穿龈部位带有纳米抑菌结构环的牙种植体及其加工方法与流程

1.本发明属于口腔种植体领域，涉及牙种植体表面结构设计，尤其是一种穿龈部位具有促牙龈成纤维细胞及牙龈间充质干细胞，同时抑各类口腔菌粘附纳米结构环的牙种植体。


背景技术：

2.近年来，伴随社会现代化飞速发展，人们对口腔健康的关注越来越高。牙种植作为治疗牙缺损的重要手段之一，临床的应用也越来越广泛。随着临床实践的深入，对植入体周围感染的关注持续增加。牙种植体植入后，口腔中的细菌很容易通过牙龈与种植体结合部进入牙周组织引起牙周炎，甚至导致植入失败。因此，开发具有预防牙周炎和加速牙龈
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种植体界面整合双重功能的种植体具有迫切的临床需求。但是，现有的赋予种植体表面抑菌能力的技术存在明显弊端，如化学接枝方法可以提高种植体表面的抑菌性能，但是相关技术无法满足医疗器械生产中的品控、灭菌及长期保存等要求，接枝的化学涂层在口腔的复杂环境中无法长期保持功效，很难通过当前医疗器械注册证的监管审批。且当前国内还没有可预防牙周炎及加速牙龈
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种植体界面整合的种植体获批上市。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种穿龈部位带有预防牙周炎及加速牙龈
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种植体界面整合双重功能表面的牙种植体设计，该表面具有抑各类口腔细菌粘附，同时促牙龈间充质干细胞和牙龈成纤维细胞生长的功能。
4.实现本发明目的的技术方案为：
5.首先，在种植牙的穿龈部通过等离子体注入方法注入具有生物活性、耐磨或耐腐蚀的c、n、ca、p元素；等离子体注入深度为500
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2000nm。然后在注入元素的部位制作三级微纳结构。
6.通过调控等离子体注入时的气氛成分、电压等相关工艺参数，可以控制注入元素的种类和注入深度。c、n等元素可以有效强化表面，提高种植体穿龈部位表面的耐腐蚀性和耐磨性，提高种植体植入后的稳定性和长期可靠性。ca、p等元素可以有效提高表面的生物活性，可以有效促进牙龈成纤维细胞和牙龈间充质干细胞的粘附增殖，加快种植体穿龈部位与牙龈的界面整合。
7.随后，在穿龈部位表面制备三级微纳复合结构。该三级微纳复合结构由三种级别尺寸的结构叠加组成。第一级结构为宽20
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60μm、深1
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2μm的微米级的沟槽结构；第二级结构可以由宽100
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500nm、高50
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200nm的条纹组成，或由高50
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200nm的阵列突起组成，二级结构分布于一级结构表面；第三级结构为具有亚微米或纳米尺度的纳米颗粒、纳米棒、纳米锥等结构组成，三级结构分布于二级结构表面。由于尺寸效应，上述第一级结构有效增大了材料的表面积，其尺寸与牙龈成纤维细胞和牙龈间充质干细胞相近，因此有利于这两种细胞在其上的粘附和生长。第二级结构使表面粗糙度提高，为牙龈成纤维细胞和牙龈间充质干细
胞粘附提供了粘附位点，同时这些结构有效减少了各类口腔菌的粘附。第三级结构可以对细菌起到杀灭作用，同时不会对牙龈成纤维细胞和牙龈间充质干细胞生长产生影响。上述三种结构的综合作用使该表面具有了抑制细菌粘附，进而避免细菌在种植体植入早期通过牙龈
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种植体界面空隙进入牙周组织的功能，同时该微纳复合结构可以促进牙龈成纤维细胞生长进而加快牙龈和种植体界面的整合，实现牙周组织与外界细菌的隔断。
8.三级微纳结构采用脉冲激光加工。脉冲激光加工的具体步骤为：首先，测量种植体尺寸及加工位置的尺寸。随后，打开激光器，调节功率、频率、扫描速度、加工线间距等加工参数，使光斑照射在穿龈部位加工起始位置。保持激光焦点与激光加工位置距离不变，扫描整个穿龈部位表面。脉冲激光加工的参数为：激光频率1～10khz，脉冲能量3000～8000uj，光斑直径50～60μm，线间距40～60μm，扫描速度10～20mm/s。
9.不进行离子注入，仅通过穿龈部位表面的三级微纳复合结构制备，就能实现促牙龈成纤维细胞和牙龈间充质干细胞粘附增殖，抑各类口腔菌粘附生长的效果。但通过离子注入活性元素与三级微纳复合结构的共同作用可以达到更好的促牙龈成纤维细胞和牙龈间充质干细胞粘附、抑制口腔菌粘附的效果。
10.本发明提出了一种穿龈部位带有预防牙周炎及加速牙龈
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种植体界面整合双重功能表面的牙种植体及其制备方法，穿龈部位表面具有含c、n、ca、p等元素的涂层，这一涂层提高了穿龈部位表面的生物活性，可以有效提高牙龈成纤维细胞和牙龈间充质干细胞在其上的粘附、生长，加快牙龈和种植体界面的整合，也能有效提高表面的耐磨和耐腐蚀性能。同时该表面具有三级微纳复合结构，这种物理结构可抑制各类口腔菌在其表面的粘附与生长，进而避免细菌在种植体植入早期通过牙龈
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种植体界面空隙进入牙周组织，同时该结构可以促进牙龈成纤维细胞和牙龈间充质干细胞的生长进而加快牙龈和种植体界面的整合，实现牙周组织与外界细菌的隔断。该种植体设计在牙种植领域具有极大的应用潜力。
11.本发明的有益效果为：
12.本发明通过在种植体穿龈部位制备具有生物活性成分和微纳复合结构的表面，可以有效促进牙龈成纤维细胞和牙龈间充质干细胞的粘附、增殖，同时抑制各类口腔菌在其上的粘附、生长，可有效降低种植体植入后的牙周感染风险，提高植入的成功率，同时这一抑菌环的制备仅设计种植体的表面处理，并不与现有的种植体生产工艺冲突，也可以降低相关种植体产品注册审批的难度。
附图说明：
13.图1a，图1b，图1c分别为实施例1中种植体、种植体表面等离子体处理区域及种植体表面飞秒激光处理区域示意图；
14.图2为实施例1中飞秒激光加工区域表面的微观形貌，其中a，b，c分别为第一级、第二级和第三级结构图；
15.图3为实施例1中飞秒激光加工区域表面成分分析图；
16.图4为对照例1中四种表面牙龈成纤维细胞及牙龈间充质干细胞粘附情况对比图；
17.图5为实施例1中四种表面大肠杆菌和金黄色葡萄球菌粘附情况对比图；
18.图6对照例2中两表面耐磨损性能比较图；
19.图7为对照例3中两表面口腔菌粘附情况对比图，其中a
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g分别为甲型链球菌、厌氧
链球菌、表皮葡萄球菌、奈瑟氏菌、乳杆菌、螺旋体和假丝酵母。
具体实施方式
20.下面通过具体实施例对本发明作进一步详述
21.实施例1
22.本实施例中应用等离子注入和飞秒激光加工方法，在种植体穿龈部位的表面制备抑菌生物活性表面。
23.具体步骤和工艺为：
24.(1)首先应用等离子体注入方法向种植体表面注入c、n、ca、p元素。将纯ti种植体置于含c、n、ca、p四种元素的气氛中，应用金属等离子体浸没注入技术在种植体表面至距表面500nm的深度范围内制备了含上述四种元素的成分层。图1a为种植体示意图。图1b为等离子体注入方法处理部位示意图，深色部分为等离子体注入区域。
25.(2)测量种植体尺寸及加工位置的尺寸。本例所用种植体长8mm，其中穿龈部位长3mm，骨结合部位直径3.5mm，穿龈部位颈部最宽处4.8mm。
26.(3)将种植体固定于四轴平移台上。打开激光器，调节激光参数。调整光斑位置，使激光光斑照射在穿龈部位的起始位置。加工工艺为激光频率1khz，脉冲能量8000uj，光斑直径50μm，线间距50μm，扫描速度10mm/s加工穿龈部位表面，加工时旋转轴旋转一周，y轴平移0.1mm，同时x轴移动以保证激光焦点到样品表面距离不变，如此往复覆盖整个穿龈部位表面，在穿龈部位表面同步诱导产生三级微纳复合结构。
27.图2为加工后该部位表面形貌，其中a、b、c分别为该三级微纳复合结构中的第一级结构、第二级结构和第三级结构。图3为所得的种植体穿龈部位表面化学成分。图1c为激光加工区域。
28.(4)将加工完成的种植体取下，清洗灭菌并封装。
29.对照例1
30.本对照例通过体外细胞实验和抑菌粘附实验，比较了纯钛打磨表面、具有生物活性成分的打磨钛表面、具有三级微纳复合结构的钛表面及具有生物活性成分及微纳复合结构的钛表面对多种细胞、细菌在其上粘附、生长行为的影响。
31.纯钛打磨表面(a表面)制备方法为：应用机械打磨方法打磨纯钛表面。具有生物活性成分的打磨钛表面(b表面)制备方法为：首先应用机械打磨方法制备打磨纯钛表面，随后应用金属等离子体浸没注入技术向表面注入ca、p、c、n四种元素，等离子体注入工艺参数与实施例1中所用的一致。具有三级微纳复合结构的钛表面(c表面)制备方法为：首先应用机械打磨方法制备打磨钛表面，随后应用飞秒激光加工方法在表面制备微纳复合结构，飞秒激光加工工艺与实施例1中的相同。具有生物活性成分及微纳复合结构的钛表面(d表面)制备地方法为：用与b表面制备方法相同的方法制备含有ca、p、c、n四种元素的钛表面，随后应用飞秒激光加工方法在表面制备微纳结构，制备工艺与实施例1中的飞秒激光加工工艺一致。
32.首先进行牙龈成纤维细胞、牙龈间充质干细胞粘附实验。将40μl，5
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104个/ml牙龈成纤维细胞悬液和牙龈间充质干细胞悬液分别滴在四种样品表面上，分别培养24h后,用pbs冲洗表面，用cck
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8法比较四种样品表面粘附细胞数量。
33.图4为对四种样品表面od值的统计结果。a表面od值最低，b、c表面od值均高于a表面的，说明通过等离子体注入方法向纯钛表面注入生物活性成分和通过飞秒激光加工在表面制备微纳复合结构的方法对牙龈成纤维细胞和牙龈间充质干细胞的粘附均有促进作用。d表面od值明显高于另三种表面，表明应用表面活性成分注入结合微纳复合结构制备对两种细胞的粘附、增殖有显著促进作用。
34.随后进行了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在四种表面粘附的实验。将40μl，浓度为106个/ml大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌液分别滴在四种样品表面上，培养6h后，用pbs冲洗表面菌液，进行荧光染色，用激光共聚焦显微镜进行观察，每个表面统计任意10个位置的荧光强度。
35.如图5所示，a、b表面两种细菌均大量粘附。c表面和d表面细菌粘附量相比a、b两表面粘附数量明显较小，这表面微纳复合结构对两种细菌的粘附具有明显的抑制作用。值得注意的是，b表面细菌粘附量略高于a表面，这表明b表面在具有较高的生物活性后，细菌在其上的粘附也略有促进，d表面粘附量与c表面的基本一致，这表明微纳复合结构对细菌粘附的抑制作用消除了d表面生物活性提高带来的细菌粘附增多的影响。
36.上述细胞和细菌实验结果表明，通过等离子体注入方法结合飞秒激光加工方法在种植体表面制备的具有生物活性成分和微纳复合结构的表面具有促进牙龈成纤维细胞和牙龈间充质干细胞的粘附、增殖的同时抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌粘附的双重功能。
37.对照例2
38.本对照例比较了具有微纳复合结构的纯钛表面和注入c、n、ca、p元素的具有微纳复合结构钛表面的耐磨。其中具有微纳复合结构的纯钛表面按对照例1中的c表面制备方法制备，注入c、n、ca、p元素的具有微纳复合结构的钛表面按照对照例1中d表面制备方法制备。
39.应用磨损试验机对两种表面的耐磨性能进行测试，应用si3n4研磨球以300r/min的转速和200n的载荷进行表面干摩擦，摩擦30分钟后，分别统计两表面的磨损量。如图6所示，摩擦30分钟后，注入元素的表面磨损量明显低于纯钛表面，这表明等离子体注入方法注入元素对表面耐磨损性能有明显提高。
40.对照例3
41.本对照例比较了多种常见口腔菌在光滑的纯钛表面和具有生物活性成分及微纳复合结构的钛表面粘附情况。
42.其中，纯钛表面制备方法为：应用机械打磨方法处理纯钛表面。具有生物活性成分及微纳复合结构的表面按照实施例1中方法制备。抑菌实验选用的菌种有：甲型链球菌、厌氧链球菌、表皮葡萄球菌、奈瑟氏菌、乳杆菌、螺旋体和假丝酵母。分别通过荧光强度统计和平板计数方法统计两种表面粘附细菌数量。
43.荧光强度统计实验方法为：将40μl，浓度为106个/ml大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌液分别滴在四种样品表面上，培养6h后，用pbs冲洗表面菌液，进行荧光染色，用激光共聚焦显微镜进行观察，每个表面统计任意10个位置的荧光强度。如图7所示，由于打磨钛表面不具有抑菌性能，7种口腔菌在其表面上均大量粘附，具有微纳复合结构的生物活性表面7中细菌粘附量均明显少于打磨钛表面，这一结果表明，相比光滑的纯钛种植体表面，本发明提出的具有微纳复合结构和生物生物活性成分的种植体表面对常见口腔菌在其上的粘附
具有显著的抑制作用。
44.实施例2
45.本实施例中应用飞秒激光两次加工在穿龈部位获得所需结构。具体飞秒激光加工步骤与工艺为：
46.(1)将激光光斑照射在穿龈部位的起始位置，加工种植体穿龈部位。加工工艺为激光频率10khz，脉冲能量3000uj，光斑直径60μm，线间距50μm，扫描速度20mm/s加工穿龈部位表面，加工时t轴旋转一周，y轴平移0.2mm，同时x轴移动以保证激光焦点到样品表面距离不变，如此往覆盖整个穿龈部位表面。
47.(2)移动x轴使激光光斑回到该部位加工起始位置，进行二次加工，二次加工的工艺为：激光频率10khz，脉冲能量200uj，光斑直径60μm，线间距50μm，扫描速度20mm/s加工穿龈部位表面，加工时t轴旋转一周，y轴平移0.2mm，同时x轴移动以保证激光焦点到样品表面距离不变，如此往覆盖整个穿龈部位表面。
48.其他与实施例1相同。
49.以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。