。将包含huA5B7的VH和VL序列及其亲和力成熟变体(参见表16)的重链和轻链与对NKG2D具有特异性的重链和轻链(包括克隆P1AE4980的VH和VL序列,分别为SEQIDNO112和80)组合。包含CEA结合物P011.177的示例性此类双特异性抗体的序列在SEQIDNO213、214、215和216中给出。构建体是使用常规(非基于PCR的)克隆技术制备的,并且在瞬时转染的悬浮适应CHOK1细胞中表达,在无动物成分和无血清的培养基中生长。参照标准方案从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白质。简言之,通过使用蛋白A的亲和色谱从细胞培养物上清液中纯化含有Fc的蛋白质。在pH3.0下实现洗脱,然后立即中和样品。浓缩蛋白质,并通过尺寸排阻色谱法在20mM组氨酸、140mM氯化钠(pH6.0)中将聚集蛋白质与单体蛋白质分离。实例20.包含亲和力成熟的CEA结合物的双特异性CEAxNKG2D抗体的表征两种亲和力成熟的CEA结合物P002.139和P001.177被转化为双特异性分子,如上文实例19中所述。将这两种分子与中度CEA表达LS180肿瘤细胞的结合与含有亲本人源化A5B7CEA结合物(huA5B7)的相应分子的结合进行比较。通过流式细胞术分析分子与肿瘤细胞的结合(图28)。含有亲和力成熟的CEA结合物P002.139和P001.177的双特异性分子与CEA的结合略好于具有亲本huA5B7结合物的相应分子。在下一步中,在JurkatNFATNKG2D报告细胞测定中,在MKN45细胞(图29)以及LS180和HT29细胞(图30)上,确定了这三种双特异性NKG2DxCEA抗体的功能活性。在一些条件下,具有亲和力成熟的CEA结合物P002.139或P001.177的分子的活性比使用包含huA5B7CEA结合物的分子测得的活性略强。实验如以上实例16中所述进行。对于JurkatNFATNKG2D报告细胞测定,在一些情况下,使用384孔板,如下所示。将10000个靶细胞接种在白色平底384孔板中。然后添加指定浓度的TCB和双特异性NKG2DxCEA抗体,并且添加15000个JurkatNFATNKG2D报告细胞,对应于1.5:1的E:T比。实例21.使用NKG2D结合物C26和ADI27743,克隆、生产和纯化抗NKG2D(双特异性)抗体合成抗NKG2D抗体C26和ADI27743(WO2018/148445)的可变结构域,并且将其克隆到编码人IgG1或M形式双特异性分子的质粒中(图12F),每个都具有PGLALAFc结构域突变。双特异性抗体包含抗CEA抗体huA5B7作为第二结合物。产生的分子的完整氨基酸序列在SEQIDNO221-222(C26IgG)、SEQIDNO223-224(ADI27743IgG)、SEQIDNO225、226、229和230(C26双特异性)、以及SEQIDNO227-230(ADI27743双特异性)中给出。所得构建体由Evitria(Switzerland)使用其专有的载体系统通过常规的(基于非PCR)克隆技术和悬浮液适应的CHOK1细胞(最初接收自ATCC,并且适于在Evitria的悬浮液培养物中进行无血清生长)制备。在生产过程中,使用Evitria专有的无动物成分和无血清的培养基(eviGrow和eviMake2)及其专有的转染试剂(eviFect)。根据标准方案从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白质。简言之,通过使用蛋白A的亲和色谱从细胞培养物上清液中纯化含有Fc的蛋白质。在pH3.0下实现洗脱,然后立即中和样品。浓缩蛋白质,并通过尺寸排阻色谱法在20mM组氨酸、140mM氯化钠(pH6.0)中将聚集蛋白质与单体蛋白质分离。实例22.抗NKG2D抗体P1AE4980与C26和ADI27743的比较在NK92细胞系上与NKG2D结合测试来自实例21的抗NKG2D抗体P1AE4980、C26和ADI27743与NK92细胞上的NKG2D的结合。NK92细胞在含有2%FBS、1%GlutaMax(Gibco)和10ng/mlProleukin(Novartis)的高级RPMI1640培养基(Gibco)中培养。检查NK92细胞的活力,并且细胞重新悬浮并调整至密度为1.5mio细胞/ml。将100μl该细胞悬浮液(含0.15mio细胞)接种到96孔圆底板中。在400xg下将孔板离心4min,并且除去上清液。然后将40μl稀释的抗体或FACS缓冲液加入细胞中,并且在4℃下孵育30分钟。孵育后,用FACS缓冲液(每孔150μl)洗涤细胞两次。然后将30μl的稀释的二级PE抗人Fc特异性二抗(JacksonImmunoResearch,#109-116-170)添加到细胞中。将细胞在4℃下再孵育30分钟。为去除未结合的抗体,用FACS缓冲液(每孔150μl)将细胞再洗涤两次。为了测量,将细胞重新悬浮于150μlFACS缓冲液中。使用BD流式细胞仪测量荧光。如图31所示,抗NKG2D抗体P1AE4980显示与NK92细胞的最高总体结合,表明与ADI27743和C26相比,与细胞结合的抗体数量最高。在最高测试浓度下,抗NKG2D抗体C26与NK92的结合非常弱。还测试了来自实例21的相应双特异性NKG2DxCEA抗体的结合。如使用IgG所见,与包含C26或ADI27743的双特异性抗体相比,包含P1AE4980作为NKG2D结合物的双特异性抗体显示出对NK92细胞的最高总体结合(图32)。在JurkatNFATNKG2D报告细胞测定中测试功能活性在JurkatNFATNKG2D报告细胞测定中,联合5nMCEA-TCB与肿瘤细胞系MKN45(DSMZACC409)和HT-29(ATCCHTB-38),测试了包含C26、ADI27743或P1AE4980作为NKG2D结合物的双特异性CEAxNKG2D抗体,如上文实例16中所述。在MKN45(图33)或HT-29(图34)细胞存在下,JurkatNFATNKG2D报告细胞测定表明与包含ADI27743或C26的双特异性抗体相比,包含P1AE4980作为NKG2D结合物的双特异性抗体与5nMCEA-TCB组合导致JurkatNFATNKG2D细胞的最高活化。与包含P1AE4980的双特异性抗体相比,包含ADI27743的双特异性抗体适度活化JurkatNFATNKG2D细胞。包含C26的双特异性抗体仅在两种测试的靶细胞系存在时非常微弱地活化JurkatNFATNKG2D细胞。实例23.包含野生型的或效应子沉默的Fc结构域的抗NKG2D抗体的比较评估了具野生型的或效应子沉默的Fc结构域的抗NKG2D抗体对NK细胞的活化。对于此测定,抗体P1AE4980或395以(单特异性)人IgG1形式使用。PBMC是从全血中新鲜分离的。对分离的PBMC进行计数并检查其活力。将细胞以3mio细胞/ml的密度,重新悬浮在RPMI 10%FBS 1%Glutamax中。在96孔U型底板中每孔接种100μl的细胞悬浮液(产生300000个细胞/孔)。将50μl稀释的抗NKG2D抗体添加到每个孔中,得到总共150μl/孔。将板在培养箱中在37℃下孵育24小时,并且然后以350xg离心2min。收获PBMC并且接种在另一个96孔U底板中,用于通过流式细胞术进行分析。将细胞以400xg离心4min,并且用PBS洗涤一次。将50μl稀释的AquaLive/Dead染色剂(在PBS,Invitrogen,#L34965中以1:1000稀释)添加到每个孔中,并且在4℃下孵育30min。然后,添加150μlFACS缓冲液(1xPBS、2%FBS、1%0.5MEDTApH8、0.25%NaN3(20%)),并且将板以400xg离心4min。去除上清液,并且用150μlFACS缓冲液再次洗涤细胞。然后,将每孔30μl的FITC抗人CD3(BioLegend,#300406)、BrilliantViolet421TM抗人CD56(BioLegend,#318328)、APC抗人CD69(BioLegend,#310910)的抗体混合物添加到细胞中。将细胞在4℃下孵育60min。然后将细胞用FACS缓冲液洗涤两次,并且重新悬浮在每孔100μl的含有1%PFA的FACS缓冲液中以固定细胞。将板在4℃下孵育过夜。在第二天进行FACS测量之前,将细胞重新悬浮在150μlFACS缓冲液中。使用BDLSRFortessa装置进行分析。如图35所示,具有野生型Fc结构域的抗NKG2D抗体诱导NK细胞上CD69的上调,这表明活化。与之相比,具有效应子沉默Fc结构域(包含PGLALA突变)的抗NKG2D抗体不会诱导NK细胞上CD69的上调。这表明我们的激动性抗NKG2D抗体在没有功能性Fc结构域的情况下不会诱导NK或其他表达Fcγ受体的免疫细胞的全身性活化(但只有在经由靶细胞抗原进行结合并且交联后才会局部活化表达NKG2D的细胞)。***尽管为了清楚理解的目的先前已通过举例说明和实施例相当详细地描述了本发明,但是这些描述和实施例不应理解为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容均全文以引用方式明确地并入。序列表<110>豪夫迈·罗氏有限公司<120>与NKG2D结合的抗体<130>P35642<150>EP19186265<151>2019-07-15<160>230<170>PatentIn版本3.5<210>1<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>1SerTyrAlaMetSer15<210>2<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>2AlaIleSerGlySerGlyGlySerThrTyrTyrAlaAspSerValLys151015Gly<210>3<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>3GluLeuTyrArgGluTyrMetAspTyr15<210>4<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>4GlnGlyAspSerLeuArgSerTyrTyrAlaSer1510<210>5<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>5GlyLysAsnAsnArgProSer15<210>6<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>6AsnSerArgAspSerPheSerIleHisGlnAsnVal1510<210>7<211>118<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>7GluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530AlaMetSerTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerAlaIleSerGlySerGlyGlySerThrTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysGluLeuTyrArgGluTyrMetAspTyrTrpGlyGlnGlyThr100105110LeuValThrValSerSer115<210>8<211>109<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>8SerSerGluLeuThrGlnAspProAlaValSerValAlaLeuGlyGln151015ThrValArgIleThrCysGlnGlyAspSerLeuArgSerTyrTyrAla202530SerTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProValLeuValIleTyr354045GlyLysAsnAsnArgProSerGlyIleProAspArgPheSerGlySer505560SerSerGlyAsnThrAlaSerLeuThrIleThrGlyAlaGlnAlaGlu65707580AspGluAlaAspTyrTyrCysAsnSerArgAspSerPheSerIleHis859095GlnAsnValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeu100105<210>9<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>9SerTyrTrpIleGly15<210>10<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>10IleIleTyrProGlyAspSerAspThrArgTyrSerProSerPheGln151015Gly<210>11<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>11LeuTyrProValGlyValTyrPheAspTyr1510<210>12<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>12ArgAlaSerGlnSerIleSerSerTrpLeuAla1510<210>13<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>13AspAlaSerSerLeuGluSer15<210>14<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>14GlnGlnTyrTrpSerTyrTrpMet15<210>15<211>119<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>15GluValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlyGlu151015SerLeuLysIleSerCysLysGlySerGlyTyrSerPheThrSerTyr202530TrpIleGlyTrpValArgGlnMetProGlyLysGlyLeuGluTrpMet354045GlyIleIleTyrProGlyAspSerAspThrArgTyrSerProSerPhe505560GlnGlyGlnValThrIleSerAlaAspLysSerIleSerThrAlaTyr65707580LeuGlnTrpSerSerLeuLysAlaSerAspThrAlaMetTyrTyrCys859095AlaArgLeuTyrProValGlyValTyrPheAspTyrTrpGlyGlnGly100105110ThrLeuValThrValSerSer115<210>16<211>106<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>16AspIleGlnMetThrGlnSerProSerThrLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValThrIleThrCysArgAlaSerGlnSerIleSerSerTrp202530LeuAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuLeuIle354045TyrAspAlaSerSerLeuGluSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrGluPheThrLeuThrIleSerSerLeuGlnPro65707580AspAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnTyrTrpSerTyrTrpMet859095PheGlyGlnGlyThrLysValGluIleLys100105<210>17<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>17TyrTrpMetThr1<210>18<211>18<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>18CysIleHisGlyGlySerSerGlySerThrTyrTyrAlaSerTrpVal151015AsnGly<210>19<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>19ProGlyTyrArgSerTrpSerLysThrPheAspLeu1510<210>20<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>20ArgAlaSerGlnAspIleSerGluSerLeuAsn1510<210>21<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>21AlaAlaSerSerLeuGlnSer15<210>22<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>22GlnGlnAlaAsnSerPheProLeuThr15<210>23<211>121<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>23GlnGlnLeuGluGlnSerGlyGlyGlyLeuValThrProGlyGlySer151015LeuLysLeuCysCysIleGlySerGlyPheAspPheAsnThrTyrTrp202530MetThrTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpIleGly354045CysIleHisGlyGlySerSerGlySerThrTyrTyrAlaSerTrpVal505560AsnGlyArgPheThrLeuSerArgAspIleAspGlnSerThrGlyCys65707580LeuGlnValAsnSerLeuThrAlaAlaAspThrAlaMetTyrTyrCys859095AlaArgProGlyTyrArgSerTrpSerLysThrPheAspLeuTrpGly100105110GlnGlyThrMetValThrValSerSer115120<210>24<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>24AspIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValThrIleThrCysArgAlaSerGlnAspIleSerGluSer202530LeuAsnTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuLeuIle354045TyrAlaAlaSerSerLeuGlnSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspTyrThrLeuThrIleSerSerLeuGlnPro65707580GluAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnAlaAsnSerPheProLeu859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysValGluIleLys100105<210>25<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>25IleTyrTrpMetSer15<210>26<211>18<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>26ArgIleTyrGlyGlySerSerAspTyrThrAlaTyrAlaSerTrpVal151015AsnGly<210>27<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>27LeuAsnProSerPheSerArgSerPheAspTyr1510<210>28<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>28ArgAlaSerGlnGlyIlePheSerTrpLeuVal1510<210>29<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>29GlyAlaSerThrLeuGlnSer15<210>30<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>30GlnGlnGlyTyrSerThrProTyrThr15<210>31<211>121<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>31GluGlnSerGlyGlyGlyAlaGlyGlyGlyLeuValLysProGlyGly151015SerLeuGluLeuCysCysLysAlaSerGlyPheAspPheSerIleTyr202530TrpMetSerTrpValArgGlnSerProGlyLysGlyLeuGluTrpIle354045GlyArgIleTyrGlyGlySerSerAspTyrThrAlaTyrAlaSerTrp505560ValAsnGlyArgPheThrLeuSerArgAspIleAspGlnSerThrGly65707580CysLeuGlnLeuAsnSerLeuThrAlaAlaAspThrAlaMetTyrTyr859095CysValArgLeuAsnProSerPheSerArgSerPheAspTyrTrpGly100105110GlnGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>32<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>32AspIleGlnMetThrGlnSerProSerSerValSerAlaSerValGly151015AspArgValThrIleThrCysArgAlaSerGlnGlyIlePheSerTrp202530LeuValTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaProGluLeuLeuMet354045TyrGlyAlaSerThrLeuGlnSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGlnPro65707580GluAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnGlyTyrSerThrProTyr859095ThrPheGlyGlnGlyThrLysValGluIleLys100105<210>33<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>33SerTyrAlaMetSer15<210>34<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>34ArgIleSerAspGlyGlyGlyThrIleTyrTyrThrAspSerValLys151015Gly<210>35<211>14<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>35HisArgLeuTyrAspSerIleGlyAlaTyrAlaMetAspVal1510<210>36<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>36ArgAlaSerGlnSerIleSerSerTyrLeuAsn1510<210>37<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>37AspAlaSerAsnLeuGluThr15<210>38<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>38GlnGlnAlaAsnSerPheProLeuThr15<210>39<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>39GluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530AlaMetSerTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerArgIleSerAspGlyGlyGlyThrIleTyrTyrThrAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleAlaArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr65707580LeuGluMetLysSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysHisArgLeuTyrAspSerIleGlyAlaTyrAlaMetAspVal100105110TrpGlyGlnGlyThrThrValAlaValSerSer115120<210>40<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>40AspIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValThrIleThrCysArgAlaSerGlnSerIleSerSerTyr202530LeuAsnTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuLeuIle354045TyrAspAlaSerAsnLeuGluThrGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGlnPro65707580GluAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnAlaAsnSerPheProLeu859095ThrPheGlyProGlyThrLysValAspIleLys100105<210>41<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>41TyrTrpMetThr1<210>42<211>18<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>42CysIleHisGlyGlyAspSerGlyAlaThrTyrTyrAlaAsnTrpVal151015AsnGly<210>43<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>43ProGlyTyrProSerTrpSerLysThrPheAspLeu1510<210>44<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>44GlnAlaSerGlnAspIleSerAsnAlaLeuAsn1510<210>45<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>45AlaAlaSerThrLeuGlnSer15<210>46<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>46GlnHisSerAsnSerPheProLeuThr15<210>47<211>121<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>47GlnGlnLeuGluGlnSerGlyGlyGlyLeuValThrProGlyGlySer151015LeuLysValCysCysLysAlaSerGlyPheAspPheThrThrTyrTrp202530MetThrTrpValArgGlnAlaProGluLysGlyLeuGluTrpIleGly354045CysIleHisGlyGlyAspSerGlyAlaThrTyrTyrAlaAsnTrpVal505560AsnGlyArgPheThrLeuSerArgAspIleAspGlnSerThrGlyCys65707580LeuGlnLeuAsnSerLeuThrAlaAlaAspThrAlaMetTyrTyrCys859095AlaArgProGlyTyrProSerTrpSerLysThrPheAspLeuTrpGly100105110GlnGlyThrMetValThrValSerSer115120<210>48<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>48AspIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValThrIleThrCysGlnAlaSerGlnAspIleSerAsnAla202530LeuAsnTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuLeuIle354045TyrAlaAlaSerThrLeuGlnSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGlnPro65707580GluAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnHisSerAsnSerPheProLeu859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysValGluIleLys100105<210>49<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>49TyrTrpMetThr1<210>50<211>18<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>50CysIleHisGlyGlyGlySerGlyThrThrSerTyrAlaSerTrpVal151015AsnGly<210>51<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>51ProGlyTyrArgSerTrpSerLysThrPheAspLeu1510<210>52<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>52GlnAlaAsnGlnAspIleSerAsnAlaLeuAsn1510<210>53<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>53AlaAlaSerSerLeuGlnSer15<210>54<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>54GlnGlnAlaAlaSerPheProLeuThr15<210>55<211>121<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>55GlnGlnLeuGluGlnSerGlyGlyGlyLeuValLysProGlyGlySer151015LeuGluLeuCysCysIleAlaSerGlyPheAspPheSerThrTyrTrp202530MetThrTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpIleGly354045CysIleHisGlyGlyGlySerGlyThrThrSerTyrAlaSerTrpVal505560AsnGlyArgPheThrLeuSerArgAspIleAspGlnSerThrGlyCys65707580LeuGlnLeuThrSerLeuThrAlaAlaAspThrAlaMetTyrTyrCys859095AlaArgProGlyTyrArgSerTrpSerLysThrPheAspLeuTrpGly100105110GlnGlyThrMetValThrValSerSer115120<210>56<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>56AspIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValThrIleThrCysGlnAlaAsnGlnAspIleSerAsnAla202530LeuAsnTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuLeuIle354045TyrAlaAlaSerSerLeuGlnSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGlnPro65707580GluAspPheAlaAlaTyrTyrCysGlnGlnAlaAlaSerPheProLeu859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysValGluIleLys100105<210>57<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>57SerTyrAlaMetSer15<210>58<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>58AlaIleGlyIleGlyGlyGlyGlyThrTyrTyrAlaAspSerValLys151015Gly<210>59<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>59GlyAlaSerPheAspPheIleAsnPhePheProTyr1510<210>60<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>60ArgAlaSerGlnGlyIleSerAsnAspLeuAla1510<210>61<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>61AlaAlaSerSerLeuGlnSer15<210>62<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>62GlnGlnThrTyrSerThrProLeuThr15<210>63<211>121<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>63GluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530AlaMetSerTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerAlaIleGlyIleGlyGlyGlyGlyThrTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrHisCys859095AlaLysGlyAlaSerPheAspPheIleAsnPhePheProTyrTrpGly100105110GlnGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>64<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>64AspIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValThrIleThrCysArgAlaSerGlnGlyIleSerAsnAsp202530LeuAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuLeuIle354045TyrAlaAlaSerSerLeuGlnSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGlnPro65707580GluAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnThrTyrSerThrProLeu859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysValGluIleLys100105<210>65<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>65AspTyrAlaMetSer15<210>66<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>66TyrAsnSerPheSerValGlySerThrAspTyrAlaAspSerValLys151015Gly<210>67<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>67HisSerGlyAsnTyrTyrThrGlyProPheHisTyr1510<210>68<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>68ArgAlaSerGlnGlyIleSerSerTyrLeuAla1510<210>69<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>69AlaAlaSerSerLeuGluSer15<210>70<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>70GlnGlnSerTyrSerThrProIleThr15<210>71<211>121<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>71GluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaThrSerGlyPheThrPheSerAspTyr202530AlaMetSerTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerTyrAsnSerPheSerValGlySerThrAspTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095SerLysHisSerGlyAsnTyrTyrThrGlyProPheHisTyrTrpGly100105110GlnGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>72<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>72AspIleGlnLeuThrGlnSerProSerPheLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValThrIleThrCysArgAlaSerGlnGlyIleSerSerTyr202530LeuAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuLeuIle354045TyrAlaAlaSerSerLeuGluSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGlnPro65707580GluAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnSerTyrSerThrProIle859095ThrPheGlyGlnGlyThrArgLeuGluIleLys100105<210>73<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>73ThrPheTrpMetThr15<210>74<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>74CysIleHisGlyGlySerGlySerArgAspTyrAlaSerTrpValAsn151015Gly<210>75<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>75ProGlyTyrArgSerTrpSerLysThrPheAspLeu1510<210>76<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>76ArgAlaSerGlnAspIleSerGlyAlaLeuAsn1510<210>77<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>77AlaAlaSerSerLeuGlnSer15<210>78<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>78GlnGlnAlaAsnSerPheProLeuThr15<210>79<211>121<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>79GlnGluGlnLeuGluGlnSerGlyGlyGlyLeuValThrProGlyGly151015SerLeuLysLeuCysCysThrAlaSerGlyPheAspPheAsnThrPhe202530TrpMetThrTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpIle354045GlyCysIleHisGlyGlySerGlySerArgAspTyrAlaSerTrpVal505560AsnGlyArgPheThrLeuSerArgAspIleAspGlnSerThrAlaCys65707580LeuGlnValAsnSerLeuThrAlaAlaAspThrAlaMetTyrTyrCys859095AlaArgProGlyTyrArgSerTrpSerLysThrPheAspLeuTrpGly100105110GlnGlyThrMetValThrValSerSer115120<210>80<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>80AspIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValThrIleThrCysArgAlaSerGlnAspIleSerGlyAla202530LeuAsnTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaProAsnLeuLeuIle354045TyrAlaAlaSerSerLeuGlnSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspTyrThrLeuThrIleSerSerLeuGlnPro65707580GluAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnAlaAsnSerPheProLeu859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysValGluIleLys100105<210>81<211>115<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>81GluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530AlaMetSerTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerAlaIleSerGlySerGlyGlySerThrTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysGlySerGlyPheAspTyrTrpGlyGlnGlyThrLeuValThr100105110ValSerSer115<210>82<211>108<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>82GluIleValLeuThrGlnSerProGlyThrLeuSerLeuSerProGly151015GluArgAlaThrLeuSerCysArgAlaSerGlnSerValSerSerSer202530TyrLeuAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgLeuLeu354045IleTyrGlyAlaSerSerArgAlaThrGlyIleProAspArgPheSer505560GlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerArgLeuGlu65707580ProGluAspPheAlaValTyrTyrCysGlnGlnTyrGlySerSerPro859095LeuThrPheGlyGlnGlyThrLysValGluIleLys100105<210>83<211>107<212>PRT<213>智人<400>83ArgThrValAlaAlaProSerValPheIlePheProProSerAspGlu151015GlnLeuLysSerGlyThrAlaSerValValCysLeuLeuAsnAsnPhe202530TyrProArgGluAlaLysValGlnTrpLysValAspAsnAlaLeuGln354045SerGlyAsnSerGlnGluSerValThrGluGlnAspSerLysAspSer505560ThrTyrSerLeuSerSerThrLeuThrLeuSerLysAlaAspTyrGlu65707580LysHisLysValTyrAlaCysGluValThrHisGlnGlyLeuSerSer859095ProValThrLysSerPheAsnArgGlyGluCys100105<210>84<211>105<212>PRT<213>智人<400>84GlnProLysAlaAlaProSerValThrLeuPheProProSerSerGlu151015GluLeuGlnAlaAsnLysAlaThrLeuValCysLeuIleSerAspPhe202530TyrProGlyAlaValThrValAlaTrpLysAlaAspSerSerProVal354045LysAlaGlyValGluThrThrThrProSerLysGlnSerAsnAsnLys505560TyrAlaAlaSerSerTyrLeuSerLeuThrProGluGlnTrpLysSer65707580HisArgSerTyrSerCysGlnValThrHisGluGlySerThrValGlu859095LysThrValAlaProThrGluCysSer100105<210>85<211>328<212>PRT<213>智人<400>85AlaSerThrLysGlyProSerValPheProLeuAlaProSerSerLys151015SerThrSerGlyGlyThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLysAspTyr202530PheProGluProValThrValSerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSer354045GlyValHisThrPheProAlaValLeuGlnSerSerGlyLeuTyrSer505560LeuSerSerValValThrValProSerSerSerLeuGlyThrGlnThr65707580TyrIleCysAsnValAsnHisLysProSerAsnThrLysValAspLys859095LysValGluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCys100105110ProAlaProGluLeuLeuGlyGlyProSerValPheLeuPheProPro115120125LysProLysAspThrLeuMetIleSerArgThrProGluValThrCys130135140ValValValAspValSerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrp145150155160TyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGlu165170175GluGlnTyrAsnSerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeu180185190HisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsn195200205LysAlaLeuProAlaProIleGluLysThrIleSerLysAlaLysGly210215220GlnProArgGluProGlnValTyrThrLeuProProSerArgAspGlu225230235240LeuThrLysAsnGlnValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyr245250255ProSerAspIleAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsn260265270AsnTyrLysThrThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePhe275280285LeuTyrSerLysLeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsn290295300ValPheSerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThr305310315320GlnLysSerLeuSerLeuSerPro325<210>86<211>225<212>PRT<213>智人<400>86AspLysThrHisThrCysProProCysProAlaProGluLeuLeuGly151015GlyProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMet202530IleSerArgThrProGluValThrCysValValValAspValSerHis354045GluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluVal505560HisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSerThrTyr65707580ArgValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeuAsnGly859095LysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuProAlaProIle100105110GluLysThrIleSerLysAlaLysGlyGlnProArgGluProGlnVal115120125TyrThrLeuProProSerArgAspGluLeuThrLysAsnGlnValSer130135140LeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAspIleAlaValGlu145150155160TrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThrProPro165170175ValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThrVal180185190AspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSerValMet195200205HisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSerLeuSer210215220Pro225<210>87<211>216<212>PRT<213>智人<400>87MetGlyTrpIleArgGlyArgArgSerArgHisSerTrpGluMetSer151015GluPheHisAsnTyrAsnLeuAspLeuLysLysSerAspPheSerThr202530ArgTrpGlnLysGlnArgCysProValValLysSerLysCysArgGlu354045AsnAlaSerProPhePhePheCysCysPheIleAlaValAlaMetGly505560IleArgPheIleIleMetValAlaIleTrpSerAlaValPheLeuAsn65707580SerLeuPheAsnGlnGluValGlnIleProLeuThrGluSerTyrCys859095GlyProCysProLysAsnTrpIleCysTyrLysAsnAsnCysTyrGln100105110PhePheAspGluSerLysAsnTrpTyrGluSerGlnAlaSerCysMet115120125SerGlnAsnAlaSerLeuLeuLysValTyrSerLysGluAspGlnAsp130135140LeuLeuLysLeuValLysSerTyrHisTrpMetGlyLeuValHisIle145150155160ProThrAsnGlySerTrpGlnTrpGluAspGlySerIleLeuSerPro165170175AsnLeuLeuThrIleIleGluMetGlnLysGlyAspCysAlaLeuTyr180185190AlaSerSerPheLysGlyTyrIleGluAsnCysSerThrProAsnThr195200205TyrIleCysMetGlnArgThrVal210215<210>88<211>137<212>PRT<213>智人<400>88AsnSerLeuPheAsnGlnGluValGlnIleProLeuThrGluSerTyr151015CysGlyProCysProLysAsnTrpIleCysTyrLysAsnAsnCysTyr202530GlnPhePheAspGluSerLysAsnTrpTyrGluSerGlnAlaSerCys354045MetSerGlnAsnAlaSerLeuLeuLysValTyrSerLysGluAspGln505560AspLeuLeuLysLeuValLysSerTyrHisTrpMetGlyLeuValHis65707580IleProThrAsnGlySerTrpGlnTrpGluAspGlySerIleLeuSer859095ProAsnLeuLeuThrIleIleGluMetGlnLysGlyAspCysAlaLeu100105110TyrAlaSerSerPheLysGlyTyrIleGluAsnCysSerThrProAsn115120125ThrTyrIleCysMetGlnArgThrVal130135<210>89<211>216<212>PRT<213>食蟹猴<400>89MetGlyTrpIleArgGlyArgArgProArgHisAsnLeuGluMetSer151015GluPheHisAsnTyrLysLeuGlyLeuAlaLysSerAspPheSerThr202530ArgCysGlnLysGlnArgCysProValIleLysSerLysCysArgGlu354045AsnAlaSerProLeuPhePheCysCysPheIleAlaValAlaMetGly505560IleArgPheIleIleMetValThrIleTrpSerAlaValPheLeuAsn65707580SerLeuPheAsnGlnGluValGlnIleProLeuThrGluSerTyrCys859095GlyProCysProLysAsnTrpIleCysTyrLysAsnAsnCysTyrGln100105110PhePheAsnGluSerLysAsnTrpTyrGluSerGlnAlaSerCysMet115120125SerGlnAsnAlaSerLeuLeuLysValTyrSerLysGluAspGlnAsp130135140LeuLeuLysLeuValLysSerTyrHisTrpMetGlyLeuValHisIle145150155160ProThrAsnGlySerTrpGlnTrpGluAspGlySerIleLeuSerPro165170175AsnLeuLeuThrIleIleGluMetGlnLysGlyAspCysAlaLeuTyr180185190AlaSerSerPheLysGlyTyrIleGluAsnCysSerIleProAsnThr195200205TyrIleCysMetGlnArgThrVal210215<210>90<211>137<212>PRT<213>食蟹猴<400>90AsnSerLeuPheAsnGlnGluValGlnIleProLeuThrGluSerTyr151015CysGlyProCysProLysAsnTrpIleCysTyrLysAsnAsnCysTyr202530GlnPhePheAsnGluSerLysAsnTrpTyrGluSerGlnAlaSerCys354045MetSerGlnAsnAlaSerLeuLeuLysValTyrSerLysGluAspGln505560AspLeuLeuLysLeuValLysSerTyrHisTrpMetGlyLeuValHis65707580IleProThrAsnGlySerTrpGlnTrpGluAspGlySerIleLeuSer859095ProAsnLeuLeuThrIleIleGluMetGlnLysGlyAspCysAlaLeu100105110TyrAlaSerSerPheLysGlyTyrIleGluAsnCysSerIleProAsn115120125ThrTyrIleCysMetGlnArgThrVal130135<210>91<211>232<212>PRT<213>小鼠<400>91MetAlaLeuIleArgAspArgLysSerHisHisSerGluMetSerLys151015CysHisAsnTyrAspLeuLysProAlaLysTrpAspThrSerGlnGlu202530GlnGlnLysGlnArgLeuAlaLeuThrThrSerGlnProGlyGluAsn354045GlyIleIleArgGlyArgTyrProIleGluLysLeuLysIleSerPro505560MetPheValValArgValLeuAlaIleAlaLeuAlaIleArgPheThr65707580LeuAsnThrLeuMetTrpLeuAlaIlePheLysGluThrPheGlnPro859095ValLeuCysAsnLysGluValProValSerSerArgGluGlyTyrCys100105110GlyProCysProAsnAsnTrpIleCysHisArgAsnAsnCysTyrGln115120125PhePheAsnGluGluLysThrTrpAsnGlnSerGlnAlaSerCysLeu130135140SerGlnAsnSerSerLeuLeuLysIleTyrSerLysGluGluGlnAsp145150155160PheLeuLysLeuValLysSerTyrHisTrpMetGlyLeuValGlnIle165170175ProAlaAsnGlySerTrpGlnTrpGluAspGlySerSerLeuSerTyr180185190AsnGlnLeuThrLeuValGluIleProLysGlySerCysAlaValTyr195200205GlySerSerPheLysAlaTyrThrGluAspCysAlaAsnLeuAsnThr210215220TyrIleCysMetLysArgAlaVal225230<210>92<211>133<212>PRT<213>小鼠<400>92AsnLysGluValProValSerSerArgGluGlyTyrCysGlyProCys151015ProAsnAsnTrpIleCysHisArgAsnAsnCysTyrGlnPhePheAsn202530GluGluLysThrTrpAsnGlnSerGlnAlaSerCysLeuSerGlnAsn354045SerSerLeuLeuLysIleTyrSerLysGluGluGlnAspPheLeuLys505560LeuValLysSerTyrHisTrpMetGlyLeuValGlnIleProAlaAsn65707580GlySerTrpGlnTrpGluAspGlySerSerLeuSerTyrAsnGlnLeu859095ThrLeuValGluIleProLysGlySerCysAlaValTyrGlySerSer100105110PheLysAlaTyrThrGluAspCysAlaAsnLeuAsnThrTyrIleCys115120125MetLysArgAlaVal130<210>93<211>165<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>93HisHisHisHisHisHisGlySerGlyLeuAsnAspIlePheGluAla151015GlnLysIleGluTrpHisGluGlyGlyGlyGlySerAsnSerLeuPhe202530AsnGlnGluValGlnIleProLeuThrGluSerTyrCysGlyProCys354045ProLysAsnTrpIleCysTyrLysAsnAsnCysTyrGlnPhePheAsp505560GluSerLysAsnTrpTyrGluSerGlnAlaSerCysMetSerGlnAsn65707580AlaSerLeuLeuLysValTyrSerLysGluAspGlnAspLeuLeuLys859095LeuValLysSerTyrHisTrpMetGlyLeuValHisIleProThrAsn100105110GlySerTrpGlnTrpGluAspGlySerIleLeuSerProAsnLeuLeu115120125ThrIleIleGluMetGlnLysGlyAspCysAlaLeuTyrAlaSerSer130135140PheLysGlyTyrIleGluAsnCysSerThrProAsnThrTyrIleCys145150155160MetGlnArgThrVal165<210>94<211>388<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>94GlyLeuAsnAspIlePheGluAlaGlnLysIleGluTrpHisGluAsp151015LysThrHisThrCysProProCysProAlaProGluLeuLeuGlyGly202530ProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMetIle354045SerArgThrProGluValThrCysValValValAspValSerHisGlu505560AspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluValHis65707580AsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSerThrTyrArg859095ValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeuAsnGlyLys100105110GluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuProAlaProIleGlu115120125LysThrIleSerLysAlaLysGlyGlnProArgGluProGlnValTyr130135140ThrLeuProProCysArgAspGluLeuThrLysAsnGlnValSerLeu145150155160TrpCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAspIleAlaValGluTrp165170175GluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThrProProVal180185190LeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThrValAsp195200205LysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSerValMetHis210215220GluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSerLeuSerPro225230235240GlyGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerAsnSerLeuPheAsn245250255GlnGluValGlnIleProLeuThrGluSerTyrCysGlyProCysPro260265270LysAsnTrpIleCysTyrLysAsnAsnCysTyrGlnPhePheAspGlu275280285SerLysAsnTrpTyrGluSerGlnAlaSerCysMetSerGlnAsnAla290295300SerLeuLeuLysValTyrSerLysGluAspGlnAspLeuLeuLysLeu305310315320ValLysSerTyrHisTrpMetGlyLeuValHisIleProThrAsnGly325330335SerTrpGlnTrpGluAspGlySerIleLeuSerProAsnLeuLeuThr340345350IleIleGluMetGlnLysGlyAspCysAlaLeuTyrAlaSerSerPhe355360365LysGlyTyrIleGluAsnCysSerThrProAsnThrTyrIleCysMet370375380GlnArgThrVal385<210>95<211>227<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>95AspLysThrHisThrCysProProCysProAlaProGluLeuLeuGly151015GlyProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMet202530IleSerArgThrProGluValThrCysValValValAspValSerHis354045GluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluVal505560HisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSerThrTyr65707580ArgValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeuAsnGly859095LysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuProAlaProIle100105110GluLysThrIleSerLysAlaLysGlyGlnProArgGluProGlnVal115120125CysThrLeuProProSerArgAspGluLeuThrLysAsnGlnValSer130135140LeuSerCysAlaValLysGlyPheTyrProSerAspIleAlaValGlu145150155160TrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThrProPro165170175ValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuValSerLysLeuThrVal180185190AspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSerValMet195200205HisGluAlaLeuHisAsnArgPheThrGlnLysSerLeuSerLeuSer210215220ProGlyLys225<210>96<211>388<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>96GlyLeuAsnAspIlePheGluAlaGlnLysIleGluTrpHisGluAsp151015LysThrHisThrCysProProCysProAlaProGluLeuLeuGlyGly202530ProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMetIle354045SerArgThrProGluValThrCysValValValAspValSerHisGlu505560AspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluValHis65707580AsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSerThrTyrArg859095ValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeuAsnGlyLys100105110GluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuGlyAlaProIleGlu115120125LysThrIleSerLysAlaLysGlyGlnProArgGluProGlnValTyr130135140ThrLeuProProSerArgAspGluLeuThrLysAsnGlnValSerLeu145150155160ThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAspIleAlaValGluTrp165170175GluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThrProProVal180185190LeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThrValAsp195200205LysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSerValMetHis210215220GluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSerLeuSerPro225230235240GlyGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerAsnSerLeuPheAsn245250255GlnGluValGlnIleProLeuThrGluSerTyrCysGlyProCysPro260265270LysAsnTrpIleCysTyrLysAsnAsnCysTyrGlnPhePheAspGlu275280285SerLysAsnTrpTyrGluSerGlnAlaSerCysMetSerGlnAsnAla290295300SerLeuLeuLysValTyrSerLysGluAspGlnAspLeuLeuLysLeu305310315320ValLysSerTyrHisTrpMetGlyLeuValHisIleProThrAsnGly325330335SerTrpGlnTrpGluAspGlySerIleLeuSerProAsnLeuLeuThr340345350IleIleGluMetGlnLysGlyAspCysAlaLeuTyrAlaSerSerPhe355360365LysGlyTyrIleGluAsnCysSerThrProAsnThrTyrIleCysMet370375380GlnArgThrVal385<210>97<211>388<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>97GlyLeuAsnAspIlePheGluAlaGlnLysIleGluTrpHisGluAsp151015LysThrHisThrCysProProCysProAlaProGluLeuLeuGlyGly202530ProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMetIle354045SerArgThrProGluValThrCysValValValAspValSerHisGlu505560AspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluValHis65707580AsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSerThrTyrArg859095ValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeuAsnGlyLys100105110GluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuGlyAlaProIleGlu115120125LysThrIleSerLysAlaLysGlyGlnProArgGluProGlnValTyr130135140ThrLeuProProSerArgAspGluLeuThrLysAsnGlnValSerLeu145150155160ThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAspIleAlaValGluTrp165170175GluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThrProProVal180185190LeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThrValAsp195200205LysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSerValMetHis210215220GluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSerLeuSerPro225230235240GlyGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerAsnSerLeuPheAsn245250255GlnGluValGlnIleProLeuThrGluSerTyrCysGlyProCysPro260265270LysAsnTrpIleCysTyrLysAsnAsnCysTyrGlnPhePheAsnGlu275280285SerLysAsnTrpTyrGluSerGlnAlaSerCysMetSerGlnAsnAla290295300SerLeuLeuLysValTyrSerLysGluAspGlnAspLeuLeuLysLeu305310315320ValLysSerTyrHisTrpMetGlyLeuValHisIleProThrAsnGly325330335SerTrpGlnTrpGluAspGlySerIleLeuSerProAsnLeuLeuThr340345350IleIleGluMetGlnLysGlyAspCysAlaLeuTyrAlaSerSerPhe355360365LysGlyTyrIleGluAsnCysSerIleProAsnThrTyrIleCysMet370375380GlnArgThrVal385<210>98<211>384<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>98GlyLeuAsnAspIlePheGluAlaGlnLysIleGluTrpHisGluAsp151015LysThrHisThrCysProProCysProAlaProGluLeuLeuGlyGly202530ProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMetIle354045SerArgThrProGluValThrCysValValValAspValSerHisGlu505560AspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluValHis65707580AsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSerThrTyrArg859095ValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeuAsnGlyLys100105110GluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuGlyAlaProIleGlu115120125LysThrIleSerLysAlaLysGlyGlnProArgGluProGlnValTyr130135140ThrLeuProProSerArgAspGluLeuThrLysAsnGlnValSerLeu145150155160ThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAspIleAlaValGluTrp165170175GluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThrProProVal180185190LeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThrValAsp195200205LysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSerValMetHis210215220GluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSerLeuSerPro225230235240GlyGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerAsnLysGluValPro245250255ValSerSerArgGluGlyTyrCysGlyProCysProAsnAsnTrpIle260265270CysHisArgAsnAsnCysTyrGlnPhePheAsnGluGluLysThrTrp275280285AsnGlnSerGlnAlaSerCysLeuSerGlnAsnSerSerLeuLeuLys290295300IleTyrSerLysGluGluGlnAspPheLeuLysLeuValLysSerTyr305310315320HisTrpMetGlyLeuValGlnIleProAlaAsnGlySerTrpGlnTrp325330335GluAspGlySerSerLeuSerTyrAsnGlnLeuThrLeuValGluIle340345350ProLysGlySerCysAlaValTyrGlySerSerPheLysAlaTyrThr355360365GluAspCysAlaAsnLeuAsnThrTyrIleCysMetLysArgAlaVal370375380<210>99<211>374<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>99AspGlyCysLysProCysIleCysThrValProGluValSerSerVal151015PheIlePheProProLysProLysAspValLeuThrIleThrLeuThr202530ProLysValThrCysValValValAspIleSerLysAspAlaProGlu354045ValGlnPheSerTrpPheValAspAspValGluValHisThrAlaGln505560ThrGlnProArgGluGluGlnPheAsnSerThrPheArgSerValSer65707580GluLeuProIleMetHisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluPheLys859095CysArgValAsnSerAlaAlaPheGlyAlaProIleGluLysThrIle100105110SerLysThrLysGlyArgProLysAlaProGlnValTyrThrIlePro115120125ProProLysGluGlnMetAlaLysAspLysValSerLeuThrCysMet130135140IleThrAspPhePheProGluAspIleThrValGluTrpGlnTrpAsn145150155160GlyGlnProAlaGluAsnTyrLysAsnThrGlnProIleMetAspThr165170175AspGlySerTyrPheValTyrSerLysLeuAsnValGlnLysSerAsn180185190TrpGluAlaGlyAsnThrPheThrCysSerValLeuHisGluGlyLeu195200205HisAsnHisHisThrGluLysSerLeuSerHisSerProGlyGlyGly210215220GlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerAsnSerLeu225230235240PheAsnGlnGluValGlnIleProLeuThrGluSerTyrCysGlyPro245250255CysProLysAsnTrpIleCysTyrLysAsnAsnCysTyrGlnPhePhe260265270AspGluSerLysAsnTrpTyrGluSerGlnAlaSerCysMetSerGln275280285AsnAlaSerLeuLeuLysValTyrSerLysGluAspGlnAspLeuLeu290295300LysLeuValLysSerTyrHisTrpMetGlyLeuValHisIleProThr305310315320AsnGlySerTrpGlnTrpGluAspGlySerIleLeuSerProAsnLeu325330335LeuThrIleIleGluMetGlnLysGlyAspCysAlaLeuTyrAlaSer340345350SerPheLysGlyTyrIleGluAsnCysSerThrProAsnThrTyrIle355360365CysMetGlnArgThrVal370<210>100<211>548<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>100AlaGluProHisSerLeuArgTyrAsnLeuMetValLeuSerGlnAsp151015GluSerValGlnSerGlyPheLeuAlaGluGlyHisLeuAspGlyGln202530ProPheLeuArgTyrAspArgGlnLysArgArgAlaLysProGlnGly354045GlnTrpAlaGluAspValLeuGlyAlaLysThrTrpAspThrGluThr505560GluAspLeuThrGluAsnGlyGlnAspLeuArgArgThrLeuThrHis65707580IleLysAspGlnLysGlyGlyLeuHisSerLeuGlnGluIleArgVal859095CysGluIleHisGluAspSerSerThrArgGlySerArgHisPheTyr100105110TyrAspGlyGluLeuPheLeuSerGlnAsnLeuGluThrGlnGluSer115120125ThrValProGlnSerSerArgAlaGlnThrLeuAlaMetAsnValThr130135140AsnPheTrpLysGluAspAlaMetLysThrLysThrHisTyrArgAla145150155160MetGlnAlaAspCysLeuGlnLysLeuGlnArgTyrLeuLysSerGly165170175ValAlaIleArgArgThrValProProMetValAsnValThrSerSer180185190GluValSerGluGlyAsnIleThrValThrCysArgAlaSerSerPhe195200205TyrProArgAsnIleThrLeuThrTrpArgGlnAspGlyValSerLeu210215220SerHisAsnThrGlnGlnTrpGlyAspValLeuProAspGlyAsnGly225230235240ThrTyrGlnThrTrpValAlaThrArgIleArgGlnGlyGluGluGln245250255ArgPheThrCysTyrMetGluHisSerGlyAsnHisGlyThrHisPro260265270ValProSerGlyLysValLeuValLeuGlnSerGlnArgThrValAsp275280285AlaSerGlyGlySerProThrProProThrProGlyGlyGlySerAla290295300AspLysThrHisThrCysProProCysProAlaProGluAlaAlaGly305310315320GlyProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMet325330335IleSerArgThrProGluValThrCysValValValAspValSerHis340345350GluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluVal355360365HisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSerThrTyr370375380ArgValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeuAsnGly385390395400LysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuGlyAlaProIle405410415GluLysThrIleSerLysAlaLysGlyGlnProArgGluProGlnVal420425430TyrThrLeuProProCysArgAspGluLeuThrLysAsnGlnValSer435440445LeuTrpCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAspIleAlaValGlu450455460TrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThrProPro465470475480ValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThrVal485490495AspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSerValMet500505510HisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSerLeuSer515520525ProGlyLysSerGlyGlyLeuAsnAspIlePheGluAlaGlnLysIle530535540GluTrpHisGlu545<210>101<211>227<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>101AspLysThrHisThrCysProProCysProAlaProGluAlaAlaGly151015GlyProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMet202530IleSerArgThrProGluValThrCysValValValAspValSerHis354045GluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluVal505560HisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSerThrTyr65707580ArgValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeuAsnGly859095LysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuGlyAlaProIle100105110GluLysThrIleSerLysAlaLysGlyGlnProArgGluProGlnVal115120125CysThrLeuProProSerArgAspGluLeuThrLysAsnGlnValSer130135140LeuSerCysAlaValLysGlyPheTyrProSerAspIleAlaValGlu145150155160TrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThrProPro165170175ValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuValSerLysLeuThrVal180185190AspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSerValMet195200205HisGluAlaLeuHisAsnArgPheThrGlnLysSerLeuSerLeuSer210215220ProGlyLys225<210>102<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>102SerIleHisGlyGlySerGlySerArgAspTyrAlaSerTrpValAsn151015Gly<210>103<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>103SerIleHisGlyGlySerGlySerArgAspTyrAlaAspSerValLys151015Gly<210>104<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>104SerIleHisGlyGlySerGlySerArgAspTyrSerProSerPheGln151015Gly<210>105<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>105SerIleHisGlyGlySerGlySerArgAspTyrAsnProSerLeuLys151015Ser<210>106<211>121<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>106GlnGluGlnLeuGluGlnSerGlyGlyGlyLeuValThrProGlyGly151015SerLeuLysLeuCysCysThrAlaSerGlyPheAspPheAsnThrPhe202530TrpMetThrTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpIle354045GlySerIleHisGlyGlySerGlySerArgAspTyrAlaSerTrpVal505560AsnGlyArgPheThrLeuSerArgAspIleAspGlnSerThrAlaCys65707580LeuGlnValAsnSerLeuThrAlaAlaAspThrAlaMetTyrTyrCys859095AlaArgProGlyTyrArgSerTrpSerLysThrPheAspLeuTrpGly100105110GlnGlyThrMetValThrValSerSer115120<210>107<211>121<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>107GluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheAspPheAsnThrPhe202530TrpMetThrTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045GlySerIleHisGlyGlySerGlySerArgAspTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgProGlyTyrArgSerTrpSerLysThrPheAspLeuTrpGly100105110GlnGlyThrThrValThrValSerSer115120<210>108<211>121<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>108GluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheAspPheAsnThrPhe202530TrpMetThrTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045GlySerIleHisGlyGlySerGlySerArgAspTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnSerLysAsnThrAlaTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgProGlyTyrArgSerTrpSerLysThrPheAspLeuTrpGly100105110GlnGlyThrThrValThrValSerSer115120<210>109<211>121<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>109GluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheAspPheAsnThrPhe202530TrpMetThrTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045GlySerIleHisGlyGlySerGlySerArgAspTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAspIleAspGlnSerThrAlaTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgProGlyTyrArgSerTrpSerLysThrPheAspLeuTrpGly100105110GlnGlyThrThrValThrValSerSer115120<210>110<211>121<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>110GluValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheAspPheAsnThrPhe202530TrpMetThrTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045GlySerIleHisGlyGlySerGlySerArgAspTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerAlaAspIleAspGlnSerThrAlaTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgProGlyTyrArgSerTrpSerLysThrPheAspLeuTrpGly100105110GlnGlyThrThrValThrValSerSer115120<210>111<211>121<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>111GlnGluGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheAspPheAsnThrPhe202530TrpMetThrTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045GlySerIleHisGlyGlySerGlySerArgAspTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAspIleAspGlnSerThrAlaTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgProGlyTyrArgSerTrpSerLysThrPheAspLeuTrpGly100105110GlnGlyThrThrValThrValSerSer115120<210>112<211>121<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>112GlnGluGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlyGlu151015SerLeuLysIleSerCysLysGlySerGlyPheAspPheAsnThrPhe202530TrpMetThrTrpValArgGlnMetProGlyLysGlyLeuGluTrpMet354045GlySerIleHisGlyGlySerGlySerArgAspTyrSerProSerPhe505560GlnGlyGlnValThrIleSerAlaAspIleAspGlnSerThrAlaTyr65707580LeuGlnTrpSerSerLeuLysAlaSerAspThrAlaMetTyrTyrCys859095AlaArgProGlyTyrArgSerTrpSerLysThrPheAspLeuTrpGly100105110GlnGlyThrThrValThrValSerSer115120<210>113<211>121<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>113GlnGluGlnLeuGlnGluSerGlyProGlyLeuValLysProSerGlu151015ThrLeuSerLeuThrCysThrValSerGlyPheAspPheAsnThrPhe202530TrpMetThrTrpIleArgGlnProProGlyLysGlyLeuGluTrpIle354045GlySerIleHisGlyGlySerGlySerArgAspTyrAsnProSerLeu505560LysSerArgValThrIleSerValAspIleAspGlnAsnGlnPheSer65707580LeuLysLeuSerSerValThrAlaAlaAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgProGlyTyrArgSerTrpSerLysThrPheAspLeuTrpGly100105110GlnGlyThrThrValThrValSerSer115120<210>114<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>114SerTyrTrpMetHis15<210>115<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>115PheIleArgAsnLysAlaAsnGlyGlyThrThrGluTyrAlaAlaSer151015ValLysGly<210>116<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>116AspArgGlyLeuArgPheTyrPheAspTyr1510<210>117<211>14<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>117ThrLeuArgArgGlyIleAsnValGlyAlaTyrSerIleTyr1510<210>118<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>118TyrLysSerAspSerAspLysGlnGlnGlySer1510<210>119<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>119MetIleTrpHisSerGlyAlaSerAlaVal1510<210>120<211>120<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>120ValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyArgSer151015LeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrValSerSerTyrTrp202530MetHisTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpValGly354045PheIleArgAsnLysAlaAsnGlyGlyThrThrGluTyrAlaAlaSer505560ValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspAspSerLysAsnThrLeu65707580TyrLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyr859095CysAlaArgAspArgGlyLeuArgPheTyrPheAspTyrTrpGlyGln100105110GlyThrThrValThrValSerSer115120<210>121<211>116<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>121GlnAlaValLeuThrGlnProAlaSerLeuSerAlaSerProGlyAla151015SerAlaSerLeuThrCysThrLeuArgArgGlyIleAsnValGlyAla202530TyrSerIleTyrTrpTyrGlnGlnLysProGlySerProProGlnTyr354045LeuLeuArgTyrLysSerAspSerAspLysGlnGlnGlySerGlyVal505560SerSerArgPheSerAlaSerLysAspAlaSerAlaAsnAlaGlyIle65707580LeuLeuIleSerGlyLeuGlnSerGluAspGluAlaAspTyrTyrCys859095MetIleTrpHisSerGlyAlaSerAlaValPheGlyGlyGlyThrLys100105110LeuThrValLeu115<210>122<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>122AspTyrTyrMetAsn15<210>123<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>123PheIleGlyAsnLysAlaAsnAlaTyrThrThrGluTyrSerAlaSer151015ValLysGly<210>124<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>124AspArgGlyLeuArgPheTyrPheAspTyr1510<210>125<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>125ArgAlaSerSerSerValThrTyrIleHis1510<210>126<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>126AlaThrSerAsnLeuAlaSer15<210>127<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>127GlnHisTrpSerSerLysProProThr15<210>128<211>121<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>128GluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheThrAspTyr202530TyrMetAsnTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpLeu354045GlyPheIleGlyAsnLysAlaAsnAlaTyrThrThrGluTyrSerAla505560SerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspLysSerLysAsnThr65707580LeuTyrLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaThrTyr859095TyrCysThrArgAspArgGlyLeuArgPheTyrPheAspTyrTrpGly100105110GlnGlyThrThrValThrValSerSer115120<210>129<211>106<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>129GluIleValLeuThrGlnSerProAlaThrLeuSerLeuSerProGly151015GluArgAlaThrLeuSerCysArgAlaSerSerSerValThrTyrIle202530HisTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgSerTrpIleTyr354045AlaThrSerAsnLeuAlaSerGlyIleProAlaArgPheSerGlySer505560GlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGluProGlu65707580AspPheAlaValTyrTyrCysGlnHisTrpSerSerLysProProThr859095PheGlyGlnGlyThrLysLeuGluIleLys100105<210>130<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>130ThrTyrAlaMetAsn15<210>131<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>131ArgIleArgSerLysTyrAsnAsnTyrAlaThrTyrTyrAlaAspSer151015ValLysGly<210>132<211>14<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>132HisGlyAsnPheGlyAsnSerTyrValSerTrpPheAlaTyr1510<210>133<211>14<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>133GlySerSerThrGlyAlaValThrThrSerAsnTyrAlaAsn1510<210>134<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>134GlyThrAsnLysArgAlaPro15<210>135<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>135AlaLeuTrpTyrSerAsnLeuTrpVal15<210>136<211>125<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>136GluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerThrTyr202530AlaMetAsnTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerArgIleArgSerLysTyrAsnAsnTyrAlaThrTyrTyrAlaAsp505560SerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspAspSerLysAsnThr65707580LeuTyrLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyr859095TyrCysValArgHisGlyAsnPheGlyAsnSerTyrValSerTrpPhe100105110AlaTyrTrpGlyGlnGlyThrLeuValThrValSerSer115120125<210>137<211>109<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>137GlnAlaValValThrGlnGluProSerLeuThrValSerProGlyGly151015ThrValThrLeuThrCysGlySerSerThrGlyAlaValThrThrSer202530AsnTyrAlaAsnTrpValGlnGluLysProGlyGlnAlaPheArgGly354045LeuIleGlyGlyThrAsnLysArgAlaProGlyThrProAlaArgPhe505560SerGlySerLeuLeuGlyGlyLysAlaAlaLeuThrLeuSerGlyAla65707580GlnProGluAspGluAlaGluTyrTyrCysAlaLeuTrpTyrSerAsn859095LeuTrpValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeu100105<210>138<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>138GluPheGlyMetAsn15<210>139<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>139TrpIleAsnThrLysThrGlyGluAlaThrTyrValGluGluPheLys151015Gly<210>140<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>140TrpAspPheAlaTyrTyrValGluAlaMetAspTyr1510<210>141<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>141LysAlaSerAlaAlaValGlyThrTyrValAla1510<210>142<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>142SerAlaSerTyrArgLysArg15<210>143<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>143HisGlnTyrTyrThrTyrProLeuPheThr1510<210>144<211>121<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>144GlnValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlyAla151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrGluPhe202530GlyMetAsnTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMet354045GlyTrpIleAsnThrLysThrGlyGluAlaThrTyrValGluGluPhe505560LysGlyArgValThrPheThrThrAspThrSerThrSerThrAlaTyr65707580MetGluLeuArgSerLeuArgSerAspAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgTrpAspPheAlaTyrTyrValGluAlaMetAspTyrTrpGly100105110GlnGlyThrThrValThrValSerSer115120<210>145<211>108<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>145AspIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValThrIleThrCysLysAlaSerAlaAlaValGlyThrTyr202530ValAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuLeuIle354045TyrSerAlaSerTyrArgLysArgGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGlnPro65707580GluAspPheAlaThrTyrTyrCysHisGlnTyrTyrThrTyrProLeu859095PheThrPheGlyGlnGlyThrLysLeuGluIleLys100105<210>146<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>146AspThrTyrMetHis15<210>147<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>147ArgIleAspProAlaAsnGlyAsnSerLysTyrValProLysPheGln151015Gly<210>148<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>148PheGlyTyrTyrValSerAspTyrAlaMetAlaTyr1510<210>149<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>149ArgAlaGlyGluSerValAspIlePheGlyValGlyPheLeuHis151015<210>150<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>150ArgAlaSerAsnArgAlaThr15<210>151<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>151GlnGlnThrAsnGluAspProTyrThr15<210>152<211>121<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>152GlnValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlySer151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyPheAsnIleLysAspThr202530TyrMetHisTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMet354045GlyArgIleAspProAlaAsnGlyAsnSerLysTyrValProLysPhe505560GlnGlyArgValThrIleThrAlaAspThrSerThrSerThrAlaTyr65707580MetGluLeuSerSerLeuArgSerGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaProPheGlyTyrTyrValSerAspTyrAlaMetAlaTyrTrpGly100105110GlnGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>153<211>111<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>153GluIleValLeuThrGlnSerProAlaThrLeuSerLeuSerProGly151015GluArgAlaThrLeuSerCysArgAlaGlyGluSerValAspIlePhe202530GlyValGlyPheLeuHisTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaPro354045ArgLeuLeuIleTyrArgAlaSerAsnArgAlaThrGlyIleProAla505560ArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSer65707580SerLeuGluProGluAspPheAlaValTyrTyrCysGlnGlnThrAsn859095GluAspProTyrThrPheGlyGlnGlyThrLysLeuGluIleLys100105110<210>154<211>694<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>154GlnValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlyAla151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrGluPhe202530GlyMetAsnTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMet354045GlyTrpIleAsnThrLysThrGlyGluAlaThrTyrValGluGluPhe505560LysGlyArgValThrPheThrThrAspThrSerThrSerThrAlaTyr65707580MetGluLeuArgSerLeuArgSerAspAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgTrpAspPheAlaTyrTyrValGluAlaMetAspTyrTrpGly100105110GlnGlyThrThrValThrValSerSerAlaSerThrLysGlyProSer115120125ValPheProLeuAlaProSerSerLysSerThrSerGlyGlyThrAla130135140AlaLeuGlyCysLeuValLysAspTyrPheProGluProValThrVal145150155160SerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSerGlyValHisThrPheProAla165170175ValLeuGlnSerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrVal180185190ProSerSerSerLeuGlyThrGlnThrTyrIleCysAsnValAsnHis195200205LysProSerAsnThrLysValAspLysLysValGluProLysSerCys210215220AspGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGluValGlnLeuLeu225230235240GluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGlySerLeuArgLeuSer245250255CysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerThrTyrAlaMetAsnTrpVal260265270ArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpValSerArgIleArgSer275280285LysTyrAsnAsnTyrAlaThrTyrTyrAlaAspSerValLysGlyArg290295300PheThrIleSerArgAspAspSerLysAsnThrLeuTyrLeuGlnMet305310315320AsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCysValArgHis325330335GlyAsnPheGlyAsnSerTyrValSerTrpPheAlaTyrTrpGlyGln340345350GlyThrLeuValThrValSerSerAlaSerValAlaAlaProSerVal355360365PheIlePheProProSerAspGluGlnLeuLysSerGlyThrAlaSer370375380ValValCysLeuLeuAsnAsnPheTyrProArgGluAlaLysValGln385390395400TrpLysValAspAsnAlaLeuGlnSerGlyAsnSerGlnGluSerVal405410415ThrGluGlnAspSerLysAspSerThrTyrSerLeuSerSerThrLeu420425430ThrLeuSerLysAlaAspTyrGluLysHisLysValTyrAlaCysGlu435440445ValThrHisGlnGlyLeuSerSerProValThrLysSerPheAsnArg450455460GlyGluCysAspLysThrHisThrCysProProCysProAlaProGlu465470475480AlaAlaGlyGlyProSerValPheLeuPheProProLysProLysAsp485490495ThrLeuMetIleSerArgThrProGluValThrCysValValValAsp500505510ValSerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGly515520525ValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsn530535540SerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrp545550555560LeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuGly565570575AlaProIleGluLysThrIleSerLysAlaLysGlyGlnProArgGlu580585590ProGlnValTyrThrLeuProProCysArgAspGluLeuThrLysAsn595600605GlnValSerLeuTrpCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAspIle610615620AlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThr625630635640ThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLys645650655LeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCys660665670SerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeu675680685SerLeuSerProGlyLys690<210>155<211>451<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>155GlnValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlyAla151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrGluPhe202530GlyMetAsnTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMet354045GlyTrpIleAsnThrLysThrGlyGluAlaThrTyrValGluGluPhe505560LysGlyArgValThrPheThrThrAspThrSerThrSerThrAlaTyr65707580MetGluLeuArgSerLeuArgSerAspAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgTrpAspPheAlaTyrTyrValGluAlaMetAspTyrTrpGly100105110GlnGlyThrThrValThrValSerSerAlaSerThrLysGlyProSer115120125ValPheProLeuAlaProSerSerLysSerThrSerGlyGlyThrAla130135140AlaLeuGlyCysLeuValLysAspTyrPheProGluProValThrVal145150155160SerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSerGlyValHisThrPheProAla165170175ValLeuGlnSerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrVal180185190ProSerSerSerLeuGlyThrGlnThrTyrIleCysAsnValAsnHis195200205LysProSerAsnThrLysValAspLysLysValGluProLysSerCys210215220AspLysThrHisThrCysProProCysProAlaProGluAlaAlaGly225230235240GlyProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMet245250255IleSerArgThrProGluValThrCysValValValAspValSerHis260265270GluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluVal275280285HisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSerThrTyr290295300ArgValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeuAsnGly305310315320LysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuGlyAlaProIle325330335GluLysThrIleSerLysAlaLysGlyGlnProArgGluProGlnVal340345350CysThrLeuProProSerArgAspGluLeuThrLysAsnGlnValSer355360365LeuSerCysAlaValLysGlyPheTyrProSerAspIleAlaValGlu370375380TrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThrProPro385390395400ValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuValSerLysLeuThrVal405410415AspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSerValMet420425430HisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSerLeuSer435440445ProGlyLys450<210>156<211>214<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>156GlnAlaValValThrGlnGluProSerLeuThrValSerProGlyGly151015ThrValThrLeuThrCysGlySerSerThrGlyAlaValThrThrSer202530AsnTyrAlaAsnTrpValGlnGluLysProGlyGlnAlaPheArgGly354045LeuIleGlyGlyThrAsnLysArgAlaProGlyThrProAlaArgPhe505560SerGlySerLeuLeuGlyGlyLysAlaAlaLeuThrLeuSerGlyAla65707580GlnProGluAspGluAlaGluTyrTyrCysAlaLeuTrpTyrSerAsn859095LeuTrpValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeuSerSerAla100105110SerThrLysGlyProSerValPheProLeuAlaProSerSerLysSer115120125ThrSerGlyGlyThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLysAspTyrPhe130135140ProGluProValThrValSerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSerGly145150155160ValHisThrPheProAlaValLeuGlnSerSerGlyLeuTyrSerLeu165170175SerSerValValThrValProSerSerSerLeuGlyThrGlnThrTyr180185190IleCysAsnValAsnHisLysProSerAsnThrLysValAspLysLys195200205ValGluProLysSerCys210<210>157<211>215<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>157AspIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValThrIleThrCysLysAlaSerAlaAlaValGlyThrTyr202530ValAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuLeuIle354045TyrSerAlaSerTyrArgLysArgGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGlnPro65707580GluAspPheAlaThrTyrTyrCysHisGlnTyrTyrThrTyrProLeu859095PheThrPheGlyGlnGlyThrLysLeuGluIleLysArgThrValAla100105110AlaProSerValPheIlePheProProSerAspGluGlnLeuLysSer115120125GlyThrAlaSerValValCysLeuLeuAsnAsnPheTyrProArgGlu130135140AlaLysValGlnTrpLysValAspAsnAlaLeuGlnSerGlyAsnSer145150155160GlnGluSerValThrGluGlnAspSerLysAspSerThrTyrSerLeu165170175SerSerThrLeuThrLeuSerLysAlaAspTyrGluLysHisLysVal180185190TyrAlaCysGluValThrHisGlnGlyLeuSerSerProValThrLys195200205SerPheAsnArgGlyGluCys210215<210>158<211>674<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>158GlnValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlySer151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyPheAsnIleLysAspThr202530TyrMetHisTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMet354045GlyArgIleAspProAlaAsnGlyAsnSerLysTyrValProLysPhe505560GlnGlyArgValThrIleThrAlaAspThrSerThrSerThrAlaTyr65707580MetGluLeuSerSerLeuArgSerGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaProPheGlyTyrTyrValSerAspTyrAlaMetAlaTyrTrpGly100105110GlnGlyThrLeuValThrValSerSerAlaSerThrLysGlyProSer115120125ValPheProLeuAlaProSerSerLysSerThrSerGlyGlyThrAla130135140AlaLeuGlyCysLeuValGluAspTyrPheProGluProValThrVal145150155160SerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSerGlyValHisThrPheProAla165170175ValLeuGlnSerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrVal180185190ProSerSerSerLeuGlyThrGlnThrTyrIleCysAsnValAsnHis195200205LysProSerAsnThrLysValAspGluLysValGluProLysSerCys210215220AspGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlnAlaValValThr225230235240GlnGluProSerLeuThrValSerProGlyGlyThrValThrLeuThr245250255CysGlySerSerThrGlyAlaValThrThrSerAsnTyrAlaAsnTrp260265270ValGlnGluLysProGlyGlnAlaPheArgGlyLeuIleGlyGlyThr275280285AsnLysArgAlaProGlyThrProAlaArgPheSerGlySerLeuLeu290295300GlyGlyLysAlaAlaLeuThrLeuSerGlyAlaGlnProGluAspGlu305310315320AlaGluTyrTyrCysAlaLeuTrpTyrSerAsnLeuTrpValPheGly325330335GlyGlyThrLysLeuThrValLeuSerSerAlaSerThrLysGlyPro340345350SerValPheProLeuAlaProSerSerLysSerThrSerGlyGlyThr355360365AlaAlaLeuGlyCysLeuValLysAspTyrPheProGluProValThr370375380ValSerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSerGlyValHisThrPhePro385390395400AlaValLeuGlnSerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThr405410415ValProSerSerSerLeuGlyThrGlnThrTyrIleCysAsnValAsn420425430HisLysProSerAsnThrLysValAspLysLysValGluProLysSer435440445CysAspLysThrHisThrCysProProCysProAlaProGluAlaAla450455460GlyGlyProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeu465470475480MetIleSerArgThrProGluValThrCysValValValAspValSer485490495HisGluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyValGlu500505510ValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSerThr515520525TyrArgValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeuAsn530535540GlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuGlyAlaPro545550555560IleGluLysThrIleSerLysAlaLysGlyGlnProArgGluProGln565570575ValTyrThrLeuProProCysArgAspGluLeuThrLysAsnGlnVal580585590SerLeuTrpCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAspIleAlaVal595600605GluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThrPro610615620ProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThr625630635640ValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSerVal645650655MetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSerLeu660665670SerPro<210>159<211>449<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>159GlnValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlySer151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyPheAsnIleLysAspThr202530TyrMetHisTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMet354045GlyArgIleAspProAlaAsnGlyAsnSerLysTyrValProLysPhe505560GlnGlyArgValThrIleThrAlaAspThrSerThrSerThrAlaTyr65707580MetGluLeuSerSerLeuArgSerGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaProPheGlyTyrTyrValSerAspTyrAlaMetAlaTyrTrpGly100105110GlnGlyThrLeuValThrValSerSerAlaSerThrLysGlyProSer115120125ValPheProLeuAlaProSerSerLysSerThrSerGlyGlyThrAla130135140AlaLeuGlyCysLeuValGluAspTyrPheProGluProValThrVal145150155160SerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSerGlyValHisThrPheProAla165170175ValLeuGlnSerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrVal180185190ProSerSerSerLeuGlyThrGlnThrTyrIleCysAsnValAsnHis195200205LysProSerAsnThrLysValAspGluLysValGluProLysSerCys210215220AspLysThrHisThrCysProProCysProAlaProGluAlaAlaGly225230235240GlyProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMet245250255IleSerArgThrProGluValThrCysValValValAspValSerHis260265270GluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluVal275280285HisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSerThrTyr290295300ArgValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeuAsnGly305310315320LysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuGlyAlaProIle325330335GluLysThrIleSerLysAlaLysGlyGlnProArgGluProGlnVal340345350CysThrLeuProProSerArgAspGluLeuThrLysAsnGlnValSer355360365LeuSerCysAlaValLysGlyPheTyrProSerAspIleAlaValGlu370375380TrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThrProPro385390395400ValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuValSerLysLeuThrVal405410415AspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSerValMet420425430HisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSerLeuSer435440445Pro<210>160<211>232<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>160GluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerThrTyr202530AlaMetAsnTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerArgIleArgSerLysTyrAsnAsnTyrAlaThrTyrTyrAlaAsp505560SerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspAspSerLysAsnThr65707580LeuTyrLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyr859095TyrCysValArgHisGlyAsnPheGlyAsnSerTyrValSerTrpPhe100105110AlaTyrTrpGlyGlnGlyThrLeuValThrValSerSerAlaSerVal115120125AlaAlaProSerValPheIlePheProProSerAspGluGlnLeuLys130135140SerGlyThrAlaSerValValCysLeuLeuAsnAsnPheTyrProArg145150155160GluAlaLysValGlnTrpLysValAspAsnAlaLeuGlnSerGlyAsn165170175SerGlnGluSerValThrGluGlnAspSerLysAspSerThrTyrSer180185190LeuSerSerThrLeuThrLeuSerLysAlaAspTyrGluLysHisLys195200205ValTyrAlaCysGluValThrHisGlnGlyLeuSerSerProValThr210215220LysSerPheAsnArgGlyGluCys225230<210>161<211>218<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>161GluIleValLeuThrGlnSerProAlaThrLeuSerLeuSerProGly151015GluArgAlaThrLeuSerCysArgAlaGlyGluSerValAspIlePhe202530GlyValGlyPheLeuHisTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaPro354045ArgLeuLeuIleTyrArgAlaSerAsnArgAlaThrGlyIleProAla505560ArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSer65707580SerLeuGluProGluAspPheAlaValTyrTyrCysGlnGlnThrAsn859095GluAspProTyrThrPheGlyGlnGlyThrLysLeuGluIleLysArg100105110ThrValAlaAlaProSerValPheIlePheProProSerAspArgLys115120125LeuLysSerGlyThrAlaSerValValCysLeuLeuAsnAsnPheTyr130135140ProArgGluAlaLysValGlnTrpLysValAspAsnAlaLeuGlnSer145150155160GlyAsnSerGlnGluSerValThrGluGlnAspSerLysAspSerThr165170175TyrSerLeuSerSerThrLeuThrLeuSerLysAlaAspTyrGluLys180185190HisLysValTyrAlaCysGluValThrHisGlnGlyLeuSerSerPro195200205ValThrLysSerPheAsnArgGlyGluCys210215<210>162<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>162PheIleGlyAsnLysAlaAsnGlyTyrThrThrGluTyrSerAlaSer151015ValLysGly<210>163<211>121<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>163GluValLysLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaThrSerGlyPheThrPheThrAspTyr202530TyrMetAsnTrpValArgGlnProProGlyLysAlaLeuGluTrpLeu354045GlyPheIleGlyAsnLysAlaAsnGlyTyrThrThrGluTyrSerAla505560SerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspLysSerGlnSerIle65707580LeuTyrLeuGlnMetAsnThrLeuArgAlaGluAspSerAlaThrTyr859095TyrCysThrArgAspArgGlyLeuArgPheTyrPheAspTyrTrpGly100105110GlnGlyThrThrLeuThrValSerSer115120<210>164<211>106<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>164GlnThrValLeuSerGlnSerProAlaIleLeuSerAlaSerProGly151015GluLysValThrMetThrCysArgAlaSerSerSerValThrTyrIle202530HisTrpTyrGlnGlnLysProGlySerSerProLysSerTrpIleTyr354045AlaThrSerAsnLeuAlaSerGlyValProAlaArgPheSerGlySer505560GlySerGlyThrSerTyrSerLeuThrIleSerArgValGluAlaGlu65707580AspAlaAlaThrTyrTyrCysGlnHisTrpSerSerLysProProThr859095PheGlyGlyGlyThrLysLeuGluIleLys100105<210>165<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<220><221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>X是Y或A或E<400>165AspTyrXaaMetAsn15<210>166<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>166AspTyrAlaMetAsn15<210>167<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>167AspTyrGluMetAsn15<210>168<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>X是F或V<220><221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>X是G或S<400>168XaaIleXaaAsnLysAlaAsnAlaTyrThrThrGluTyrSerAlaSer151015ValLysGly<210>169<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>169ValIleSerAsnLysAlaAsnAlaTyrThrThrGluTyrSerAlaSer151015ValLysGly<210>170<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>170PheIleSerAsnLysAlaAsnAlaTyrThrThrGluTyrSerAlaSer151015ValLysGly<210>171<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<220><221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>X是L或I<220><221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>X是Y或G或Q或S<400>171AspArgGlyXaaArgPheXaaPheAspTyr1510<210>172<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>172AspArgGlyIleArgPheGlyPheAspTyr1510<210>173<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>173AspArgGlyLeuArgPheSerPheAspTyr1510<210>174<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>174AspArgGlyIleArgPheTyrPheAspTyr1510<210>175<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>175AspArgGlyIleArgPheGlnPheAspTyr1510<210>176<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>176AspArgGlyIleArgPheSerPheAspTyr1510<210>177<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>X是R或H<400>177XaaAlaSerSerSerValThrTyrIleHis1510<210>178<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>178HisAlaSerSerSerValThrTyrIleHis1510<210>179<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<220><221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>X是K或V或Q或I<220><221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>X是P或S<400>179GlnHisTrpSerSerXaaXaaProThr15<210>180<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>180GlnHisTrpSerSerValProProThr15<210>181<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>181GlnHisTrpSerSerGlnProProThr15<210>182<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>182GlnHisTrpSerSerIleSerProThr15<210>183<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>183GlnHisTrpSerSerLysSerProThr15<210>184<211>121<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>184GluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheThrAspTyr202530TyrMetAsnTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpLeu354045GlyPheIleGlyAsnLysAlaAsnAlaTyrThrThrGluTyrSerAla505560SerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspLysSerLysAsnThr65707580LeuTyrLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaThrTyr859095TyrCysThrArgAspArgGlyIleArgPheGlyPheAspTyrTrpGly100105110GlnGlyThrThrValThrValSerSer115120<210>185<211>106<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>185GluIleValLeuThrGlnSerProAlaThrLeuSerLeuSerProGly151015GluArgAlaThrLeuSerCysArgAlaSerSerSerValThrTyrIle202530HisTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgSerTrpIleTyr354045AlaThrSerAsnLeuAlaSerGlyIleProAlaArgPheSerGlySer505560GlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGluProGlu65707580AspPheAlaValTyrTyrCysGlnHisTrpSerSerValProProThr859095PheGlyGlnGlyThrLysLeuGluIleLys100105<210>186<211>121<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>186GluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheThrAspTyr202530TyrMetAsnTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpLeu354045GlyPheIleGlyAsnLysAlaAsnAlaTyrThrThrGluTyrSerAla505560SerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspLysSerLysAsnThr65707580LeuTyrLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaThrTyr859095TyrCysThrArgAspArgGlyLeuArgPheSerPheAspTyrTrpGly100105110GlnGlyThrThrValThrValSerSer115120<210>187<211>106<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>187GluIleValLeuThrGlnSerProAlaThrLeuSerLeuSerProGly151015GluArgAlaThrLeuSerCysArgAlaSerSerSerValThrTyrIle202530HisTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgSerTrpIleTyr354045AlaThrSerAsnLeuAlaSerGlyIleProAlaArgPheSerGlySer505560GlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGluProGlu65707580AspPheAlaValTyrTyrCysGlnHisTrpSerSerGlnProProThr859095PheGlyGlnGlyThrLysLeuGluIleLys100105<210>188<211>121<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>188GluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheThrAspTyr202530TyrMetAsnTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpLeu354045GlyPheIleGlyAsnLysAlaAsnAlaTyrThrThrGluTyrSerAla505560SerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspLysSerLysAsnThr65707580LeuTyrLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaThrTyr859095TyrCysThrArgAspArgGlyIleArgPheTyrPheAspTyrTrpGly100105110GlnGlyThrThrValThrValSerSer115120<210>189<211>106<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>189GluIleValLeuThrGlnSerProAlaThrLeuSerLeuSerProGly151015GluArgAlaThrLeuSerCysArgAlaSerSerSerValThrTyrIle202530HisTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgSerTrpIleTyr354045AlaThrSerAsnLeuAlaSerGlyIleProAlaArgPheSerGlySer505560GlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGluProGlu65707580AspPheAlaValTyrTyrCysGlnHisTrpSerSerIleSerProThr859095PheGlyGlnGlyThrLysLeuGluIleLys100105<210>190<211>121<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>190GluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheTyrPheThrAspTyr202530AlaMetAsnTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpLeu354045GlyValIleSerAsnLysAlaAsnAlaTyrThrThrGluTyrSerAla505560SerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspLysSerLysAsnThr65707580LeuTyrLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaThrTyr859095TyrCysThrArgAspArgGlyLeuArgPheTyrPheAspTyrTrpGly100105110GlnGlyThrThrValThrValSerSer115120<210>191<211>106<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>191GluIleValLeuThrGlnSerProAlaThrLeuSerLeuSerProGly151015GluArgAlaThrLeuSerCysHisAlaSerSerSerValThrTyrIle202530HisTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgSerTrpIleTyr354045AlaThrSerAsnLeuAlaSerGlyIleProAlaArgPheSerGlySer505560GlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGluProGlu65707580AspPheAlaValTyrTyrCysGlnHisTrpSerSerLysProProThr859095PheGlyGlnGlyThrLysLeuGluIleLys100105<210>192<211>121<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>192GluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheTyrPheThrAspTyr202530TyrMetAsnTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpLeu354045GlyPheIleSerAsnLysAlaAsnAlaTyrThrThrGluTyrSerAla505560SerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspLysSerLysAsnThr65707580LeuTyrLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaThrTyr859095TyrCysThrArgAspArgGlyLeuArgPheTyrPheAspTyrTrpGly100105110GlnGlyThrThrValThrValSerSer115120<210>193<211>106<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>193GluIleValLeuThrGlnSerProAlaThrLeuSerLeuSerProGly151015GluArgAlaThrLeuSerCysArgAlaSerSerSerValThrTyrIle202530HisTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgSerTrpIleTyr354045AlaThrSerAsnLeuAlaSerGlyIleProAlaArgPheSerGlySer505560GlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGluProGlu65707580AspPheAlaValTyrTyrCysGlnHisTrpSerSerLysProProThr859095PheGlyGlnGlyThrLysLeuGluIleLys100105<210>194<211>121<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>194GluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheThrAspTyr202530TyrMetAsnTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpLeu354045GlyPheIleGlyAsnLysAlaAsnAlaTyrThrThrGluTyrSerAla505560SerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspLysSerLysAsnThr65707580LeuTyrLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaThrTyr859095TyrCysThrArgAspArgGlyIleArgPheGlnPheAspTyrTrpGly100105110GlnGlyThrThrValThrValSerSer115120<210>195<211>106<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>195GluIleValLeuThrGlnSerProAlaThrLeuSerLeuSerProGly151015GluArgAlaThrLeuSerCysArgAlaSerSerSerValThrTyrIle202530HisTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgSerTrpIleTyr354045AlaThrSerAsnLeuAlaSerGlyIleProAlaArgPheSerGlySer505560GlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGluProGlu65707580AspPheAlaValTyrTyrCysGlnHisTrpSerSerLysSerProThr859095PheGlyGlnGlyThrLysLeuGluIleLys100105<210>196<211>121<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>196GluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheTyrPheThrAspTyr202530TyrMetAsnTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpLeu354045GlyValIleSerAsnLysAlaAsnAlaTyrThrThrGluTyrSerAla505560SerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspLysSerLysAsnThr65707580LeuTyrLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaThrTyr859095TyrCysThrArgAspArgGlyIleArgPheGlnPheAspTyrTrpGly100105110GlnGlyThrThrValThrValSerSer115120<210>197<211>106<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>197GluIleValLeuThrGlnSerProAlaThrLeuSerLeuSerProGly151015GluArgAlaThrLeuSerCysArgAlaSerSerSerValThrTyrIle202530HisTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgSerTrpIleTyr354045AlaThrSerAsnLeuAlaSerGlyIleProAlaArgPheSerGlySer505560GlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGluProGlu65707580AspPheAlaValTyrTyrCysGlnHisTrpSerSerLysSerProThr859095PheGlyGlnGlyThrLysLeuGluIleLys100105<210>198<211>121<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>198GluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheTyrPheSerAspTyr202530TyrMetAsnTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpLeu354045GlyValIleSerAsnLysAlaAsnAlaTyrThrThrGluTyrSerAla505560SerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspLysSerLysAsnThr65707580LeuTyrLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaThrTyr859095TyrCysThrArgAspArgGlyIleArgPheGlnPheAspTyrTrpGly100105110GlnGlyThrThrValThrValSerSer115120<210>199<211>106<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>199GluIleValLeuThrGlnSerProAlaThrLeuSerLeuSerProGly151015GluArgAlaThrLeuSerCysArgAlaSerSerSerValThrTyrIle202530HisTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgSerTrpIleTyr354045AlaThrSerAsnLeuAlaSerGlyIleProAlaArgPheSerGlySer505560GlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGluProGlu65707580AspPheAlaValTyrTyrCysGlnHisTrpSerSerLysSerProThr859095PheGlyGlnGlyThrLysLeuGluIleLys100105<210>200<211>121<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>200GluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheThrAspTyr202530TyrMetAsnTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpLeu354045GlyPheIleGlyAsnLysAlaAsnAlaTyrThrThrGluTyrSerAla505560SerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspLysSerLysAsnThr65707580LeuTyrLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaThrTyr859095TyrCysThrArgAspArgGlyIleArgPheSerPheAspTyrTrpGly100105110GlnGlyThrThrValThrValSerSer115120<210>201<211>106<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>201GluIleValLeuThrGlnSerProAlaThrLeuSerLeuSerProGly151015GluArgAlaThrLeuSerCysArgAlaSerSerSerValThrTyrIle202530HisTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgSerTrpIleTyr354045AlaThrSerAsnLeuAlaSerGlyIleProAlaArgPheSerGlySer505560GlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGluProGlu65707580AspPheAlaValTyrTyrCysGlnHisTrpSerSerIleSerProThr859095PheGlyGlnGlyThrLysLeuGluIleLys100105<210>202<211>121<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>202GluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheTyrPheThrAspTyr202530TyrMetAsnTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpLeu354045GlyValIleSerAsnLysAlaAsnAlaTyrThrThrGluTyrSerAla505560SerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspLysSerLysAsnThr65707580LeuTyrLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaThrTyr859095TyrCysThrArgAspArgGlyIleArgPheSerPheAspTyrTrpGly100105110GlnGlyThrThrValThrValSerSer115120<210>203<211>106<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>203GluIleValLeuThrGlnSerProAlaThrLeuSerLeuSerProGly151015GluArgAlaThrLeuSerCysArgAlaSerSerSerValThrTyrIle202530HisTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgSerTrpIleTyr354045AlaThrSerAsnLeuAlaSerGlyIleProAlaArgPheSerGlySer505560GlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGluProGlu65707580AspPheAlaValTyrTyrCysGlnHisTrpSerSerIleSerProThr859095PheGlyGlnGlyThrLysLeuGluIleLys100105<210>204<211>121<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>204GluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheTyrPheThrAspTyr202530AlaMetAsnTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpLeu354045GlyValIleSerAsnLysAlaAsnAlaTyrThrThrGluTyrSerAla505560SerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspLysSerLysAsnThr65707580LeuTyrLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaThrTyr859095TyrCysThrArgAspArgGlyIleArgPheGlyPheAspTyrTrpGly100105110GlnGlyThrThrValThrValSerSer115120<210>205<211>106<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>205GluIleValLeuThrGlnSerProAlaThrLeuSerLeuSerProGly151015GluArgAlaThrLeuSerCysArgAlaSerSerSerValThrTyrIle202530HisTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgSerTrpIleTyr354045AlaThrSerAsnLeuAlaSerGlyIleProAlaArgPheSerGlySer505560GlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGluProGlu65707580AspPheAlaValTyrTyrCysGlnHisTrpSerSerValProProThr859095PheGlyGlnGlyThrLysLeuGluIleLys100105<210>206<211>121<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>206GluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerAspTyr202530GluMetAsnTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpLeu354045GlyPheIleSerAsnLysAlaAsnAlaTyrThrThrGluTyrSerAla505560SerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspLysSerLysAsnThr65707580LeuTyrLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaThrTyr859095TyrCysThrArgAspArgGlyIleArgPheGlyPheAspTyrTrpGly100105110GlnGlyThrThrValThrValSerSer115120<210>207<211>106<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>207GluIleValLeuThrGlnSerProAlaThrLeuSerLeuSerProGly151015GluArgAlaThrLeuSerCysArgAlaSerSerSerValThrTyrIle202530HisTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgSerTrpIleTyr354045AlaThrSerAsnLeuAlaSerGlyIleProAlaArgPheSerGlySer505560GlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGluProGlu65707580AspPheAlaValTyrTyrCysGlnHisTrpSerSerValProProThr859095PheGlyGlnGlyThrLysLeuGluIleLys100105<210>208<211>420<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>208GlnLeuThrThrGluSerMetProPheAsnValAlaGluGlyLysGlu151015ValLeuLeuLeuValHisAsnLeuProGlnGlnLeuPheGlyTyrSer202530TrpTyrLysGlyGluArgValAspGlyAsnArgGlnIleValGlyTyr354045AlaIleGlyThrGlnGlnAlaThrProGlyProAlaAsnSerGlyArg505560GluThrIleTyrProAsnAlaSerLeuLeuIleGlnAsnValThrGln65707580AsnAspThrGlyPheTyrThrLeuGlnValIleLysSerAspLeuVal859095AsnGluGluAlaThrGlyGlnPheHisValTyrProGluLeuProLys100105110ProPheIleThrSerAsnAsnSerAsnProValGluAspGluAspAla115120125ValAlaLeuThrCysGluProGluIleGlnAsnThrThrTyrLeuTrp130135140TrpValAsnAsnGlnSerLeuProValSerProArgLeuGlnLeuSer145150155160AsnAspAsnArgThrLeuThrLeuLeuSerValThrArgAsnAspVal165170175GlyProTyrGluCysGlyIleGlnAsnLysLeuSerValAspHisSer180185190AspProValIleLeuAsnValLeuTyrGlyProAspAspProThrIle195200205SerProSerTyrThrTyrTyrArgProGlyValAsnLeuSerLeuSer210215220CysHisAlaAlaSerAsnProProAlaGlnTyrSerTrpLeuIleAsp225230235240GlyAsnIleGlnGlnHisThrGlnGluLeuPheIleSerAsnIleThr245250255GluLysAsnSerGlyLeuTyrThrCysGlnAlaAsnAsnSerAlaSer260265270GlyHisSerArgThrThrValLysThrIleThrValSerAlaLeuSer275280285ProValValAlaLysProGlnIleLysAlaSerLysThrThrValThr290295300GlyAspLysAspSerValAsnLeuThrCysSerThrAsnAspThrGly305310315320IleSerIleArgTrpPhePheLysAsnGlnSerLeuProSerSerGlu325330335ArgMetLysLeuSerGlnGlyAsnIleThrLeuSerIleAsnProVal340345350LysArgGluAspAlaGlyThrTyrTrpCysGluValPheAsnProIle355360365SerLysAsnGlnSerAspProIleMetLeuAsnValAsnTyrAsnAla370375380LeuProGlnGluAsnLeuIleAsnValAspGlySerGlyLeuAsnAsp385390395400IlePheGluAlaGlnLysIleGluTrpHisGluAlaArgAlaHisHis405410415HisHisHisHis420<210>209<211>435<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>209AspIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValThrIleThrCysArgAlaSerGlnAspIleSerGlyAla202530LeuAsnTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaProAsnLeuLeuIle354045TyrAlaAlaSerSerLeuGlnSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspTyrThrLeuThrIleSerSerLeuGlnPro65707580GluAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnAlaAsnSerPheProLeu859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysValGluIleLysAlaSerThrLysGly100105110ProSerValPheProLeuAlaProSerSerLysSerThrSerGlyGly115120125ThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLysAspTyrPheProGluProVal130135140ThrValSerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSerGlyValHisThrPhe145150155160ProAlaValLeuGlnSerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSerValVal165170175ThrValProSerSerSerLeuGlyThrGlnThrTyrIleCysAsnVal180185190AsnHisLysProSerAsnThrLysValAspLysLysValGluProLys195200205SerCysAspLysThrHisThrCysProProCysProAlaProGluAla210215220AlaGlyGlyProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThr225230235240LeuMetIleSerArgThrProGluValThrCysValValValAspVal245250255SerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyVal260265270GluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSer275280285ThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeu290295300AsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuGlyAla305310315320ProIleGluLysThrIleSerLysAlaLysGlyGlnProArgGluPro325330335GlnValTyrThrLeuProProCysArgAspGluLeuThrLysAsnGln340345350ValSerLeuTrpCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAspIleAla355360365ValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThr370375380ProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeu385390395400ThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSer405410415ValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSer420425430LeuSerPro435<210>210<211>449<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>210GluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheThrAspTyr202530TyrMetAsnTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpLeu354045GlyPheIleGlyAsnLysAlaAsnAlaTyrThrThrGluTyrSerAla505560SerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspLysSerLysAsnThr65707580LeuTyrLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaThrTyr859095TyrCysThrArgAspArgGlyLeuArgPheTyrPheAspTyrTrpGly100105110GlnGlyThrThrValThrValSerSerAlaSerThrLysGlyProSer115120125ValPheProLeuAlaProSerSerLysSerThrSerGlyGlyThrAla130135140AlaLeuGlyCysLeuValGluAspTyrPheProGluProValThrVal145150155160SerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSerGlyValHisThrPheProAla165170175ValLeuGlnSerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrVal180185190ProSerSerSerLeuGlyThrGlnThrTyrIleCysAsnValAsnHis195200205LysProSerAsnThrLysValAspGluLysValGluProLysSerCys210215220AspLysThrHisThrCysProProCysProAlaProGluAlaAlaGly225230235240GlyProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMet245250255IleSerArgThrProGluValThrCysValValValAspValSerHis260265270GluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluVal275280285HisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSerThrTyr290295300ArgValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeuAsnGly305310315320LysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuGlyAlaProIle325330335GluLysThrIleSerLysAlaLysGlyGlnProArgGluProGlnVal340345350CysThrLeuProProSerArgAspGluLeuThrLysAsnGlnValSer355360365LeuSerCysAlaValLysGlyPheTyrProSerAspIleAlaValGlu370375380TrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThrProPro385390395400ValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuValSerLysLeuThrVal405410415AspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSerValMet420425430HisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSerLeuSer435440445Pro<210>211<211>228<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>211GlnGluGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlyGlu151015SerLeuLysIleSerCysLysGlySerGlyPheAspPheAsnThrPhe202530TrpMetThrTrpValArgGlnMetProGlyLysGlyLeuGluTrpMet354045GlySerIleHisGlyGlySerGlySerArgAspTyrSerProSerPhe505560GlnGlyGlnValThrIleSerAlaAspIleAspGlnSerThrAlaTyr65707580LeuGlnTrpSerSerLeuLysAlaSerAspThrAlaMetTyrTyrCys859095AlaArgProGlyTyrArgSerTrpSerLysThrPheAspLeuTrpGly100105110GlnGlyThrThrValThrValSerSerAlaSerValAlaAlaProSer115120125ValPheIlePheProProSerAspGluGlnLeuLysSerGlyThrAla130135140SerValValCysLeuLeuAsnAsnPheTyrProArgGluAlaLysVal145150155160GlnTrpLysValAspAsnAlaLeuGlnSerGlyAsnSerGlnGluSer165170175ValThrGluGlnAspSerLysAspSerThrTyrSerLeuSerSerThr180185190LeuThrLeuSerLysAlaAspTyrGluLysHisLysValTyrAlaCys195200205GluValThrHisGlnGlyLeuSerSerProValThrLysSerPheAsn210215220ArgGlyGluCys225<210>212<211>213<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>212GluIleValLeuThrGlnSerProAlaThrLeuSerLeuSerProGly151015GluArgAlaThrLeuSerCysArgAlaSerSerSerValThrTyrIle202530HisTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgSerTrpIleTyr354045AlaThrSerAsnLeuAlaSerGlyIleProAlaArgPheSerGlySer505560GlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGluProGlu65707580AspPheAlaValTyrTyrCysGlnHisTrpSerSerLysProProThr859095PheGlyGlnGlyThrLysLeuGluIleLysArgThrValAlaAlaPro100105110SerValPheIlePheProProSerAspArgLysLeuLysSerGlyThr115120125AlaSerValValCysLeuLeuAsnAsnPheTyrProArgGluAlaLys130135140ValGlnTrpLysValAspAsnAlaLeuGlnSerGlyAsnSerGlnGlu145150155160SerValThrGluGlnAspSerLysAspSerThrTyrSerLeuSerSer165170175ThrLeuThrLeuSerLysAlaAspTyrGluLysHisLysValTyrAla180185190CysGluValThrHisGlnGlyLeuSerSerProValThrLysSerPhe195200205AsnArgGlyGluCys210<210>213<211>449<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>213GlnGluGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlyGlu151015SerLeuLysIleSerCysLysGlySerGlyPheAspPheAsnThrPhe202530TrpMetThrTrpValArgGlnMetProGlyLysGlyLeuGluTrpMet354045GlySerIleHisGlyGlySerGlySerArgAspTyrSerProSerPhe505560GlnGlyGlnValThrIleSerAlaAspIleAspGlnSerThrAlaTyr65707580LeuGlnTrpSerSerLeuLysAlaSerAspThrAlaMetTyrTyrCys859095AlaArgProGlyTyrArgSerTrpSerLysThrPheAspLeuTrpGly100105110GlnGlyThrThrValThrValSerSerAlaSerThrLysGlyProSer115120125ValPheProLeuAlaProSerSerLysSerThrSerGlyGlyThrAla130135140AlaLeuGlyCysLeuValGluAspTyrPheProGluProValThrVal145150155160SerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSerGlyValHisThrPheProAla165170175ValLeuGlnSerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrVal180185190ProSerSerSerLeuGlyThrGlnThrTyrIleCysAsnValAsnHis195200205LysProSerAsnThrLysValAspGluLysValGluProLysSerCys210215220AspLysThrHisThrCysProProCysProAlaProGluAlaAlaGly225230235240GlyProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMet245250255IleSerArgThrProGluValThrCysValValValAspValSerHis260265270GluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluVal275280285HisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSerThrTyr290295300ArgValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeuAsnGly305310315320LysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuGlyAlaProIle325330335GluLysThrIleSerLysAlaLysGlyGlnProArgGluProGlnVal340345350TyrThrLeuProProCysArgAspGluLeuThrLysAsnGlnValSer355360365LeuTrpCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAspIleAlaValGlu370375380TrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThrProPro385390395400ValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThrVal405410415AspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSerValMet420425430HisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSerLeuSer435440445Pro<210>214<211>436<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>214GluIleValLeuThrGlnSerProAlaThrLeuSerLeuSerProGly151015GluArgAlaThrLeuSerCysArgAlaSerSerSerValThrTyrIle202530HisTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgSerTrpIleTyr354045AlaThrSerAsnLeuAlaSerGlyIleProAlaArgPheSerGlySer505560GlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGluProGlu65707580AspPheAlaValTyrTyrCysGlnHisTrpSerSerLysProProThr859095PheGlyGlnGlyThrLysLeuGluIleLysSerSerAlaSerThrLys100105110GlyProSerValPheProLeuAlaProSerSerLysSerThrSerGly115120125GlyThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLysAspTyrPheProGluPro130135140ValThrValSerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSerGlyValHisThr145150155160PheProAlaValLeuGlnSerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSerVal165170175ValThrValProSerSerSerLeuGlyThrGlnThrTyrIleCysAsn180185190ValAsnHisLysProSerAsnThrLysValAspLysLysValGluPro195200205LysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCysProAlaProGlu210215220AlaAlaGlyGlyProSerValPheLeuPheProProLysProLysAsp225230235240ThrLeuMetIleSerArgThrProGluValThrCysValValValAsp245250255ValSerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGly260265270ValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsn275280285SerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrp290295300LeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuGly305310315320AlaProIleGluLysThrIleSerLysAlaLysGlyGlnProArgGlu325330335ProGlnValCysThrLeuProProSerArgAspGluLeuThrLysAsn340345350GlnValSerLeuSerCysAlaValLysGlyPheTyrProSerAspIle355360365AlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThr370375380ThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuValSerLys385390395400LeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCys405410415SerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeu420425430SerLeuSerPro435<210>215<211>214<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>215AspIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValThrIleThrCysArgAlaSerGlnAspIleSerGlyAla202530LeuAsnTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaProAsnLeuLeuIle354045TyrAlaAlaSerSerLeuGlnSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspTyrThrLeuThrIleSerSerLeuGlnPro65707580GluAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnAlaAsnSerPheProLeu859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysValGluIleLysArgThrValAlaAla100105110ProSerValPheIlePheProProSerAspArgLysLeuLysSerGly115120125ThrAlaSerValValCysLeuLeuAsnAsnPheTyrProArgGluAla130135140LysValGlnTrpLysValAspAsnAlaLeuGlnSerGlyAsnSerGln145150155160GluSerValThrGluGlnAspSerLysAspSerThrTyrSerLeuSer165170175SerThrLeuThrLeuSerLysAlaAspTyrGluLysHisLysValTyr180185190AlaCysGluValThrHisGlnGlyLeuSerSerProValThrLysSer195200205PheAsnArgGlyGluCys210<210>216<211>228<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>216GluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheTyrPheThrAspTyr202530TyrMetAsnTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpLeu354045GlyPheIleSerAsnLysAlaAsnAlaTyrThrThrGluTyrSerAla505560SerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspLysSerLysAsnThr65707580LeuTyrLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaThrTyr859095TyrCysThrArgAspArgGlyLeuArgPheTyrPheAspTyrTrpGly100105110GlnGlyThrThrValThrValSerSerAlaSerValAlaAlaProSer115120125ValPheIlePheProProSerAspGluGlnLeuLysSerGlyThrAla130135140SerValValCysLeuLeuAsnAsnPheTyrProArgGluAlaLysVal145150155160GlnTrpLysValAspAsnAlaLeuGlnSerGlyAsnSerGlnGluSer165170175ValThrGluGlnAspSerLysAspSerThrTyrSerLeuSerSerThr180185190LeuThrLeuSerLysAlaAspTyrGluLysHisLysValTyrAlaCys195200205GluValThrHisGlnGlyLeuSerSerProValThrLysSerPheAsn210215220ArgGlyGluCys225<210>217<211>117<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>217GlnValGlnLeuGlnGlnTrpGlyAlaGlyLeuLeuLysProSerGlu151015ThrLeuSerLeuThrCysAlaValTyrGlyGlySerPheSerGlyTyr202530TyrTrpSerTrpIleArgGlnProProGlyLysGlyLeuGluTrpIle354045GlyGluIleAspHisSerGlySerThrAsnTyrAsnProSerLeuLys505560SerArgValThrIleSerValAspThrSerLysAsnGlnPheSerLeu65707580LysLeuSerSerValThrAlaAlaAspThrAlaValTyrTyrCysAla859095ArgAlaArgGlyProTrpSerPheAspProTrpGlyGlnGlyThrLeu100105110ValThrValSerSer115<210>218<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>218AspIleGlnMetThrGlnSerProSerThrLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValThrIleThrCysArgAlaSerGlnSerIleSerSerTrp202530LeuAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuLeuIle354045TyrLysAlaSerSerLeuGluSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrGluPheThrLeuThrIleSerSerLeuGlnPro65707580AspAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnTyrGlySerPheProIle859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysValGluIleLys100105<210>219<211>117<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>219GlnValGlnLeuGlnGlnTrpGlyAlaGlyLeuLeuLysProSerGlu151015ThrLeuSerLeuThrCysAlaValTyrGlyGlySerPheSerGlyTyr202530TyrTrpSerTrpIleArgGlnProProGlyLysGlyLeuGluTrpIle354045GlyGluIleAspHisSerGlySerThrAsnTyrAsnProSerLeuLys505560SerArgValThrIleSerValAspThrSerLysAsnGlnPheSerLeu65707580LysLeuSerSerValThrAlaAlaAspThrAlaValTyrTyrCysAla859095ArgAlaArgGlyProTrpSerPheAspProTrpGlyGlnGlyThrLeu100105110ValThrValSerSer115<210>220<211>106<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>220AspIleGlnMetThrGlnSerProSerThrLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValThrIleThrCysArgAlaSerGlnSerIleSerSerTrp202530LeuAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuLeuIle354045TyrLysAlaSerSerLeuGluSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrGluPheThrLeuThrIleSerSerLeuGlnPro65707580AspAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnTyrAsnSerTyrProThr859095PheGlyGlyGlyThrLysValGluIleLys100105<210>221<211>447<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>221GlnValGlnLeuGlnGlnTrpGlyAlaGlyLeuLeuLysProSerGlu151015ThrLeuSerLeuThrCysAlaValTyrGlyGlySerPheSerGlyTyr202530TyrTrpSerTrpIleArgGlnProProGlyLysGlyLeuGluTrpIle354045GlyGluIleAspHisSerGlySerThrAsnTyrAsnProSerLeuLys505560SerArgValThrIleSerValAspThrSerLysAsnGlnPheSerLeu65707580LysLeuSerSerValThrAlaAlaAspThrAlaValTyrTyrCysAla859095ArgAlaArgGlyProTrpSerPheAspProTrpGlyGlnGlyThrLeu100105110ValThrValSerSerAlaSerThrLysGlyProSerValPheProLeu115120125AlaProSerSerLysSerThrSerGlyGlyThrAlaAlaLeuGlyCys130135140LeuValLysAspTyrPheProGluProValThrValSerTrpAsnSer145150155160GlyAlaLeuThrSerGlyValHisThrPheProAlaValLeuGlnSer165170175SerGlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrValProSerSerSer180185190LeuGlyThrGlnThrTyrIleCysAsnValAsnHisLysProSerAsn195200205ThrLysValAspLysLysValGluProLysSerCysAspLysThrHis210215220ThrCysProProCysProAlaProGluAlaAlaGlyGlyProSerVal225230235240PheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMetIleSerArgThr245250255ProGluValThrCysValValValAspValSerHisGluAspProGlu260265270ValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLys275280285ThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSerThrTyrArgValValSer290295300ValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLys305310315320CysLysValSerAsnLysAlaLeuGlyAlaProIleGluLysThrIle325330335SerLysAlaLysGlyGlnProArgGluProGlnValTyrThrLeuPro340345350ProSerArgAspGluLeuThrLysAsnGlnValSerLeuThrCysLeu355360365ValLysGlyPheTyrProSerAspIleAlaValGluTrpGluSerAsn370375380GlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThrProProValLeuAspSer385390395400AspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThrValAspLysSerArg405410415TrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSerValMetHisGluAlaLeu420425430HisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSerLeuSerProGlyLys435440445<210>222<211>214<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>222AspIleGlnMetThrGlnSerProSerThrLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValThrIleThrCysArgAlaSerGlnSerIleSerSerTrp202530LeuAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuLeuIle354045TyrLysAlaSerSerLeuGluSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrGluPheThrLeuThrIleSerSerLeuGlnPro65707580AspAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnTyrGlySerPheProIle859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysValGluIleLysArgThrValAlaAla100105110ProSerValPheIlePheProProSerAspGluGlnLeuLysSerGly115120125ThrAlaSerValValCysLeuLeuAsnAsnPheTyrProArgGluAla130135140LysValGlnTrpLysValAspAsnAlaLeuGlnSerGlyAsnSerGln145150155160GluSerValThrGluGlnAspSerLysAspSerThrTyrSerLeuSer165170175SerThrLeuThrLeuSerLysAlaAspTyrGluLysHisLysValTyr180185190AlaCysGluValThrHisGlnGlyLeuSerSerProValThrLysSer195200205PheAsnArgGlyGluCys210<210>223<211>447<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>223GlnValGlnLeuGlnGlnTrpGlyAlaGlyLeuLeuLysProSerGlu151015ThrLeuSerLeuThrCysAlaValTyrGlyGlySerPheSerGlyTyr202530TyrTrpSerTrpIleArgGlnProProGlyLysGlyLeuGluTrpIle354045GlyGluIleAspHisSerGlySerThrAsnTyrAsnProSerLeuLys505560SerArgValThrIleSerValAspThrSerLysAsnGlnPheSerLeu65707580LysLeuSerSerValThrAlaAlaAspThrAlaValTyrTyrCysAla859095ArgAlaArgGlyProTrpSerPheAspProTrpGlyGlnGlyThrLeu100105110ValThrValSerSerAlaSerThrLysGlyProSerValPheProLeu115120125AlaProSerSerLysSerThrSerGlyGlyThrAlaAlaLeuGlyCys130135140LeuValLysAspTyrPheProGluProValThrValSerTrpAsnSer145150155160GlyAlaLeuThrSerGlyValHisThrPheProAlaValLeuGlnSer165170175SerGlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrValProSerSerSer180185190LeuGlyThrGlnThrTyrIleCysAsnValAsnHisLysProSerAsn195200205ThrLysValAspLysLysValGluProLysSerCysAspLysThrHis210215220ThrCysProProCysProAlaProGluAlaAlaGlyGlyProSerVal225230235240PheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMetIleSerArgThr245250255ProGluValThrCysValValValAspValSerHisGluAspProGlu260265270ValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLys275280285ThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSerThrTyrArgValValSer290295300ValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLys305310315320CysLysValSerAsnLysAlaLeuGlyAlaProIleGluLysThrIle325330335SerLysAlaLysGlyGlnProArgGluProGlnValTyrThrLeuPro340345350ProSerArgAspGluLeuThrLysAsnGlnValSerLeuThrCysLeu355360365ValLysGlyPheTyrProSerAspIleAlaValGluTrpGluSerAsn370375380GlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThrProProValLeuAspSer385390395400AspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThrValAspLysSerArg405410415TrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSerValMetHisGluAlaLeu420425430HisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSerLeuSerProGlyLys435440445<210>224<211>213<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>224AspIleGlnMetThrGlnSerProSerThrLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValThrIleThrCysArgAlaSerGlnSerIleSerSerTrp202530LeuAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuLeuIle354045TyrLysAlaSerSerLeuGluSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrGluPheThrLeuThrIleSerSerLeuGlnPro65707580AspAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnTyrAsnSerTyrProThr859095PheGlyGlyGlyThrLysValGluIleLysArgThrValAlaAlaPro100105110SerValPheIlePheProProSerAspGluGlnLeuLysSerGlyThr115120125AlaSerValValCysLeuLeuAsnAsnPheTyrProArgGluAlaLys130135140ValGlnTrpLysValAspAsnAlaLeuGlnSerGlyAsnSerGlnGlu145150155160SerValThrGluGlnAspSerLysAspSerThrTyrSerLeuSerSer165170175ThrLeuThrLeuSerLysAlaAspTyrGluLysHisLysValTyrAla180185190CysGluValThrHisGlnGlyLeuSerSerProValThrLysSerPhe195200205AsnArgGlyGluCys210<210>225<211>439<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>225AspIleGlnMetThrGlnSerProSerThrLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValThrIleThrCysArgAlaSerGlnSerIleSerSerTrp202530LeuAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuLeuIle354045TyrLysAlaSerSerLeuGluSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrGluPheThrLeuThrIleSerSerLeuGlnPro65707580AspAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnTyrGlySerPheProIle859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysValGluIleLysSerSerAlaSerThr100105110LysGlyProSerValPheProLeuAlaProSerSerLysSerThrSer115120125GlyGlyThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLysAspTyrPheProGlu130135140ProValThrValSerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSerGlyValHis145150155160ThrPheProAlaValLeuGlnSerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSer165170175ValValThrValProSerSerSerLeuGlyThrGlnThrTyrIleCys180185190AsnValAsnHisLysProSerAsnThrLysValAspLysLysValGlu195200205ProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCysProAlaPro210215220GluAlaAlaGlyGlyProSerValPheLeuPheProProLysProLys225230235240AspThrLeuMetIleSerArgThrProGluValThrCysValValVal245250255AspValSerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAsp260265270GlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyr275280285AsnSerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAsp290295300TrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeu305310315320GlyAlaProIleGluLysThrIleSerLysAlaLysGlyGlnProArg325330335GluProGlnValCysThrLeuProProSerArgAspGluLeuThrLys340345350AsnGlnValSerLeuSerCysAlaValLysGlyPheTyrProSerAsp355360365IleAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLys370375380ThrThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuValSer385390395400LysLeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSer405410415CysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSer420425430LeuSerLeuSerProGlyLys435<210>226<211>224<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>226GlnValGlnLeuGlnGlnTrpGlyAlaGlyLeuLeuLysProSerGlu151015ThrLeuSerLeuThrCysAlaValTyrGlyGlySerPheSerGlyTyr202530TyrTrpSerTrpIleArgGlnProProGlyLysGlyLeuGluTrpIle354045GlyGluIleAspHisSerGlySerThrAsnTyrAsnProSerLeuLys505560SerArgValThrIleSerValAspThrSerLysAsnGlnPheSerLeu65707580LysLeuSerSerValThrAlaAlaAspThrAlaValTyrTyrCysAla859095ArgAlaArgGlyProTrpSerPheAspProTrpGlyGlnGlyThrLeu100105110ValThrValSerSerAlaSerValAlaAlaProSerValPheIlePhe115120125ProProSerAspGluGlnLeuLysSerGlyThrAlaSerValValCys130135140LeuLeuAsnAsnPheTyrProArgGluAlaLysValGlnTrpLysVal145150155160AspAsnAlaLeuGlnSerGlyAsnSerGlnGluSerValThrGluGln165170175AspSerLysAspSerThrTyrSerLeuSerSerThrLeuThrLeuSer180185190LysAlaAspTyrGluLysHisLysValTyrAlaCysGluValThrHis195200205GlnGlyLeuSerSerProValThrLysSerPheAsnArgGlyGluCys210215220<210>227<211>438<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>227AspIleGlnMetThrGlnSerProSerThrLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValThrIleThrCysArgAlaSerGlnSerIleSerSerTrp202530LeuAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuLeuIle354045TyrLysAlaSerSerLeuGluSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrGluPheThrLeuThrIleSerSerLeuGlnPro65707580AspAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnTyrAsnSerTyrProThr859095PheGlyGlyGlyThrLysValGluIleLysSerSerAlaSerThrLys100105110GlyProSerValPheProLeuAlaProSerSerLysSerThrSerGly115120125GlyThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLysAspTyrPheProGluPro130135140ValThrValSerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSerGlyValHisThr145150155160PheProAlaValLeuGlnSerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSerVal165170175ValThrValProSerSerSerLeuGlyThrGlnThrTyrIleCysAsn180185190ValAsnHisLysProSerAsnThrLysValAspLysLysValGluPro195200205LysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCysProAlaProGlu210215220AlaAlaGlyGlyProSerValPheLeuPheProProLysProLysAsp225230235240ThrLeuMetIleSerArgThrProGluValThrCysValValValAsp245250255ValSerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGly260265270ValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsn275280285SerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrp290295300LeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuGly305310315320AlaProIleGluLysThrIleSerLysAlaLysGlyGlnProArgGlu325330335ProGlnValCysThrLeuProProSerArgAspGluLeuThrLysAsn340345350GlnValSerLeuSerCysAlaValLysGlyPheTyrProSerAspIle355360365AlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThr370375380ThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuValSerLys385390395400LeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCys405410415SerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeu420425430SerLeuSerProGlyLys435<210>228<211>224<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>228GlnValGlnLeuGlnGlnTrpGlyAlaGlyLeuLeuLysProSerGlu151015ThrLeuSerLeuThrCysAlaValTyrGlyGlySerPheSerGlyTyr202530TyrTrpSerTrpIleArgGlnProProGlyLysGlyLeuGluTrpIle354045GlyGluIleAspHisSerGlySerThrAsnTyrAsnProSerLeuLys505560SerArgValThrIleSerValAspThrSerLysAsnGlnPheSerLeu65707580LysLeuSerSerValThrAlaAlaAspThrAlaValTyrTyrCysAla859095ArgAlaArgGlyProTrpSerPheAspProTrpGlyGlnGlyThrLeu100105110ValThrValSerSerAlaSerValAlaAlaProSerValPheIlePhe115120125ProProSerAspGluGlnLeuLysSerGlyThrAlaSerValValCys130135140LeuLeuAsnAsnPheTyrProArgGluAlaLysValGlnTrpLysVal145150155160AspAsnAlaLeuGlnSerGlyAsnSerGlnGluSerValThrGluGln165170175AspSerLysAspSerThrTyrSerLeuSerSerThrLeuThrLeuSer180185190LysAlaAspTyrGluLysHisLysValTyrAlaCysGluValThrHis195200205GlnGlyLeuSerSerProValThrLysSerPheAsnArgGlyGluCys210215220<210>229<211>451<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>229GluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheThrAspTyr202530TyrMetAsnTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpLeu354045GlyPheIleGlyAsnLysAlaAsnAlaTyrThrThrGluTyrSerAla505560SerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspLysSerLysAsnThr65707580LeuTyrLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaThrTyr859095TyrCysThrArgAspArgGlyLeuArgPheTyrPheAspTyrTrpGly100105110GlnGlyThrThrValThrValSerSerAlaSerThrLysGlyProSer115120125ValPheProLeuAlaProSerSerLysSerThrSerGlyGlyThrAla130135140AlaLeuGlyCysLeuValGluAspTyrPheProGluProValThrVal145150155160SerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSerGlyValHisThrPheProAla165170175ValLeuGlnSerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrVal180185190ProSerSerSerLeuGlyThrGlnThrTyrIleCysAsnValAsnHis195200205LysProSerAsnThrLysValAspGluLysValGluProLysSerCys210215220AspLysThrHisThrCysProProCysProAlaProGluAlaAlaGly225230235240GlyProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMet245250255IleSerArgThrProGluValThrCysValValValAspValSerHis260265270GluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluVal275280285HisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSerThrTyr290295300ArgValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeuAsnGly305310315320LysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuGlyAlaProIle325330335GluLysThrIleSerLysAlaLysGlyGlnProArgGluProGlnVal340345350TyrThrLeuProProCysArgAspGluLeuThrLysAsnGlnValSer355360365LeuTrpCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAspIleAlaValGlu370375380TrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThrProPro385390395400ValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThrVal405410415AspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSerValMet420425430HisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSerLeuSer435440445ProGlyLys450<210>230<211>213<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>230GluIleValLeuThrGlnSerProAlaThrLeuSerLeuSerProGly151015GluArgAlaThrLeuSerCysArgAlaSerSerSerValThrTyrIle202530HisTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgSerTrpIleTyr354045AlaThrSerAsnLeuAlaSerGlyIleProAlaArgPheSerGlySer505560GlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGluProGlu65707580AspPheAlaValTyrTyrCysGlnHisTrpSerSerLysProProThr859095PheGlyGlnGlyThrLysLeuGluIleLysArgThrValAlaAlaPro100105110SerValPheIlePheProProSerAspArgLysLeuLysSerGlyThr115120125AlaSerValValCysLeuLeuAsnAsnPheTyrProArgGluAlaLys130135140ValGlnTrpLysValAspAsnAlaLeuGlnSerGlyAsnSerGlnGlu145150155160SerValThrGluGlnAspSerLysAspSerThrTyrSerLeuSerSer165170175ThrLeuThrLeuSerLysAlaAspTyrGluLysHisLysValTyrAla180185190CysGluValThrHisGlnGlyLeuSerSerProValThrLysSerPhe195200205AsnArgGlyGluCys210当前第1页12
再多了解一些

本文用于企业家、创业者技术爱好者查询,结果仅供参考。

发表评论 共有条评论
用户名: 密码:
验证码: 匿名发表

相关文献