一株河水短芽孢杆菌菌株及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物技术领域，更具体地，涉及一株河水短芽孢杆菌(brevibacillus fluminis)bf72菌株及其应用。


背景技术：

2.氨氮(包括分子态nh3和离子态nh
4
)，亚硝酸盐氮(no2‑
)，水体中氨氮及亚硝酸盐氮浓度是衡量水质好坏的重要指标，氨氮和亚硝酸盐氮对水产养殖动物具有很强的毒性，氨氮对水生动物细胞膜的稳定与体内的酶反应有很大影响,还会影响鳃对氧的传递性，对水生动物的排泄系统和渗透平衡造成破坏。氨氮中的分子态(nh3)和离子态(nh
4
)在水中可以相互转化，与nh
4
相比nh3因有较高的脂溶性而能更容易地通过细胞膜而扩散到细胞中去，因此nh3浓度的过高会导致水生动物代谢功能失常或组织技能损伤，进而影响其生长。水体中nh3浓度的升高通常与过多的饲料投放或饲料质量不佳有关，也可因藻类及水草过少而造成的水体缺氧而导致，对水体中氨氮浓度的降低措施传统方法有通过换水、倒池以更换新水排去污染水体，但此法容易造成水资源的浪费和环境污染；还有通过投放活性炭、沸石和麦饭石对氨氮进行吸附的方法；通过安装增氧机或使用氧化剂促进氨氮向硝酸盐方向转化或直接消除氨氮；还有通过使用微生物制剂利用其自身代谢，对氨氮和亚硝酸盐氮转化为硝酸盐等无害产物。亚硝酸盐氮是水体中有机物分解的中间产物，与氨氮相比随其对水生动物的毒性低得多但是当其浓度过高时也会造成水生动物的中毒反应，同时由于亚硝酸盐氮的致癌性使得原本毒性很小的污染物毒性增强。亚硝酸盐氮浓度过高时常用的处理方法为换水、倒池；安装增氧机或使用氧化剂；使用微生物制剂，利用其反硝化过程将亚硝酸盐氮转化为n2o或n2从而降低水体亚硝酸盐氮浓度。相较于物理、化学方法，微生物通过转化和吸收降解水体中氨氮和亚硝酸氮的方法有着更加环保节约、低成本高收效的特点，因而成为研究的热点。
3.河水短芽孢杆菌(brevibacillus fluminis)由mi
‑
jin等在2010年于韩国汉江河口湿地沉积物中分离得到，并作为一个新种发表(choi m j,bae j y,kim k y,et al.brevibacillus fluminis sp.nov.isolated from sediment of estuarine wetland.[j].international journal of systematic&evolutionary microbiology,2010,60(7):1595
‑
1599.)。河水短芽孢杆菌(brevibacillus fluminis)是革兰氏阳性菌，属好氧细菌，具有移动性。短芽孢杆菌(bacillus brevis)于1900年首次报道，之后于20世纪90年代多相分类学的发展被重新划分为新属短芽孢杆菌属(brevibacillus)。河水短芽孢杆菌(brevibacillus fluminis)菌株相较于同属不同种类的菌株在过氧化氢酶和脂肪酸谱方面是独特的，其具有产过氧化氢酶能力。对河水短芽孢杆菌(brevibacillus fluminis)生物学功能的研究较少。
[0004]
传统生物脱氮是通过微生物的硝化作用和反硝化作用完成的，硝化作用包括两种反应，首先由亚硝化细菌在好氧条件下将氨氮氧化成为亚硝酸盐氮，然后再由硝化细菌将亚硝酸盐氮进一步氧化成为硝酸盐氮。反硝化作用是由微生物在缺氧或厌氧条件下以有机
物为电子供体，先将硝酸盐还原为亚硝酸盐，进而将其还原为氮气释放出来，达到脱氮的目的。之后人们对好氧反硝化作用的发现扩大了反硝化微生物的范围，即一部分微生物在有氧条件下也能发生反硝化的现象。目前还未见有可降解氨氮及亚硝酸盐氮的河水短芽孢杆菌的报道。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于提供一种河水短芽孢杆菌(brevibacillus fluminis)bf72及其应用，该菌株可以通过减少水体中的氨氮、亚硝酸氮及亚硝酸盐实现改善水体污染，同时在水产养殖方面中，可以减少氮类污染物对水产动植物的毒害作用，增加水产食品/饲料/原料的安全性。
[0006]
本发明的目的是提供一株河水短芽孢杆菌(brevibacillus fluminis)菌株bf72。
[0007]
本发明的另一个目的是提供菌株bf72在减少水体污染方面的应用。
[0008]
本发明的另一个目的是提供菌株bf72在水产养殖方面的应用。
[0009]
本发明的另一个目的是提供菌株bf72在减少亚硝酸盐方面中的应用。
[0010]
本发明的另一个目的是提供菌株bf72在减少或降解氨氮及亚硝酸氮方面的应用。
[0011]
本发明的另一个目的是提供菌株bf72在制备减少亚硝酸盐、氨氮及亚硝酸氮的微生物菌剂方面的应用。
[0012]
本发明的另一个目的是提供一种微生物菌剂。
[0013]
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
[0014]
申请人团队从华南农业大学野生稻核心收集圃(wild rice core collection nursery of south china agricdtural university)的普通野生稻中，经人工分离纯化获得了一株耐盐、过氧化氢酶阳性、能减少水体中的氨氮、亚硝酸氮及亚硝酸盐的菌株。该菌株的16s rrna与genbank数据库进行blast比对，发现它与河水短芽孢杆菌(brevibacillus fluminis)模式菌株kacc:13381相似性为99.63％。因此将本发明的菌株应归属于河水短芽孢杆菌(brevibacillus fluminis)，命名为bf72。2021年4月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏号为gdmcc no：61567。
[0015]
菌株bf72形态特征如下：菌株呈短杆状，在lb琼脂平板上生长速度较快，菌落圆形，呈现乳白色，中间凸起，边缘湿润整齐(30℃，生长24小时)，菌落直径1.8
‑
2.0cm。最适生长温度是30℃及最佳生长ph值7。
[0016]
研究显示，该河水短芽孢杆菌(brevibacillus fluminis)bf72能显著减少水体中的氨氮、亚硝酸氮和亚硝酸盐。因此本发明要求保护：
[0017]
河水短芽孢杆菌(brevibacillus fluminis)在减少或降解氨氮及亚硝酸盐氮方面的应用。
[0018]
河水短芽孢杆菌(brevibacillus fluminis)在减少亚硝酸盐方面中的应用。
[0019]
河水短芽孢杆菌(brevibacillus fluminis)在改善水体污染方面的应用，所述水体污染是由氨氮及亚硝酸盐氮引起的水体污染。
[0020]
河水短芽孢杆菌(brevibacillus fluminis)在制备治疗水体污染的菌剂方面的应用。
[0021]
河水短芽孢杆菌(brevibacillus fluminis)在减少水产养殖中污染物对水产的
伤害方面的应用，所述污染物是氨氮和亚硝酸盐氮。
[0022]
河水短芽孢杆菌(brevibacillus fluminis)在制备水产养殖用菌剂方面的应用。
[0023]
河水短芽孢杆菌(brevibacillus fluminis)在制备减少亚硝酸盐、氨氮及亚硝酸盐氮的微生物菌剂方面的应用。
[0024]
其中，优选地，所述的河水短芽孢杆菌(brevibacillus fluminis)为河水短芽孢杆菌(brevibacillus fluminis)菌株bf72，该菌株于2021年4月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏号为gdmcc no：61567。
[0025]
一种微生物菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的河水短芽孢杆菌(brevibacillus fluminis)菌株bf72。
[0026]
本发明具有以下有益效果：
[0027]
(1)河水短芽孢杆菌(brevibacillus fluminis)，尤其是菌株bf72，可以通过减少水体中的氨氮、亚硝酸氮及亚硝酸盐实现改善水体污染；
[0028]
(2)在水产养殖方面中，可以减少氮类污染物对水产动植物的毒害作用，减少水产动植物带有的亚硝酸盐，增加水产食品/饲料/原料的安全性。
附图说明
[0029]
图1为菌株bf72稀释后涂布于lb固体培养基上培养24小时后菌落图。
[0030]
图2为菌株bf72在biolog板上利用特定碳源的效果图。
[0031]
图3为亚硝酸盐含量显色图。其中编号1：无菌 乳酸溶液(含1.0mg/ml亚硝酸钠) 摇瓶24h后的显色反应；编号2：无菌 葡萄糖溶液(含1.0mg/ml亚硝酸钠) 摇瓶24h后的显色反应；编号3：bf72菌株 乳酸溶液(含1.0mg/ml亚硝酸钠) 摇瓶24h后的显色反应；编号4：bf72菌株 葡萄糖溶液(含1.0mg/ml亚硝酸钠) 摇瓶24h后的显色反应；编号5：bf72菌株 柠檬酸溶液(含1.0mg/ml亚硝酸钠) 摇瓶24h后的显色反应；bf72菌株 乳酸钠溶液(含1.0mg/ml亚硝酸钠) 摇瓶24h后的显色反应。
[0032]
图4为菌株bf72去除氨氮及亚硝酸氮随时间变化的图。
具体实施方式
[0033]
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0034]
实施例1菌株的分离、纯化及筛选
[0035]
发明人从华南农业大学野生稻核心收集圃普通野生稻中分离纯化得到可降解氨氮及亚硝酸盐的微生物，具体分离纯化步骤如下：
[0036]
分离所用培养基为：nacl 1g，mgcl
2 0.2g，nh4cl 0.5g，cacl
2 0.02g，k2hpo4 0.5g，kh2po4 0.5g，蒸馏水1000ml，ph自然(6.5)，固体加琼脂粉18g/l，121℃灭菌30分钟。
[0037]
将样品(普通野生稻)用灭过菌的碾砵碾碎，称取10g土样用90ml磷酸缓冲液(pbs)震荡悬浮10分钟，取100μl菌液涂布平板，28度培养箱培养。而用液体培养基培养时，利用液体培养基(不加琼脂粉)，吸取100μl菌液28度摇床培养7天，待培养液很浑浊吸5μl涂平板分离纯化。观察菌体的生长情况，用接种环挑取长势较好并不同形态特征的菌苔，用平板划线
法进行反复传代培养，直至菌落的颜色、形状、大小、质地和透明度一样。最后通过简单染色(石碳酸复红染色)和显微镜镜检(油镜)，进一步观察其形态，以长度均一、宽度一致、染色情况统一为菌株纯化标准。
[0038]
结果：分离得到一株可高效降解氨氮及亚硝酸盐的单菌落菌株，记为bf72，于15％的甘油中
‑
20℃和
‑
80℃保存。
[0039]
实施例2菌株的生理生化特性及分类地位鉴定
[0040]
菌株的鉴定及保藏：实施例1分离得到的bf72菌株具有如下形态和生理、生化特性：
[0041]
a、菌体形态特性：所述菌株呈短杆状。
[0042]
b、菌落形态特性(图1)：在lb琼脂平板上生长速度较快，菌落圆形，呈现白色，中间凸起，边缘湿润整齐(30℃，生长24小时)，菌落直径1.8
‑
2.0cm，产椭圆形孢子。最适生长温度是30℃及最佳生长ph值7。
[0043]
c、生理生化特性：兼性好氧，过氧化氢酶阳性，氧化酶阴性，能利用d
‑
半乳糖、d
‑
果糖、d
‑
甘露醇、n
‑
乙酰氨基葡萄糖、苦杏仁苷、熊果苷、水杨酸、纤维二糖、麦芽糖、海藻糖、菊糖、糖原、木糖醇、图拉糖、l
‑
岩藻糖、葡萄糖酸钾，柠檬酸钠盐为唯一碳源生长；不能水解明胶和淀粉。菌株耐nacl的浓度达3.0％。
[0044]
d、分子分类地位的确定
[0045]
提取实施例1分离得到的bf72菌株的dna，扩增16s rrna基因，并用琼脂糖凝胶检测，将pcr扩增产物交由广州擎科生物技术有限公司直接进行测序，获得菌株的16s rrna序列，将16s rrna序列输入genbank进行blast比对，初步确定本发明的bf72菌株在分类学中的属、种的位置。结果发现本发明的bf72菌株的16srdna如seq id no.1所示，与河水短芽孢杆菌(brevibacillus fluminis)模式菌株kacc:13381相似性为99.63％。
[0046]
综上形态特征、分子鉴定综合判断，将本发明的bf72菌株归属于河水短芽孢杆菌(brevibacillus fluminis)。
[0047]
本发明所述的河水短芽孢杆菌(brevibacillus fluminis)bf72已于2021年4月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，菌种保藏号为gdmcc no：61567，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号。
[0048]
实施例3菌株的碳源利用率
[0049]
用white液体培养基制成96孔bio
‑
biqa碳源利用板，对菌株bf72的碳源利用率进行测定。
[0050]
配方如下：
[0051]
(1)终浓度为0.1％(w/v)的各碳源组分(见文献彭桂香,张武,谭卫军,谭志远.细菌生理特性快速检测试剂盒研制.生态学杂志,2011,30(11):2509
‑
2515.)；
[0052]
(2)cs7微量元素混合液：mnso
4 58μm，h3bo
3 82μm，znso
4 3.5μm，ki 6.0μm，cuso
4 0.8μm，na2moo
4 0.4μm，cocl
2 0.4μm，feso
4 54μm，edta
‑
2na 54μm；
[0053]
(3)white培养基：a组分：nano
3 2.5g，k2hpo
4 2.0g，nacl 0.1g，cacl
2 0.1g(分开灭菌)，kh2po4 1.0g，fecl
3 0.01g，mgso4·
7h2o 0.3g，琼脂20g，蒸馏水900ml；
[0054]
b组分：各取2.5ml的i、ii、iii溶液混合。其中i：泛酸钙10mg，烟酸10mg，对氨基苯甲酸10mg，盐酸硫胺素10mg，蒸馏水100ml；ii：vb12 40g，生物素20g，蒸馏水100ml；iii：叶
酸2mg，0.001m氢氧化钠100ml。
[0055]
1.将cs7微量元素混合液直接加入white培养基a组分当中，高温灭菌30min；
[0056]
2.将碳源配成1％的溶液，耐高温的碳源溶液高压灭菌20min，其中不耐高温的碳源半乳糖、乳糖、麦芽糖、d
‑
核糖、尿素、木糖等采用过滤灭菌。
[0057]
3.将上述的10ml各碳源溶液及0.75ml white b组分(含i、ii、iii组分各0.25ml)加入灭菌后冷却至50℃左右的white a培养基中，混合均匀后倒96孔板，每孔100μl。
[0058]
将分离纯化的河水短芽孢杆菌(brevibacillus fluminis)bf72菌株活化后，制成菌悬液，od
600
＝0.2；吸取10μl滴加于biolog板孔中，37℃培养24～36小时。
[0059]
结果：如图2所示，菌株bf72在biolog板上培养24小时后，菌株能够利用的碳源变成蓝紫色或紫黑色。bf72菌株的碳源利用率为79.2％。
[0060]
实施例4菌株在减少亚硝酸钠方面的作用
[0061]
将河水短芽孢杆菌(brevibacillus fluminis)bf72配制为od＝0.5的菌悬液，以1％的接种量，接种到含不同碳源的培养基中，每100ml培养基含浓度为1.0mg/ml亚硝酸钠。bf72菌株以37℃,80rpm摇瓶培养24h。吸取培养基到比色皿上，加入对氨基苯磺酸进行亚硝酸盐含量显色试验，以不接种bf72菌株的培养基为对照。
[0062]
结果：如图3所示，无添加bf72菌株的培养基，其内含的亚硝酸盐含量显色反应呈红色，而加入了bf72菌株的培养基，其亚硝酸盐含量显色反应呈无色。证明菌株bf72可对亚硝酸盐进行同化降解。当以柠檬酸或乳酸作为碳源时，bf72菌株对亚硝酸钠的同化降解效果最为明显。
[0063]
实施例5菌株在减少水体总氮方面的作用
[0064]
将河水短芽孢杆菌(brevibacillus fluminis)bf72用lb液体培养基活化，37℃培养24～36小时，od
600
＝1。取50ml菌液接种于500ml内含氨氮4mg/l，内含亚硝酸氮1mg/l的水体中，同时加入柠檬酸钠作为特定的碳源。在30℃,80rpm摇床培养bf72，每4h对水体进行取样，测量其氨氮及亚硝酸氮含量。
[0065]
另一方面，取两份5l水体(内含氨氮4mg/l和亚硝酸氮1mg/l)均养殖草鱼幼苗(10条)和鲤鱼幼苗(10条)。其中一份水体加入50ml的bf72菌液(od
600
＝1)，设为实验组。另一份水体加入纯水50ml，设为空白对照。记录草鱼幼苗和鲤鱼幼苗一个月内生长状态。
[0066]
结果：如图4所示，随培养时间增加，水中氨氮及亚硝酸氮含量均下降，24小时后氨氮的去除率达90％以上，亚硝酸氮的去除率达80％以上。在氨氮含量下降时，亚硝酸盐氮含量未上升，表明bf72并非将亚硝酸盐氮和氨氮相互转化，而是通过自身同化吸收水体中的氨氮和亚硝酸盐氮，从而降低水体中的总氮含量。
[0067]
另一方面：实验组的草鱼幼苗和鲤鱼幼苗在一个月内正常生长，而对照组的草鱼幼苗和鲤鱼幼苗在一个月内陆续死亡。
[0068]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。