一种用于治疗前列腺癌的药物组合物的制作方法

一种用于治疗前列腺癌的药物组合物
1.本案为分案申请，原申请的发明名称为：一种用于治疗前列腺癌的基因抑制剂，原申请的申请日为：2020
‑
04
‑
23，原申请的申请号为：cn202010327021.x。
技术领域
2.本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种用于治疗前列腺癌的药物组合物。


背景技术：

3.前列腺癌是男性泌尿生殖系统较为常见的一种恶性肿瘤，是导致全球男性死亡的主要恶性肿瘤之一。尽管我国前列腺癌的发病率远低于西方发达国家，但是由于我国人口老龄化的不断严重，前列腺癌的发病率逐年升高，严重威胁着中老年男性的健康，并且对中国男性生活方式和生活质量的影响愈加的凸显。前列腺癌的早期症状较为隐匿，因此，许多患者确诊时通常已经处于较晚的进展期。目前，传统的治疗手段如局部手术切除、化疗、放疗及激素阻断方法都有其各自的缺点和不足，如治疗后的副作用大、容易复发等。因此，选择新的治疗方式和治疗药物显得愈加紧迫。
4.长链非编码rna是一类长度上大于200nt的非编码rna.虽然，非编码rna的数量远远多于编码基因的数量，但是过去的很长一段时间，非编码基因一直被科学家视为是一些没有意义的转录片段。然而，随着高通量基因测序技术的出现，人们开始逐渐的意识到lncrna的重要性。目前的研究发现，lncrna在细胞的发生、发育、增殖、和分化等多个方面发挥着重要的作用。 同时，研究发现，lncrna在肿瘤的发生发展中，扮演着重要的作用，目前，其已经成为肿瘤诊断和治疗的重要标志物和药物靶点。lncrna在肿瘤发病机制中的研究为新的肿瘤治疗靶点的选取以及研发新的精准治疗药物提供了新的思路。
5.目前，关于linc01841在前列腺癌中的作用尚无相关报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于，针对现有技术的不足，提供一种以linc01841为作用靶标去制备得到的对linc01841具有抑制作用的基因抑制剂并将其用于制备治疗前列腺癌药物。
7.为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：本发明提供了linc01841基因抑制剂在制备治疗前列腺癌药物中的用途，所述linc01841的转录本为nr_134908.1，所述linc01841的序列如seq id no.1所示。
8.优选地，所述linc01841基因抑制剂是以linc01841为作用靶标制备得到的对linc01841具有抑制作用的分子抑制剂；所述分子抑制剂为核酸分子、抗体或小分子化合物中的一种。
9.优选地，所述核酸分子包括shrna、sirna、dsrna和微小rna。
10.优选地，所述核酸分子为sirna。
11.优选地，所述sirna的正义链序列如seq id no.6所示，所述sirna的反义链序列如seq id no.7所示。
12.此外，本发明提供了一种基因抑制剂，所述基因抑制剂为linc01841基因抑制剂，所述linc01841基因抑制剂是以linc01841为作用靶标制备得到的对linc01841具有抑制作用的分子抑制剂，所述linc01841基因抑制剂可用于制备治疗前列腺癌药物。
13.优选地，所述linc01841基因抑制剂为sirna，所述sirna的正义链序列如seq id no.6所示，所述sirna的反义链序列如seq id no.7所示。
14.除此之外，本发明提供了一种治疗前列腺癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括linc01841基因抑制剂。
15.优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或敷料。
16.优选地，所述药学上可接受的载体和/或敷料包括：粘合剂、稀释剂、润滑剂、表面活性剂、吸附载体。
17.本发明的有益效果在于：本发明首次发现linc01841可以作为前列腺癌治疗的靶点。而且，通过本发明提供的sirna可以抑制前列腺癌细胞的增殖，迁移和侵袭，因此，本发明所提供的基因抑制剂可以用于制备治疗前列腺癌药物，并且为前列腺癌药物的开发提供新的方向。
附图说明
18.图1 linc01841在正常前列癌上皮细胞rwpe
‑
1和前列腺癌细胞du
‑
145、pc3和lncap中的表达情况。
19.图2 转染si
‑
linc01841对于pc3细胞的细胞增殖能力的影响图3 转染si
‑
linc01841对于pc3细胞的细胞增殖相关蛋白c
‑
myc和cyclind1的影响。
20.图4 转染si
‑
linc01841对于pc3细胞的细胞迁移和细胞侵袭的影响。
21.图5转染si
‑
linc01841对于pc3细胞的emt相关蛋白e
‑
cadherin和vimentin的影响。
具体实施方式
22.下面将结合具体实施例对本发明做进一步说明，需要注意的是，本发明的保护范围不局限于下述的具体实施例，而且，应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。除此之外，下述实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。实施例中涉及的试剂及药品，若无特殊说明，均为普通市售产品。
23.实施例1linc01841在正常前列癌上皮细胞rwpe
‑
1和前列腺癌细胞du
‑
145、pc3、和lncap中的表达情况。
24.1.rna提取（1）将rwpe
‑
1细胞、du
‑
145细胞、pc3细胞、lncap细胞接种于六孔板中，培养48小时，待细胞铺满90%时，加入500μl trizol,充分混匀，将混合液转移至2ml离心管中，室温放置5min；
（2）将离心管置于低温高速离心机中，12000rpm离心5min，取上清；（3）加入100μl氯仿，颠倒混匀后，室温静置15min；（4）将离心管置于低温高速离心机中，12000rpm离心5min；（5）将上清转移至新的2ml无rna酶离心管中，加入等体积的预冷异丙醇颠倒混匀，冰上静置10min；（6）将离心管置于低温高速离心机中，12000rpm，离心10min，用移液器小心去除上清，保留白色沉淀；（7）加入500μl 75%乙醇，颠倒混匀，将离心管置于低温高速离心机中，4℃，8000rpm，离心5min；（8）小心去除上清，将离心管置于室温干燥，待干燥后，加入depc水完全溶解沉淀，用nanodrop 2000分光光度计测量rna浓度。
25.2.荧光定量pcr检测linc01841表达（1）逆转录反应参考takara反转录试剂盒a：去除基因组dna反应条件: 42℃ 120s，4℃。
26.b:逆转录反应反应条件：37℃ 15min；85℃ 5s，4℃。
27.（2）荧光pcr检测引物序列linc01841forward 5
’‑ꢀ
ccgctaagcacacagaggaa
‐3’
（seq id no.2）reverse 5
’‑ꢀ
aacagcaaggtgtcagcaga
‐3’
（seq id no.3）gapdh
forward 5
’‑ꢀ
ggtgtgaaccatgagaagtatga
‐3’
（seq id no.4）reverse 5
’‑ꢀ
gagtccttccacgataccaaag
‐3’
（seq id no.5）反应试剂反应条件：95℃ 10min；95℃ 12s，59℃ 40s，40个循环；60℃ 5min。
28.采用2
‑△△
ct
方法处理实验数据，结果如图1所示。
29.实验结果：从图1可以看出，前列腺癌细胞中的linc01841的表达量均高于正常细胞，且差异具有统计学意义（p ＜0.05），其中，pc3细胞中linc01841的表达量最高（6.503
±
0.116），因此选择pc3细胞进行后续的细胞实验。
30.实施例2通过cck
‑
8检测转染si
‑
linc01841对于pc3细胞的细胞增殖能力的影响（1）将5
×
103个转染si
‑
nc或si
‑ꢀ
linc01841的pc3细胞接种于96孔板中，每孔90μl，每组设置3个复孔，置于恒温细胞培养箱中培养；（2）分别在0h，24h，48h，72h对细胞进行检测，检测时，每孔加入10μl cck
‑
8检测液，之后将细胞置于恒温细胞培养箱中孵育4小时；（3）将细胞培养板置于酶标仪中，450nm处检测吸光值，绘制生长曲线，结果如表1和图2所示。
31.si
‑
linc01841序列为正义链5
’‑
ggucaagaguucaagaccaau
‐3’
（seq id no.6）反义链5
’‑
uggucuugaacucuugaccuu
‐3’
（seq id no.7）si
‑
linc01841由上海吉玛基因合成，si
‑
nc由公司提供。
32.表1转染si
‑
linc01841和si
‑
nc后pc3细胞的增殖变化时间si
‑
ncsi
‑
linc018410h0.096
±
0.0070.097
±
0.00924h0.325
±
0.0460.186
±
0.04248h0.675
±
0.0490.394
±
0.04172h0.986
±
0.0570.612
±
0.046实验结果通过表1和图2可以看出，转染si
‑
linc01841之后，相较于转染si
‑
nc，pc3细胞的增殖速率明显受到抑制，说明抑制linc01841能够抑制前列腺癌细胞的增殖。
33.实施例3
western blot检测转染si
‑
linc01841对于增殖相关蛋白的影响（1）2
×
105的pc3细胞接种到6孔培养板上，培养24h后，按照lipofectin 2000对细胞进行转染，转染分组为si
‑
nc组和si
‑
linc01841组；（2）转染48小时后，使用pbs洗涤细胞，加入150
µ
l ripa细胞裂解液，冰上放置30分钟；（3）充分裂解之后，将细胞转移到离心管中，10000g/min，4℃离心15分钟；（4）用移液器吸取上清，转移至新的离心管中；（5）吸取2
µ
l，按照bca说明书测定蛋白浓度，加入5
×
sds上样缓冲液，沸水水浴煮5min，得到蛋白样品。
34.（6）组装好电泳槽，配置5%上层胶和10%下层胶；（7）每孔加入20
µ
g蛋白样品和蛋白marker指示剂，加入新配置的电泳缓冲液，80v 20min，120v 120min；（8）组装转膜夹，转入电转槽中，加入电转液，200ma 1.5h；（9）转膜结束后，将nc膜取出，转移至5%脱脂奶粉中，室温摇床封闭1h；（10）将pvdf膜取出，使用tbst洗膜，每次5min，共3次，孵育c
‑
myc，cyclind1和β
‑
actin一抗稀释液，4℃，摇床孵育过夜。
35.（11）吸取一抗，使用tbst洗膜，每次5min，共3次，孵育二抗，室温，摇床孵育1h；（12）暗室中，快速将发光液滴加至pvdf膜上，进行显像。
36.实验结果实验结果如图3所示，可以看出，转染si
‑
linc01841的细胞中，c
‑
myc和cyclin
‑
d1的蛋白表达量明显低于转染si
‑
nc的细胞，说明抑制linc01841能够抑制c
‑
myc和cyclin
‑
d1的蛋白表达，上述结果进一步验证了通过si
‑
linc01841能够抑制前列腺癌细胞的增殖。
37.实施例4转染si
‑
linc01841对于pc3细胞的细胞迁移的影响（1）2
×
105的pc3细胞接种到6孔培养板上，培养24h后，按照lipofectin 2000对细胞进行转染，转染分组为si
‑
nc组和si
‑
linc01841组；（2）转染24h后用胰酶将细胞消化下来，收集至离心管中，用pbs和无血清培养基洗涤之后，使用无血清培养基悬浮细胞，进行计数；（3）在transwell小室的下室加入600μl含10%血清的培养基，上室中加入100μl 5
×
104细胞悬液，将细胞置于细胞恒温培养箱中培养24h；（4）用镊子小心的将小室取出，将上室的液体吸干，之后将小室转移至加有800μl甲醇的培养板中，室温固定30分钟；（5）用镊子小心的将小室取出，吸干上室固定液，将小室转移至加有800μl giemsa染液的培养板中，室温染色20分钟；（6）取出小室，用清水冲洗浸泡3次，吸去上室液体，用棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞，置于显微镜下进行拍照。
38.实验结果结果如图4细胞迁移所示，可以看出，相较于转染si
‑
nc的pc3细胞，转染si
‑
linc01841的pc3细胞穿过transwell小室的细胞数目明显减少，说明si
‑
linc01841基因抑
制剂能够抑制前列腺癌细胞pc3的细胞迁移。
39.实施例5转染si
‑
linc01841对于pc3细胞的细胞侵袭的影响（1）2
×
105的pc3细胞接种到6孔培养板上，培养24h后，按照lipofectin 2000对细胞进行转染，转染分组为si
‑
nc组和si
‑
linc01841组；（2）转染24h后用胰酶将细胞消化下来，收集至离心管中，用pbs和无血清培养基洗涤之后，使用无血清培养基悬浮细胞，进行计数；（3）将冻存于
‑
80℃的bd matrigel胶 4℃过夜，使其完全变成液态；（4） 用移液器吸取200μl无血清培养基至无菌离心管，加入40μl matrigel胶，冰上轻轻混匀，在transwell小室的上室加入100μl matrigel胶，将小室放入恒温细胞培养箱中，孵育至matrigel胶完全变为固态；（5）在transwell小室的下室加入600μl含10%血清的培养基，上室中加入100μl 5
×
104细胞悬液，将细胞置于细胞恒温培养箱中培养24h；（6）将transwell小室小心的用镊子取出，吸干上室中的液体，之后将小室转移到加有800μl甲醇的细胞培养板中，室温固定30分钟；（7）固定好后，将小室取出，吸干上室的液体，之后将小室转移到加有800μl giemsa染液的细胞培养板中，室温染色20分钟；（8）用pbs冲洗transwell小室，吸取上室液体，小心擦去transwell小室上室的细胞，置于显微镜下进行拍照。
40.实验结果实验结果如图4细胞侵袭所示，可以看出，相较于转染si
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nc的pc3细胞，转染si
‑
linc01841的pc3细胞穿过matrigel胶进入小室下部的细胞数目明显减少，说明si
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linc01841基因抑制剂能够抑制前列腺癌细胞pc3的细胞迁移。
41.实施例6转染si
‑
linc01841对于pc3细胞的emt相关蛋白e
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cadherin和vimentin的影响。
42.（1）2
×
105的pc3细胞接种到6孔培养板上，培养24h后，按照lipofectin 2000对细胞进行转染，转染分组为si
‑
nc组和si
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linc01841组；（2）转染48小时后，使用pbs洗涤细胞，加入150
µ
l ripa细胞裂解液，冰上放置30分钟；（3）充分裂解之后，将细胞转移到离心管中，10000g/min，4℃离心15分钟；（4）用移液器吸取上清，转移至新的离心管中；（5）吸取2
µ
l，按照bca说明书测定蛋白浓度，加入5
×
sds上样缓冲液，沸水水浴煮5min，得到蛋白样品。
43.（6）组装好电泳槽，配置5%上层胶和12%下层胶；（7）每孔加入20
µ
g蛋白样品和蛋白marker指示剂，加入新配置的电泳缓冲液，80v 20min，120v 120min；（8）组装转膜夹，转入电转槽中，加入电转液，200ma 1.5h；（9）转膜结束后，将pvdf膜取出，转移至5%脱脂奶粉中，室温摇床封闭1h；（10）将pvdf膜取出，使用tbst洗膜，每次5min，共3次，孵育e
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cadherin，vimentin
和gapdh一抗稀释液，4℃，摇床孵育过夜。
44.（11）吸取一抗，使用tbst洗膜，每次5min，共3次，孵育二抗，室温，摇床孵育1h；（12）暗室中，快速将发光液滴加至pvdf膜上，进行显像。
45.实验结果：通过图5可以看出，转染si
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linc01841的细胞中，e
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cadherin表达上调而vimentin的表达量下调，说明抑制linc01841能够抑制前列腺癌细胞pc3的emt，上述结果进一步验证了通过si
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linc01841能够抑制前列腺癌细胞的迁移和侵袭。
46.综上所述，本发明所提供的基因抑制剂si
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linc01841能够抑制前列腺癌细胞的增殖，迁移和侵袭，因此，si
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linc01841可以用于制备治疗前列腺癌的药物。